CN110799176A - 治疗肺部疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了通过肺部施用包含紫杉烷颗粒(例如多西他赛或紫杉醇颗粒)的组合物来治疗包括肺肿瘤在内的肺部疾病的组合物和方法。

Description

治疗肺部疾病的方法

交叉引用

本申请要求2017年6月14日提交的62/519257、2018年2月9日提交的62/628582、2018年4月6日提交的62/653942、2018年5月31日提交的62/678387的美国临时专利申请的优先权，将其每个以全文引入本文作为参考。

背景技术

肺癌是第二大最常见的癌症，也是最致命的癌症之一。常规疗法，例如手术切除、放疗和化学疗法，并未获得令人满意的长期存活率。即使是高剂量的全身性药物递送，也只能导致少量的紫杉烷类药物到达肺部肿瘤。因此需要用于治疗肺部肿瘤的改进方法。

发明内容

一方面，本发明提供了用于治疗肺部疾病例如肺部肿瘤或肺纤维化的方法，其包括向患有肺部疾病的受试者通过肺部施用(pulmonary administration)有效量的包含紫杉烷颗粒的组合物来治疗所述肺部疾病，其中紫杉烷颗粒包含至少95％的紫杉烷，并且具有0.1μm至5μm的平均粒径(数字)。在一个实施方案中，肺部施用可包括雾化，其中雾化导致紫杉烷颗粒或其悬浮液的气雾液滴向受试者的肺部递送。在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒可以具有0.4μm至2μm的平均粒径(数字)。在进一步的实施方案中，紫杉烷颗粒的平均粒度(数字)可以为约0.4μm至约1.2μm，或约0.6μm至约1.0μm。

在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒可以具有至少10m²/g、或至少12m²/g、14m²/g、16m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、32m²/g、34m²/g、或35m²/g的比表面积(SSA)，或其中紫杉烷颗粒具有约10m²/g至约60m²/g的SSA。在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒可以存在于悬浮液中，其中该悬浮液包含：

(a)紫杉烷颗粒；

(b)药学上可接受的载体，和

(c)聚山梨酸酯，其中所述聚山梨酸酯以以0.01％v/v至约1.5％v/v、或以0.01％v/v至约1％v/v、约0.01％v/v至约0.5％v/v、约0.01％v/v至约0.4％v/v、约0.01％v/v至约0.25％v/v、约0.05％v/v至约0.5％v/v、约0.05％v/v至约0.25％v/v、约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.1％v/v至约0.25％v/v、约0.1％v/v、约0.16v/v、或约0.25％v/v的浓度存在于悬浮液中。在一个实施方案中，药学上可接受的载体可以是盐水，例如0.9％氯化钠溶液。在另一个实施方案中，聚山梨酸酯可以是聚山梨酸酯80。在另一个实施方案中，紫杉烷可以以约1mg/ml至约40mg/ml或约6mg/ml至约20mg/ml的浓度存在于悬浮液中。

在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒及其悬浮液可以是未包衣的，并且排除脂质、聚合物、蛋白质例如白蛋白、聚乙氧基化蓖麻油和/或由单、二和三甘油酯和聚乙二醇的单和二酯组成的聚乙二醇甘油酯类。

在其他实施方案中，紫杉烷可包含紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，紫杉烷可包含紫杉醇或其药学上可接受的盐。在该实施方案中，颗粒可以具有以下一种或多种特征：

(a)约0.050g/cm³至约0.12g/cm³或约0.060g/cm³至约0.11g/cm³的平均堆积密度(未振实)；

(b)至少12m²/g、15m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、32m²/g、34m²/g或35m²/g的SSA；

(c)约22m²/g至约40m²/g、25m²/g至约40m²/g、30m²/g至约40m²/g、或约35m²/g至约40m²/g的SSA；和/或

(d)其中，在以75RPM运行的USP II桨法装置中，在37℃和pH 7.0的50％甲醇/50％水(v/v)的溶液中在30分钟或更短时间内，至少40％(w/w)的紫杉醇溶解。

在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒可包含多西他赛或其药学上可接受的盐；在该实施方案中，颗粒具有以下一个或多个特征：

(a)约0.050g/cm³至约0.12g/cm³或约0.060g/cm³至约0.1g/cm³的平均堆积密度(未振实)；

(b)至少12m²/g、15m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、35m²/g、40m²/g、或42m²/g的SSA；

(c)约20m²/g至约50m²/g、或约35m²/g至约46m²/g的SSA；和/或

(d)其中，在以75RPM运行的USPII桨法装置中，在37℃和pH 7.0的15％甲醇/85％水(v/v)的溶液中在30分钟或更短时间内，至少40％(w/w)的多西他赛溶解。

在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒可以是结晶形式。在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒或其悬浮液被雾化以用于施用，并且所述气雾液滴具有约0.5μm至约6μm直径、或约1μm至约3μm的直径、或约2μm至约3μm的直径的质量中值空气动力学直径(MMAD)。

在一个实施方案中，紫杉烷在施用后持续至少4天在受试者的肺组织中是可检测到的。

在一些实施方案中，在施用所述组合物后，紫杉烷颗粒驻留在肿瘤部位，使所述肺部肿瘤暴露于所述紫杉烷颗粒经过足以刺激所述受试者的内源性免疫系统的持续时间量，从而导致产生杀伤肿瘤的细胞并且所述杀伤肿瘤的细胞以足以治疗所述肺部肿瘤的水平渗入肺部肿瘤。在一些实施方案中，内源性免疫系统的刺激产生细胞(细胞介导的)免疫应答。在其他一些实施方案中，内源免疫系统的刺激产生体液免疫应答。在一些实施方案中，内源免疫系统的刺激产生肿瘤疫苗。在一些实施方案中，肿瘤转移减少或消除。

在一实施方案中，持续时间量为至少4周。

在一些实施方案中，所述杀伤肿瘤细胞包含T细胞、B细胞或天然杀伤(NK)细胞或其组合。

在一些实施方案中，组合物以两次或更多次分开的给药方式施用。

在一些实施方案中，两次或更多次分开的给药方式为每周一次，持续至少两周。

在其他实施方案中，两次或更多次分开的给药方式为每周两次，持续至少一周，其中所述两次或更多次分开的给药方式相隔至少一天。

在一些实施方案中，肿瘤的治疗是肿瘤的消除。

在本发明的上下文中公开了以下实施方案1至25。

实施方案1是一种用于治疗包括但不限于肺部肿瘤或肺纤维化的肺部疾病的方法，包括向患有肺部疾病的受试者通过肺部施用有效量的包含紫杉烷颗粒的组合物以治疗所述肺部疾病，其中所述紫杉烷颗粒包含至少95％的紫杉烷并且具有0.1μm至5μm的平均粒径(数字)。

实施方案2根据是实施方案1所述的方法，其中所述肺部施用包括雾化，并且其中所述雾化导致所述紫杉烷颗粒或其悬浮液的气雾液滴向所述受试者肺部递送。

实施方案3为根据实施方案1-2中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷颗粒具有0.4μm至2μm的平均粒径(数字)。

实施方案4为根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷颗粒具有约0.4μm至约1.2μm、或约0.6μm至约1.0μm的平均粒径(数字)。

实施方案5为根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷颗粒具有至少10m²/g、或至少12m²/g、14m²/g、16m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、32m²/g、34m²/g或35m²/g的比表面积(SSA)；或其中所述紫杉烷颗粒具有约10m²/g至约60m²/g的SSA。

实施方案6为根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述紫杉烷颗粒存在于悬浮液中，其中所述悬浮液包含：

(a)所述紫杉烷颗粒；

(b)药学上可接受的载体；和

(c)聚山梨酸酯，其中所述聚山梨酸酯以0.01％v/v至约1.5％v/v、或以0.01％v/v至约1％v/v、约0.01％v/v至约0.5％v/v、约0.01％v/v至约0.4％v/v、约0.01％v/v至约0.25％v/v、约0.05％v/v至约0.5％v/v、约0.05％v/v至约0.25％v/v、约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.1％v/v至约0.25％v/v、约0.1％v/v、约0.16v/v、或约0.25％v/v的浓度存在于悬浮液中。

实施方案7为根据实施方案6所述的方法，其中所述药学上可接受的载体是盐水，例如0.9％氯化钠溶液。

实施方案8为根据实施方案6或7所述的方法，其中所述聚山梨酸酯为聚山梨酸酯80。

实施方案9为根据实施方案6-8中任一项所述的方法，其中所述紫杉烷以约1mg/ml至约40mg/ml或约6mg/ml至约20mg/ml的浓度存在于所述悬浮液中。

实施方案10为根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中，所述颗粒及其悬浮液是未包衣的，并且排除脂质、聚合物、蛋白质例如白蛋白、聚乙氧基化蓖麻油、和/或由单、二和三甘油酯和聚乙二醇的单酯和二酯组成的聚乙二醇甘油酯类。

实施方案11为根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述紫杉烷包括紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛，或其药学上可接受的盐。

实施方案12为根据实施方案11所述的方法，其中所述紫杉烷包括紫杉醇或其药学上可接受的盐。

实施方案13为根据实施例12所述的方法，其中，所述颗粒具有以下一个或多个特征：

(a)约0.050g/cm³至约0.12g/cm³或约0.060g/cm³至约0.11g/cm³的平均堆积密度(未振实)；

(b)至少12m²/g、15m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、32m²/g、34m²/g或35m²/g的SSA；

(c)约22m²/g至约40m²/g、25m²/g至约40m²/g、30m²/g至约40m²/g、或约35m²/g至约40m²/g的SSA；和/或

(d)其中，在以75RPM运行的USP II桨法装置中，在37℃和pH 7.0的50％甲醇/50％水(v/v)的溶液中在30分钟或更短时间内，至少40％(w/w)的紫杉醇溶解。

实施方案14为根据实施方案11所述的方法，其中，所述紫杉烷包括多西他赛或其药学上可接受的盐。

实施方案15为根据实施例14所述的方法，其中，所述颗粒具有以下一个或多个特征：

(a)约0.050g/cm³至约0.12g/cm³或约0.060g/cm³至约0.1g/cm³的平均堆积密度(未振实)；

(b)至少12m²/g、15m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、35m²/g、40m²/g、或42m²/g的SSA；

(c)约20m²/g至约50m²/g、或约35m²/g至约46m²/g的SSA；和/或

(d)其中，在以75RPM运行的USP II桨法装置中，在37℃和pH 7.0的15％甲醇/85％水(v/v)的溶液中在30分钟或更短时间内，至少40％(w/w)的多西他赛溶解。

实施方案16为根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷在所述施用后至少4天仍可在所述受试者的肺组织中被检测到。

实施方案17为根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷颗粒为结晶形式。

实施方案18为根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中将所述紫杉烷颗粒或其悬浮液雾化以施用，并且所述雾化产生具有约0.5μm至约6μm直径、或约1μm至约3μm的直径、或约2μm至约3μm的直径的质量中值空气动力学直径(MMAD)的气雾液滴。

实施方案19为根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述肺部疾病包括肺部肿瘤，并且其中在施用所述组合物后所述紫杉烷颗粒驻留在所述肺部肿瘤部位，使所述肺部肿瘤暴露于所述紫杉烷颗粒经过足以刺激所述受试者的内源性免疫系统的持续时间量，从而导致产生杀伤肿瘤的细胞并且所述杀伤肿瘤的细胞以足以治疗所述肺部肿瘤的水平渗入肺部肿瘤。

实施方案20为根据实施方案19所述的方法，其中，所述持续时间量为至少4周。

实施方案21为根据实施方案19-20中任一项所述的方法，其中所述杀伤肿瘤细胞包括T细胞、B细胞或自然杀伤(NK)细胞，或其组合。

实施方案22为根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物以两次或更多次分开的给药方式施用。

实施方案23为根据实施方案22所述的方法，其中所述两次或更多次分开的给药方式为每周施用一次，持续至少两周。

实施方案24为根据实施方案22所述的方法，其中所述两次或更多次分开的给药方式为每周施用两次，持续至少一周，其中所述两次或更多次分开的给药方式相隔至少一天。

实施方案25为根据实施方案1-24中任一项所述的方法，其中所述肺部疾病包括肺部肿瘤，并且其中所述治疗包括所述肿瘤的消除。

附图说明

图1是根据吸入研究的紫杉醇的肺组织和血浆水平随时间变化的图。

图2是来自6.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂的吸入研究的空气动力学直径的图。

图3是来自20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂的吸入研究的空气动力学直径的图。

图4是来自吸入研究的紫杉醇血浆水平随时间变化的图。

图5是来自吸入研究的紫杉醇肺组织水平随时间变化的图。

图6是来自吸入研究的紫杉醇的肺组织和血浆水平随时间变化的图。

图7是压缩空气射流Hospitak雾化器的图。

图8是来自原位肺癌研究的动物体重随时间的图。

图9是来自原位肺癌研究的动物体重随时间变化的图。

图10是来自原位肺癌研究的动物肺重量的图。

图11是来自原位肺癌研究的动物肺与体重之比的图。

图12是来自原位肺癌研究的动物肺与脑重量比的图。

图13是来自原位肺癌研究的平均肿瘤面积的图。

图14是来自原位肺癌研究的平均肿瘤面积的图。

图15是来自原位肺癌研究的肿瘤消退图。

图16是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块的主要特征。(2×)。

图17是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006对照，腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块内未分化细胞的主要特征。

图18是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块内未分化细胞的主要特征。

图19是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块内未分化细胞的主要特征表现为肺泡腔内肿块。a(20×)。

图20是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块内原始细胞的主要特征。b(10×)。

图21是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块内原始细胞的主要特征。b20×。

图22是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块内原始细胞的主要特征。b(40×)。

图23是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块内原始细胞的主要特征。b(40×)。

图24是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0细支气管。细支气管内未分化细胞的主要特征。c(20×)。

图25是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0腺体。肺部肿瘤肿块内泡状腺分化的主要特征。d(10×)。

图26是原位肺癌组织玻片的显微照片-1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0腺体。肺部肿瘤肿块内泡状腺分化的主要特征。d(20×)。

图27是原位肺癌组织玻片的显微照片-2001(IV

)腺癌-2，原始-1，消退-0。细支气管下的肺部肿瘤块的主要特征，没有显示血管内浸润的证据。。(2×)。

图28是原位肺癌组织玻片的显微照片-2001(IV

)腺癌-2，原始-1，消退-0。推至细支气管下的肺部肿瘤块的主要特征，没有显示血管内浸润的证据。(4×)。

图29是原位肺癌组织玻片的显微照片-2001(IV

)腺癌-2，原始-1，消退-0。推至细支气管下的肺部肿瘤块的主要特征。(10×)。

图30是原位肺癌组织玻片的显微照片-2003(IV

)腺癌-1，原始-1，消退-1。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。(4×)。

图31是原位肺癌组织玻片的显微照片-2003(IV )腺癌-1，原始-1，消退-1。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。(10×)。

图32是原位肺癌组织玻片的显微照片-2003(IV

)腺癌-1，原始-1，消退-1。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。(20×)。

图33是原位肺癌组织玻片的显微照片-2003(IV

)腺癌-1，原始-1，消退-1。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。注意沿着边缘的淋巴细胞和巨噬细胞。1(40×)。

图34是原位肺癌组织玻片的显微照片-2003(IV )腺癌-1，原始-1，消退-1。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。注意沿着边缘的淋巴细胞和巨噬细胞。2(40×)。

图35是原位肺癌组织玻片的显微照片-2003(IV

)腺癌-1，原始-1，消退-1。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。注意较大的泡沫状且着色的巨噬细胞。2，2×(40×)。

图36是原位肺癌组织玻片的显微照片-2010(IV

)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块的主要特征。(2×)。

图37是原位肺癌组织载片的显微照片-2010(IV

)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块的主要特征。(20×)。

图38是原位肺癌组织玻片的显微照片-2010(IV

)腺癌-3，原始-1，消退-0。肺部肿瘤肿块的主要特征。注意沿着边缘的巨噬细胞的细微证据。(40×)。

图39是原位肺癌组织载玻片的显微照片-4009(IH紫杉醇颗粒制剂1×高)腺癌-0，原始-0，消退-4。已经历完全消退的肺部肿瘤肿块的特征。(2×)。

图40是原位肺癌组织载玻片的显微照片-4009(IH紫杉醇颗粒制剂1×高)腺癌-0，原始-0，消退-4。已经历完全消退的肺部肿瘤肿块的特征。注意间质纤维化。(10×)。

图41是原位肺癌组织玻片的显微照片-4009(IH紫杉醇颗粒制剂1×高)腺癌-0，原始-0，消退-4。已经历完全消退的肺部肿瘤肿块的特征。注意间质纤维化、以及沿着边缘的淋巴细胞和巨噬细胞。(40×)。

图42是原位肺癌组织玻片的显微照片-5010(IH紫杉醇颗粒制剂2×低)腺癌-1，原始-0，消退-3。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。(2×)。

图43是原位肺癌组织玻片的显微照片-5010(IH紫杉醇颗粒制剂2×低)腺癌-1，原始-0，消退-3。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。(10×)。

图44是原位肺癌组织玻片的显微照片-5010(IH紫杉醇颗粒制剂2×低)腺癌-1，原始-0，消退-3。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。(20×)。

