CN110794155A - 一种用于检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种用于检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于低密度脂蛋白胆固醇检测技术领域，具体涉及一种用于检测小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒至少包含用于清除样品中除sd‑LDL‑C以外的脂蛋白的试剂组合物(1)和仅与sd‑LDL‑C反应的试剂组合物(2)；所述试剂组合物(1)包括嵌合酯酶和镁基类离子液体。本发明提供的是一种特异性较高的用于小而密低密度脂蛋白胆固醇检测的试剂盒。用本发明所述试剂盒在检测时可特异地清除sd‑LDL以外的脂蛋白，提高了试剂盒的检测结果的准确度。而且该试剂盒操作简单，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。

Description

一种用于检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明属于低密度脂蛋白胆固醇检测技术领域，具体涉及一种用于检测小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
低密度脂蛋白胆固醇(LDL)是一种球形颗粒的脂蛋白，直径为22nm，核心是1500个胆固醇酯；外面由800个磷脂和500个未酯化的胆固醇分子包裹。根据密度不同，用密度梯度超速离心法(Metabolism,2001:983-988.)可以将LDL分为7种亚型：LDL-1和LDL-2为大而轻LDL(Large-buoyant LDL,lb-LDL)；LDL-3和LDL-4为中间密度LDL(intermediate-denseLDL,id-LDL)；LDL-5、LDL-6和LDL-7为小而密LDL(small-dense LDL,sd-LDL)。已有的研究表明，sd-LDL的增加是动脉硬化的主要危险因素之一，与普通LDL相比，其致动脉粥样硬化能力更强，与冠心病的关系更为密切，因此开展对sd-LDL的常规检测是非常必要的。
已知的sd-LDL检测方法主要有超速离心法、分级沉淀法、电泳法、高效液相色谱法等，这些方法步骤繁琐、自动化程度低，难以在临床常规开展。应用于全自动生化分析仪的酶法检测试剂盒近年来得到了开发和应用，这一类试剂盒的基本检测原理，是在低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂的基础上，进一步清除LDL-C中除sd-LDL-C以外的脂蛋白胆固醇，从而实现对剩余的sd-LDL-C直接测定，即：第一步，首先清除LDL-C以外的脂蛋白胆固醇，并进一步清除LDL-C中除sd-LDL-C以外的脂蛋白胆固醇；第二步，用胆固醇测定试剂对剩余的sd-LDL-C进行定量测定。上述步骤中，第一步是此方法的核心步骤，该步骤中，作为“首先清除LDL-C以外的脂蛋白胆固醇”的方法，已有文献和专利资料进行了公开，如文献“Low-density lipoprotein cholesterol can be chemically measured a newsuperior method.(J Lab Clin Med,1998:195-201.)”和专利“低密度脂蛋白中胆固醇的定量方法(ZL 97182112.7，已失效)”公开了表面活性剂的种类及HLB值与各脂蛋白组分反应度之间的关系。作为“进一步清除LDL-C中sd-LDL-C以外的脂蛋白胆固醇”的方法，专利“用于定量测定小而密LDL的试剂(ZL 200880013083.0)”通过严格控制胆固醇酯酶活性和在0.05g/L-1.0g/L的表面活性剂的存在下消除试样中除sd-LDL-C以外的脂蛋白胆固醇，然而，由于胆固醇酯酶和表面活性剂的非特异性，此方法的特异性是不令人满意的。作为一种方法的改进，文献“Development of a Homogeneous Assay for Measurement of SmallDense LDL Cholesterol.