MXPA01006207A - Un suplemento alimenticio para animales comprendiendo composiciones especificas de fosfolipidos. - Google Patents

Abstract

Una mezcla de suplemento alimenticio para animales que incluye una mezcla de fosfolipidos teniendo una proporcion especifica de componentes como se define a continuacion: Fosfatidilcolina 18 ? 1; Fosfatidiietanolamina 14 ?1; Lisofosfatidilcolina 4 ? 1; Lisofosfatidiletanolamina 1 ? 1; Lisofosfatidilinositol 2 ? 1. la mezcla de fosfolipidos provee un alimento para animales mejorado el cual tiene efectos beneficos en el comportamiento funcional de los animales.

Description

UN SUPLEMENTO ALIMENTICIO PARA ANIMALES COMPRENDIENDO COMPOSICIONES ESPECIFICAS DE FQSFOUPIDOS DESCRIPCIÓN Esta invención se refiere a composiciones específicas de fosfoiípidos para proveer un alimento mejorado para -animales, particularmente composiciones preparadas de extractos de frijol de soya.

Lecítinas de frijol de soya particulares pueden ser incorporadas en los alimentos para animales con efectos benéficos en el desarrollo de animales, especialmente en la tasas de crecimiento. La lecitina de frijol de soya es rutinariamente utilizada como aditivo para animales, típicamente en montos variando de 0.1 a 3% y es un emulsíficador permitido para éste uso de acuerdo con las Regulaciones de la Comunidad Europea. Los beneficios proveídos por la lecitina incorporada en el alimento de animales incluyen mejor digestión de grasas y transporte de los lípidos fuera del hígado. La lecitina también provee una buena fuente de choline. Esto es frecuentemente incluido en los compuestos alimenticios para animales, reemplazos de leche y dietas acuáticas.

La lecitina cruda contiene una variedad de fosfoiípidos y glicoiípidos (glycolípids) así como pequeños montos de ácido fosfático y lípidos neutrales. Los fosfoiípidos más abundantes son phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) y phosphatidylinositol (PI). Phospholipases y lipasas producida naturalmente por ciertas cadenas de bacterias, hongos y otros organismos, o enzimas extraídas del páncreas de los animales, pueden ser usadas para lograr una conversión de fosfoiípidos a su deacylated derivados conocidos como lysolecithynes, tales como lysophosphatidycholine (LPC), lysophosphatidylethanolamine (LPE) y lysophosphatidylinositol (LPI). Estas lysolecithynes tienen un impacto benéfico en el crecimiento de los animales cuando se comparan con lecítinas (Schwarszer K and Adams C, Lipids 98

[1996] y Patente UK número 22667033).

Ha sido bien conocido por algún tiempo que diferentes mezclas de lípidos pueden tener efectos importantes y ampliamente diferentes en membranas biológicas. Por ejemplo, la mezcla activa de lípidos AL721 es sintéticamente preparada . desde glicéridos neutrales, phosphatidylcholine y phosphatidyiethanolamine erula proporción de 7:2:1 y ha sido usada para inhibir adherencia de virus a la superficie de los sitios receptores de las células (Effects of Novel Compound (AL721) on HTLV-II Infectivity in vitro. Sarin P; Gallo R; Scheer D; Crews F; and Lippa A. New England Jorunal of Medicine 313

[1985] No. 20 1289-1290). Esta proporción precisa de lípidos parece que hace permeable a la membrana y es asociada con una disminución de colesterol ligado a la membrana (A Special Lipid Mixture for Membrane Fluidisation; Lyte M and Shinitzky M. Biochem Biophys Acta 812

[1985] 133-138). Es un objeto de la presente invención el proveer nuevas composiciones para producir un alimento mejorado para animales el cual tiene efectos benéficos en el desarrollo del animal, especialmente tasas de crecimiento. Un objeto adicional de la presente invención es el proveer nuevas composiciones que pueden ser producidas de lecitina cruda, proveyendo por tanto composiciones las cuales son más baratas de producir y pueden ser manufacturadas en volumen.

Consecuentemente, un primer aspecto de la presente invención provee un suplemento alimenticio para animales comprendiendo una composición fosfolípida teniendo los siguientes componentes en las proporciones dadas Phosphatidylcholine 18 Phosphatidyiethanolamine 14 ? Lysophosphatidylcholine 4 Lysophosphatidylethanolamine 1 ? Lysophosphatidylinositol 2 ? Preferentemente/ la proporción de componentes en la composición es como se indica a continuación: P osphatidylcholine 18 Phosphatidylethanóíamine 14 Lysophosphatidylcholine 4 Lysophosphatidylethanolamine 1 Lysophosphatidylinositol 2 La composición puede incluir fosfolípidos adicionales, tales como phosphatidylinistol (PI), acylphosphatidylethanolamine (APE), inositol (PI), diphosphatidyl, glycerol (DPG), ácido fosfático (PA) y ácido lysophosphatic (LPA).