图45是原位肺癌组织玻片的显微照片-5010(IH紫杉醇颗粒制剂2×低)腺癌-1，原始-0，消退-3。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。(40×)。

图46是原位肺癌组织玻片的显微照片-6005(IH紫杉醇颗粒制剂2×高)腺癌-1，原始0，消退-4。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。(2×)。

图47是原位肺癌组织玻片的显微照片-6005(IH紫杉醇颗粒制剂2×高)腺癌-1，原始-0，消退-4。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。注意间质纤维化以及沿着边缘的淋巴细胞和巨噬细胞。(10×)。

图48是原位肺癌组织载玻片的显微照片-6005(IH紫杉醇颗粒制剂2×高)腺癌-1，原始-0，消退-4。正在经历消退的肺部肿瘤肿块的特征。注意沿着边缘的淋巴细胞和巨噬细胞。(20×)。

图49是原位肺癌组织玻片的显微照片-6005(IH紫杉醇颗粒制剂2×高)腺癌-1，原始-0，消退-4。注意沿着边缘的淋巴细胞和巨噬细胞。(40×)。

图50是原位肺癌组织玻片的显微照片-6005(IH紫杉醇颗粒制剂2×高)腺癌-1，原始-0，消退-4。注意肺泡内有残留肿瘤细胞的病灶区域的存在。2(40×)。

图51是来自吸入研究的动物体重随时间变化的图。

图52是来自吸入研究的动物体重随时间变化的图。

图53是吸入研究中紫杉醇血浆水平随时间变化的图表。

图54是吸入研究中紫杉醇肺组织水平随时间变化的图。

具体实施方式

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。除非另有明确说明，否则本文所用的“与”可与“或”互换使用。

如本文所用，“约”是指所述计量单位的+/-百分之五(5％)。除非上下文另外明确指出，否则可以组合使用本发明的任何方面的所有实施例。

除非上下文清楚地另外要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”、“包含”等应理解为包含性含义，而不是排他性或穷举性含义；也就是说，从某种意义上说为“包括但不限于”。使用单数或复数的词也分别包括复数和单数。另外，当在本申请中使用时，词语“此处”、“上述”和“下述”以及类似含义的词语应整体上指本申请，而不是本申请的任何特定部分。组合物及其使用方法可以“包括”、“基本上由说明书中公开的任何成分或步骤组成”或“由说明书中公开的任何成分或步骤组成”。

本公开的实施例的描述并非旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施例和示例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。

在第一方面，本发明提供了治疗肺部疾病的方法，该方法包括向患有肺部疾病的受试者肺部施用有效量的包含紫杉烷颗粒的组合物以治疗肺肿瘤，其中紫杉烷颗粒包含至少95％的紫杉烷并且具有0.1μm至5μm的平均粒径(数字)。

发明人惊奇地发现，与以前使用的任何其他紫杉烷制剂相比，根据本发明的方法对紫杉烷颗粒进行肺部施用导致紫杉烷在肺中的停留时间长得多。如以下实施例所示，紫杉烷在给药后至少96小时内仍可在受试者的肺组织中检测到。在各种其他实施方案中，紫杉烷在受试者的肺组织中在给药后至少108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312、324或336小时仍然可检测。因此，这些方法可用于治疗可使用紫杉烷颗粒有效治疗的任何肺部疾病，包括但不限于肺部肿瘤、间皮瘤、限制性肺部疾病(如肺纤维化)和阻塞性肺部疾病(如慢性阻塞性肺病)(COPD)。

本发明的另一方面是，所述方法还允许在施用组合物后使肺部肿瘤暴露于紫杉烷颗粒持续足够长的时间，以刺激受试者的内源性免疫系统，导致产生杀伤肿瘤细胞和该杀伤肿瘤细胞以足以治疗肿瘤的水平浸润到肿瘤中。在一些实施方案中，内源性免疫系统的刺激产生细胞(细胞介导的)免疫应答。在一些其他实施方案中，内源免疫系统的刺激产生体液免疫应答。在一些实施方案中，内源免疫系统的刺激产生肿瘤疫苗。在一些实施方案中，肿瘤转移减少或消除。杀肿瘤细胞可包含T细胞、B细胞或自然杀伤(NK)细胞或其组合。在一些实施例中，暴露的持续时间量为至少108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240、252、264、276、288、300、312、324、336小时。在各种其他实施方案中，暴露的持续时间量为至少3、4、5、6、7或8周。组合物可以通过肺部单剂量单次给药(周期)或以单剂量的两次或更多次分开给药(2次或更多次周期)给药。在一些实施例中，两次或更多次分开的给药的间隔为或至少间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或14天。在一些实施方案中，两次或更多次分开的给药间隔2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-12、8-11、8-10、8-9、9-12、9-11、9-10、10-12、10-11、11-12、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周。在一些实施方案中，以2-5、2-4、2-3、3-5、3-4、2、3、4、5或更多次分开给药的方式施用组合物。在一些实施方案中，两次或更多次分开的施用间隔2至12周施用。在一些实施方案中，以两至五次分开给药的方式施用组合物。在一些实施方案中，两次或更多次分开的施用每周一次，持续至少两周。在其他实施方案中，两次或更多次分开的给药每周两次，持续至少一周，其中两次或更多次分开的给药相隔至少一天。在一些实施方案中，治疗方法导致肿瘤的消除(根除)。在一些实施方案中，以1、2、3、4、5、6或更多次分开给药的方式施用组合物。在其他实施方案中，组合物以7次或更多次分开的给药方式施用。

如本文所用，“紫杉烷颗粒”是基本上由紫杉烷(即至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的紫杉烷)组成的颗粒，其平均粒径(数字)为0.1μm至5μm之间。本发明所用的紫杉烷颗粒是未包衣的，并且没有被包埋、容纳、包封或封闭在固体赋形剂中，但是，本发明的紫杉烷颗粒可以包含通常在制备紫杉烷期间发现的杂质和副产物。即使这样，紫杉烷颗粒包含至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的紫杉烷，这意味着紫杉烷颗粒由或基本上由基本上纯的紫杉烷组成。

紫杉烷类是一类含紫杉二烯母核的二萜类化合物，其难溶于水。本发明的紫杉烷颗粒可以是任何合适的紫杉烷，包括但不限于紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、紫杉烯、巴卡丁III、紫杉素A、brevifoliol和紫杉碱D，及其组合或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，紫杉烷选自由紫杉醇、多西他赛和卡巴他赛或其药学上可接受的盐组成的组。

紫杉醇和多西他赛活性药物成分(API)可从加拿大温哥华的Phyton Biotech LLC商购获得。按无水、无溶剂计算，多西他赛API含量不少于95％，或不少于97.5％。按无水、无溶剂计算，紫杉醇API含有不少于95％，或不少于97％的紫杉醇。在一些实施方案中，紫杉醇API和多西他赛API是USP和/或EP级的。紫杉醇API可以通过半合成化学过程或天然来源(例如植物细胞发酵或提取)制备。

肺部肿瘤是肺内存在的任何肿瘤，并且可以是原发性或转移性肺肿瘤。肺部肿瘤的非限制性实例包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。在一实施方案中，肺部肿瘤是SCLC。在另一个实施方案中，肺部肿瘤是NSCLC。受试者可以是患有肺部肿瘤的任何哺乳动物，包括但不限于人和其他灵长类动物、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊等。

紫杉烷颗粒的“有效量”可以由主治医师基于所有相关因素来确定。紫杉烷颗粒可以是单独施用的紫杉烷，或者可以根据所有情况与主治医师认为合适的其他治疗剂一起施用。在一个实施方案中，该方法进一步包括用标准的治疗对象来治疗该对象，例如静脉内化学疗法、放射疗法、手术切除等。

如本文所用，“治疗”、“治疗方案”或“处理”是指实现以下一项或多项：(a)减小肿瘤或纤维化的大小；(b)降低肿瘤的生长速度；(c)消除肿瘤或纤维化；(d)减少或限制肿瘤转移的发展和/或扩散，或消除肿瘤转移。在一些实施方案中，治疗是消除肿瘤或纤维化。

在本发明的一个具体实施方案中，肺部施用包括吸入单剂量的紫杉烷颗粒，例如通过经鼻、经口吸入或两者。紫杉烷颗粒可以以两次或更多次分开的给药(剂量)给药。在该实施方案中，紫杉烷颗粒可以配制成气雾剂(即：抗肿瘤颗粒在气态介质中的稳定分散或悬浮的液滴)。由气雾递送的紫杉烷颗粒可通过重力沉降、惯性碰撞和/或扩散而沉积在气道中。可以使用用于产生气雾剂的任何合适的装置，包括但不限于压力计吸入器(pMDI)、喷雾器、干粉吸入器(DPI)和软雾吸入器。

在一个特定的实施方案中，该方法包括吸入经由雾化而形成气雾的紫杉烷颗粒。雾化器通常使用压缩空气或超声波来产生紫杉烷颗粒或其悬浮液的可吸入气雾液滴。在该实施方案中，雾化导致紫杉烷颗粒或其悬浮液的气雾剂肺部递送至受试者。

在另一个实施方案中，所述方法包括吸入经由pMDL雾化的紫杉烷颗粒，其中所述紫杉烷颗粒或其悬浮液悬浮在合适的推进剂体系中(包括但不限于在加压容器中包含至少一种液化气的氢氟烷烃(HFA))。用计量阀密封。阀门的致动导致递送紫杉烷颗粒或其悬浮液的定量喷雾剂。

在其他实施方案中，紫杉烷颗粒具有大于0.2μm或0.3μm的平均粒度(数字)。在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒具有至少0.4μm的平均粒径(数字)。在其他实施方案中，紫杉烷颗粒的平均粒径(数字)为0.4μm至2μm，或0.5μm至1.5μm，或0.2μm至1μm，或0.2μm至小于1μm。

在进一步的实施方案中，紫杉烷颗粒的平均粒径可以在约0.4μm至约5μm、约0.4μm至约3μm、约0.5μm至约1.4μm、约0.4μm至约0.8μm、约0.4μm至约0.7μm、或约0.5μm至约0.7μm的范围内。在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒的平均粒径为约0.4μm至约1.2μm、或约0.6μm至约1.0μm。在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒的平均粒径为0.6μm至0.861μm、或约0.5μm至约0.7μm、或约0.2μm至约1μm、或约0.2μm至小于1μm、或约0.3μm至约1μm、或约0.3μm至小于1μm、或约0.4μm至约1μm、或约0.4μm至小于1μm。

紫杉烷颗粒的粒径可以通过粒径分析仪确定，并且将测量值表示为基于数分布(数字)的平均直径。一种合适的粒度分析仪是采用光遮蔽的分析技术的仪器，也称为光区或单颗粒光学传感(SPOS)。合适的光阻粒度分析仪是ACCUSIZER，例如ACCUSIZER 780SIS，可从Particle Sizing Systems(Port Richey，Florida)获得。另一种合适的粒度分析仪是采用激光衍射的仪器，例如Shimadzu SALD-7101。

在将紫杉烷颗粒气雾化给药的实施方案中，紫杉烷颗粒或其悬浮液的气雾剂液滴的质量平均空气动力学直径(MMAD)可以是用于本发明的任何合适的直径。在一实施方式中，气雾剂液滴的MMAD直径为约0.5μm至约6μm。在各种其他实施方式中，气雾剂液滴的MMAD直径为约0.5μm至约5.5μm、直径为约0.5μm至约5μm、直径为约0.5μm至约4.5μm、直径为约0.5μm至约4μm、直径为约0.5μm至约3.5μm、直径为约0.5μm至约3μm、直径为约0.5μm至约2.5μm、直径为约0.5μm至约2μm、直径为约1μm至约5.5μm、直径为约1μm至约5μm、直径为约1μm至约4.5μm、直径为约1μm至约4μm、直径为约1μm至约3.5μm、直径为约1μm至约3μm、直径为约1μm至约2.5μm、直径为约1μm至约2μm、直径为约1.5μm至约5.5μm、直径为约1.5μm至约5μm、直径为约1.5μm至约4.5μm、直径为约1.5μm至约4μm、直径为约1.5μm至约3.5μm、直径为约1.5μm至约3μm、直径为约1.5μm至约2.5μm、直径为约1.5μm至约2μm、直径为约2μm至约5.5μm、直径为约2μm至约5μm、直径为约2μm至约4.5μm、直径为约2μm至约4μm、直径为约2μm至约3.5μm、直径为约2μm至约3μm、直径为约2μm至约2.5μm。用于测量气雾剂液滴的质量中位空气动力学直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)的合适仪器是七段式气雾采样器(seven-stageaerosol sampler)，例如Mercer-Style Cascade Impactor。

在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒可以具有至少10m²/g或至少12m²/g、14m²/g、16m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、32m²/g、34m²/g、或35m²/g的比表面积(SSA)；或其中紫杉烷颗粒的SSA为约10m²/g至约60m²/g。

在各种实施方案中，紫杉烷颗粒通过“压缩的反溶剂沉淀”(PCA)方法制得，如美国专利US 5874029、US 5833891、US 6113795、US 7744923、US 8778181、US 9233348，美国公开号US 2015/0375153、US 2016/0334336、US 2016/0374953；以及国际专利申请公开号WO2016/197091、WO 2016/197100和WO 2016/197101中所公开的；所有这些通过引用并入本文。

在使用超临界二氧化碳、超临界二氧化碳(抗溶剂)和溶剂(例如丙酮或乙醇)的PCA粒度减小方法中，用于在良好表征的粒度分布内生成小至0.1至5μm的未包衣的紫杉烷颗粒。在加工过程中除去了二氧化碳和溶剂(可能残留最多0.5％的残留溶剂)，留下紫杉烷颗粒状粉末。稳定性研究表明，紫杉醇颗粒粉末在室温下最多可保存59个月，并在加速条件下(40℃/75％相对湿度)最多可保存六个月，在小瓶剂型中是稳定的。

相较于通过使用物理撞击或研磨(例如湿磨或干磨)、微粉碎、崩解、粉碎、微流化、或粉碎的常规粒径减小方法，通过各种超临界二氧化碳的粒径减小方法可具有独特的物理学特性。如美国公开号2016/0374953中公开的，其通过引用并入本文，这种独特的特征包括堆积密度(不敲击量筒的情况下，组合物中颗粒总数的质量除以它们倒入量筒时所占据的总体积，该总体积包括颗粒体积、颗粒间空隙体积和内部孔体积)介于0.05g/cm³和0.15g/em³之间，比表面积(SSA)至少为18m²/g紫杉烷(例如紫杉醇和多西他赛)颗粒，其通过美国公开2016/0374953中所述的超临界二氧化碳粒径减小方法生产，如下所述。该堆积密度范围通常低于通过常规方式生产的紫杉烷颗粒的堆积密度，并且SSA通常高于通过常规方式生产的紫杉烷颗粒的SSA。与通过常规方法生产的紫杉烷相比，这些独特的特性导致在水/甲醇介质中的溶解速率显著提高。如本文所用，“比表面积”(SSA)是指每单位质量的紫杉烷的紫杉烷颗粒的总表面积，通过以下方法利用Brunauer-Emmett-Teller(“BET”)等温线测量：将200至300mg的分析物添加到30mL的样品管中。装载的管然后被安装到Porous MaterialsInc.

