CN110585193A - 一种二芳基丁内酯类木脂素类化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用 - Google Patents

一种二芳基丁内酯类木脂素类化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种二芳基丁内酯类木脂素类化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。本发明所述的木脂素类化合物经体外、体内、分子水平的实验后，证明其具有较强的抗肝星状细胞增殖的作用、抗肝纤维化的作用，以及针对基质金属蛋白酶‑2(MMP2)、基质金属蛋白酶‑9(MMP9)和转化生长因子‑β1(TGF‑β1)均有较低的IC50值，具有良好的结合并抑制其生物活性的作用，故而可作为抗肝纤维化药物。

Description

一种二芳基丁内酯类木脂素类化合物在制备抗肝纤维化药物 中的应用
本发明是根据专利法第31条提出的分案申请，原申请的申请日为2017年9月13日，申请号为201710823479.2，发明名称为：一种木脂素类化合物在制备抗肝纤维药物中的应用。原申请所记载的技术方案全文被本发明引用。
技术领域
本发明涉及天然产物化学药物领域，具体地说，涉及一种二芳基丁内酯类木脂素类化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
背景技术
肝纤维化是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外基质成分过度异常地沉积，而影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化必经阶段。研究表明肝纤维化尚有逆转至正常的可能，若进展至肝硬化则无逆转可能，因此寻找治疗肝纤维化的药物是众多学者研究的热点。目前虽在诊治肝纤维化方面有一些进展，但仍缺乏确定有效的药物。而富含木脂素的药材和木脂素的单体在抗肝纤维化的方面都有较好的药效活性。可为肝纤维化的治疗提供思路。
木脂素是一类天然酚类化合物，具有多样的结构和广泛的生物活性。其结构是两个苯丙素单元(C6-C3)的二聚体。常见的有芳基萘类，二苄基丁内酯类，四氢呋喃类，二苄基丁烷类，联苯环辛烯类和新木脂素等类型。木脂素主要从天然物质中提取获得，存在于超过70种的植物中，所在部位各异。因此木脂素的提取和分离目前还没有形成系统、规范的方法，尤其是缺乏适合于批量或者规模化制备的方法。富含木脂素类化合物的植物在民间有着相当长的医用历史，随着现代分离手段、结构鉴定方法及高通量筛选技术的广泛应用，木脂素的抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗虫、抗氧化、抗风湿、保肝、抑制植物生长等生物活性被相继报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种木脂素类化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种木脂素类化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用。
本发明所述木脂素类化合物是指C6-C3单位连接而成的化合物。
其中，优选的为化合物1a，1b，1c，1d，1e，2a；最优选的为化合物1d，1e。
本发明所述木脂素类化合物是由天然柴胡萃取而得。
所述制备方法包括步骤：
1)取干燥的竹叶柴胡药材粉碎成粗粉，用8-10倍量75％乙醇加热回流提取2-4次，每次1-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩除去乙醇，搅拌加水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取；收集萃取液，旋转蒸发，得到各个萃取部分；
2)将乙酸乙酯萃取部分溶于乙酸乙酯中使其浓度达到20-50mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用石油醚-乙酸乙酯系统以4∶1(v/v)，1∶1(v/v)，1∶8(v/v)，1∶20(v/v)，纯甲醇系统梯度洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发，得到1∶20的洗脱部分；
3)将1∶20的洗脱部分溶于乙酸乙酯中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用石油醚-乙酸乙酯系统以2∶1(v/v)等度洗脱；每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按极性合并，得到待分离的洗脱馏分94-109#和110-128#；
4)将待分离的洗脱馏分94-109#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行60％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集41-43min出现的化合物吸收峰；馏分命名为化合物4b；
5)将待分离的洗脱馏分110-128#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行50％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集12-14min出现的化合物吸收峰；馏分命名为化合物1a，收集22-25min出现的化合物吸收峰；馏分命名为化合物4a；
6)正丁醇萃取部分按3倍量丙酮溶液加热回流提取3次，每次30min。收集提取液，旋转蒸发，得到正丁醇萃取的丙酮可溶部分和正丁醇萃取的丙酮不可溶部分；
7)将正丁醇萃取的丙酮可溶部分溶于丙酮中使其浓度达到20-50mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用乙酸乙酯-甲醇系统以100∶1(v/v)，75∶1(v/v)，25∶1(v/v)，纯甲醇系统梯度洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发，得到75∶1的洗脱部分；
8)将75∶1的洗脱部分溶于丙酮中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用环己烷-丙酮系统以4∶1(v/v)，3∶2(v/v)，1∶2(v/v)梯度洗脱。每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按极性合并，得到待分离的洗脱馏分3-5#和6-10#；
