JPS61145190A - ホスフアチジルコリンの単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、脂質溶液をシリカゲル上のクロマトグラフィ
を行うことによって、他のリン脂質を含有しない純粋な
１，２−ジアシル−グリセロ−３−ホスフォコリン（ホ
スファチジルコリン）を単離する新規な方法に関する。

製菓業において、植物性のホスファチジルコリンは活性
薬剤および助剤として使用されている。

活性薬剤としての用途においては、（経口投与用には）
ホスファチジルコリンを多く含有するリン脂質または（
静脈内投与用には）リンホスファチジルコリンをほとん
ど含まない高純度のホスファチジルコリンが必要とされ
る。

非経口投与される脂肪乳濁液の調製のために用いられる
乳化剤のような助剤としての用途またはりボゾームおよ
び混合ミセルの各々の生成のための用途のためには、ホ
スファチジルコリンは、溶血的に作用する（ｈｅａｍｏ
ｌｙｔｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｎｇ）リソホスファチジ
ルコリンを含まないことが要求される。

植物性のホスファチジルコリンを回収するための出発材
料として、大豆油および食用油（サラダ油〕の調製にお
いて生成され精製されていないレシチンおよび精製され
ていないリン脂質と称される精製されていないリン脂質
または市販のレシチンが使用される。（カーク−オスマ
ー（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ）　ＫよるｒＫｎｃｙｌ、
　Ｃｈｅｍ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、Ｊ１４．２５０〜２６
９およびピーエイチリスト（Ｐ、Ｈ。

Ｌｉ５ｔ）によるｒＰｈａｒｍ、　Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ
ｓｔｅｃｈｎ、　ｈｅｕｔｅｌ　（７）　１〜８（１９
８０）に記載されている。ノ大豆レシチン（大豆の精製
されていないリン脂質）　（ｓｏｙａ　ｒａｗ−ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｉｄｅ）は、極性脂質（リン脂質／糖脂質）
　　　６０〜７０％大豆油　　　　　　　　　　　　２
７〜３７係水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１．５〜２％様々の他の物質　　　　　　　　０．
５〜２優を含有する・ 精製されていないレシチンおよび大豆レシチンのそれぞ
れを脱油することによって得られ、純粋レシチンとも称
される極性脂質は、下記の成分（近似値で示す）を有す
るものである。

ホスファチジルコリン（ＰＣ）　　　　　　　　３０％
リソホスファチジルコリン（ＬＰＧ　）　　　　　　　
２％ホスファチジルエタノールアミン（ＰＦ−）　　　
　２２％リンホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＦ
＝）　　　２　俤ホスファチジルセリン（ＰＳ）　　　
　　　　　３％ホスファチジルイノシトール（Ｐ工）　
　　　　　１５チリソホスフアチジルイノシトール（Ｌ
Ｐ工）、　　　　１％フィト糖脂質（ＰＧＩ、）　　　
　　　　　　１３悌ホスフアチジル酸（ＰＡ）８憾 他の脂質　　　　　　　　　　　　　４係低品位の大豆
レシチン（大豆の精製されていないリン脂質）　（ｓｏ
ｙａ　ｒａｗ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｅ）は、５チまで
のリソホスファチジルコリンヲ含む。

ホスファチジルコリンを豊富に含む画分の調製について
様々な方法があることが知られている。例えば大豆の精
製されていないリン脂質をアセトンによって脱油するこ
とによって（米国特許第５，２６８，３３５号）、極性
脂質（純粋なレシチン）の混合物が得られる。また大豆
の精製されていないリン脂質のアルコール抽出によって
（西独国特許第１，４９２，９５２号）、ホスファチジ
ルコリンを多く含む極性脂質の混合物を含有する油が得
られる。

最近では、新規の極性脂質回収方法が例えばＤＥ−Ｏ８
３，Ｏｉ　１１８５号のような文献に記載されており、
それによると大豆の精製されていないリン脂質を超臨界
ＣＯ２による抽出によって脱油しまたは、欧州特許出願
第００４９９１４号に記載されているよ５に、限界濾過
によって、ヘキサン／２−プロパノール（７５／２５　
）中リン脂質の溶液からホスファチジルコリンを多く含
む画分が得られる。大豆の精製されていな（・リン脂質
のようなリン脂質混合物を含む油を、この方法において
使用する場合は、アセトンによる脱油または勾配溶剤法
のいずれかの操作が必要とされる。