BET-202A型。然后使用BETWIN软件包进行自动测试，随后计算每个样品的表面积。如本领域技术人员将理解的那样，“紫杉烷颗粒”可以包括聚集的紫杉烷颗粒和非聚集的紫杉烷颗粒；因为SSA是基于每克确定的，所以它考虑了组合物中聚集的和非聚集的紫杉烷颗粒。BET比表面积测试程序是美国药典和欧洲药典中均包含的药典方法。堆密度测量可以通过在室温下将紫杉烷颗粒倒入量筒中而不敲击，测量质量和体积并计算堆密度来进行。

如美国公开2016/0374953中所公开的，研究显示，通过在Deco-PBM-V-0.41球磨机用5mm的研磨球尺寸在室温下以600RPM的速度持续60分钟，产生具有15.0m²/g的SSA和0.31g/cm³的堆密度的紫杉醇颗粒。同样在美国公开2016/0374953中公开，当使用以下方法通过超临界二氧化碳方法生产时，一批紫杉醇颗粒的SSA为37.7m²/g，堆积密度为0.085g/cm³：在丙酮中制备65mg/mL紫杉醇的溶液。将BETE 雾喷嘴(BETE FogNozzle，Inc.)和声波探针(Qsonica，型号Q700)放置在相距约8mm的结晶室内。将具有约100nm孔的不锈钢网过滤器连接到结晶室以收集沉淀的紫杉醇颗粒。将超临界二氧化碳置于制造设备的结晶室内，并在约38℃和24kg/小时的流速下达到约1200psi。在20kHz的频率下，将声波探头调整为总输出功率的60％。将含有紫杉醇的丙酮溶液以4.5mL/分钟的流速泵送通过喷嘴约36小时。通过上述超临界二氧化碳方法生产的其他各种紫杉醇颗粒具有的SSA值为：22.27m²/g、23.90m²/g、26.19m²/g、30.02m²/g、31.16m²/g，31.70m²/g，32.59m²/g、33.82m²/g、35.90m²/g、38.22m²/g和38.52m²/g。

如美国公开号2016/0374953中公开的，研究表明，通过在Deco-PBM-V-0.41球磨机使用5mm的球尺寸在室温下以600RPM的速度研磨持续60分钟，产生具有15.2m²/g的SSA和0.44g/cm³的堆密度的多西他赛颗粒。同样在美国公开2016/0374953中公开的，当通过超临界二氧化碳方法使用以下方法生产时，多西他赛颗粒具有44.2m²/g的SSA和0.079g/cm³的堆积密度：在乙醇中制备79.32mg/mL多西他赛。将喷嘴和声波探头放置在相距约9mm的可加压室内。将具有约100nm孔的不锈钢网过滤器连接至可加压室以收集沉淀的多西他赛颗粒。将超临界二氧化碳置于制造设备的可加压室中，并在约38℃和68slpm的流速下达到约1200psi。在20kHz的频率下，将声波探头调整为总输出功率的60％。将含有多西他赛的乙醇溶液以2mL/分钟的流速泵过喷嘴约95分钟。然后，当将混合物泵送通过不锈钢筛网过滤器时，从超临界二氧化碳中收集沉淀的多西他赛聚集物和颗粒。打开包含多西他赛颗粒的过滤器，并从过滤器中收集所得产物。

如美国公开号2016/0374953中公开的，溶出度研究显示，与通过Deco-PBM-V-0.41球磨机使用5mm的球尺寸将紫杉醇和多西他赛在室温下以600RPM的速度研磨持续60分钟制得的紫杉醇和多西他赛颗粒相比，通过美国公开号2016/0374953中描述的超临界二氧化碳方法制得的紫杉醇和多西他赛颗粒在甲醇/水介质中的溶解速率增加。用于确定溶解速率的程序如下。对于紫杉醇，通过将材料和珠粒在小瓶中滚动约1小时，将约50mg的材料涂覆在约1.5克的1mm玻璃珠上。将珠粒转移到不锈钢网状容器中，并放入含有甲醇/水50/50(v/v)介质的溶出槽中，该介质在37℃、pH 7和USP装置II(浆法)下以75rpm运行。在10、20、30、60和90分钟时，取出5mL等分试样，通过0.22μm过滤器过滤，并在227nm的UV/VIS分光光度计上进行分析。将样品的吸光度值与在溶解介质中制备的标准溶液的吸光度值进行比较，以确定溶解的材料量。对于多西他赛，将约50mg的材料直接置于含有甲醇/水15/85(v/v)介质的溶出浴中，该溶出槽温度为37rpm，pH为7，使用USP装置II(桨法)。在5、15、30、60、120和225分钟时，取出5mL等分试样，通过0.22μm过滤器过滤，并在232nm的UV/VIS分光光度计上进行分析。将样品的吸光度值与在溶解介质中制备的标准溶液的吸光度值进行比较，以确定溶解物的量。对于紫杉醇，通过超临界二氧化碳法制得的颗粒的溶解速率为在30分钟内溶解47％，而通过研磨制得的颗粒为在30分钟内溶解为32％。对于多西他赛，通过超临界二氧化碳方法制得的颗粒的溶解速率为在30分钟内溶解为27％，而研磨制得的颗粒在30分钟内溶解为9％。

在一些实施方案中，紫杉烷颗粒具有至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、或至少35m²/g的SSA。在一个实施方案中，抗肿瘤颗粒的SSA为约10m²/g至约50m²/g。在一些实施方案中，抗肿瘤颗粒的堆积密度(未振实)为约0.050g/cm³至约0.20g/cm³。

在其他实施方案中，抗肿瘤颗粒的SSA为：

(a)16m²/g至31m²/g或32m²/g至40m²/g；

(b)16m²/g至30m²/g或32m²/g至40m²/g；

(c)16m²/g至29m²/g或32m²/g至40m²/g；

(d)17m²/g至31m²/g或32m²/g至40m²/g；

(e)17m²/g至30m²/g或32m²/g至40m²/g；

(f)17m²/g至29m²/g，或32m²/g至40m²/g；

(g)16m²/g至31m²/g或33m²/g至40m²/g；

(h)16m²/g至30m²/g或33m²/g至40m²/g；

(i)16m²/g至29m²/g或33m²/g至40m²/g；

(j)17m²/g至31m²/g或33m²/g至40m²/g；

(k)17m²/g至30m²/g或33m²/g至40m²/g；

(l)17m²/g至29m²/g或33m²/g至40m²/g；

(m)16m²/g至31m²/g，或≥32m²/g；

(h)17m²/g至31m²/g，或≥32m²/g；

(i)16m²/g至30m²/g，或≥32m²/g；

(j)17m²/g至30m²/g，或≥32m²/g；

(k)16m²/g至29m²/g，或≥32m²/g；

(l)17m²/g至29m²/g，或≥32m²/g；

(m)16m²/g至31m²/g，或≥33m²/g；

(n)17m²/g至31m²/g，或≥33m²/g；

(o)16m²/g至30m²/g，或≥33m²/g；

(p)17m²/g至30m²/g，或≥33m²/g；

(q)16m²/g至29m²/g，或≥33m²/g；或者

(r)17m²/g至29m²/g，或≥33m²/g。

在一些实施方案中，紫杉烷颗粒是紫杉醇颗粒，并且具有至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、或至少35m²/g的SSA。在其他实施方案中，紫杉醇颗粒的SSA为18m²/g至50m²/g、或20m²/g至50m²/g、或22m²/g至50m²/g、或25m²/g至50m²/g、或26m²/g至50m²/g、或30m²/g至50m²/g，or 35m²/g至50m²/g、或18m²/g至45m²/g、或20m²/g至45m²/g、或22m²/g至45m²/g、或25m²/g至45m²/g、或26m²/g至45m²/g or 30m²/g至45m²/g、或35m²/g至45m²/g、或18m²/g至40m²/g、或20m²/g至40m²/g、或22m²/g至40m²/g、或25m²/g至40m²/g、或26m²/g至40m²/g、或30m²/g至40m²/g、或35m²/g至40m²/g。

在一些实施方案中，紫杉醇颗粒具有0.05g/cm³至0.15g/cm³或0.05g/cm³至0.20g/cm³的堆积密度(未振实)。

在一些实施方案中，紫杉醇颗粒具有在以75RPM、37℃、pH 7运行的USPII桨法装置中在50％甲醇/50％水(v/v)的溶液中在30分钟或更短时间内溶解至少40％w/w的溶解速率。

在另一个实施方案中，紫杉醇颗粒具有以下一个或多个特征：

(a)在约0.050g/cm³至约0.12g/cm³之间，或在约0.060g/cm³至约0.11g/cm³之间的平均堆密度(未振实)；

(b)至少为12m²/g、15m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、32m²/g、34m²/g或35m²/g的SSA；

(c)约22m²/g至约40m²/g、25m²/g至约40m²/g、30m²/g和约40m²/g、或约35m²/g至约40m²/g的SSA；和/或

(d)其中至少40％(w/w)的紫杉醇在37℃和pH 7.0下以75RPM运行的USPII桨法装置中于50％甲醇/50％水(v/v)的溶液中溶解30分钟或更短时间内溶解。

在一实施方案中，紫杉醇颗粒的平均堆积密度(未振实)为约0.050g/cm³至约0.12g/cm³之间，并且SSA为至少30m²/g。在另一个实施方案中，紫杉醇颗粒具有在约0.050g/cm³至约0.12g/cm³之间的平均堆积密度(未振实)和至少35m²/g的SSA。在一个实施方案中，紫杉醇颗粒的平均堆积密度(未振实)为约0.030g/cm³至约0.12g/cm³，并且SSA为约30m²/g至约40m²/g。在另一个实施方案中，紫杉醇颗粒具有约0.060g/cm³至约0.11g/cm³的平均堆积密度(未振实)和约30m²/g至约40m²/g的SSA。在另一个实施方案中，紫杉醇颗粒具有约0.060g/cm³至约0.11g/cm³的平均堆积密度(未振实)和至少30m²/g的SSA。在另一个实施方案中，紫杉醇颗粒具有约0.060g/cm³至约0.11g/cm³的平均堆积密度(未敲击)和至少35m²/g的SSA。

在另一个实施方案中，所述组合物的紫杉醇颗粒中至少40％(w/w)的紫杉醇在以75RPM运行的USP II桨法装置中于50％甲醇/50％水(v/v)的溶液中溶解30分钟或更短时间内溶解。使用pH 7，并且所述紫杉醇的溶解度不受pH影响。在另一个实施方案中，溶出度研究在37℃下进行。

在一些实施方案中，紫杉烷颗粒是多西他赛颗粒，并且具有至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、或至少42m²/g的SSA。在其他实施方案中，多西他赛颗粒的SSA为18m²/g至60m²/g、或22m²/g至60m²/g、或25m²/g至60m²/g、或30m²/g至60m²/g、或40m²/g至60m²/g、或18m²/g至50m²/g、或22m²/g至50m²/g、或25m²/g至50m²/g、或26m²/g至50m²/g、或30m²/g至50m²/g、或35m²/g至50m²/g、或40m²/g至50m²/g。

在一些实施方案中，多西他赛颗粒具有0.05g/cm³至0.15g/cm³的堆积密度(未振实)。在一些实施方案中，多西他赛颗粒在以75RPM、37℃、pH7运行的USP II桨法装置中在15％甲醇/85％水(v/v)的溶液中在30分钟或更短时间内溶解至少20％w/w的溶解速率。

在另一个实施方案中，多西他赛颗粒具有一个或多个以下特征：

(a)在约0.050g/cm³至约0.12g/cm³之间，或在约0.06g/cm³至约0.1g/cm³之间的平均堆积密度(未振实)；

(b)至少为12m²/g、15m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、35m²/g、40m²/g或42m²/g的SSA；

(c)约20m²/g至约50m²/g、或约35m²/g至约46m²/g的SSA；和/或

(d)其中至少20％(w/w)的多西他赛在37℃和pH7.0下以75RPM运行的USP II桨法装置中于15％甲醇/85％水(v/v)的溶液中溶解30分钟或更短时间内溶解。

在一个实施方案中，多西他赛颗粒具有约0.050g/cm³至约0.12g/cm³的平均堆积密度(未振实)和至少30m²/g的SSA。在另一个实施方案中，多西他赛颗粒具有约0.050g/cm³至约0.12g/cm³的平均堆积密度(未振实)和至少35m²/g的SSA。在另一个实施方案中，多西他赛颗粒具有约0.050g/cm³至约0.12g/cm³的平均堆积密度(未振实)和至少40m²/g的SSA。在一实施方案中，多西他赛颗粒具有约0.050g/cm³至约0.12g/cm³的平均堆积密度(未振实)和约20m²/g至约50m²/g的SSA。在另一个实施方案中，多西他赛颗粒的平均堆积密度(未振实)为约0.06g/cm³至约0.1g/cm³，而SSA为约30m²/g至约50m²/g。在另一个实施方案中，多西他赛颗粒的平均堆积密度(未敲击)为约0.06g/cm³至约0.1g/cm³，并且SSA为约35m²/g至约50m²/g。在另一个实施方案中，多西他赛颗粒的平均堆积密度(未振实)为约0.06g/cm³至约0.1g/cm³，而SSA为约35m²/g至约45m²/g。

在另一个实施方案中，至少20％(w/w)的多西他赛在以75RPM运行的USP II桨法装置中在15％甲醇/85％水(v/v)的溶液中于30分钟或更短时间内溶解。在紫杉烷的溶解度不受pH影响的情况下，使用中性pH。在另一个实施方案中，溶出度研究在37℃下进行。

在这些各种实施方案的任何一个中，紫杉烷颗粒可以按每紫杉烷颗粒包含至少4.16×10^-13克紫杉烷或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，紫杉烷颗粒是非聚集的单个颗粒，并且不是多个紫杉烷颗粒的簇。

在本发明的各种实施方案中，紫杉烷颗粒是未包衣的(纯净的)单个颗粒；优选地，紫杉烷颗粒是未包衣的。紫杉烷颗粒不与任何物质结合或缀合；紫杉烷颗粒的表面上没有物质被吸收或吸附；紫杉烷颗粒不包封在任何物质中；紫杉烷颗粒上没有任何物质。紫杉烷颗粒不是紫杉烷的微乳液、纳米乳液、微球或脂质体；和/或紫杉烷颗粒不与单体、聚合物(或生物相容性聚合物)、蛋白质、表面活性剂或白蛋白结合、附着、包封或包覆。在一些实施方案中，单体、聚合物(或生物相容性聚合物)、共聚物、蛋白质、表面活性剂或白蛋白不被吸收或吸附到紫杉烷颗粒的表面上。在一些实施方案中，组合物不含/不包含或不含有聚合物/共聚物或生物相容性聚合物/共聚物。在一些实施方案中，组合物不含/不包含或不含有蛋白质。在本发明的一些方面，所述组合物不含/不包含或不含有白蛋白。在本发明的一些方面，所述组合物不含/不包含或不含有透明质酸。在本发明的一些方面，所述组合物不含/不包含或不含有透明质酸和紫杉烷的缀合物。在本发明的一些方面，所述组合物不含/不包含或不含有透明质酸和紫杉醇的缀合物。在本发明的一些方面，所述组合物不含/不包含或不含有泊洛沙姆、聚阴离子、聚阳离子、改性聚阴离子、改性聚阳离子、壳聚糖、壳聚糖衍生物、金属离子、纳米载体、聚γ-谷氨酸(PGA)、聚丙烯酸(PAA)、藻酸(ALG)、维生素E-TPGS、二甲基异山梨醇(DM)、甲氧基PEG 350、柠檬酸、抗VEGF抗体、乙基纤维素、聚苯乙烯、聚酐、聚羟基酸、聚磷腈、聚原酸酯、聚酯、聚酰胺、多糖、聚蛋白、苯乙烯-异丁烯-苯乙烯(SUBS)、聚酸酐共聚物、聚己内酯、聚乙二醇(PEG)、聚(双(P-羧基苯氧基)丙烷-癸二酸、聚(d，l-乳酸)(PLA)，聚(d，1-乳酸-共-乙醇酸)(PLAGA)和/或聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)。在一些实施方案中，紫杉烷颗粒为结晶形式。在其他实施方案中，紫杉烷颗粒为无定形形式，或结晶和无定形两者的组合。

在一个实施方案中，用于给药的紫杉烷颗粒包含在混悬液(即：与药学上可接受的载体和/或以气雾剂形式)中约0.1mg/ml至约100mg/ml的紫杉烷制剂。在各种其他实施方案中，制剂可以为约0.5mg/ml至约100mg/ml、约1mg/ml至约100mg/ml、约2mg/ml至约100mg/ml、约5mg血l至约100mg/ml、约10mg/ml至约100mg/ml、约25mg/ml至约100mg/ml、约0.1mg/ml至约75mg/ml、约0.5mg/ml至约75mg/ml、约1mg/ml至约75mg/ml、约2mg/ml至约75mg/ml、约5mg/ml至约75mg/ml、约10mg/ml至约75mg/ml、约25mg/ml至约75mg/m、约0.1mg/ml至约50mg/ml、约0.5mg/ml至约50mg/ml、约1mg/ml至约50mg/ml、约2mg/ml至约50mg/ml、约5mg/ml至约50mg/ml、约10mg/ml至约50mg/ml、约25mg/ml至约50mg/m、约0.1mg/ml至约25mg/ml、约0.5mg/ml至约25mg/血l、约1mg血l至约40mg/ml、约1mg/ml至约25mg/ml、约2mg/ml至约25mg/ml、约5mg/ml至约25mg/ml、约10mg/ml至约25mg/ml、约0.1mg/ml至约15mg/ml、约0.5mg/ml至约15mg/ml、约1mg/ml至约15mg血l、约2mg/ml至约15mg/ml、约5mg/ml至约15mg/ml、约10mg/ml至约15mg/ml、约0.1mg/ml至约10mg/ml、约0.5mg/ml至约10mg/ml、约1mg/ml至约10mg/ml、约2mg/ml至约10mg/ml、约5mg/ml至约10mg/ml、约0.1mg/ml至约5mg血l、约0.5mg/ml至约5mg/ml、约1mg/ml至约5mg/ml、约2mg/ml至约5mg/ml、约0.1mg血l至约2mg/ml、约0.5mg/ml至约2mg/ml、约1mg/ml至约2mg血l、约0.1mg/ml至约1mg/ml、约0.5mg血l至约1mg/ml、约0.1mg/ml至约0.5mg/ml、约0.1mg/ml至约15mg/ml、约0.5mg/ml至约15mg/ml、约1mg/ml至约15mg/ml、约2mg/ml至约15mg/ml、约5mg/ml至约15mg/ml、约3mg/ml至约8mg/ml、或约4mg/ml至约6mg/ml的紫杉烷，或至少约0.1、0.5、1、10、20、25、50、75、或100mg/ml的紫杉烷。