(Clinical Chemistry,2011:57–65.)”和专利“定量测定小而密LDL胆固醇的方法和试剂盒(ZL 201410058250.0)”更进一步在第一步反应中引入了磷脂酶，使其作用于LDL分级中的lb-LDL亚组分，旨在磷脂酶存在下清除小而密LDL之外的LDL中的胆固醇，然而研究发现，对于存在着lb-LDL、id-LDL、sd-LDL三个亚组分的LDL而言，仅相对特异地清除掉lb-LDL亚组分，使得此法依然存在着特异性不高的可能。公开的资料表明，该法与作为参考方法的sd-LDL-C沉淀法的相关系数r值均小于0.95，进一步提示了该方法存在特异性不高的可能。
因此，提供一种特异性的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测方法及试剂盒，已成为临床开展低密度脂蛋白胆固醇检测的一种迫切需求。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种含有可特异性作用于lb-LDL和id-LDL使其分解的嵌合酯酶和镁基类离子液体的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。采用本发明所述试剂盒在检测时可特异地清除sd-LDL以外的脂蛋白，试剂盒的特异性显著提高。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其中，所述试剂盒至少包含
用于清除样品中除sd-LDL-C以外的脂蛋白的试剂组合物(1)和仅与sd-LDL-C反应的试剂组合物(2)；
所述试剂组合物(1)包括嵌合酯酶和镁基类离子液体。
优选地，所述试剂组合物(2)中包括聚氧乙烯苯基醚衍生物，所述聚氧乙烯苯基醚衍生物的亲水-亲油平衡值(HLB)在13以上且小于15。
优选地，所述HLB值在13以上且小于15的聚氧乙烯苯基醚衍生物，作为商业上可以获得的实例，选自TritonX-100、TritonX-102或TritonX-104。
进一步优选地，所述HLB值在13以上且小于15的聚氧乙烯苯基醚衍生物的浓度为2-50ml/L。
优选地，所述试剂组合物(2)中还包括烷基糖苷，所述烷基糖苷的HLB在9以上且小于16。
作为商业上可以获得的实例，选自APG1214。
进一步优选地，所述烷基糖苷的浓度为0.5-10ml/L。
进一步优选地，所述聚氧乙烯苯基醚衍生物与烷基糖苷的浓度比为1-3.5：1。
优选地，所述镁基类离子液体为Mg(ClO4)2-DMF镁基类离子液体、MgCl2-ChCl镁基类离子液体和MgCl2-ChCl-ZnCl2镁基类离子液体中的至少一种。
进一步优选地，所述试剂组合物(1)中镁基类离子液体的浓度为0.1-2ml/L。
优选地，所述嵌合酯酶是可特异性作用于lb-LDL和id-LDL使其分解的lb-id-LDL嵌合酯酶。作为lb-id-LDL嵌合酯酶的商业上可得到的产品实例，例如绍兴市创烨生物科技有限公司的嵌合酯酶T-301。
进一步优选地，所述试剂组合物(1)中嵌合酯酶的浓度为0.01-10KU/L。
优选地，所述试剂组合物(1)中还包括浓度为0.1-10KU/L的胆固醇酯酶、0.2-20KU/L的胆固醇氧化酶和50-5000KU/L过氧化氢酶。
优选地，所述试剂组合物(1)还包括pH 6.5-7.5GOOD’S缓冲液，其浓度为20-200mmol/L。
进一步优选地，所述GOOD’S缓冲液，作为商业上可以获得的实例，选自MOPS缓冲液、PIPES缓冲液或Tris缓冲液。
优选地，所述试剂组合物(2)还包括过氧化物酶，其浓度为10-200KU/L。
优选地，所述试剂组合物(2)还包括pH 6.5-7.5GOOD’S缓冲液，其浓度为20-200mmol/L。
优选地，所述试剂组合物(1)还包括Trinder’S显色剂、PEG6000、三甲基-β-环糊精、环氧乙烷十八烷胺、Brij-58、proclin300和海藻糖。