他のリン脂質を含有しないホスファチジルコリンの回収
は、リン脂質をクロマトグラフィによって分離すること
によって実施される。この場合吸着剤と溶離剤の組み合
わせは、重要な決め手となる。

天然の大豆の精製されていないリン脂質を出発材料とす
る場合には、多段階方法において、エタノールを溶離剤
としアルミナ上でクロマトグラフィを行なうことによっ
て、３〜４チのリソホスファチジルコリンを含有する純
粋なホスファチジルコリンが得られる（米国特許第３，
０３１，４７８号）。アルミナは再生不可能で廃棄処分
をしなければならないため、アルミナをホス７アチジル
エタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホス
ファチジル酸および糖脂質のようなリン脂質とともに充
填される。

リン脂質の分類における吸着剤としてはしばしばシリカ
ゲルが用いられる。ドイツ特許公開明細置薬２，９１５
，６１４号には、石油エーテルを溶剤とするシリカゲル
上でのクロマトグラフィによって、大豆の精製されてい
ないリン脂質より油およびステアリンを分離して純粋な
レシチンを回収する方法が開示されている。この方法に
よるとシリカゲル上に油およびステアリンが残留してい
るので、第２分画において極性を有する溶剤による溶離
をしなければならない。リン脂質は、室温においてシリ
カゲルによるアルコ゛へ。

一ル溶媒より保持される（エイチリヒタ−（Ｈ，Ｒｌｃ
ｈ−□ｔｅｒ）等によるｒＰｈａｒｍａｚｉｅ　Ｊ　３
２．１６４、（１９７７））。

リン脂質の分離または選択的な脱着は、アルコール／ア
ンモニア（特開昭４９−９３４００号）またはクロロホ
ルム／メタノール若しくはクロロホルム／メタノール／
水の混合物のいずれかを用いることによって実施される
。第１に、クロロホルム／メタノールおよびクロロホル
ム／メタノール／水の各勾配溶出用の溶剤を用いるシリ
カゲル上のクロマトグラフィを行なうことによって、リ
ンホスファチジルコリンを含まないホスファチジルコリ
ンを回収することは可能である。勾配溶出法を行った場
合には、最終生成物から溶剤混合物（部分的に共沸混合
物を含有）を回収および除去するのに極めて複雑な操作
を要する。

ドイツ特許公開明細置薬４ｏ４７．ｏ４８号に開示され
ているリン脂質のアルコール溶液から高温におけるシリ
カゲル上のカラムクロマトグラフィによってホスファチ
ジルコリンを単離する方法は、以下の２段階よりなる。

１、大豆の精製されていないリン脂質からの抽出ホスフ
ァチジルコリン収率：約６０％ ２、カラムクロマトグラフィによる精製ホスファチジル
コリン収率：約７６％ 両段階を通じてのホスファチジルコリンの全収率は大豆
の精製されていないリン脂質に対する理論値に対して約
４４％である。

この効率は、満足できる値とは言えない。さらに、ホス
ファチジルコリンは痕跡量のホスファチジルエタノール
アミンおよびリンホスファチジルコリンを含有する。リ
ンホスファチジルコリンは、その方法の性質のため分離
することが不可能であるので、出発材料としては、リン
ホスファチジルコリンを０．５％以下しか含有しない最
高級の大豆の精製されていないリン脂質のみが使用可能
である。

大豆の精製されていないリン脂質から他のリン脂質を含
まないホス７７チジルコリンヲ単離するための上記した
全ての方法は、下記の欠点のうち１つまたはそれ以上を
有するものである。

即ち多段階操作であること、ホスファチジルコリンの収
率が低いこと、部分的に勾配溶出法を用いるカラムクロ
マトグラフィによる分離においては再生不可能な溶剤混
合物を用いること、毒性溶媒を用いること、リソホスフ
ァチジルコリンによって出発材料を選択する必要がある
こと、再生不可能な吸着剤を用いること、最終生成物中
にホスファチジルエタノールアミンおよびリソホス７ア
テジルコリンのような他のリン脂質が存在することおよ
びホスファチジルコリンの含有量が低い点があげられる
。

これらの欠点があるため調製に必要なコストが必然的に
高くつき、他のリン脂質を含まない所望のホス７アチジ
ルコリンが得られないという結果となる。

そこで本発明の目的は、他のリン脂質、特にリソホス７
アチジルコリンを含まないホスファチジルコリンを、精
製されていないリン脂質（大豆、ナタネ、ヒマワリ）か
ら単離するための簡単な方法を提供する点にある。