9)将待分离的洗脱馏分3-5#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行55％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集45-47min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物3a；收集48-49min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物5a；收集61-63min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物2a；
9)将待分离的洗脱馏分6-10#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行45％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集30-32min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物2b；收集35-37min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物5b；收集45-49min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物3b；
10)将正丁醇萃取的丙酮不可溶部分溶于丙酮中使其浓度达到20-50mg/ml，过100-200目的硅胶柱色谱，采用乙酸乙酯-甲醇系统以100∶1(v/v)，4∶1(v/v)，1∶1(v/v)，纯甲醇系统梯度洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发，得到4∶1的洗脱部分；
11)将4∶1的洗脱部分溶于丙酮中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用乙酸乙酯-甲醇系统以3∶4(v/v)等度洗脱；每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按极性合并，得到待分离的洗脱馏分1-3#，4-8#和9-12#；
12)将待分离的洗脱馏分1-3#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行35％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集18-20min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1e；收集26-29min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1d；
13)将待分离的洗脱馏分4-8#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行35％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集31-33min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物6a；收集36-37min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1b；
14)将待分离的洗脱馏分4-8#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行30％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集25-28min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1c；收集48-50min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物7a。
本发明提取得到的化合物，经体外、体内、分子水平的实验后，证明其具有较强的抗肝星状细胞增殖的作用、抗肝纤维化的作用，以及针对基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)和转化生长因子-β1(TGF-β1)均有较低的IC50值，具有良好的结合并抑制其生物活性的作用，故而可作为抗肝纤维化药物。
本发明化合物用于药物时，可以单独使用或制成其他临床可用的不同剂型的药物，剂型包括散剂、注射剂、胶囊剂、丸剂、微胶囊、片剂、膜剂、软胶囊剂、膏剂、栓剂、气雾剂、酊剂、口服液、颗粒剂。可按照药物制剂学添加医学上可接受的药用辅料，包括填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、pH调节剂或润滑剂等。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
除非特别说明，本发明中所有百分比均为体积百分比。
实施例1化合物的制备方法
本实施例所述木脂素类化合物是由天然柴胡萃取而得，具体过程如下：
1)取干燥的竹叶柴胡药材(产自中国云南)15kg粉碎成粗粉，用9倍量75％乙醇加热回流提取3次，每次1h，过滤，合并滤液，减压浓缩除去乙醇，搅拌加水稀释至40L，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取。收集萃取液，旋转蒸发，得到各个萃取部分。
2)将乙酸乙酯萃取部分溶于乙酸乙酯中使其浓度达到20-50mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用石油醚-乙酸乙酯系统以4∶1(v/v)，1∶1(v/v)，1∶8(v/v)，1∶20(v/v)，纯甲醇系统梯度洗脱。收集洗脱液，旋转蒸发，得到1∶20的洗脱部分。
3)将1∶20的洗脱部分溶于乙酸乙酯中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用石油醚-乙酸乙酯系统以2∶1(v/v)等度洗脱。每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按极性合并，得到待分离的洗脱馏分94-109#和110-128#。
4)将待分离的洗脱馏分94-109#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行60％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集41-43min出现的化合物吸收峰。馏分命名为化合物4b。