在一实施方案中，紫杉烷颗粒在气雾化之前存在于液体载体中。可以使用任何合适的液体载体，例如水性液体载体。可以使用任何合适的含水液体载体，包括但不限于0.9％盐溶液(生理盐水)，例如0.9％注射用氯化钠USP。在另一个实施方案中，紫杉烷颗粒在雾化之前存在于悬浮液中。在一些实施方案中，悬浮液包括水性载体。载体可以包含在水中的缓冲剂、渗透盐和/或表面活性剂，以及用于调节pH、等渗性和粘度的其他试剂。在使用水性载体的一个实施方案中，以w/w或w/v为基准计，表面活性剂的浓度小于1％；在其他实施方案中，小于0.5％、小于0.25％或约0.1％。在其他实施方案中，水性载体可排除表面活性剂

(由单、双和三甘油酯和聚乙二醇的单和二酯组成的聚乙二醇甘油酯)和/或(聚乙氧基化蓖麻油)。在一些实施方案中，该组合物或悬浮液不包括聚合物、蛋白质(例如白蛋白)、聚乙氧基化蓖麻油和/或由单、二和三甘油酯和聚乙二醇的单和二酯组成的聚乙二醇甘油酯。

在一些实施方案中，悬浮液可包含水和任选的一种或多种选自缓冲剂、张度调节剂、防腐剂、缓和剂、粘度调节剂、渗透剂、表面活性剂、抗氧化剂、碱化剂、酸化剂、消泡剂、和着色剂的赋形剂。例如，悬浮液可包含紫杉烷颗粒、水、缓冲剂和盐。它任选地进一步包含表面活性剂。在一些实施方案中，悬浮液基本上由水、悬浮在水中的紫杉醇颗粒和缓冲剂组成。悬浮液可以进一步包含渗透盐。

悬浮液可包含一种或多种表面活性剂。合适的表面活性剂包括但不限于例如聚山梨酸酯、月桂基硫酸盐、乙酰化甘油单酸酯、二乙酰化甘油单酸酯和泊洛沙姆。聚山梨酸酯是聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，其是山梨糖醇及其酸酐的一系列偏脂肪酸酯，与每摩尔山梨糖醇及其酸酐的约20、5或4摩尔环氧乙烷共聚。聚山梨酸酯的非限制性实例是聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯21、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯61、聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯81、聚山梨酸酯85和聚山梨酸酯120。包含约20摩尔环氧乙烷的聚山梨酸酯是亲水性非离子表面活性剂。包含约20摩尔环氧乙烷的聚山梨酸酯的实例包括聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85和聚山梨酸酯120。聚山梨酸酯可从Croda商业获得，商品名为TWEEN^TM。聚山梨酸酯的编号标识对应于TWEEN的编号标识，例如，聚山梨酸酯20为TWEEN 20，聚山梨酸酯40为TWEEN 40，聚山梨酸酯60为TWEEN 60，聚山梨酸酯80为TWEEN 80等。USP/NF等级的聚山梨酸酯包括聚山梨酸酯20NF、聚山梨酸酯40NF、聚山梨酸酯60NF和聚山梨酸酯80NF。聚山梨酸酯也可采用PhEur级(欧洲药典)、BP级和JP级。术语“聚山梨酸酯”是非专有名称。聚山梨酸酯20的化学名称为聚氧乙烯20脱水山梨醇单月桂酸酯。聚山梨酸酯40的化学名称为聚氧乙烯20脱水山梨醇单棕榈酸酯。聚山梨酸酯60的化学名称为聚氧乙烯20脱水山梨醇单硬脂酸酯。聚山梨酸酯80的化学名称为聚氧乙烯20脱水山梨醇单油酸酯。在一些实施方案中，悬浮液可包含聚山梨酸酯的混合物。在一些实施方案中，悬浮液包含聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯65、聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯85和/或聚山梨酸酯120。在其他实施方案中，悬浮液包含聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯40、聚山梨酸酯60和/或聚山梨酸酯80。在一个实施方案中，该悬浮液包含聚山梨酸酯80。

悬浮液可包含一种或多种张力调节剂。合适的张力调节剂包括但不限于例如一种或多种无机盐、电解质、氯化钠、氯化钾、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠、硫酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钠以及碱土金属盐(例如碱土金属无机盐，如钙盐和镁盐)、甘露糖醇、葡萄糖、甘油、丙二醇及其混合物。

悬浮液可包含一种或多种缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、盐酸、氢氧化钠、三(羟甲基)氨基乙烷、双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷和碳酸氢钠以及其他本领域普通技术人员已知的类型。缓冲液通常用于将pH调节至腹膜内使用的理想范围。通常pH值约为5至9、5至8、6至7.4、6.5至7.5、或6.9至7.4是理想的。

悬浮液可包含一种或多种缓和剂。缓和剂是在粘膜上形成舒缓膜的试剂，所述粘膜例如是衬在腹膜和其中的器官的膜。缓和剂可以减轻轻微的疼痛和炎症，有时被称为粘膜保护剂。当与本文所述的另一种聚合物缓和剂一起使用时，合适的缓和剂包括约0.2至约2.5％的纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和甲基纤维素；约为0.01％的明胶；约0.05-1％的多元醇，例如甘油、聚乙二醇300、聚乙二醇400和丙二醇；约0.1至约4％聚乙烯醇；约0.1％至约2％聚维酮；以及约0.1％的右旋糖酐70。

悬浮液可包含一种或多种碱化剂以调节pH。如本文所用，术语“碱化剂”旨在表示用于提供碱性介质的化合物。此类化合物包括但不限于，例如氨溶液、碳酸铵、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠和本领域的普通技术人员已知晓的其他化合物。

该悬浮液可以包含一种或多种用于调节pH值的干燥剂。如本文所用，术语“酸化剂”旨在表示用于提供酸性介质的化合物。这样的化合物包括但不限于例如乙酸、氨基酸、柠檬酸、硝酸、富马酸和其他α-羟基酸、盐酸、抗坏血酸和硝酸以及本领域普通技术人员已知的其他化合物。

悬浮液可包含一种或多种消泡剂。如本文所用，术语“消泡剂”是指防止或减少填充组合物表面上形成的泡沫量的一种或多种化合物。合适的消泡剂包括但不限于，例如二甲聚硅氧烷、SIMETHICONE、辛醇和本领域普通技术人员已知的其他消泡剂。

悬浮液可包含一种或多种增加或降低悬浮液粘度的粘度调节剂。合适的粘度调节剂包括甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甘露醇和聚乙烯基吡啶酮。

在一些实施方案中，紫杉烷颗粒存在于还包含聚山梨酸酯的悬浮液中。在一个特定的实施方案中，紫杉烷颗粒存在于还包含聚山梨酸酯的悬浮液中，其中聚山梨酸酯为聚山梨酸酯80。在其他实施方案中，聚山梨酸酯或聚山梨酸酯80以约0.01％v/v至约1.5％v/v的浓度存在于悬浮液中。发明人惊奇地发现，列举的非常少量的聚山梨酸酯80降低了紫杉烷颗粒与悬浮液中的水性载体(例如盐水)的界面处的表面张力。在一些实施方案中，颗粒可以用聚山梨酸酯或聚山梨酸酯80包衣，在其他实施方案中，颗粒不用聚山梨酸酯或聚山梨酸酯80包衣。在各种其他实施方案中，聚山梨酸酯或聚山梨酸酯80以约0.01％v/v至约1％v/v、约0.01％v/v至约0.5％v/v、约0.01％v/v至约0.4％v/v、约0.01％v/v至约0.25％v/v、约0.05％v/v至约0.5％v/v、约0.05％v/v至约0.25％v/v、约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.1％v/v至约0.25％v/v、约0.1％v/v、约0.16v/v或约0.25％v/v的浓度存在于悬浮液中。在其他实施方案中，紫杉烷，例如紫杉醇，以约1mg/ml至约40mg/ml、或约6mg/ml至约20mg/ml的浓度存在于悬浮液中。在各种其他实施方案中，紫杉烷以约6mg/ml至约15mg/ml、约6mg/ml至约10mg/ml、约10mg/ml至约20mg/ml、约10mg/ml和约15mg/ml、约6mg/ml、约10mg/ml或约15mg/ml的浓度存在于悬浮液中。在各种其他实施方案中，组合物中的水性载体可以是盐水，例如约0.9％的氯化钠。

实施例1紫杉醇颗粒(即：本文所公开的紫杉醇颗粒，约98％的紫杉醇，其平均粒径(数字)为0.83μm，SSA为27.9m²/g，堆积密度(未振实)为0.0805g/cm³，用于实施例1、2、3和4)的悬浮液——安全性和药效开发项目-Sprague Dawley大鼠的初步药动学研究(PilotPharmacokinetic Study)

研究编号：FY17-008A

执行概述

该初步研究的目的是为使用紫杉醇颗粒悬浮液制剂进行完整动力学研究(PK)的研究确定采样时间点。由于紫杉醇颗粒制剂的潜力增加了在肺中的滞留性，因此对0.5至168小时的9个时间点进行了评估，以确定进行完整药理学研究的合适采样策略。

十六只(16)Sprague Dawley大鼠仅经鼻一次吸入就暴露于紫杉醇颗粒制剂(目标剂量为0.37mg/kg)。在暴露后的0.5、6、12、24、48、72、120和168小时的指定时间点对两只动物(n＝2)实施安乐死。收集血液(血浆)和肺组织样本。

在暴露当天，按照生产商提供的说明制备紫杉醇颗粒制剂(6mg/mL)。

所有动物的总的气雾剂的暴露时间为63分钟。在整个63分钟的紫杉醇颗粒制剂气雾剂的暴露过程中，通过测量堆积在仅鼻暴露室中呼吸区的47毫米GF/A过滤器上的制剂量来监测气雾剂浓度。使用来自暴露室上动物呼吸区的Mercer型级联撞击器测量气雾剂颗粒尺寸(液滴尺寸)。

使用两个Hospitak压缩空气喷射雾化器雾化紫杉醇颗粒悬浮液制剂(紫杉醇平均气雾剂浓度：目标82.65μg/L)。从GF/A过滤器测得的总平均气雾剂浓度为0.24mg/L，紫杉醇的平均气雾剂浓度为73.5μg/mL。测得粒度分布为2.0μmMMAD，GSD为2.2。测得的平均紫杉醇气雾剂浓度为73.5μg/L，比目标平均紫杉醇气雾剂浓度82.65μg/L低了11％(在分析测定的准确性/回收性能标准为±15％内)。在整个紫杉醇颗粒制剂气雾剂暴露过程中监测氧气和温度。记录的氧气和温度范围分别为19.7％-20.9％和20.4℃-20.8℃。

紫杉醇在肺部的沉积剂量是根据紫杉醇的平均气雾剂浓73.5μg/L、平均啮齿动物体重326g、假定沉积分数为10％和暴露持续时间为63分钟计算得出的。确定达到的平均啮齿动物沉积剂量为0.33mg/kg。与0.37mg/kg的目标沉积剂量相比，平均达到的沉积剂量低约11％，但在雾化暴露的预期变化范围内(与目标相差±15％)。

所有动物存活到其指定的尸检时间点。尸检时，几只动物的肺部仅有很少的红色变色。尸检时未发现其他异常总体观察。从尸检中获得体重和肺重量，所有时间点动物的平均终末体重(标准差)为346.26g(24.01)；平均肺重(标准差)为1.60g(0.13)。

通过液相色谱-质谱(LCMS)分析法检测全身血液(来自K₂EDTA的血浆形式)，并按照第4.6节(生物分析)中简要介绍的方法检测肺组织，以定量紫杉醇作为时间的函数。肺组织分析显示，在168小时内，肺部暴露有可检测量的紫杉醇。24小时后，全身血液显示未检测到紫杉醇(低于1ng/mL)。根据这些数据，建议对PK研究采用以下采样时间点：吸入暴露后0.5(±10分钟)、6(±10分钟)、12(±10分钟)、24(±30分钟)、48(±30分钟)、72(±30分钟)、120(±30分钟)、168(±30分钟)、240(±30分钟)和336(±30分钟)。

目标

初步研究的目的是为使用紫杉醇颗粒制剂的完整药代动力学(PK)研究确定采样时间点。通过腹膜内(IP)注射给予紫杉醇颗粒制剂的初步数据表明在腹膜腔内有明显的保留时间。由于紫杉醇颗粒制剂可能导致其在肺中的滞留增加，因此对168小时的时间进行了评估，以确定用于完整药代动力学研究的适当采样策略。

材料和方法

测试系统

物种/株：Sprague Dawley大鼠

研究开始时的动物年龄：8-10周龄

研究开始时的动物体重范围：308-353g

研究数量/性别：18只雄性(16只研究动物和2只备用动物)

来源：Charles River Laboratories(Kingston，NY)

标识：Permanent maker尾部标记

测试与对照品制剂和施用

根据生产商提供的说明制备紫杉醇颗粒悬浮液制剂(6mg/mL)。简要地，将0.02mL的1％聚山梨醇酯80加入到含有紫杉醇颗粒(306mg)的小瓶中。剧烈摇晃紫杉醇颗粒悬浮液小瓶，然后倒转以确保润湿小瓶中存在的所有颗粒。摇动后，立即向小瓶中加入46mL的0.9％氯化钠，并摇动小瓶至少1分钟，以确保充分混合并适当分散悬浮液。将所得制剂放置至少5分钟，以减少小瓶中的任何空气/泡沫，然后将其放入喷雾器中进行雾化工作。将最终制剂保持在室温下，并在重构后3小时内使用。

实验设计

十六只(16)Sprague Dawley大鼠仅经鼻一次吸入就暴露于紫杉醇颗粒悬浮液制剂(目标剂量为0.37mg/kg)。在暴露后0.5(±10分钟)、6(±10分钟)、12(±10分钟)、24(±30分钟)、48(±30分钟)、72(±30分钟)、120(±30分钟)和168(±30分钟)小时处对两只动物(n＝2)实施安乐死，收集血液(血浆)和肺组织。没有进行特定的PK建模；相反，数据将为PK研究确定紫杉醇暴露后可检测量的持续时间。

饲养、检疫和研究分配

从Charles River Laboratories(Kingston，NY)获得雄性Sprague Dawley大鼠(6-8周大)，并隔离14天。在隔离结束时，对动物称重，然后按体重随机分配以进行研究。通过尾标和笼卡鉴定动物。使用标准技术维护和监控水、光照、湿度和温度控制。在非接触时间随意给大鼠喂食标准啮齿动物饮食。

体重和每日观察

在整个研究期间和安乐死时每天随机收集体重。比较医学动物资源(CMAR)人员每天对研究中的每只动物进行两次观察，观察是否有任何异常、濒死或死亡的临床迹象。

仅经鼻的气雾剂暴露

适应(conditioning)

使用标准技术，将动物置于仅鼻暴露管中长达70分钟。暴露前三天进行了三次适应，第一次为时30分钟，第二次为60分钟，第三次为70分钟。在准备工作的整个过程中以及在暴露过程中都对他们进行了密切的监视，以确保他们不会遭受短暂的痛苦。

暴露系统

吸入暴露系统由两个压缩空气喷射雾化器(Hospitak)和啮齿动物仅鼻吸入暴露室组成。在整个暴露过程中监测暴露的氧气水平(％)。用一组两个压缩空气喷射雾化器(使用长达40(±1)分钟，然后用第二组两个压缩空气雾化器替换以保持剩余暴露时间)生成紫杉醇颗粒悬浮制剂气雾剂，入口压力为20psi。将气雾剂引导通过24英寸的不锈钢气雾剂输送管线(直径为1.53厘米)进入仅鼻暴露室。

浓度监测

通过将气雾剂收集到预先称重的GF/A 47mm过滤器上来进行气雾剂浓度监测。在整个啮齿动物暴露期间，从仅鼻暴露室的啮齿动物呼吸区域采样过滤器。通过GF/A过滤器的气雾剂采样流速保持在1.0±0.5L/分钟。总共收集了六个GF/A过滤器，在整个暴露时间内每10分钟收集一个，除了最后一个过滤器是在13分钟后收集的。样品收集后，称重过滤器以测定暴露系统中的总气雾剂浓度。提取滤膜并通过高效液相色谱法(HPLC)进行分析，以量化每个滤膜上收集的紫杉醇的量。用每个过滤器的总气雾剂浓度和紫杉醇气雾剂浓度通过除以通过过滤器的总气流收集的气雾剂和紫杉醇气雾剂的总量来计算。通过如下所述的方程1，使用紫杉醇的平均气雾剂浓度计算紫杉醇在啮齿动物肺部的平均沉积剂量。

粒度测定

气雾剂的粒径分布是通过Mercer型七级串联撞击器(Intox Products，Inc.，Albuquerque，NM)从仅鼻暴露室的啮齿动物呼吸区测量的。根据质量中值空气动力学直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)确定粒度分布。级联撞击器样品以2.0±0.1L/分钟的流速收集。

剂量测定

使用方程1计算沉积剂量。在该计算中，使用了根据暴露量测得的平均气雾剂浓度以及大鼠的平均组体重。以这种方式，使用测得的紫杉醇气雾剂浓度计算出沉积在大鼠肺中的紫杉醇的估计量。

其中

沉积剂量＝(DD)μg/kg

²呼吸分钟量(RMV)＝0.608x BW^0.852

气雾剂暴露浓度(AC)＝紫杉醇气雾剂浓度(μg/L)

沉积分数(DF)＝假设的沉积分数为10％

BW＝受研究动物的平均体重(随机；第-1天)(千克)