Una composición preferida de la presente invención tiene la siguiente fórmula empírica: Fosfolípido Peso % PC 9.69 PI 7.90 LPC 1.90 . PE 6.88 APE 1.42 DPG 0.38 LPE 0.91 PG 0.00 PA 4.47 LPI 1.20 PS 0.00 LPA 0.56 SPH 0.00 Otros 0.00 La composición es preferentemente proveída en un alimento para animales tal como un concentrado con un portador, tal como silica tale, preferentemente siendo incluido en un monto de 10-40% por peso, mayormente preferido 25%. Alternativamente, la composición puede ser proveída en solución. La presente invención será ahora adicionalmente ilustrada por medio de los siguientes ejemplos en donde el Ejemplo 1 se refiere a una investigación into the uptake of the dye 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazoliumbromide (MTV) by a monolayer of Vero (riñon de mono) células usando células tratadas con una composición de la presente invención y células tratadas con lecitina estándar, el Ejemplo 2 se refiere a un experimento in vibro para investigar la permeabilidad de las membranas de plasma celular utilizando células las cuales han sido tratadas con una composición de la presente invención y células las cuales han sido tratadas con lecitina estándar por medio de tratamiento en las respectivas células con un medio conteniendo ácidos grasos (fatty acids) radioactivos y el Ejemplo 3 se refiere a un experimento in vibro para determinar el incremento en peso diario en cerdos alimentados con un suplemento alimenticio conteniendo una composición de la presente invención o lecitina estándar, y con referencia a los dibujos que se acompañan en donde: La Figura 1 ilustra respectivamente el Espectro para Lecitina y para lecitina modificada de acuerdo con la presente invención, utilizando espectroscopio magnético de resonanda nudear de fosforo (phosphorus nudear magnetic resonance spectroscopy); y La Figura 2 es una gráfica ilustrando los efectos in vitro de lecitina y lecitina modificada de acuerdo con la presente invención. - La presente invención describe un angosto alcance de los promedios de la fórmula empírica de las lecitinas potentes más biológicas y su uso en las formulaciones de alimento para animal. Ejemplo 1 Se midió el promedio de salida de las células de into the uptake of the dye 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyltetrazoliumbromide (MTT) by a monolayer of Vero (riñon de mono). MTT es una sal de tetrasodio? (tetrazolium) la cual resultando una solución amarilla en agua. Cuando el MTT es tomado por una célula viva, enzimas de dehydrogenase se adhieren al anillo de tetrazolium formando una agua insoluble, púrpura, formazan con la célula. Este formazan es solubilizado en ácido isopropanol y su absorbencia es medido espectrofotométricamente (spectrophotometrically). El número de absorbencia provee una indicación de la tasa de absorbencia celular, por ejemplo, para determinar si la proporción alterada de fosfolípídos de la presente invendón incrementa las tasas de absorción celular, indicada por más MTT siendo absorbido y metabolizado. Método Quince receptáculos de 6-Well Linbros Plates fueron sembrados con células Vero desde un cultivo de tres días e incubados por la noche bajo condidones estándar en lml Dulbeccos Modified Eagles Media (DMEM) + 10% foetal calf serum para proveer células estándar de una sola capa. Las dos proporciones de fosfolípidos, mostrados más adelante en la Tabla 2, nombradas Proporción de lecitina y proporción de lecitina Modificada fueron suspendidos en la Solución Balanceada de Sal Hanfes (HBSS)(Hanks Balanced SALT Solutjon + 4% de etanol resultando en un contenido total de fosfolípidos de 3.9 mg mi'1. La proporción de Lecitina es la que se encuentra en lecitina de frijol de soya sin modificar, la proporción de lecitina Modificada es aquella acorde con la presente invención la cual puede ser obtenida por varias técnicas tal como mezclar conjuntamente los componeotes puros sintéticamente derivados ó por enzimas actuando en la lecitina cruda.

Tabla 2.

Receptáculos triplicados de células Vero de una sola capa fueron entonces tratados con dosis de las dos proporciones, mostradas en la tabla 2, durante 90 minutos conjuntamente con control negativo. Esto resultó en una concentración por receptáculo de 0.78 ó 0.39 mg mi'1 total de fosfolípidos. 100 µ? de una solución de 5 mg mi'1 de MTT entonces fe añadida a cada receptáculo e incubada por 30 minutos. Las células de una sola capa fueron entonces lavadas dos veces con HBSS y cualquier medio fue removido de los receptáculos, lml de acidifíed isopropanol entonces fue añadido a cada receptáculo y los platos fueron entonces girados hasta que la coloración púrpura fue disuelta. Esta solución fue entonces removida y medida espectrofotométricamente (spectrophotometrically) en 57nm, con una lectura de entorno de 660nm.