作为本发明的一个实施方式，所述试剂组合物(1)中包括pH 6.5-7.5、浓度为20-200mmol/L的GOOD’S缓冲液、浓度为0.01-10KU/L的嵌合酯酶、浓度为0.1-2ml/L的镁基类离子液体，浓度为0.5-5mmol/L的Trinder’S显色剂、浓度为0.1-10KU/L的胆固醇酯酶、浓度为0.2-20KU/L的胆固醇氧化酶、浓度为50-5000KU/L的过氧化氢酶、浓度为0.2-10g/L的PEG6000、浓度为0.5-10g/L的三甲基-β-环糊精、浓度为0.5-8g/L的环氧乙烷十八烷胺、浓度为0.5-15g/L的Brij-58、浓度为0.01-5ml/L的proclin300、浓度为5-200g/L的海藻糖。
优选地，所述试剂组合物(2)还包括4-AAP、胆酸钠、proclin300和海藻糖。
作为本发明的一个实施方式，所述试剂组合物(2)中包括pH 6.5-7.5、浓度为20-200mmol/L的GOOD’S缓冲液、浓度为10-200KU/L的过氧化物酶、浓度为0.5-5mmol/L的4-AAP、浓度为2-50ml/L的聚氧乙烯苯基醚衍生物、浓度为0.5-10ml/L的烷基糖苷、浓度为2-20mmol/L的胆酸钠、浓度为0.01-5ml/L的proclin300、浓度为5-200g/L的海藻糖。
作为本发明的一个优选实施方式，所述试剂组合物(1)中包括pH 6.8-7.2、浓度为30-100mmol/L的GOOD’S缓冲液、浓度为0.1-3KU/L的嵌合酯酶、浓度为的0.5-1.5ml/L镁基类离子液体、浓度为1-4mmol/L的Trinder’S显色剂、浓度为0.5-5KU/L的胆固醇酯酶、浓度为1-10KU/L的胆固醇氧化酶、浓度为100-3000KU/L的过氧化氢酶、浓度为0.5-5g/L的PEG6000、浓度为1-5g/L的三甲基-β-环糊精、浓度为1-3g/L的环氧乙烷十八烷胺、浓度为1-10g/L的Brij-58、浓度为0.02-2ml/L的proclin300、浓度为10-100g/L的海藻糖。
作为本发明的一个优选实施方式，所述试剂组合物(2)中包括pH 6.8-7.2、浓度为30-100mmol/L的GOOD’S缓冲液、浓度为50-100KU/L的过氧化物酶、浓度为1-4mmol/L的4-AAP、浓度为10-20ml/L的聚氧乙烯苯基醚衍生物、浓度为1-5ml/L的烷基糖苷、浓度为5-15mmol/L的胆酸钠、浓度为0.02-2ml/L的proclin300、浓度为10-100g/L的海藻糖。
作为本发明的一个优选实施例，所述试剂组合物(1)中包括pH 7.0、浓度为65mmol/L的GOOD’S缓冲液、浓度为1.5KU/L的嵌合酯酶、浓度为1ml/L的镁基类离子液体、浓度为3mmol/L的Trinder’S显色剂、浓度为2KU/L的胆固醇酯酶、浓度为5KU/L的胆固醇氧化酶、浓度为1500KU/L的过氧化氢酶、浓度为2.5g/L的PEG6000、浓度为2.5g/L的三甲基-β-环糊精、浓度为2g/L的环氧乙烷十八烷胺、浓度为5g/L的Brij-58、浓度为0.2ml/L的proclin300、浓度为50g/L的海藻糖。
作为本发明的一个优选实施方式，所述试剂组合物(2)中包括pH 7.0 GOOD’S、浓度为65mmol/L的缓冲液、浓度为75KU/L的过氧化物酶、浓度为3mmol/L的4-AAP、浓度为15ml/L的聚氧乙烯苯基醚衍生物、浓度为5ml/L的烷基糖苷、浓度为10mmol/L的胆酸钠、浓度为0.2ml/L的proclin300、浓度为50g/L的海藻糖。
本申请的研发人员经过长期研究发现，将嵌合酯酶和镁基类离子液体结合可以特异性地催化分解lb-LDL和id-LDL，而对sd-LDL无明显催化分解作用；但是，将嵌合酯酶和其它种类的离子液体结合时并无法产生较好的特异性催化分解作用。
因此，将嵌合酯酶和镁基类离子液体组合可用于sd-LDL-C的特异性检测。
采用如上试剂盒对样品中小而密低密度脂蛋白胆固醇进行检测的原理为：
首先，在含有镁基类离子液体和嵌合酯酶的试剂组合物作用下，血清样本中除LDL以外的脂蛋白以及LDL中的lb-LDL、id-LDL两个亚组分中的胆固醇均被清除；
第二步，剩余的sd-LDL-C发生特异性显色反应，对应检测出sd-LDL-C浓度。
本发明的试剂盒可使用全自动生化分析仪进行检测，检测步骤如下：