安乐死和尸检

通过腹腔注射安乐死溶液对动物实施安乐死。尸检期间，通过心脏穿刺将血液(用于血浆)收集到K₂EDTA管中，称重肺，收集肺组织样本，并在液氮中速冻以进行生物分析。此外，由合格的尸检人员进行了全面的总体检查。检查了身体的外表面、孔口以及颅腔、胸腔和腹腔的内容物。使用一组词汇术语描述和记录病变，这些术语涉及形态、数量、形状、颜色、稠度和严重性。

生物分析

通过液相色谱-质谱(LCMS)测定法测定全身血液(来自K₂EDTA的血浆形式)和肺组织，以定量紫杉醇的量随时间的变化。简而言之，该测定利用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)测定来定量紫杉醇。通过蛋白质沉淀法提取血浆样品，并通过反相色谱分离。肺样品用水以4∶1的比例匀浆(水：肺组织)。然后在LCMS上分析之前，匀浆经过相似的蛋白质沉淀方法。使用基于矩阵的校准曲线进行定量。

未对这些数据进行药代动力学建模。但是，紫杉醇降至检测灵敏度极限(1ng/mL)以下的浓度用于确定主要PK研究的采样时间点。

结果

临床观察与生存

所有动物均存活至其指定的尸检时间点并体重增加，在研究期间未观察到异常的临床观察。

紫杉醇颗粒暴露

气雾剂浓度

表1显示了在暴露期间通过对每个GF/A过滤器进行采样而测得的总气雾剂和紫杉醇气雾剂浓度。吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度为73.5μg/L，比目标平均紫杉醇气雾剂浓度目标值为82.65μg/L低约11％。平均暴露气雾剂浓度在目标气雾剂浓度的±15％以内，这是雾化吸入暴露所期望的。

表1.FY17-008A吸入暴露期间的气雾剂浓度。

氧气和温度

记录的氧气和温度范围分别为19.7％至20.9％和20.4℃至20.8℃。

粒径

使用级联撞击器，对于6.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂气雾剂，根据MMAD(GSD)确定了粒度分布，为2.0(2.2)μm。

沉积剂量

基于紫杉醇的平均气雾剂浓度为73.5μg/L，第1天(随机)啮齿动物的平均体重为326g，假设沉积分数为10％，暴露时间为63分钟；测定的平均获得的啮齿动物沉积剂量为0.33mg/kg。与目标沉积剂量0.37mg/kg相比，平均达到的沉积剂量低约11％，这是由于暴露的平均气雾剂浓度存在预期的变化(相对于目标为±13％)。

尸检

所有动物存活到其指定的尸检时间点。尸检时，几只动物的肺部仅有最小的红色变色。尸检时未发现其他异常总体观察。确定个体和平均肺重，体重和比例。平均终端体重(标准偏差)为346.26g(24.01)。

平均肺重(标准差)为1.60g(0.13)。器官肺的重量和肺的重量与体重之比是用于评估对吸入材料的潜在毒理学响应的常用参数。总体而言，数据与历史数据一致，表明这些端点中的任何一个均未响应。

生物分析

结果总结在下面的表2和图1中。暴露后0.5小时时血浆中紫杉醇的平均浓度为16.705ng/mL，然后在24小时内逐渐降低，并且在所有后续时间点均低于定量下限(1ng/mL)。暴露后0.5小时，肺组织中紫杉醇的平均浓度为21940ng/g，到168小时的时间点逐渐降低至419.6ng/g。这表明紫杉醇颗粒在肺部的显著保留，且全身暴露量最小。

表2肺组织和血浆结果

结论

十六只(16)雄性Sprague Dawley大鼠仅经鼻一次吸入就暴露于紫杉醇颗粒制剂气雾剂(目标剂量为0.37mg/kg)。在暴露后0.5、6、12、24、48、72、120和168小时对两只动物(n＝2)实施安乐死以收集血液(血浆)和肺组织。

在63分钟的吸入暴露过程中，紫杉醇的平均气雾剂浓度为73.5μg/L，比紫杉醇的平均目标气雾剂浓度82.65μg/L低11％。平均暴露气雾剂浓度在目标气雾剂浓度的±15％以内，这是雾化吸入暴露所期望的。使用级联撞击器将6.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂气雾剂的以MMAD(GSD)计的粒径分布确定为2.0(2.2)μm。记录的氧气和温度范围分别为19.7％-20.9％和20.4℃-20.8℃。

紫杉醇的沉积剂量是根据紫杉醇的平均气雾剂浓度为73.5μg/L、平均啮齿动物的体重326g、假定的沉积分数为10％和暴露时间为63分钟计算得出的。确定达到的平均啮齿动物沉积剂量为0.33mg/kg。与预期的0.37mg/kg的目标剂量相比，由于预期的变异性(与目标值相差±15％)，平均达到的沉积剂量要低约11％。

所有动物都存活到其计划的尸检时间点。尸检时，几只动物的肺部仅有很少的红色变色。尸检时未发现其他异常的总体观察。从尸检中获得体重和肺重量，平均终末体重(标准差)为346.26g(24.01)；平均肺重(标准差)为1.60g(0.13)。器官肺的重量以及肺重量与体重之比是用于评估对吸入材料的潜在毒理学响应的常用参数。总体而言，数据表明在这些终点均未响应。

暴露后0.5小时血浆中紫杉醇的平均浓度为16.705ng/mL，然后在24小时时间点逐渐降低，并在24小时后的所有时间点均低于定量下限。暴露后0.5小时，肺组织中紫杉醇的平均浓度为21940ng/g，到168小时的时间点逐渐降低至419.6ng/g。这表明紫杉醇颗粒在肺部的显著保留，且全身暴露量最小。建议对PK研究使用以下采样时间点：0.5(±10分钟)、6(±10分钟)、12(±10分钟)、24(±30分钟)、48(±30分钟)、72(±30分钟)分钟、120(±30分钟)、168(±30分钟)、240(±30分钟)和336(±30分钟)小时。

实施例2：FY17-008B研究-紫杉醇颗粒气雾剂吸入暴露研究

执行摘要

这项工作的总体目标是使用6.0mg/mL和20.0mg/mL的紫杉醇颗粒悬浮液制剂对雄性大鼠进行仅鼻吸入暴露。大鼠吸入暴露各进行65分钟。

根据生产商提供的说明制备6.0mg/mL和20.0mg/mL的紫杉醇颗粒悬浮液制剂。同时在20psi下使用两个Hospitak压缩空气喷射雾化器将紫杉醇颗粒制剂雾化到啮齿类动物吸入暴露室内。在每次暴露期间，通过以1.0±0.5L/min的流速取样到47毫米GF/A过滤器上，从动物呼吸区测量气雾剂浓度。通过使用Nfercer式级联撞击器以2.0±0.1L/min的流速采样来自动物呼吸区的气雾剂来确定粒径。重量分析过滤器以确定总紫杉醇颗粒气雾剂浓度，并通过高效液相摄影法(HPLC)测定每次暴露的紫杉醇气雾剂浓度。在整个吸入过程中监测氧气并记录温度。

对于使用6.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂的吸入暴露，紫杉醇颗粒的平均总气雾剂浓度和紫杉醇气雾剂浓度分别确定为0.25mg/L且RSD为7.43％以及85.64μg/L且RSD为10.23％。对于6.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂气雾剂，使用级联冲击器测得的平均质量中值空气动力学直径(几何标准偏差)为1.8(2.0)μm。对于使用20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂进行的吸入暴露，紫杉醇颗粒的平均气雾剂总浓度和紫杉醇气雾剂浓度分别确定为0.46mg/L且RSD为10.93％以及262.27μg/L且RSD为11.99％。对于20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂气雾剂，使用级联撞击器测得的平均质量中位数空气动力学直径(几何标准偏差)为2.3(1.9)μm。

使用方程1分别计算6.0mg/mL和20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂暴露65分钟计算得出平均紫杉醇沉积剂量分别为0.38mg/kg和1.18mg/kg的。

配制和吸入暴露

制剂准备

材料

测试品

吸入暴露所用的测试品如下所示。

紫杉醇颗粒

标识：紫杉醇颗粒(无菌)

描述：紫杉醇的新型干粉制剂，以306mg/小瓶的形式提供

供应商：US Biotest

制造商：CritiTech

储存条件：环境

载体

制备紫杉醇微粒制剂的载体如下所示。

聚山梨酸酯80

标识：注射用0.9％氯化钠中的无菌1％聚山梨酸酯80

描述：透明液体

供应商：US Biotest

制造商：CritiTech

储存条件：环境

生理盐水

标识：无菌注射用0.9％氯化钠，USP

描述：透明液体

制造商：Hospira，Inc，IL

储存条件：环境

制剂和吸入接触

制剂准备

如下制备6.0mg/mL的紫杉醇颗粒制剂：简要地，将0.02mL的1％聚山梨酸酯80加到含有紫杉醇颗粒(306mg)的小瓶中。将小瓶剧烈振摇并倒置以确保润湿小瓶中存在的所有颗粒。摇动后，立即向小瓶中加入46mL的0.9％氯化钠溶液，并将小瓶摇动至少1分钟，以确保充分混合并适当分散悬浮液。

将上述针对6.0mg/mL制剂的紫杉醇颗粒制剂步骤用于制备20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂，但向小瓶中添加10.3mL的0.9％氯化钠溶液，以代替用于6.0mg/mL制剂的46mL。

将所得制剂放置至少5分钟，以减少小瓶中的任何空气/泡沫，然后将其放入喷雾器中进行雾化工作。将6.0mg/mL的最终制剂保持在室温下并在配制后2小时内雾化。20.0mg/mL的最终制剂保持在室温下，并在重构后30分钟内雾化。

实验设计

将三十(30)只Sprague Dawley大鼠暴露于单次“临床参考”剂量的静脉内

(紫杉醇：目标剂量为5.0me/kg)，三十(30)只Sprague Dawley大鼠暴露于本文所公开的紫杉醇颗粒制剂中(目标剂量为0.37mg/kg)和三十只(30)Sprague Dawley大鼠通过仅一次鼻子吸入就暴露于紫杉醇颗粒制剂(目标剂量为1.0mg/kg)。3只动物(n＝3)在暴露后0.5(±10分钟)、6(±10分钟)、12(±10分钟)、24(±30分钟)、48(±30分钟)、72(±30分钟)、120(±30分钟)、168(±30分钟)、240(±30分钟)和336(±30分钟)小时处被安乐死以采集血液(血浆)和肺组织。对每个剂量组的血浆和肺组织进行非房室分析，以确定紫杉醇暴露后可检测量的持续时间。

暴露系统设置/气雾剂生成：如实施例1所示

气雾剂浓度监测：如实施例1所示

粒度分布：如实施例1所示

沉积剂量计算：如实施例1所示

结果

暴露结果

气雾剂浓度和粒径

使用仅经鼻暴露室中动物呼吸区的47mm GF/A过滤器，监测每次紫杉醇颗粒制剂气雾暴露的气雾剂浓度。每次暴露期间，采样了七个47mm GF/A过滤器。在每个低剂量和高剂量组中，过滤器FS-1至FS-6分别取样10分钟，过滤器FS-7取样5分钟。使用来自暴露室上动物呼吸区的Mercer型级联撞击器测量粒度。表3和表4分别显示了在低剂量和高剂量暴露期间通过对GF/A过滤器进行采样而测得的总和紫杉醇气雾剂浓度。

表3.FY17-008B低剂量吸入暴露期间的气溶胶浓度。

表4.FY17-008B高剂量吸入暴露期间的气溶胶浓度。

使用级联撞击器，将每种紫杉醇颗粒的粒径(气雾剂液滴尺寸)分布均以MMAD(相对于空气动力学直径的空气中颗粒质量分布的中位数)(GSD；伴随MMAD测量来表征粒径分布的变化)确定的紫杉醇颗粒制剂气雾剂。对于6.0mg/mL和20.0mg/mL的紫杉醇颗粒制剂气雾剂，MMAD(GSD)分别确定为1.8(2.0)μm和2.3(1.9)μm。图2和图3分别显示了6.0mg/mL和20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂气雾剂的粒径分布。

沉积剂量

紫杉醇的沉积剂量是根据紫杉醇的平均气雾剂浓度、平均大鼠体重、假设沉积分数为10％，低剂量和高剂量的紫杉醇颗粒制剂各65分钟的暴露时间通过方程1计算得出的。表5示出了针对每个暴露的平均紫杉醇气雾剂浓度、平均大鼠体重、暴露时间和沉积剂量。紫杉醇颗粒制剂暴露于6.0mg/kg和20.0mg/kg时确定平均获得的啮齿动物沉积剂量分别为0.38mg/kg和1.18mg/kg。

表5.针对低剂量和高剂量紫杉醇颗粒制剂的吸入暴露的紫杉醇沉积剂量。

氧气和温度

在整个紫杉醇颗粒制剂气雾剂暴露过程中监测氧气和温度。对于6.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂的暴露，记录的氧气和温度范围分别为19.8％-20.9％和20.7℃-20.8℃。对于20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂的暴露，整个暴露过程中记录的氧气值为19.8％，温度范围为20.7℃至20.8℃。

初步数据如图4-6所示。

实施例3：评估裸鼠原位肺癌模型中吸入紫杉醇颗粒制剂的药效-FY17-095研究

执行概述

在第-1天，对一百二十七(127)只NIH-mu裸鼠进行了X射线辐照以诱导免疫抑制。在第0天，通过气管内滴注动物Calu3肿瘤细胞。动物经历了三个星期的生长期。在第三周，通过体重分层将动物随机分为5个研究组。从第4周开始，第2组中的动物在第22、29和36天通过静脉内(IV)给药(5mg/kg)每周一次接受

第3组和第4组的动物分别每周一次(星期一)吸入(INH)低剂量(0.5mg/kg)和高剂量(1.0mg/kg)的紫杉醇颗粒制剂，第5组和第6组的动物分别以低剂量(0.50mg/kg)和高剂量(最高1.0mg/kg)每周两次(星期一和星期四)接受紫杉醇颗粒制剂的目标吸入剂量。组1中的动物未经治疗作为正常肿瘤细胞生长的对照。在第8周对所有动物进行尸检。

所有动物存活到其指定的尸检时间点。与该模型有关的临床观察包括皮疹和呼吸困难。在整个研究过程中，所有组的体重增加率均大致相同。

每周一次低剂量和每周两次低剂量紫杉醇颗粒制剂组的吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度分别为270.51μg/L和263.56μg/L。每周一次高剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次高剂量紫杉醇颗粒制剂组的吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度分别为244.82μg/L和245.76μg/L。

剂量基于平均气雾剂紫杉醇浓度、最近的平均组体重、假定的沉积分数10％和33分钟(低剂量)或65分钟(高剂量)的暴露持续时间。在治疗的四个星期中，每周一次低剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次低剂量紫杉醇颗粒制剂组的平均达到的啮齿动物沉积剂量分别为0.655mg/kg和0.640mg/kg(1.28mg/kg/周)。每周一次高剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次高剂量紫杉醇颗粒制剂组的平均获得的啮齿动物沉积剂量分别为1.166mg/kg和1.176mg/kg(2.352mg/kg/周)。对于接受静脉注射

的组，在第22、29和36天的平均剂量分别为4.94、4.64和4.46mg/kg。

在预定的尸检中，每组的大多数动物的肺部都有棕褐色结节和/或肺部出现红色或棕褐色斑片状变色。其他零星的观察结果包括一只动物的腹部疝气和另一只动物的心包结节。尸检时未发现其他异常总体观察。

与未经治疗的对照组相比，在经

处理的动物的肺重量、肺与BW的比率以及肺与脑的重量的比率显著降低。每周一次的紫杉醇颗粒制剂高剂量组的体重与

组具有相似的重量，且与未治疗的对照组相比，具有显著降低的肺重量和肺与脑的比例。

从组织学上讲，所有组中大多数动物的肺部都有一些肿瘤形成的证据。肿瘤形成的特征是存在随机分布在肺实质内的可膨胀的大小不等的小肿块，以及较大的扩张和合并肿块，这些肿块最多可累及肺实质的75％，较小的气道和血管。较大的肿块主要分布在肺门区域或并列于轴向气道，较小的肿块通常位于周围。

肺部肿瘤肿块的主要形态细胞特征从未分化到分化程度相当高的形态的肺的腺癌不等。主要的肿瘤细胞类型显示出未分化的腺癌形态。细胞为多形性，大的，间变性的，无色的两性霉素染色，胞浆中有类似于粘液囊泡的细小空泡，表现为中度到明显的异核生物，并被观察到个体化或成片生长，缺乏清晰的分化为腺癌的特征。但是，在其他肿块中观察到或在先前描述的未分化肿块中观察到的细胞形态特征更加有条理并且与充分分化的肺腺癌一致，表明腺泡明显分化。这些两性染色的肿瘤细胞主要排列成巢状或腺状，并被肺泡隔隔开。在该肿瘤细胞群中很少观察到有丝分裂图。在这些肿块中较少见到的是原始出现的相对较小的原始肿瘤细胞的病灶区，这些细胞具有少量至中等量的淡嗜碱性染色细胞质、卵圆形和可变的囊泡核、以及中等的肛门异位症。观察到这些原始肿瘤细胞随机生长并成片生长。在这种嗜碱性原始肿瘤细胞群中，最常见的是有丝分裂图和凋亡小体数量增加。通常观察到炎症，其特征在于混合的炎症细胞(主要是嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、泡沫巨噬细胞和偶发的巨细胞)浸润并伴有间质纤维化。实质性坏死很少见。