Tabla 3.

Las lecturas de absorbencia final fueron obtenidas restando Abs660nm de Abs570nm y calculando el promedio de absorbencia de los receptáculos triplicados. Las figuras calculadas se muestran en la siguiente Tabla 4.

Muestra Promedio de Absorbencia Lecitina 1 0.14933 Lecitina 2 0.16266 Lecitina Modificada 1 0.155 Lecitina Modificada 2 0.1683 Comparando las dosis de 250 µ? de lecitina y los Promedios de la lecitina modificada de los fosfolípidos existe un incremento de 3.7% en el nivel de MTT metabolízado en las células tratadas con el promedio de lecítina modificada sobre las vistas en el promedio de Lecítina en las células tratadas. Un aumento similar del 3.5% en las células de lecítina Modificada es visto con las dosis de 125 µ?. El valor del control negativo muestra que las células no son adversamente afectadas por el proceso de tratamiento. Un efecto adicional mayor podría ser visto si la dispersión de los fosfolípidos en el promedio pudiera ser mejorado, como cantidades de fosfolípidos fueron observados en la superficie del promedio durante la prueba. Esto sugiere que la cantidad de fosfolípidos actuando en las células en ésta prueba es muy por debajo del máximo con el que se comenzó de 0.78 mg mi'1 Consecuentemente el promedio de diferentes especies de fosfolípidos en la lecítina Modificada de acuerdo con la presente invención tiene el efecto de aumentar la absorción celular sobre lo que se ve en la Lecítina. Ejemplo 2 Una simple prueba in vitro fue efectuada para examinar las propiedades biológicas del producto tratado con enzimas comparada con la lecítina sustraída (substrate lecithin). El producto tratado con enzimas tiene una composición similar a la composición sintetizada utilizada en el Ejemplo 1. la permeabilidad de la membrana de plasma de la célula a los ácidos fáticos (fatty acids) fue medida por células tratadas con mezclas de lecítina en promedio que contenían ácidos fáticos (fatty acids) radiactivos. Se usaron tanto ácidos marcados C 4 stearic y palmític.

Método Células clonadas BHK fueron cultivadas en la forma normal utilizando G-MEM media suplementada con 10% FBS, 10ml/L de 200mM L-Glutamine, 5% TSB y 10 ml/L de solución anti-biotic/antimycotic. Todos los reactivos fueron suministrados por Sigma Chemiclas, Dorset. La línea celular fue obtenida de la Colección de Cultivos de Células Animales Europea (European Collection of Animal Ceil Cultures) en el Centro para Microbiología Aplicada e Investigación en Portón Town (Centre for Applied Microbiology and Research).

Las células fueron cultivadas en matraces de 25 cm2 y todos los experimentos fueron desarrollados por triplicado. Las células en los receptáculos fueron expuestas a lpCi de ácido stearic y palmitic C14 preparado en Solución Balanceada de SALT de Hanks (Hanks' Balanced Salt Solution) dé un stock 75 Ci stock solution. Ellas fueron co - expuestas a concentraciones variadas bien sea de lecitina o enzimas tratadas con lecitina. Estas fueron preparadas utilizando una mezcladora Ultra-Turrex para hacer 1% de emulsiones acuosas. Los cultivos fueron dejados por una hora y después el medio fue removido por aspiración. Las células adheridas después fueron bañadas dos veces en la solución de hanks y fueron typsinised utilizando solución typsin-EDTA. Ellas entonces fueron hechas bolita (pelleted) por centrífuga a 1000 rpm durante 5 minutos en tubos Eppendorf pesados previamente (preweighted Eppendorf tubes). La célula empildorada (pelleted) entonces fue disueita (lysed) utilizando agua destilada y un disruptor ultrasónico y fue dejado toda la noche. Los Eppendorfs fueron entonces fueron girados de nuevo y 100 µ? alícuotas de agua fueron removidas para análisis en un contador de centelleo. Se utilizo sigmaflour como líquido centellante. Los resultado fueron convertidos en DPM per mg cell solids después de que los Eppendorfs fueron pesados nuevamente después que se pesaron. La Figura 2 de los dibujos que se acompañan muestran el promdio de los tres resultados para cada experimento, en donde WA" es ácido lecithin-stearic, WB" es enzima tratada con ácido lecithin-stearic, "C" es ácido lecithin-palmitic y "D" es enzima tratada con ácido lecithin-palmitic, revelando que la enzima de lecitina modificada tiene una mejora similar en la actividad de la mezcla "sintética" utilizada en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3 Seis grupos de cerdos fueron crecidos en corrales conteniendo 35 cerdos en cada uno. Se utilizó una dieta de engorda y alimento tipo "486" (BOCM - Pauls Ltd. England) el cual contenía o lecitina o la lecitina modificada de la presente invención incluida en un nivel de 250g por tonelada de alimento animal. Los dos tipos de lecitina fueron introducidos al alimento durante la producción como 25% concentrado en el silica tale carríer. El resumen de los resultados se muestra en la Tabla 5 siguiente. Tabla 5 Estos resultados se traducen en un incremento en una ganancia en el peso en el grupo alimentado con la lecitína modificada del +6.1%. La lecitína modificada de la presente invención tiene propiedades biológicas inusuales en el material sustraído o componentes individuales. Las composiciones específicas como se define en la presente son recomendadas para la mejoría de las tasas de crecimiento del ganado. Ejemplo 1 utilizado en la composición reivindicada formada al sumar juntos componentes puros sintéticamente derivados en donde en los Ejemplos 2 y 3 las lecitinas utilizadas han sido modificadas por enzimas disponibles en el arte para producir la composición reivindicada. La fórmula empírica precisa de la composición preferida de la presente invención se da en la siguiente Tabla 6.