5)将待分离的洗脱馏分110-128#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行50％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集12-14min出现的化合物吸收峰。馏分命名为化合物1a，收集22-25min出现的化合物吸收峰。馏分命名为化合物4a。
6)正丁醇萃取部分按3倍量丙酮溶液加热回流提取3次，每次30min。收集提取液，旋转蒸发，得到正丁醇萃取的丙酮可溶部分和正丁醇萃取的丙酮不可溶部分。
7)将正丁醇萃取的丙酮可溶部分溶于丙酮中使其浓度达到20-50mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用乙酸乙酯-甲醇系统以100∶1(v/v)，75∶1(v/v)，25∶1(v/v)，纯甲醇系统梯度洗脱。收集洗脱液，旋转蒸发，得到75∶1的洗脱部分。
8)将75∶1的洗脱部分溶于丙酮中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用环己烷-丙酮系统以4∶1(v/v)，3∶2(v/v)，1∶2(v/v)梯度洗脱。每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按极性合并，得到待分离的洗脱馏分3-5#和6-10#。
9)将待分离的洗脱馏分3-5#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行55％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集45-47min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物3a；收集48-49min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物5a；收集61-63min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物2a。
9)将待分离的洗脱馏分6-10#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行45％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集30-32min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物2b；收集35-37min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物5b；收集45-49min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物3b。
10)将正丁醇萃取的丙酮不可溶部分溶于丙酮中使其浓度达到20-50mg/ml，过100-200目的硅胶柱色谱，采用乙酸乙酯-甲醇系统以100∶1(v/v)，4∶1(v/v)，1∶1(v/v)，纯甲醇系统梯度洗脱。收集洗脱液，旋转蒸发，得到4∶1的洗脱部分。
11)将4∶1的洗脱部分溶于丙酮中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，采用乙酸乙酯-甲醇系统以3∶4(v/v)等度洗脱。每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按极性合并，得到待分离的洗脱馏分1-3#，4-8#和9-12#。
12)将待分离的洗脱馏分1-3#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行35％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集18-20min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1e；收集26-29min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1d。
13)将待分离的洗脱馏分4-8#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行35％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集31-33min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物6a；收集36-37min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1b。
14)将待分离的洗脱馏分4-8#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行30％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集25-28min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1c；收集48-50min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物7a。
15个化合物的13C NMR数据如表1所示。
实施例2 MTT法体外抑激活的肝星状细胞实验
本实施例针对本发明所述木脂素类化合物进行MTT法体外抑激活的肝星状细胞实验。
实验材料：人肝星状细胞株LX-2，大鼠肝星状细胞株T-6
受试药物：15个化合物配制终浓度梯度为100μM、20μM、4μM、0.8μM和0.16μM。
阳性对照：柴胡皂苷d配制终浓度梯度为100μM、20μM、4μM、0.8μM和0.16μM。
以人肝星状细胞株LX-2为例，采用MTT法测定15个化合物对激活后肝星状细胞的抑制作用。
(1)LX-2人肝星状细胞株计数，将细胞制成5×104个/mL的细胞悬液。
(2)取细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔200μL。37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h，待细胞贴壁。
(3)每孔依次加入TGF-β1至终浓度为10ng/mL孵育24h。
(3)其后，于96孔板中加入受试药物，每组均设5个复孔。同时设立溶剂对照组和柴胡皂苷d阳性对照组。37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养48h。