病理学家认为以肿瘤细胞逐渐丧失为特征的单个肿瘤块边缘的扇贝状存在，以通过残余的肺实质性纤维化结缔组织支架并伴有泡沫性巨噬细胞的侵袭而完全消除肿瘤细胞是肿瘤消退的证据。。

与阳性对照比较组1以及

处理的比较组2，紫杉醇颗粒制剂处理的组(组3-6)的总体肺肿瘤负荷降低，其特征在于腺癌肿瘤块和原始肿瘤细胞群的严重性降低以及肿瘤消退的证据。没有观察到其他与治疗相关的病变或发现。在通过吸入接受紫杉醇颗粒制剂的动物的肺中观察到广泛的单核细胞浸润。由于所用模型缺乏T细胞，因此可能是B细胞或NK细胞。据推测，紫杉醇颗粒对肿瘤的局部的、可能更高浓度的暴露会影响肿瘤，导致环境改变使得单核细胞浸润到肺中。

目标

该研究的目的是评估与临床参考剂量的静脉内施用

相比，吸入紫杉醇颗粒制剂在减少肺癌原位模型中的肿瘤负荷方面的药效。

材料和方法

测试系统

种/株：NIH-mu裸鼠

研究开始时的动物年龄：3-5周龄

研究开始时的体重范围：大约150-200克

研究数量/性别：127雄性(120动物和7备用)

来源：Envigo

标识：Permanent maker尾部标记

配方

用于静脉注射制剂的临床参考材料是药品

给药当天用盐水将药物产品复溶至5.0mg/mL，并按照制造商的说明进行存储。

紫杉醇颗粒制剂

根据生产商的建议，制备20.0mg/ml紫杉醇颗粒制剂进行暴露。具体而言，紫杉醇颗粒用1％的聚山梨酸酯80复溶。用手摇动小瓶，直到所有颗粒都被润湿。加入另外的0.9％注射用氯化钠(达到所需的浓度目标)，并将小瓶用手摇动另外一分钟。继续摇晃直到看不到大块并且悬浮液被适当分散。

在将其放置在雾化器中进行雾化工作之前，应将所得的制剂至少保持至少5分钟的时间以减少小瓶中的任何空气/泡沫。将最终制剂保持在室温下，并在重构后2小时内将其雾化。最终的20.0mg/mL保持在室温下，并在重建后30(+5)分钟内雾化。

实验设计

一百二十七(127)只动物用于研究。在对肿瘤细胞进行x射线照射和剂量给药之前，将7只动物指定为备用动物(备用动物未进行射线照射或细胞系滴注)。在第-1天，对所有研究动物进行X射线照射以诱导免疫抑制。在第0天，通过气管内(IT)滴注给动物施用Calu3肿瘤细胞。动物经历了三个星期的生长期。在第三周期间，通过体重分层将动物随机分为下表6中总结的组。从第4周开始，第2组的动物通过静脉内(IV)给药每周接受一次目标剂量(5mg/kg)的

第3组和第4组的动物每周一次(星期一)分别以低剂量(0.5mg/kg)和高剂量(1.0mg/kg)吸入目标剂量的紫杉醇颗粒制剂。第5组和第6组的动物每周两次(星期一和星期四)以低(0.5mg/kg)和高(1.0mg/kg)吸入目标剂量的紫杉醇颗粒制剂。组1中的动物未经治疗作为正常肿瘤细胞生长的对照组。在第8周内对所有动物进行了尸检。

饲养、检疫、分配至研究

隔离后，对所有动物称重并根据体重随机分配以除去7个备用动物。从第1周到第3周，通过笼卡(LC编号)和尾标识别动物。

在开始治疗前的第3周，将动物称重，并按照体重分层将其随机分为上述组，并分配研究编号。从这一点开始，通过笼卡和sharpie尾标来识别动物。

免疫抑制和辐照

在第1天，对动物进行了约500rads的全身X射线暴露(Phillips RT 250X射线治疗装置，Phillips Medical Systems，Shelton，CT)，其设置为250kVp，15mA，并且源到对象的距离为100厘米。将动物放置在饼室单元中，每片饼2-3动物。辐照过程花费约10-15分钟。

肿瘤细胞植入

在第0天，动物接受通过IT施用的肿瘤细胞(Calu3)。简而言之，在诱导室中用3％至5％的异氟烷麻醉后，将动物的上切牙钩在倾斜的滴灌平台上。轻轻将动物的舌头固定住，同时将管心针插入刚好穿过喉咙并进入气管。经由气管内滴注将EDTA悬浮液中的一定体积的细胞(目标剂量体积：500μL；浓度：每0.5mL约20×10⁶)递送至肺。滴注后，仔细监测动物的呼吸和运动。肿瘤细胞植入后，动物在治疗之前经历了大约3周的肿瘤生长期，以允许肿瘤细胞移植和肺癌的发展。

Calu3的生长和制备

Calu3细胞在37℃，5％CO₂的细胞培养瓶中生长。它们在含有10％胎牛血清(FBS)的罗斯韦尔公园纪念研究所(RPMI)1640培养基中生长，直至融合达到80％。维持细胞直至滴注当天。在滴注之前，通过用PBS洗涤收集它们，然后加入胰蛋白酶以从烧瓶中除去细胞。用含有10％FBS的RPMI 1640培养基中和细胞。然后将它们以100xg离心5分钟。除去培养基，将细胞重悬于450μL无血清RPMI中的2000万个细胞浓度。滴注前，将50μL的70μM EDTA加入细胞悬液中，每只大鼠的IT总剂量为500μL。

体重和每日观察

整个第3周每周一次、从第4周开始到研究结束每周两次、并且在尸检时，收集体重进行随机分组。

每天两次观察每只接受研究的动物是否有异常、发病或死亡的临床迹象。技术人员在给药和体重期观察动物。

给药IV-尾静脉注射

在第22、29和36天通过IV尾静脉注射向组2中的动物施用

(5mg/mL，最大剂量体积为250μL)。

紫杉醇颗粒制剂给药-仅经鼻气雾剂暴露调节

使动物适应仅经鼻暴露管长达70分钟。暴露前三天进行了三次适应，第一次为时30分钟，第二次为60分钟，第三次为70分钟。在整个适应期间和暴露期间都要对它们进行密切监测，以确保它们不会遭受短暂的痛苦。

暴露系统

用两个压缩空气喷射的Hospitak雾化器在20psi的雾化器压力下生成气雾剂，如图7所示。20.0mg/mL的紫杉醇颗粒悬浮液制剂用于低剂量和高剂量暴露。将气雾剂通过输送管线导入32端口仅经鼻暴露室。进行啮齿动物吸入暴露33分钟或65分钟，用一组两个Hospitak压缩空气喷射雾化器(使用长达40(±1)分钟)产生紫杉醇颗粒悬浮气雾剂，然后用第二组两个Hospitak雾化器持续剩余的暴露时间。在每次吸入暴露过程中都要监测并记录氧气和温度。

浓度监测

通过将气雾剂收集到预先称重的GF/A 47毫米过滤器上来进行气雾剂浓度监测。在每次吸入暴露期间，从仅经鼻暴露室的动物呼吸区采样过滤器。通过GF/A过滤器的气雾剂采样流速保持在1.0±0.5L/分钟。除最后一个过滤器外，每10分钟在每个暴露持续时间内收集过滤器。在低剂量暴露(第3组和第5组)持续33分钟的情况下，在13分钟后收集最终过滤器，在高剂量暴露(第4组和第6组)持续65分钟的情况下，在15分钟后收集最终过滤器。收集样品后，称重过滤器以确定暴露系统中的总气雾剂浓度。

称重后，将每个过滤器放置在7mL玻璃小瓶中。提取玻璃瓶中的过滤器，并通过高效液相色谱(HPLC)进行分析，以定量收集到过滤器上的紫杉醇的量。总气雾剂浓度和每个过滤器的紫杉醇气雾剂浓度通过气雾剂和收集的紫杉醇气雾剂的总量除以通过过滤器的总气流量来计算。如以下剂量确定部分中所示，使用方程1，使用平均紫杉醇气雾剂浓度来计算紫杉醇驻留啮齿动物肺的平均沉积剂量。

剂量测定

沉积剂量是使用方程1计算的。在该计算中，使用了根据暴露量测得的平均气雾剂浓度以及大鼠的平均组体重。以这种方式，使用测得的紫杉醇气雾剂浓度计算出沉积在大鼠肺中的紫杉醇的估计量。其中：

其中，沉积剂量＝(DD)μg/kg

²呼吸分钟量(RMV)＝0.608x BW^0.852

气雾剂暴露浓度(AC)＝紫杉醇气雾剂浓度(μg/L)

沉积分数(DF)＝假设的沉积分数为10％

BW＝研究中动物的平均体重(随机；第-1天)(公斤)

安乐死和尸检

在预定的尸检中，通过腹膜内注射过量的基于贝比妥酸酯的镇静剂使动物安乐死。

血液和组织采集

对于所有尸检，收集终末体重和脑重。对于预定的安乐死，将血液(用于血浆)通过心脏穿刺收集到K₂EDTA管中。取出肺并称重。将包含肿瘤、气管支气管淋巴结的一部分肺组织冷冻在液氮中，以备将来分析之用。剩余的肺被固定以进行潜在的组织病理学检查。

组织病理学

以“面包条”(bread loaf)的方式修剪固定的左肺叶，将备用切片放入2个盒中，以产生2个玻片，每个玻片具有3个代表性的左肺切片。常规处理组织，石蜡包埋，在约4μm处切片，固定，并用苏木精和曙红(H&E)染色以进行显微镜检查。对发现进行主观性、半定量性分级。

从120只研究的裸鼠中的60只中获取肺切片(每只动物1-4)，纵切，制成H&E染色载玻片，进行光学显微镜评估。

在本次审查中，记录了显微镜下的发现，然后将其转移到电子病理报告系统(PDS-Ascentos-1.2.0，V.1.2)中，该系统总结了肺部负荷特征数据的发生率和严重性，并列表显示了结果并生成单个动物的数据。对60只裸鼠的肺进行组织学检查：第1组[1001-1010]，第2组[2001-2010]，第3组[3001-3010]，第4组[4001-4010]，第5组[S001-S010]和第6组[6001-6010]。为了评估这些肺中的肿瘤负荷水平，在组织病理学检查期间对肺进行了评估和评分。对于每种累积的肺负荷特征诊断：1)腺癌(未分化和分化)，2)原始肿瘤细胞(分化程度差的多形细胞)，3)肿瘤消退，使用4点分级量表对肺进行半定量分级显示整个肺组织的受累百分比提供如下：0＝无证据，1＝极小(约占肺部总面积的1-25％)，2＝轻度(约占肺部总面积的25-50％)，3＝中度(约占肺部总面积的50-75％)和4＝明显(约占肺部总面积的75-100％)。

组织形态计量学

使用来自各组的前10只动物的固定的左肺叶进行组织形态计量学分析。使用形态计量学(“面包切片”)样式的修剪来修剪组织。简而言之，修剪是在距肺的顶部末端2到4毫米之间的一个随机点开始的。将每个肺部切成约4mm厚。编号为奇数的部分放在盒子1的末端，而编号为偶数的部分放在盒子2的末端。然后处理组织切片，石蜡包埋，以4μm切片，并用苏木精和曙红(HE)染色进行检查。两个载玻片(奇数和偶数切片)均用于确定每只动物的平均肿瘤分数。

通过Lovelace Biomedical对来自指定动物的苏木精和曙红(HE)染色的肺组织进行形态计量分析。使用Hamamatsu Nanozoomer扫描整个玻片(每只动物2个，包含整个左肺的横截面)。使用Visiopharm Integrator System软件(VIS，2017.2.5.3857版)分析扫描结果。肿瘤面积分数的统计分析用GraphPad Prism 5(5.04版)处理。

使用整个玻片扫描，在所有左肺组织上进行了计算机图像定量设计，以量化每个玻片上存在的肿瘤面积。用于定量肺转移区域的Visiopharm应用程序用于根据细胞密度、染色强度、大小和染色强度将肿瘤细胞与正常肺组织区分开。注意，基于简单的H&E染色的这种定量将不是完美的(即，它不能完全区分肿瘤组织的类型，不能区分坏死的和活的肿瘤组织，并且某些正常结构可以被包括为肿瘤)。在H&E切片的该过程中应用的价值在于其是一种无偏倚的肿瘤定量方法。确定整个肺部的面积，然后将被确定为转移的结构所占的面积表示为总面积的百分比。可对要分析的区域进行细微调整以确保排除肺外结构并包括整个肺部，该细微调整可以手动执行。避免使用其他手动操作，以确保所有组之间的一致性并消除引入偏差的可能性。如果可能的话，开发专门的免疫组织化学染色剂以仅识别肿瘤组织将增加该分析的特异性。

血液采集与处理

尸检时收集的血液通过在4℃下以最小1300g离心10分钟的方式处理成血浆。将血浆样品储存在-70至-90℃的温度下，直到分析或装运给供应商。

结果

临床观察、生存率和体重

所有动物存活到其指定的尸检时间点。与该模型有关的临床观察包括皮疹和呼吸困难。观察到一只动物患有上腹部疝。根据兽医的建议，用不进行吸入暴露的第1组(未经处理的对照组)交换，因此没有必要限制暴露管。

图8显示了整个研究期间的平均体重。图9显示了从第0天起平均体重的百分比变化。在整个研究过程中，所有组的体重增加速率均相同。

IV尾静脉注射

对于接受

静脉注射的组，第22、29和36天的平均剂量分别为4.94、4.64和4.46mg/kg。

紫杉醇颗粒暴露

气雾剂浓度和沉积剂量

总气雾剂和紫杉醇气雾剂浓度通过每次暴露期间GF/A过滤器的采样来测量。每周一次的低剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次的低剂量紫杉醇颗粒制剂组的吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度分别为270.51μg/L和263.56μg/L。每周一次高剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次高剂量紫杉醇颗粒制剂组的吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度分别为244.82μg/L和245.76μg/L。在每次暴露过程中都要监测氧气和温度水平。

剂量基于平均气雾剂紫杉醇浓度、最近的平均组体重、假定的沉积百分数10％和暴露持续时间为33或65分钟。在治疗的四周中，每周一次低剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次低剂量紫杉醇颗粒制剂组的平均啮齿动物沉积剂量分别为0.655mg/kg和0.640mg/kg(1.28mg/kg/周)。

每周一次高剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次高剂量紫杉醇颗粒制剂组的平均达到的啮齿动物沉积剂量分别为1.166mg/kg和1.176mg/kg(2.352mg/kg/周)。

粒度(MMAD和GSD)

使用级联冲击器，针对每种紫杉醇颗粒制剂气雾剂，根据质量中位数空气动力学直径(MMAD)和几何标准偏差(GSD)确定粒度分布。对于20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂气雾剂，平均MMAD被确定为2.01μm，GSD为1.87。

尸检观察和器官重量

所有动物存活到其指定的尸检时间点。尸检时，每组动物的肺部都有棕褐色结节和/或肺部呈红色或棕褐色斑片状变色。其他零星的观察结果包括一只动物的腹部疝气和另一只动物的心包结节。尸检时未发现其他异常大体观察。尸检时，一只动物没有任何可见的肿瘤(结节)。

各个动物器官重量数据在图10、图11和图12中图形化表示。与未经治疗的对照组相比，在经

治疗的动物的肺重量中，肺与体重的比和肺与脑的重量比显著降低。与未经治疗的对照组相比，每周一次紫杉醇颗粒制剂高剂量组的体重与治疗组相似，并且肺重量和肺脑比例显著降低。每周一次紫杉醇颗粒制剂低剂量组、每周两次紫杉醇颗粒制剂低剂量组和每周两次紫杉醇颗粒制剂高剂量组大体具有相似的平均肺重量和比率。

形态计量学

与对照组相比，所有治疗组的平均肺肿瘤分数均降低。但是，两组之间没有统计学上的显著差异。在横截面肺玻片上检查的肿瘤面积分数上IV

治疗组和任何紫杉醇颗粒制剂的治疗方案之间也没有统计学上的显著差异。如该模型的典型特征，肿瘤部分中所有组中的动物之间存在很大的差异。这些数据应与该模型中肺肿瘤负担的其他指标(包括肺与脑的重量比和最终解释的标准组织病理学)结合起来考虑。重要的是要注意对左肺叶的固定肺组织进行了运动强度分析和组织病理学检查，而对右肺叶的冰冻组织进行了其他肺组织分析。平均肿瘤面积示于图13和图14。