１段階操作において、特定の溶剤を用い特定の条件下に
おいて溶出液の特定のフラクションのみを採集するとい
うシリカゲルクロマトグラフィを行な５ことによって、
精製されていないリン脂質溶液から他のリン脂質を含ま
ないホス７アチジルコリンを得ることができるという発
見は、驚きに値いするものである。

本発明による方法は、低沸点石油エーテル留点（４０ｒ
乃至８０℃）、０１〜Ｃ４の低級アルカノールおよび水
からなる溶剤混合物中に精製されていないリン脂質を溶
解させ、その溶液をシリカゲルを充填したカラムに注入
し、前記温度において同一の溶剤混合物を用いて溶離を
行ない、溶出液のうち、主流出液を採集し、溶離材料を
常法により単離すると出発材料中のリン脂質混合中に存
在していた他のリン脂質のような付随的リン脂質を含ま
ないホスファチジルコリンが得られた。１容積部の石油
エーテル（６５℃乃至７５℃）、１容積部のプ・ロバノ
ール−２および０．１７５体積部の水よりなる溶剤混合
物を使用することが望ましい。

出発材料の大豆リン脂質内に含まれている他の脂質は初
期溶出液および終期溶出液中で分離される。１段階操作
において、主流出液中の多種の化合物を含む混合物から
痕跡量の糖脂質のみを不純物として含有する純粋なホス
７アチジルコリンを単離することが可能であることに篤
くべぎことである。

糖脂質は、それ自体周知の方法、例えばホス７７チジル
コリンをエタノールに溶解させる（糖脂質はエタノール
に不溶性であるので）ことによって除去することができ
る。このようにして、他の物質、特にリソホスファチジ
ルコリンを含まない高純度ホスファチジルコリンが得ら
れる。

たとえば、大豆の精製されていないリン脂質より純粋な
ホス７アチジルコリン標準物質と高純度のホスファチジ
ルコリン標準物質が得られ、その収率は大豆の精製され
ていないリン脂質に対して、各々理論値の８８％および
８６チでありこの収率４今までに達成不可能であった値
である。

操作が簡単であることに加えて、本発明は低品位のＭ’
Ａされていないリン脂質も使用可能であることに利点が
ある。この方法は、リソホスファチジルコリンを不純物
として含む低品位の精製されていないリン脂質より周知
の方法によって調製されたホスファチジルコリンにも応
用できる。

シリカケ゛ルとしては、様々の粒子寸法を有するクロマ
トグラフィ用の普通の製品または活性化若しくは不活化
され得る圧縮型シリカゲルを用いることができる。

本発明による方法は、常圧または大気圧より高い圧力下
で、それらの圧力に対して許容しうる温度、好適には２
０℃乃至５０℃において実施することができる。

本発明による方法の第１の利点は、クロマトグラフィ終
了後席にシリカゲルを再使用できる点にある。全ての不
純物は、初期流出液および終期流出液の各々に含まれる
。カラムを再充填した場合には、その中に含まれる不純
物が次に続く初期流出液とともに溶離されるので終期流
出液の採集は省略することができる。

第２の利点扛、容易に再蒸留され得る溶剤混合物を使用
できる点にある。

さらに従来の方法と比較すると、一段階の操作よりなる
新規な方法は経済的であるという利点がある。例えば、
大豆ホスファチジルコリンが、大豆の精製されていない
リン脂質より収率８８チで回収される。カラムクロマト
グラフィによる分離法においては、シリカゲル２０Ｏｆ
上で大豆の精製されていないリン脂質１１ｏｆを分離す
る際に必要な全溶離剤はわずか４．４ｔである・本方法
はカラムクロマトグラフィでの一般的な精製よりもむし
ろ濾過の性質を有１−ている。

以下、実施例により本発明の詳細な説明するが、これに
限定されるものではない。

（実施例） 分析 リン脂質を薄層クロマトグラフィによって分析した。油
含有量は、透析可能な物質と等しいと考慮した。水分含
有量は、カールフィッシャ（Ｋａｒｌ　Ｆｉｓｃｈｅｒ
）法によって測定し、残留溶媒の含有量はガスクロマト
グラフィで測定した。

溶剤および溶離混合物 １容積部の石油エーテル（６５℃乃至７３℃）、１容積
部のプロパノ−ルー２および０．１７５容積部の水より
なる混合物を使用した。

カラムクロマトグラフィー 二重ジャケット式クロマトグラフィカラム（内径４．５
副長さ３７　ｃｍ　）を使用した。熱交換器をカラムの
前部に設けた。上記した溶剤混合物中のシリカゲル（Ｗ
ｏｅ１ｍ社製）２００Ｆのスラリーをカラムに充填した
。なおりロマトグラフイ、終了後にもシリカゲルは再利
用することができる。