S1分别按比例配制试剂组合物(1)和试剂组合物(2)；
S2将试剂组合物(1)与样本混合、反应结束后测得吸光值AU,1；
S3向S2中继续加入试剂组合物(2)继续反应后测得吸光值AU,2，由吸光值差计算出样本中的sd-LDL-C浓度。
优选地，所述全自动生化分析仪进行反应的主波长为600nm，副波长为700nm。
优选地，全自动生化分析仪的反应温度为37℃±1℃。
优选地，S2、S3中反应时间均为3-8min。
优选地，待测样本与试剂组合物(1)的体积比例为1:45-60。
优选地，待测样本与试剂组合物(2)的体积比例为1:15-20。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果是：
(1)本发明提供了一种特异性较高的用于小而密低密度脂蛋白胆固醇检测的试剂盒。
用本发明所述试剂盒在检测时可特异地清除sd-LDL以外的脂蛋白，提高了试剂盒的检测结果的准确度。
(2)作为本发明的优选方案，在上述试剂盒中同时加入HLB值在13以上且小于15的聚氧乙烯苯基醚衍生物和HLB在9以上且小于16的烷基糖苷时，试剂盒还具有优异的稳定性，在2-8℃保存可至少稳定保存18个月。
(3)本发明提供的试剂盒操作简单，可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
具体实施方式
实施例1
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其包括试剂组合物(1)和试剂组合物(2)，
配制试剂组合物(1)，其包括浓度为0.01KU/L的lb-id-LDL嵌合酯酶、浓度为0.1ml/L的Mg(ClO4)2-DMF镁基类离子液体、浓度为0.5mmol/L的TOOS、浓度为0.1KU/L的胆固醇酯酶、浓度为0.2KU/L的胆固醇氧化酶、浓度为50KU/L的过氧化氢酶、浓度为0.2g/L的PEG6000、浓度为0.5g/L的三甲基-β-环糊精、浓度为0.5g/L的环氧乙烷十八烷胺、浓度为0.5g/L的Brij-58、浓度为0.01ml/L的proclin300、浓度为5g/L的海藻糖、浓度为20mmol/L、pH 6.5的MOPS缓冲液。
配制试剂组合物(2)，其包括浓度为10KU/L的过氧化物酶、浓度为0.5mmol/L的4-AAP、浓度为2ml/L的聚氧乙烯苯基醚衍生物TritonX-100、浓度为2ml/L的烷基糖苷APG1214、浓度为2mmol/L的胆酸钠、浓度为0.01ml/L的proclin300、浓度为5g/L的海藻糖、浓度为20mmol/L、pH 6.5的MOPS缓冲液。
采用该试剂盒进行检测，采用的仪器为BECKMAN LX20全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂I体积为150μl，试剂Ⅱ体积为50μl，测定主/副波长为600/700nm测定方法为两点终点法，定标曲线的拟合方式为线性拟合。
检测步骤如下：
S1分别按上述比例配制试剂组合物(1)和试剂组合物(2)；
S2试剂组合物(1)和血清样本混合后在测定温度反应5分钟，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,1、AS,1、AU,1；
S3加入试剂组合物(2)后继续反应5分钟，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,2、AS,2、AU,2，由仪器自动计算出样本中的sd-LDL-C浓度。用本法和沉淀法同时测定了25例血清样本液中sdLDL-C浓度，检测结果如下表1。
表1为本实施例所述方法测定的血清样本中sdLDL-C的浓度与沉淀法测定的sdLDL-C浓度的对照表。
Figure BDA0002288764520000061
Figure BDA0002288764520000071
相关性曲线为：Y＝0.956X+0.302，相关系数为0.976。
实施例2
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其包括试剂组合物(1)和试剂组合物(2)，