病理结果

通过对鉴定出的肿瘤细胞种群进行玻片检查，病理学家确定：(1)所有治疗组中的腺癌(未分化和分化的细胞)总体肺肿瘤负担的严重程度略有降低(第2组(1.7)、第3组(1.8)、第4组(1.7)、第5组(1.6)和第6组(1.6)相比于未治疗的对照组第1组(2.1))；(2)相比于对应的对照组第1组(0.9)和第2组(1.0)，在第3组(0.3)、第4组(0.3)、第5组(0.2)和第6组(0.2)的严重程度的降低证明了原始肿瘤细胞数量的减少；以及3)相比于对应的对照组第1组(0.0)和第2组(0.1)。肺负荷特征数据的发生率和严重程度总结在表7和图15中。玻片的显微照片显示在图16-50中。

表7.累积肺负载表的发生率和严重程度

^a基于1-4的4分分级标准的严重等级：1＝最小，2＝轻度，3＝中度，4＝标记。

^b(0)的存在表示没有有关病变的组织病理学证据

图16至50中的显微照片的组织病理学概述

一般观察：

对照：广泛水平的活细胞增殖细胞，几乎没有免疫细胞浸润。

IV：许多存活的肿瘤块，具有一些淋巴细胞反应以及一些肿瘤消退。

紫杉醇颗粒制剂1×每周，高：从肺部清除肿瘤，几乎没有存活的肿瘤细胞。剩余的肿块似乎是免疫细胞浸润和纤维化。

紫杉醇颗粒制剂2×每周，低：免疫细胞浸润的一些剩余肿瘤结节浸润，包括巨噬细胞和单核细胞。

紫杉醇颗粒制剂2×每周，高：免疫浸润的肿瘤结节几乎没有并且替代肿瘤间质纤维化。

在通过吸入接受紫杉醇颗粒制剂的动物的肺中观察到广泛的单核肿瘤细胞浸润。由于使用的模型缺乏T细胞，因此死细胞很可能是B细胞或NK细胞或二者。B细胞负责抗体的产生，并可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性参与肿瘤细胞的杀伤(抗体与表达Fc受体的细胞结合并增强这些细胞的杀伤能力)。NK细胞是先天性淋巴样细胞，在杀死肿瘤细胞中至关重要。在患有肿瘤的患者中，NK细胞活性降低，导致肿瘤生长。NK细胞与T细胞一起，成为某些检查点抑制剂增加其活性的靶标。

通过使用各种能够传递触发信号或抑制信号的表面受体，NK细胞可以监测其环境中的细胞，以确定该细胞是否异常(肿瘤或病毒感染)，应通过细胞毒性消除。

NK细胞的细胞毒性和趋化性可以通过许多病理过程来改变，包括肿瘤细胞及其副产物。响应某些信号，其功能得到增强或提高。通过使用不同的Toll样受体(TLR)响应几种病原体相关分子模式(PAMP)；NK细胞可以增加细胞因子的产生和/或细胞溶解活性。细胞因子，包括IL-2、IL-15、IL-12、IL-18和IFNα/β，也可以改变NK细胞的活性。NK细胞不是只是能够杀死不同肿瘤细胞靶标的溶细胞效应子的简单细胞，相反，它们代表了一个异类种群，可以在变化的环境中微调其活动。

在用紫杉醇颗粒制剂治疗的动物的肺中，肿瘤负担似乎被显著降低，并且比 IV的要低。因此，以紫杉醇颗粒制剂形式的紫杉醇局部给药提供了额外的功效。这可能是由于随时间暴露于化疗剂的时间更长，并且细胞向肿瘤部位的强烈浸润。后者的反应似乎取决于剂量密度(实际剂量和剂量频率)。

特定显微照片的观察结果：

图16：受试者1006(对照)腺癌-3，原始-1，消退-0。低倍放大倍数(2x)，显示了未分化的、多形的、大的、间变性的肿瘤细胞在肺泡腔内或在肺泡隔内的一般分布。大多数细胞不具有腺癌的特征，并出现在连续的肿瘤薄片中。许多细胞具有嗜碱性的染色细胞质，而其他细胞则大且具有间变性，并含有淡的两亲性染色。请注意肺泡巨噬细胞的既存驻留群的存在和无肿瘤消退。

图30：受试者2003

腺癌-1，原始-1，消退-1。低倍放大(4x)显示肿瘤肿块的一般分布，该肿瘤肿块主要在周围以及充满肺泡间隙的多个较小的扩张性肿瘤块。肿瘤细胞是多形性的、大的、间变性的，具有淡的两亲性染色，从未分化到分化的腺癌模式变化。肿块周围存在肿瘤消退的证据，其主要特征是巨噬细胞浸润。

图36：受试者2010

腺癌-3，原始-1，消退-0。低倍放大倍数(2x)表示充满大部分肺泡腔以及周围肿瘤细胞的大扩张性肿瘤块的一般分布。大多数肿瘤细胞主要是未分化的、多形的、大的、间变性的，具有淡的两亲性染色。原始细胞较小，为卵圆形，并具有更多的嗜碱性染色细胞质，具有可变的囊泡核和中度到明显的细胞核大小不等。炎性细胞浸润主要是中性粒细胞和巨噬细胞。该图表明没有肿瘤消退。

图39：受试者4009(IH紫杉醇颗粒造纤维1×/周高)腺癌-0，原始-0，消退-4。低倍率放大倍数(2x)，显示先前填充的肿瘤块的一般分布，在周围的肺泡间隙可见纤维结缔组织，中央胶原基质和纤维细胞的多个小区域，并且肺泡间隔增厚支持了肿瘤的证据消退。另外，肺泡间隙通常充满巨噬细胞和淋巴细胞的浸润以及肿瘤消退的其他证据。

图42：受试者5010(IH紫杉醇颗粒制剂2×/周低)腺癌-1，原始0，消退-3。低倍放大倍数(2x)，显示先前填充的肿瘤块的一般分布。消退质量变小且随机分布。可见纤维结缔组织充满/取代了肺泡间隙，提示腺癌消退灶。急性坏死、纤维结缔支架、上皮细胞以及基质周围巨噬细胞、巨细胞和淋巴细胞的混合细胞浸润是肿瘤消退的迹象。

图46：受试者6005(IH紫杉醇颗粒制剂2×/周高)腺癌-1，原始-0，消退-4。低倍放大倍数(2x)显示先前填充的肿瘤块在纤维结缔组织的多个小区域中的普遍分布，这些结缔组织填充/置换了肺泡间隙，提示腺癌细胞先前已浸润。先前填充的肿块、中央胶原基质核心和周围的纤维结缔组织的纤维化的填充/替换肺泡腔、隔膜增厚以及存在充填由淋巴细胞和巨噬细胞浸润的肺泡腔的纤维细胞可证明肿瘤消退。

结论

在第-1天，对一百二十七(127)只NIH-mu裸鼠进行了X射线辐照以诱导免疫抑制。在第0天，通过气管内(IT)滴注给动物施用Calu3肿瘤细胞。动物经历了三个星期的生长期。在第三周，通过体重分层将动物随机分组。从第4周开始，第2组中的动物在第22、29和36天通过静脉内(IV)剂量(5mg/kg)每周一次接受第3组和第4组的动物每周(星期一)分别接受低(0.5mg/kg)和高(1.0mg/kg)目标剂量的紫杉醇颗粒制剂吸入(INH)剂量。第5组和第6组的动物分别以低剂量(0.50mg/kg)和高剂量(1.0mg/kg)每周两次(星期一和星期四)接受紫杉醇颗粒制剂的目标吸入剂量。第1组中的动物未经治疗作为正常肿瘤细胞生长的对照。在第8周对所有动物进行尸检。

所有动物存活到其指定的尸检时间点。与该模型有关的临床观察包括皮疹、呼吸困难。在整个研究过程中，所有组的体重增加速率均相同。

每周一次低剂量和每周两次低剂量紫杉醇颗粒制剂组的吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度分别为270.51μg/L和263.56μg/L。每周一次高剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次高剂量紫杉醇颗粒制剂组的吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度分别为244.82μg/L和245.76μg/L。

剂量基于平均气雾剂紫杉醇浓度、最近的平均组体重、假定沉积分数10％33或65分钟的和暴露持续时间。在治疗的四个星期中，每周一次低剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次低剂量紫杉醇颗粒制剂组的平均达到的啮齿动物沉积剂量分别为0.655mg/kg和0.640mg/kg(1.28mg/kg/周)。每周一次高剂量紫杉醇颗粒制剂组和每周两次高剂量紫杉醇颗粒制剂组的平均获得的啮齿动物沉积剂量分别为1.166mg/kg和1.176mg/kg(2.352mg/kg/周)。对于接受

静脉注射的组，第22、29和36天的平均剂量分别为4.94、4.64和4.46mg/kg。

在预定的尸检中，每组的大多数动物的肺部都有棕褐色结节和/或肺部出现红色或棕褐色斑片状变色。其他零星的观察结果包括一只动物的腹部疝气和另一只动物的心包结节。尸检时未发现其他异常大体观察。

与未经治疗的对照组相比，在经治疗的动物中，肺重量、肺与体重的比率以及肺与脑的重量比率明显更低。与未经治疗的对照组相比，每周一次的紫杉醇颗粒制剂高剂量组的体重与

组相似，并且肺重量和肺脑比例显著降低。

与阳性对照第1组和经

处理的对比组第2组相比，通过较低的肺/脑重量比和较低的总体肺肿瘤负荷来测量治疗效果，而没有明显的不良事件。吸入紫杉醇颗粒制剂治疗的肺肿瘤负荷的组织学分析显示，肿瘤肿块减少，原始肿瘤细胞数量减少，肿瘤消退增加。在通过吸入接受紫杉醇颗粒制剂的动物的肺中观察到广泛的单核细胞浸润。由于使用的模型缺乏T细胞，因此该细胞很可能是B细胞或NK细胞。据推测，肿瘤对紫杉醇颗粒的局部的、可能更高浓度的暴露会影响肿瘤，从而导致环境的改变，从而将单核细胞浸润到肺中。

实施例4：FY 17-008B研究——紫杉醇颗粒药代动力学研究

执行概述

通过单次静脉内(IV)快速推注或仅经鼻吸入紫杉醇颗粒制剂(目标剂量为0.37或1.0mg/kg)，将九十(90)只雄性Sprague Dawley大鼠暴露于“临床参考”剂量的紫杉醇(用于注射混悬液的紫杉醇蛋白结合颗粒，又名nab-紫杉醇)中。在暴露后0.5至336小时的十(10)个时间点对三只动物(n＝3)实施安乐死，以收集血液(血浆)和肺组织。对血浆和肺组织进行非房室分析(NCA)，以确定每个剂量组暴露后紫杉醇可检测量的持续时间。从所有组中指定为336小时时间点的动物收集右肺进行液相色谱-质谱(LCMS)分析，而左肺则用10％中性缓冲福尔马林(NBF)灌注并保留以进行潜在的组织病理学检查。为了进行比较的组织病理学分析，在336小时的时间点对3只备用动物(幼稚对照(

control))实施了安乐死，并以相同的方式进行了肺部采集。指定为所有其他时间点的动物将所有肺单独冷冻以进行LCMS分析。

低剂量和高剂量紫杉醇颗粒制剂组的吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度分别为85.64μg/L和262.27μg/L。平均暴露气雾剂浓度在目标气雾剂浓度的±15％以内，这是雾状吸入暴露所期望的。使用级联撞击器，针对每种紫杉醇颗粒制剂气雾剂，根据MMAD(GSD)确定粒度分布。对于6.0mg/mL和20.0mg/mL的紫杉醇颗粒制剂气雾剂，MMAD(GSD)分别确定为1.8(2.0)μm和2.3(1.9)μm。

根据紫杉醇的平均气雾剂浓度为85.64μg/L，第0天组平均体重为420.4g，假定的沉积分数为10％和暴露时间为65分钟，计算出紫杉醇的低剂量沉积。对于低剂量紫杉醇颗粒制剂组，确定的平均获得的啮齿动物沉积剂量为0.38mg/kg。对于高剂量紫杉醇颗粒制剂组，紫杉醇的平均气雾剂浓度为262.27μg/L，第0天组的平均体重为420.3g，假定沉积分数为10％，暴露时间为65分钟；测定的平均获得的啮齿动物沉积剂量为1.18mg/kg。对于6.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂暴露，记录的氧气和温度范围分别为19.8％-20.9％和20.7℃-20.8℃。对于20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂的暴露，整个暴露过程中记录的氧气值为19.8％，温度范围为20.7℃至20.8℃。对于接受IV注射

的组，第1天体重范围为386.1至472.8g，其导致

剂量为2.6-3.2mg/kg，平均组剂量为2.9mg/kg。

在研究过程中，所有组均增加了体重。在整个研究过程中未发现异常的临床观察结果。所有动物存活到其指定的尸检时间点。在预定的每个时间点的窗口内对所有动物实施安乐死。

尸检时，每组大约一半的动物的肺部仅有最小到轻微的棕褐色变色。此类观察通常与吸入暴露有关。其他短暂的观察结果包括心脏增大(动物#2016)和气管支气管淋巴结增大。尸检时未发现其他异常大体观察。组织病理学表明，在本研究条件下，来自试验和参考品治疗的大鼠的肺和气管均在正常范围内，与未治疗的大鼠没有区别。在给药后336小时，在吸入研究中作为对肺中沉积的外源物质的生理正常反应的生理学正常反应，巨噬细胞蓄积在用于该研究的治疗动物的肺部中并未明显。

NCA设计用于量化暴露(浓度与时间曲线下的面积[AUC])，达到最大浓度的时间(T_max)，最大浓度(C_max)以及可能的表观终末半衰期(T_1/2)。

新型紫杉醇颗粒制剂的假设是该制剂将导致紫杉醇在肺组织中的保留增加并减少全身暴露。全身血浆的半衰期对于测试的制剂/剂量是不变的，并且肺组织内的半衰期随着通过吸入递送的紫杉醇颗粒制剂增加。当通过紫杉醇颗粒制剂通过吸入给药时，肺组织暴露(剂量标准化的AUC)增加。

总体而言，与IV“临床参考”相比，当通过吸入递送时，数据表明紫杉醇颗粒在肺组织内显著保留。

目标

这项研究的目的是确定与紫杉醇的临床参考剂量相比，紫杉醇颗粒制剂的药代动力学。来自Lovelace Biomedical的FY 17-008A研究(上述实施例1)的紫杉醇颗粒气雾剂通过吸入给药的初步药代动力学(PK)数据显示在肺组织中的保留时间超过168小时。在该研究中，对通过单次给予低或高剂量的仅经鼻吸入的紫杉醇颗粒制剂或通过单次静脉(IV)尾部注射给予临床参考剂量的紫杉醇的动物在从0.5至336小时的时间点进行了血浆和肺组织的评估。

材料和方法

测试系统

物种/株：Sprague Dawley大鼠

研究开始时的动物年龄：8-10周龄

研究开始时的体重范围：345-447克

研究数量/性别：95只雄性(90只研究动物和5只备用动物)

来源：Charles River实验室(Kingston，NY)

标识：Permanent maker尾部标记

制剂

静脉注射(IV)制剂使用的临床参考材料为药物产品

(制造商：Celgene Corporation，Summit，NJ；批号：6111880)。用盐水将该药物产品重构为5.0mg/mL(制造商：Baxter Healthcare，Deerfield，ll.；批号：P357889)，并按照制造商的说明进行存放。

紫杉醇颗粒制剂

根据供应者的建议，准备了低剂量组暴露的6.0mg/ml紫杉醇颗粒制剂和高剂量组暴露的20.0mg/ml紫杉醇颗粒制剂。具体而言，紫杉醇颗粒用1％的聚山梨酸酯80复溶。将小瓶带状摇动，直到所有颗粒都被润湿。加入另外的0.9％注射用氯化钠(达到所需的浓度目标)，并将小瓶再摇动一分钟。

继续摇晃直到看不到大块并且悬浮液被适当分散。将所得制剂静置至少5分钟，以减少小瓶中的任何空气/泡沫，然后将其放入喷雾器中进行雾化工作。最终制剂6.0mg/mL保持在室温下，重建后2小时内雾化。最终制剂20.0mg/mL保持在室温下，并在重构后30分钟内雾化。

实验设计

表8中第1组的动物接受了

(通过紫杉醇蛋白结合颗粒用于可注射悬浮液)的单次“临床参考”剂量(制剂浓度：5mg/mL，目标剂量：5.0mg/kg，基于体重；目标剂量体积：不超过250μL)通过静脉内尾静脉注射。根据以下研究设计，单次仅经鼻吸入(INH)将表9中第2组和第3组中的动物暴露于紫杉醇颗粒制剂气雾剂(目标剂量为0.37或1.0mg/kg)。3只动物(n＝3)在暴露后0.5(±10分钟)、6(±10分钟)、12(±10分钟)、24(±30分钟)、48(±30分钟)、72(±30分钟)、120(±30分钟)、168(±30分钟)、240(±30分钟)和336(±30分钟)小时安乐死，以采集血液(血浆)和肺组织。对每个剂量组的血浆和肺组织进行非房室分析，以确定紫杉醇暴露后可检测量的持续时间。所有组中指定为336小时时间点的动物的右肺分别冷冻进行LCMS分析，而左肺则用10％中性福尔马林缓冲液(NBF)灌注并保留以进行潜在的组织病理学检查。