出発材料 下記の成分を有する精製されていないリン脂質を使用し
た。

ホスファチジルコリン（ＰＣ）　　　　１６％　　１８
％　　　２２％ホスファチジルエタノールアミン（ｐ幻
　１７％　　　１１　　１３％リソホスファチジルコリ
ｙ（ＬｐＣ）　　　　２．５１　　２．６％　　　１．
０％ホスファチジルイノシトール（Ｐ工）　　　　９％
　　１２％　　　ｊ３％Ｎ−アシル−ホスファチジルエ
タノ−２％　　　　１％　　　　１％ルアミン（Ｎ−ア
シル−ｐｇ） ホスファチジル酸（ＦＡ）　　　　　　　８チ　　　７
チ　　　５チ油　　　　　　　　　　　　　　　　　３
５チ　　３６チ　　３０％残り：他の脂質 実施例　１ 上記した溶剤混合物中（１６％ＰＣおよび２．５％ＬＰ
Ｇを含む〕大豆の精製されていないリン脂質１１０２の
浴液４５０−をシリカゲル（２００？）を充填したクロ
マトグラフィカラムへ注入し、同じ溶剤混合物によって
室温において溶離した。全溶離液を３つのフラクション
に分けた。フラクションを蒸発させ残留物を分析した。

第１フラクション：０乃至１，６を残留物：８９５２中
性脂質、糖脂質ならびにＰＫ％Ｎ−アシル−ＰＲ，ＦＡ
およびＰＩおよび痕跡量のＰＣのようなリン脂質を含ん
でいた。

第２フラクション１．８乃至４．４を残留物：１８２（
純粋なホスファチジルコリン） ＰＣ含有量二８６％ 油含有量：［Ｌ５チ 薄層クロマト７グラフイの試鹸によって、ＰＣ以外には
不純物として糖脂質のみが検出された。

ＰＣ効率：大豆の精製されていないリン脂質に対する理
論値の８８係 第３フラクション４．４を乃至５、Ｏ２残留物：２９　
ＰＣｌＬＰＣおよび痕跡量の糖脂質を含んでいた。

シリカゲル上に少量のＰＣ残存物が残っていた。

８６チのホスファチジルコリンを含む第２フラクシヨン
１８１を１時間室温において９５％エタノール中２００
−とともに攪拌した。非溶性の糖脂質を濾過助剤として
のアルミナ１Ｆを介して濾過した。Ｆ液を蒸発させ残留
物を分析した。

残留物：　　１５．８Ｆ（高純度のホスファチジルコリ
ン）ＰＣＣ含有量　　９６％ 水：１，６チ 油＝０．５％ エタノール二０．８係 ＰＣ効率：天然の大豆脂質に対する理論値の８６チ純度
（ＤＣ）：他の不純物は検出されなかった。

実施例　２ 実施例１と同じ方法によってカラム温度５０℃において
試験を行なった。同様のフラクション分画を同じ全溶離
液体積で行なった。第２フラクシヨンは、８７％ＰＣ（
純粋なホスファチジルコリン）を含有する固体１６．！
Ｍを含んでいた。

薄層クロマトグラフィによる純度は、実施例１による生
成物の純度と同じであった。

実施例　３ （ドイツ特許公開明細置薬３．０４７．０４８号に開示
された方法による比較例〕 （１６，５％ＰＣおよび２，５俤り、ＰＣを含有する）
大豆の精製されていないリン脂質を５分間７５℃におい
て９６％エタノール１０３２ｍ／で攪拌した。

沈殿物を室温において分離し、上方のエタノール相を蒸
発させた。

残留物：　　　１１０ｆ ＰＣ含有量：　３０チ ＰＣ効率二　　大豆の精製されていないリン脂質に対す
る理論値の６０ チ 残留物１１０ｔを９６％エタノール３５０ｍ１中に溶解
させ、ドイツ特許公開明細置薬３，０４４０４８号に記
載の方法（実施例１）に従って、７０℃の温度において
９６％エタノールを溶離剤とするカラムクロマトグラフ
ィにより分離した。主流出液を蒸発させ残留物を分析し
た。