配制试剂组合物(1)，其包括浓度为1.5KU/L的lb-id-LDL嵌合酯酶、浓度为1ml/L的MgCl2-ChCl镁基类离子液体、浓度为3mmol/L的HDAOS、浓度为2KU/L的胆固醇酯酶、浓度为5KU/L的胆固醇氧化酶、浓度为1500KU/L的过氧化氢酶、浓度为2.5g/L的PEG6000、浓度为2.5g/L的三甲基-β-环糊精、浓度为2g/L的环氧乙烷十八烷胺、浓度为5g/L的Brij-58、浓度为0.2ml/L的proclin300、浓度为50g/L的海藻糖、浓度为65mmol/L、pH 7.0的PIPES缓冲液；
配制试剂组合物(2)，其包括浓度为75KU/L的过氧化物酶、浓度为3mmol/L的4-AAP、浓度为15ml/L的聚氧乙烯苯基醚衍生物TritonX-102、浓度为5ml/L的烷基糖苷APG1214、浓度为10mmol/L的胆酸钠、浓度为0.2ml/L的proclin300、浓度为50g/L的海藻糖、浓度为65mmol/L、pH 7.0PIPES缓冲液。
采用该试剂盒进行检测，采用的仪器为BECKMANAU5400全自动生化分析仪，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂I体积为150μl，试剂Ⅱ体积为50μl，测定主/副波长为600/700nm测定方法为两点终点法，定标曲线的拟合方式为线性拟合。
检测步骤如下：
S1分别按上述比例配制试剂组合物(1)和试剂组合物(2)；
S2试剂组合物(1)和血清样本混合后在测定温度反应5分钟，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,1、AS,1、AU,1；
S3加入试剂组合物(2)后继续反应5分钟，分别读取空白管、标准管、血清管的吸光度值AB,2、AS,2、AU,2，由仪器自动计算出样本中的sd-LDL-C浓度。用本法和沉淀法同时测定了25例血清样本液中sdLDL-C浓度。
采用与实施例1相同的检测方法，结果表明，实施例2试剂盒的测定结果与沉淀法测定结果呈现了很好的相关性，相关性曲线为：Y＝1.004X-1.352，相关系数r为0.983。
实施例3
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其包括试剂组合物(1)和试剂组合物(2)，
配制试剂组合物(1)，其包括浓度为10KU/L的lb-id-LDL嵌合酯酶、浓度为2ml/L的MgCl2-ChCl-ZnCl2镁基类离子液体、浓度为0.5ml/L的烷基糖苷APG1214、浓度为5mmol/L的TODB、浓度为10KU/L的胆固醇酯酶、浓度为20KU/L的胆固醇氧化酶、浓度为5000KU/L的过氧化氢酶、浓度为10g/L的PEG6000、浓度为10g/L的三甲基-β-环糊精、浓度为8g/L的环氧乙烷十八烷胺、浓度为15g/L的Brij-58、浓度为5ml/L的proclin300、浓度为200g/L的海藻糖、浓度为200mmol/L、pH 7.5的Tris缓冲液；
配制试剂组合物(2)，其包括浓度为200KU/L的过氧化物酶、浓度为5mmol/L的4-AAP、浓度为50ml/L的聚氧乙烯苯基醚衍生物TritonX-104、浓度为20mmol/L的胆酸钠、浓度为5ml/L的proclin300、浓度为200g/L的海藻糖、浓度为200mmol/L、pH 7.5的Tris缓冲液。
采用与实施例1相同的检测方法，结果表明，实施例3试剂盒的测定结果与沉淀法测定结果呈现了很好的相关性，相关性曲线为：Y＝0.947X+0.500，相关系数r为0.967。
实施例4
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其与实施例2的区别仅在于，试剂组合物(2)中不含有烷基糖苷，具体如下：
配制试剂组合物(2)，其包括浓度为75KU/L的过氧化物酶、浓度为3mmol/L的4-AAP、浓度为15ml/L的聚氧乙烯苯基醚衍生物TritonX-102、浓度为10mmol/L的胆酸钠、浓度为0.2ml/L的proclin300、浓度为50g/L的海藻糖、浓度为65mmol/L、pH 7.0PIPES缓冲液。