为了进行比较性的组织病理学检查，在336小时的时间点同时对3只备用动物(幼稚对照)实施了安乐死，并以相同的方式进行了肺部采集。

表8.实验设计

^A每组研究动物和三只备用动物将在暴露后336小时收集组织用于LCMS分析以及潜在的组织病理学。

^B通过IV尾静脉注射向第1组动物施用

(浓度：5mg/ml，目标剂量：基于体重最高为5.0mg/kg，剂量体积小超过250μL)

饲养、隔离和分配研究

从Charles River实验室(Kingston，NY)获得雄性Sprague Dawley大鼠(6-8周龄)，并隔离14天。在隔离结束时，对动物称重，并按体重将其随机分配用于研究。通过尾标和笼卡鉴定动物。根据适当的SOP维护和监控水、光照、湿度和温度控制。在非接触时间随意给大鼠喂食标准啮齿动物饮食。

体重和每日观察

在整个研究期间和安乐死时每天随机收集体重。通过Comparative MedicineAnimal Resources(CMAR)人员每天对研究中的每只动物进行两次观察，观察是否有任何异常、濒死或死亡的临床迹象。

施用IV-尾静脉注射

(浓度：5mg/mL，目标剂量：5.0mg/kg，基于体重剂量体积：不超过250μL)一次通过静脉内尾静脉注射施用于第1组的动物。

紫杉醇粒子施用-仅经鼻暴露于气雾剂

适应

使动物适应仅经鼻暴露管长达70分钟。暴露前三天进行了三次适应，第一次为时30分钟，第二次为60分钟，第三次为70分钟。在整个适应期间和暴露期间都要对它们进行密切监测，以确保它们不会遭受短暂的痛苦。

暴露系统

用两个压缩空气喷射的Hospitak雾化器在20psi的雾化器压力下生成气雾剂，如上图7所示(请参见实施例3)。低剂量和高剂量暴露分别使用6.0mg/mL和20.0mg/mL的紫杉醇颗粒悬浮液制剂。将两种制剂分别雾化，然后将气雾剂通过输送管线导入32端口的仅鼻子暴露室。分别进行啮齿动物吸入暴露65分钟，用一套两个Hospitak压缩空气喷射雾化器(使用长达40(±1)分钟)产生紫杉醇颗粒悬浮气雾剂，然后用第二套两个Hospitak雾化器在剩余暴露时间替代。在每次吸入暴露过程中都要监测氧气并记录温度。

浓度监测

与实施例1相同

粒度测定

与实施例1相同

剂量测定

与实施例1相同

安乐死和尸检

在上述研究设计中的时间点，通过腹膜内(IP)注射安乐死溶液对动物实施安乐死。

对于336小时的时间点(以及备用动物，n＝3)：尸体剖检期间，通过心脏穿刺将血液(血浆)收集到K₂EDTA管中。收集整个肺的重量，将左肺捆扎并填充中性缓冲福尔马林，并保存用于潜在的组织病理学检查。分别称量右肺叶并在液氮中速冻，并保存在-70至-90℃进行生物分析。此外，由合格的尸检人员进行了全面的总体检查。检查了身体的外表面、孔口以及颅腔、胸腔和腹腔的内容物。使用一组词汇术语描述和记录病变，这些术语涉及形态、数量、形状、颜色、稠度和严重性。

对于其他所有的时间点：在尸检期间，通过心脏穿刺将血液(用于血浆)收集到K₂EDTA管中。收集整个肺的重量，分别称重肺叶并在液氮中速冻，并保存在-70至-90℃进行生物分析。此外，由合格的尸检人员进行了全面的总体检查。检查了身体的外表面、孔口以及颅腔、胸腔和腹腔的内容物。使用一组词汇术语描述和记录病变，这些术语涉及形态、数量、形状、颜色、稠度和严重性。

组织病理学

修剪可用的固定组织。修剪固定的左肺叶，以产生典型的气道毒理病理学切片。常规处理组织，石蜡包埋，切成约4μm切片，固定，并用苏木精和曙红(H&E)染色以进行显微镜检查。由一位在毒理病理学方面经验丰富的病理学家对结果进行主观的、半定量的1-5型分级(1＝最小，2＝轻度，3＝中度，4＝明显，5＝严重))。Provantis^TM(Eastern LSS Ltd.，Staffordshire，英格兰)计算机软件/数据库用于组织病理学数据的采集、报告和分析。

血液采集和处理

尸检时收集的血液通过在4℃下以最小1300g离心10分钟的方式处理成血浆。将血浆样品储存在-70至-90℃直至分析。

生物分析

通过液相色谱-质谱(LCMS)测定法测定全身血液(来自K₂EDTA的血浆形式)和肺组织，以定量紫杉醇的量随时间的变化。简而言之，该测定利用超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)来定量紫杉醇。通过蛋白质沉淀法提取样品，并通过反相色谱分离。使用基于矩阵的校准曲线进行定量。

对来自血浆和肺组织浓度的数据进行了非房室分析。至少要确定C_max、T_max、AUC和表观末端半衰期。可以基于数据确定其他参数。

结果

临床观察，生存率和体重

所有动物存活到其指定的尸检时间点。在预定的每个时间点的窗口内对所有动物实施安乐死。

在整个研究过程中未发现异常的临床观察结果。

图51和图52显示了整个研究期间的平均体重，并且是从第1天起的百分比变化。在整个研究过程中，所有组的体重增加速率均相同。

IV尾静脉注射

对于接受IV注射

的组，第1天体重为386.1至472.8g，这导致

剂量为2.6-3.2mg/kg。平均剂量(标准差)为2.9(0.16)mg/kg。表9列出了各个

剂量。

表9各个

剂量

^动物接受的最大IV剂量为250μL体积的5mg/mL

制剂(1.25mg)

紫杉醇颗粒物暴露

气雾剂浓度和粒径

参见：结果-实施例2中的气雾剂浓度和粒径。

氧气和温度

参见：结果-实施例2中的氧气和温度。

沉积剂量

参见：结果-实施例2中的沉积剂量。

尸检

所有动物存活到其指定的尸检时间点。尸检时，每组的动物在肺部都有轻微至棕褐色的变色(表10)。此类观察通常与吸入暴露有关。其他零星的观察结果包括心脏增大(动物#2016)和气管支气管淋巴结增大。尸检时未发现其他异常大体观察。

表10尸检总结

组织病理学

给药后的336小时(-14天)处死的用于本研究的动物的气管和左肺中没有发现明显的异常。在组织上与作为对照的“备用”动物在显微镜下没有区别。

在检查用于本研究的治疗动物的肺部内，巨噬细胞的积累并不明显。肺泡巨噬细胞的某种程度的增加在吸入研究中非常常见，因为它对沉积在肺中的外源物质具有生理上的正常反应(在未经治疗的动物中，相对较低的水平也可能是相对常见的现象)。在这项研究中，吸入给药动物的明显缺乏可能部分与组织学检查的相对较晚(336小时或约14天)的给药后时间点有关。

生物分析和PK建模

结果总结在下表11、12和13以及图53和图54中。紫杉醇平均血浆浓度与时间的关系以及紫杉醇平均肺组织浓度与时间的关系的数据如上所述，其结果分别示于表14和15。

表11肺和血浆生物分析结果-

IV(IV nab-紫杉醇)

表12肺和血浆生物分析结果-紫杉醇颗粒制剂低剂量(0.38mg/kg)IH

表13肺和血浆生物分析结果-紫杉醇颗粒制剂高剂量(1.18mg/kg)IH

表14紫杉醇血浆PK建模结果

表15紫杉醇肺组织PK建模结果

使用WinNonlin基于每个时间点的平均血浆或肺组织浓度进行建模。NCA旨在量化暴露(浓度对时间的曲线下面积[AUC])，达到最大浓度的时间(T_max)，最大浓度(C_max)，并在可能的情况下出现明显的终末半衰期(T₁/₂)。对于通过测试的制剂/剂量而言，全身血浆内的半衰期没有变化，并且通过吸入递送的紫杉醇颗粒制剂增加了肺组织内的半衰期。当通过紫杉醇颗粒制剂通过吸入给药时，增加了对肺组织的暴露(剂量标准化的AUC)。

总体而言，数据表明当通过吸入递送时，紫杉醇颗粒在肺组织内的显著保留。

结论

九十(90)只Sprague Dawley大鼠通过暴露于单次静脉内(IV)快速推注“临床参考”剂量的

(紫杉醇蛋白结合颗粒的可注射混悬剂)或单次仅经鼻吸入紫杉醇颗粒制剂(目标剂量为0.37或1.0mg/kg)。在暴露后0.5至336小时的十(10)个时间点对三只动物(n＝3)实施安乐死，以收集血液(血浆)和肺组织。对每个剂量组的血浆和肺组织进行非房室分析，以确定紫杉醇暴露后可检测量的持续时间。从所有组中指定为336小时时间点的动物收集右肺进行液相色谱-质谱(LCMS)分析，而左肺则用10％中性缓冲福尔马林(NBF)灌注并保留以进行潜在的组织病理学检查。为了进行比较性的组织病理学检查，在336小时的时间点对3只备用动物(幼稚对照)实施了安乐死，并以相同的方式进行了肺部采集。指定为所有其他时间点的动物将所有肺单独冷冻以进行LCMS分析。

低剂量和高剂量紫杉醇颗粒制剂组的吸入暴露平均紫杉醇气雾剂浓度分别为85.64μg/L和262.27μg/L。平均暴露气雾剂浓度在目标气雾剂浓度的±15％以内，这是雾化吸入暴露所期望的。使用级联撞击器，针对每种紫杉醇颗粒制剂气雾剂，根据MMAD(GSD)确定粒度分布。对于6.0mg/mL和20.0mg/mL的紫杉醇颗粒制剂气雾剂，MMAD(GSD)分别被确定为1.8(2.0)μm和2.3(1.9)μm。

紫杉醇的沉积剂量是根据紫杉醇的平均气雾剂浓度为85.64μg/L、第0天的组的平均体重为420.4g、假定的沉积分数为10％和暴露时间为65分钟计算得出的；对于低剂量紫杉醇颗粒制剂组，确定的平均获得的啮齿动物沉积剂量为0.38mg/kg。对高剂量紫杉醇颗粒制剂组，紫杉醇平均气雾剂浓度为262.27μg/L，第0天组的平均体重为420.5g，假定沉积分数为10％，暴露时间为65分钟；测定的平均获得的啮齿动物沉积剂量为1.18mg/kg。对于6.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂暴露，记录的氧气和温度范围分别为19.8％-20.9％和20.7℃-20.8℃。对于20.0mg/mL紫杉醇颗粒制剂的暴露，整个暴露过程中记录的氧气值为19.8％，温度范围为20.7℃至20.8℃。

对于接受静脉内注射

的组，第1天体重范围为386.1至472.8g，这导致

剂量为2.6-3.2mg/kg，平均组剂量为2.9mg/kg。

在研究过程中，所有组均增加了体重。在整个研究过程中未发现异常的临床观察结果。所有动物存活到其指定的尸检时间点。在针对每个时间点的窗口内将所有动物安乐死

尸检时，每组大约一半的动物的肺部仅有最小到轻微的棕褐色变色。此类观察通常与吸入暴露有关。其他短暂的观察结果包括心脏增大(动物#2016)和气管支气管淋巴结增大。尸检时未发现其他异常大体观察。组织病理学表明，在本研究条件下，来自试验和参考品治疗的大鼠的肺和气管均在正常范围内，与未处理的大鼠没有区别。NCA设计用于量化暴露(浓度与时间曲线下面积[AUC])，达到最大浓度的时间(T_max)，最大浓度(C_max)以及可能的表观终末半衰期(T_1/2)。

新型紫杉醇颗粒制剂的假设是该制剂将导致紫杉醇在肺组织内的保留增加并减少全身暴露。对于经测试的一种或多种制剂/剂量，全身血浆内的半衰期没有变化，并且随着紫杉醇颗粒制剂的吸入，肺组织内的半衰期增加。当通过吸入递送紫杉醇颗粒制剂时，肺组织暴露(剂量标准化的AUC)增加。

总体而言，与IV“临床参考”相比，当通过吸入递送时，数据表明紫杉醇颗粒在肺组织内显著保留。

Claims (25)

1.一种用于治疗包括但不限于肺部肿瘤或肺纤维化的肺部疾病的方法，包括向患有肺部疾病的受试者通过肺部施用有效量的包含紫杉烷颗粒的组合物以治疗所述肺部疾病，其中所述紫杉烷颗粒包含至少95％的紫杉烷并且具有0.1μm至5μm的平均粒径(数字)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述肺部施用包括雾化，并且其中所述雾化导致所述紫杉烷颗粒或其悬浮液的气雾液滴向所述受试者肺部递送。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷颗粒具有0.4μm至2μm的平均粒径(数字)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷颗粒具有约0.4μm至约1.2μm、或约0.6μm至约1.0μm的平均粒径(数字)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷颗粒具有至少10m²/g、或至少12m²/g、14m²/g、16m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、32m²/g、34m²/g或35m²/g的比表面积(SSA)；或其中所述紫杉烷颗粒具有约10m²/g至约60m²/g的SSA。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述紫杉烷颗粒存在于悬浮液中，其中所述悬浮液包含：

(a)所述紫杉烷颗粒；

(b)药学上可接受的载体；和

(c)聚山梨酸酯，其中所述聚山梨酸酯以0.01％v/v至约1.5％v/v、或以0.01％v/v至约1％v/v、约0.01％v/v至约0.5％v/v、约0.01％v/v至约0.4％v/v、约0.01％v/v至约0.25％v/v、约0.05％v/v至约0.5％v/v、约0.05％v/v至约0.25％v/v、约0.1％v/v至约0.5％v/v、约0.1％v/v至约0.25％v/v、约0.1％v/v、约0.16v/v、或约0.25％v/v的浓度存在于悬浮液中。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述药学上可接受的载体是盐水，例如0.9％氯化钠溶液。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述聚山梨酸酯为聚山梨酸酯80。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中所述紫杉烷以约1mg/ml至约40mg/ml或约6mg/ml至约20mg/ml的浓度存在于所述悬浮液中。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述颗粒及其悬浮液是未包衣的，并且排除脂质、聚合物、蛋白质例如白蛋白、聚乙氧基化蓖麻油、和/或由单、二和三甘油酯和聚乙二醇的单酯和二酯组成的聚乙二醇甘油酯类。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述紫杉烷包括紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛，或其药学上可接受的盐。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述紫杉烷包括紫杉醇或其药学上可接受的盐。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述颗粒具有以下一个或多个特征：

(a)约0.050g/cm³至约0.12g/cm³或约0.060g/cm³至约0.11g/cm³的平均堆积密度(未振实)；

(b)至少12m²/g、15m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、32m²/g、34m²/g或35m²/g的SSA；

(c)约22m²/g至约40m²/g、25m²/g至约40m²/g、30m²/g至约40m²/g、或约35m²/g至约40m²/g的SSA；和/或

(d)其中，在以75RPM运行的USPII桨法装置中，在37℃和pH 7.0的50％甲醇/50％水(v/v)的溶液中在30分钟或更短时间内，至少40％(w/w)的紫杉醇溶解。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述紫杉烷包括多西他赛或其药学上可接受的盐。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述颗粒具有以下一个或多个特征：

(a)约0.050g/cm³至约0.12g/cm³或约0.060g/cm³至约0.1g/cm³的平均堆积密度(未振实)；

(b)至少12m²/g、15m²/g、18m²/g、20m²/g、25m²/g、30m²/g、35m²/g、40m²/g、或42m²/g的SSA；

(c)约20m²/g至约50m²/g、或约35m²/g至约46m²/g的SSA；和/或

(d)其中，在以75RPM运行的USPII桨法装置中，在37℃和pH 7.0的15％甲醇/85％水(v/v)的溶液中在30分钟或更短时间内，至少40％(w/w)的多西他赛溶解。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷在所述施用后至少4天仍可在所述受试者的肺组织中被检测到。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述紫杉烷颗粒为结晶形式。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中将所述紫杉烷颗粒或其悬浮液雾化以施用，并且所述雾化产生具有约0.5μm至约6μm直径、或约1μm至约3μm的直径、或约2μm至约3μm的直径的质量中值空气动力学直径(MMAD)的气雾液滴。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述肺部疾病包括肺部肿瘤，并且其中在施用所述组合物后所述紫杉烷颗粒驻留在所述肺部肿瘤部位，使所述肺部肿瘤暴露于所述紫杉烷颗粒经过足以刺激所述受试者的内源性免疫系统的持续时间量，从而导致产生杀伤肿瘤的细胞并且所述杀伤肿瘤的细胞以足以治疗所述肺部肿瘤的水平渗入肺部肿瘤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述持续时间量为至少4周。

21.根据权利要求19-20中任一项所述的方法，其中所述杀伤肿瘤细胞包括T细胞、B细胞或自然杀伤(NK)细胞，或其组合。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物以两次或更多次分开的给药方式施用。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述两次或更多次分开的给药方式为每周施用一次，持续至少两周。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述两次或更多次分开的给药方式为每周施用两次，持续至少一周，其中所述两次或更多次分开的给药方式相隔至少一天。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述肺部疾病包括肺部肿瘤，并且其中所述治疗包括所述肿瘤的消除。

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