残留物：　　　　２Ｚ７り ｐｃ含有量°　　　　　８７係 ＬＰＣ含有量：　　　　５％ ＰＣ効率：　　　　　７３％ １３７％　ＰＣと５　Ｓ　ＬＰＣとともにホスファチジ
ルコリンを含有する主流出液より得られた残留物６゜２
を１容積部の石油エーテル（６５℃乃至７３℃）と１容
積部のプロパノ−ルー２と［Ｌ１７５容積部の水とから
なる混合物１５〇−中に溶解させ、シリカゲル（２００
Ｆ）を充填したクロマトグラフィカラムに注入し、同じ
溶剤混合物によって室温で溶離した。初期流出液４００
−を得た後に主流出７夜五５Ｌを採集した。

主流出物を蒸発させ、残留物を分析した。

残留物：　２２ｔ ＰＣ含有量：　　９５％ 油含有量：　　くα５俤 ＬＰＣ含有量：　く１２係（測定限界）ＰＣ効率：　出
発材料に対する理論値の８０％水：　　　１゜５チ 実施例　４ 上記した溶剤混合物中２２％ＰＣおよび１．０％ＬＰＧ
を含むヒマワリの精製されでいないリン脂質１２５２の
溶液５００ゴをシリカゲル＜２００９）を充填したクロ
マトグラフィカラムへ注入し、同じ溶剤混合物とともに
室温において溶離した。

全溶出液を２つのフラクションに分けた。フラクション
を蒸発させ残留物を分析した。

第１フラクション０乃至１．Ｏ６残留物＝９７２中性脂
質、糖脂質ならびにＰＫ％Ｎ−アシル−ＰＥ、ＦＡ、　
ＰＩおよび痕跡量のＰＣのようなリン脂質を含有してい
た。

第２フラクション１．０乃至４．Ｏｔ残留物：２６１Ｐ
Ｃ含有量：８７％ 油含有量：Ｑ、７チ 薄層クロマトグラフィ試験によって、ＰＣ以外には不純
物として糖脂質のみが検出された。

ＰＣ効率：天然のヒマシ１７１７ン脂質に対する理論値
の８３チ シリカゲルに少量のＰＣのみが残存していた。

８７％ホスファチジルコリンを含有する第２　　　　　
”′・フラクション２６１を室温において１時間の間９
５％エタノール２［１０ｗｔとともに攪拌した。不溶性
の糖脂質を濾過助剤としてのアルミナ１２を介して濾過
した。Ｆ液を蒸発させて残留物を分析した。

残留物：　　　２！Ｌ２ｆＣ高純度のホスファチジルコ
リン）ＰＣ含有量：　　　９７％ 油含有量二〇、７％ 乾燥損失：１．５チ ＰＣ効率：　　　天然のヒマシ１７　リン脂質に対する
理論値の８２％ 純度（ＤＣ）：　　他の不純物は検出されなかった。

実施例　５ 上記した溶剤混合物中ナタネの精製されていないリン脂
質（１８％ＰＣ，２，６俤ＬＰＣ）　１６０　ｆの溶液
５００−を実施例４に記載の方法によって処理した。

残留物：　　　２０．７Ｆ（高純度のホスファチジルコ
リン）ＰＣ含有量：　　９６％ 油含有蓋：　　１．３０優 乾燥損失：　　２．０％ ＰＣ効率：　ナタネの精製されていないリン脂質に対す
る理論値の６９％ 純度（ＤＣ）：他の不純物が検出されなかった。

ベシュレンクテル・ハフソング 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）植物性脂質混合物を、低沸点石油エーテル留分（４
   ０℃乃至８０℃）、Ｃ＿１〜Ｃ＿４の低級アルカノール
   および水からなる溶剤混合物に溶解し、その溶液をシリ
   カゲルを充填したカラムへ２０℃乃至５０℃の範囲内の
   温度において注入し、この温度において同一の溶剤混合
   物を用いて溶離を行ない、主流出液を採集し、その中よ
   り出発材料の植物性脂質混合物中に存在する他のリン脂
   質を含まない純粋なホスファチジルコリンを常法によつ
   て単離することを特徴とする植物性脂質混合物からホス
   ファチジルコリンを単離する方法。 ２）１容積部の石油エーテル留分（６５℃乃至７３℃）
   、１容積部の２−プロパノールおよび０．１７５容積部
   の水からなる溶剤混合物を使用することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３）脂質混合物が、精製されていないリン脂質（精製さ
   れていないレシチン）中に存在する極性および非極性の
   植物性脂質からなることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項または第２項に記載の方法。 ４）脂質混合物が、ホスファチジルコリンを含有するリ
   ン脂質よりなることを特徴とする特許請求の範囲第３項
   に記載の方法。