本实施例提供的试剂盒采用同实施例2的方法进行检测。
实施例5
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其与实施例2的区别仅在于，试剂组合物(2)中不含有聚氧乙烯苯基醚衍生物和烷基糖苷，具体如下：
配制试剂组合物(2)，其包括浓度为75KU/L的过氧化物酶、浓度为3mmol/L的4-AAP、浓度为10mmol/L的胆酸钠、浓度为0.2ml/L的proclin300、浓度为50g/L的海藻糖、浓度为65mmol/L、pH 7.0PIPES缓冲液。
本实施例提供的试剂盒采用同实施例2的方法进行检测。
实施例6
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其与实施例2的区别仅在于，lb-id-LDL嵌合酯酶的浓度为15KU/L；
具体如下：配制试剂组合物(1)，其包括浓度为15KU/L的lb-id-LDL嵌合酯酶、浓度为1ml/L的MgCl2-ChCl镁基类离子液体、浓度为3mmol/L的HDAOS、浓度为2KU/L的胆固醇酯酶、浓度为5KU/L的胆固醇氧化酶、浓度为1500KU/L的过氧化氢酶、浓度为2.5g/L的PEG6000、浓度为2.5g/L的三甲基-β-环糊精、浓度为2g/L的环氧乙烷十八烷胺、浓度为5g/L的Brij-58、浓度为0.2ml/L的proclin300、浓度为50g/L的海藻糖、浓度为65mmol/L、pH 7.0的PIPES缓冲液。
本实施例提供的试剂盒采用同实施例2的方法进行检测。
实施例7
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其与实施例2的区别仅在于，镁基类离子液体的浓度为5ml/L。
具体如下：配制试剂组合物(1)，其包括浓度为1.5KU/L的lb-id-LDL嵌合酯酶、浓度为5ml/L的MgCl2-ChCl镁基类离子液体、浓度为3mmol/L的HDAOS、浓度为2KU/L的胆固醇酯酶、浓度为5KU/L的胆固醇氧化酶、浓度为1500KU/L的过氧化氢酶、浓度为2.5g/L的PEG6000、浓度为2.5g/L的三甲基-β-环糊精、浓度为2g/L的环氧乙烷十八烷胺、浓度为5g/L的Brij-58、浓度为0.2ml/L的proclin300、浓度为50g/L的海藻糖、浓度为65mmol/L、pH 7.0的PIPES缓冲液。
本实施例提供的试剂盒采用同实施例2的方法进行检测。
对比例1
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其与实施例2的区别仅在于，镁基类离子液体替换为1-丁基磺酸-3甲基三氟甲磺酸盐。
本实施例提供的试剂盒采用同实施例2的方法进行检测。
性能试验
1、相关性考察
实施例4-7及对比例1提供的试剂盒采用同实施例2的检测方法进行检测后得到的相关性数据，结果如下表2。
表2
n 相关性曲线 相关系数r
实施例4 25 Y＝0.952X-1.177 0.965
实施例5 25 Y＝0.965X-1.907 0.961
实施例6 25 Y＝0.975X-2.029 0.962
实施例7 25 Y＝0.950X-1.391 0.963
对比例1 25 Y＝0.912X-0.786 0.938
表2结果表明，实施例4-7的相关系统均大于0.96，明显大于对比例。
2、特异性考察
通过超离心方法分离制备了lb-LDL、id-LDL、sd-LDL三个LDL亚组分，在此基础上制备了以下3个样本：(1)样本1：含sd-LDL-C浓度为50mg/dL；(2)样本2：含sd-LDL-C浓度为50mg/dL，含lb-LDL浓度为50mg/dL；(3)样本3：含sd-LDL-C浓度为50mg/dL，含id-LDL浓度为50mg/dL。用实施例1-6及对比例1提供的试剂盒分别对样本1-3中的sd-LDL-C浓度进行测定，并分别计算样本2与样本1测定结果的相对偏差(记录为相对偏差1)、样本3与样本1测定结果的相对偏差(记录为相对偏差2)。
具体结果如下表3。
表3
Figure BDA0002288764520000111