Tabla 6 Fosfolípidos Integral Peso Molecular Mol% Peso % El aumento en la cantidad de lysophosphatidylcholine, lysophosphatidylethanolamine y lysophosphatidylinositol en promedios especificados mejora el valor de la lecitina como alimento como suplemento alimenticio al incrementar el promedio de la absorción celular en el intestino (gut).

Se postula que la actividad en la membrana resulta en cambios en la fluides de la membrana que facilita flujo pasivo (passive flux) de nutrientes hacia la célula. La composición del arte previo AL721 tenía la intención de efectuar la fluides de las membranas celulares al modificar el nivel de coiesterol en la membrana y por tanto la dinámica de la membrana (Intervention in Aging the Development and Application of Active lipid. Shinitzicy, M; Lyte, M. Heron, D. and Samuel, D. Basic Research & Pre-clinical Screening

[1983] Y 175-186). Aun cuando esto puede ser un mode de ación de la mezcla modificada de la lecitina de la presente invención se piensa que un modo más importante de acción es la substitución de la mezcla hacia la membrana por tanto directamente incrementando la motility de los fosfolípidos dentro de la matriz (matrix). Esto puede ser debido ai menor espacio ocupado por los grupos de cola de groups of the mono-acyl moieties y a la turbulencia concurrente de las cadenas que normalmente sirven para reforzar la matriz. Los tractos digestivos de los mamíferos y peces son compuestos de superficies comprendiendo tejidos llenos (perfused) de sangre para los propósitios de absorción de nutrientes y éstos tejidos son hechos de células individuales las cuales tienen membranas de plasma las cuales pueden ser afectadas por éstas lecitinas modificadas. Consecuentemente cuando las dietas contienen pequeños montos de lecitina modificada son alimentadas a los animales en experimentos el alimento es mejor absorbido en la corriente sanguínea desde el sistema digestivo y los resultados de la prueba de campo soportan ésta hipótesis mecánica (mechanistic hipótesis).

Claims (4)

Habiendo descrito la invención como antecede, considero como nueva y reclamo como propio el contenido en las siguientes. RÍE-VINDICACIONES

1. Un suplemento de alimento para animales comprendiendo una composición fosfolípida teniendo los siguientes componentes en las proporciones dadas: Phosphatidylcholine 18 ? Phosphatidylethanolamine 14 ? Lysophosphatidyicholine 4 ? Lysophosphatidyiethanolamine 1 ? Lysophosphatidylinositol 2 ?

2. Un suplemento de alimento para animales como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la proporción de los componentes es: Phosphatidylcholine 18 Phosphatidylethanolamine 14 Lysophosphatidyicholine 4 Lysophosphatidyiethanolamine 1 Lysophosphatidylinositol 2

3. Un suplemento de alimento para animales como se reivindica en la reivindicación 1 ó en la reivindicación 2 comprendiendo además fosfolípídos adicionales seleccionados del grupo consistente de phosphatidylinositol, diphosphatidyl glycerol, ácido fosfático, ácido lysophosphatidic y acylphosphatidylethanolamine.

4. Un suplemento de alimento para animales como se reivindica en la reivindicación 3 en donde la composición fosfolípida tiene la fórmula empírica siguiente: Fosolípido Peso % PC 9.69 PI 7.90 LPC 1.90 PE - 6.88 -APE- 1.42 DPG - 0.38 LPE ' 0.91 ' 0:00 PA 4.47. LPI^ 1.20 -PS 0.00 - LPA- 0.56 - SPH 0.00 Otros 0.00