从表3的结果可以看出，实施例1-7产生的相对偏差远低于对比例1。
3、精密度考察
取sd-LDL-C浓度为20.5±2.1mg/dL的低值质控样本(其共存的lb-LDL浓度为12.8mg/dL、id-LDL浓度为6.1mg/dL)和sd-LDL-C浓度为82.1±8.2mg/dL的高值质控样本(其共存的lb-LDL浓度为45.9mg/dL、id-LDL浓度为25.7mg/dL)，同一天内采用本发明试剂盒重复测定20次，计算批内CV，然后采用相同样本连续测定20天，计算批间CV。
具体结果如下表4-5：
表4
表5
Figure BDA0002288764520000113
4、试剂盒的稳定性考察
将本发明实施例1-7及对比例1制备的试剂盒在4度冰箱环境下放置24个月，其中每隔6个月，按照特异性考察方法测定sd-LDL-C浓度，样本为sd-LDL-C浓度为46.9±4.7mg/dL的中值质控样本(其共存的lb-LDL浓度为26.2mg/dL、id-LDL浓度为11.9mg/dL)，具体结果如下表6：
Figure BDA0002288764520000122
结果表明本发明1-3提供的试剂盒在放置24个月时，仍然可以精确测定sd-LDL-C浓度。实施例4-7提供的试剂盒在放置18个月时，仍然可以精确测定sd-LDL-C浓度，超过18个月时，相对偏差增大。
对比例1在放置12个月时，仍然可以精确测定sd-LDL-C浓度。超过12个月时，相对偏差增大。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其中，所述试剂盒至少包含
用于清除样品中除sd-LDL-C以外的脂蛋白的试剂组合物(1)和仅与sd-LDL-C反应的试剂组合物(2)；
所述试剂组合物(1)包括嵌合酯酶和镁基类离子液体。
2.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂组合物(2)中包括聚氧乙烯苯基醚衍生物，所述聚氧乙烯苯基醚衍生物的亲水-亲油平衡值(HLB)在13以上且小于15。
3.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂组合物(2)中还包括烷基糖苷，所述烷基糖苷的HLB在9以上且小于16。
4.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述镁基类离子液体为Mg(ClO4)2-DMF镁基类离子液体、MgCl2-ChCl镁基类离子液体和MgCl2-ChCl-ZnCl2镁基类离子液体中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述嵌合酯酶为lb-id-LDL嵌合酯酶。
6.根据权利要求5所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂组合物(1)中嵌合酯酶的浓度为0.01-10KU/L。
7.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂组合物(1)中还包括浓度为0.1-10KU/L的胆固醇酯酶、0.2-20KU/L的胆固醇氧化酶和50-5000KU/L过氧化氢酶。
8.根据权利要求1所述的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂组合物(1)还包括pH 6.5-7.5GOOD’S缓冲液，其浓度为20-200mmol/L。
9.采用如权利要求1-8中任一项所述的试剂盒对样本中小而密低密度脂蛋白胆固醇进行检测的方法，包括如下：
S1分别按比例配制试剂组合物(1)和试剂组合物(2)；
S2将试剂组合物(1)与样本混合、反应结束后测得吸光值AU,1；
S3向S2中继续加入试剂组合物(2)继续反应后测得吸光值AU,2，根据吸光值差计算出样本中的sd-LDL-C浓度。
10.根据权利要求9所述的方法，步骤S2、S3中检测采用的主波长为600nm，副波长为700nm。
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