(4)其后每培养孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL，溶于PBS中，0.22μm的膜过滤)，培养箱中再次静置培养4h。
(5)吸出上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，微量震荡器振荡5min。
(6)最后用酶标仪于490nm波长处，测定各孔吸光值。统计数据并进行数据分析。
T-6大鼠肝星状细胞也采用上述的方法经行测试。化合物对激活后的人肝星状细胞株LX-2和鼠肝星状细胞T-6的IC50值见下表2。
表2
由表2数据表明，本发明中的化合物具有显著的抑制激活肝星状细胞的增殖作用，在人肝星状细胞株LX-2，大鼠肝星状细胞株T-6中均显示较低的IC50值，即较强的抑制激活肝星状细胞增殖的作用。并且绝大多数具有与阳性对照柴胡皂苷d相同或者更高的抑制细胞增殖的作用，在体外实验中显示较强的抗肝星状细胞增殖的作用，可以作为新的抗肝纤维化药物开发利用，尤其化合物1d与1e为佳。
实施例3大鼠体内抗肝纤维化实验
本实施例针对本发明所述化合物进行大鼠体内抗肝纤维化实验。
实验动物：雄性SD大鼠，SPF级，6-8周龄，体重180+-20，购自中国军事医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK-(军)2012-2004.正常适应性饲养条件：独立隔离饲养笼饲养，温度18-21℃，湿度＞40％，150Pa加压送风，循环光照(12h光照，12h黑暗)，自由进水进食(标准颗粒饲料)，隔天换一次垫料和饲料。
实验分组：将实验大鼠265只随机分成18组，分别为正常组(10只)、模型组(15只)、化合物1a组(15只)、化合物1b组(15只)、化合物1c组(15只)、化合物1d组(15只)、化合物1e组(15只)、化合物2a组(15只)、化合物2b组(15只)、化合物3a组(15只)、化合物3b组(15只)、化合物4a组(15只)、化合物4b组(15只)、化合物5a组(15只)、化合物5b组(15只)、化合物14组(15只)、化合物6a组(15只)和柴胡皂苷7b组(15只)。
(1)空白组，适应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予生理盐水0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予生理盐水0.1mL/100g，给药4周；
(2)模型组，适应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予生理盐水0.1mL/100g，给药4周；
(3)化合物1a组，适应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物1，2mg/kg，给药4周；
(4)化合物1b组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物2，2mg/kg，给药4周；
(5)化合物1c组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物3，2mg/kg，给药4周；
(6)化合物1d组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物4，2mg/kg，给药4周；
(7)化合物1e组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物5，2mg/kg，给药4周；
(8)化合物2a组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物6，2mg/kg，给药4周；
(9)化合物2b组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物7，2mg/kg，给药4周；
(10)化合物3a组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物8，2mg/kg，给药4周；
(11)化合物3b组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物9，2mg/kg，给药4周；
(12)化合物4a组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物10，2mg/kg，给药4周；
(13)化合物4b组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物11，2mg/kg，给药4周；
(14)化合物5a组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物12，2mg/kg，给药4周；
(15)化合物5b组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物13，2mg/kg，给药4周；
(16)化合物6a组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物14，2mg/kg，给药4周；
(17)化合物7a组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予化合物15，2mg/kg，给药4周；
(18)柴胡皂苷d组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予柴胡皂苷d，2mg/kg，给药4周；
大鼠饲养4周后禁食12h，10％水合氯醛以0.35ml/100g腹腔注射麻醉，心脏取血，取出的血静止3-4h后，3500r/min离心10min，取上清，分装后存于-80℃冰箱备用。取血后心脏生理盐水灌流，快速摘取肝脏和脾脏，生理盐水清洗血污，滤纸吸干后分析天平称重，计算肝脏脾脏指数。摘取大鼠肝脏左叶置于中性固定液中，备病理学检测。其余肝脏冻于-80℃，用于后续指标检测。
15个化合物分别对大鼠肝纤维化治疗的血清指标的影响结果见下表3。
表3
#P＜0.05，##p＜0.01与正常组相比.*P＜0.05，**p＜0.01与模型组相比。
15个化合物分别对大鼠肝纤维化治疗的肝脏指标的影响结果见下表4。
表4
#P＜0.05，##p＜0.01与正常组相比.*P＜0.05，**p＜0.01与模型组相比。
由表4数据表明，从大鼠血清指标和肝脏指标两个方面显示了15个化合物在DMN诱导大鼠肝纤维化模型具有较好的抗肝纤维化药效活性。并且化合物1-15绝大多数具有与阳性对照柴胡皂苷d等效的药物活性。15个化合物在体内实验中显示较强的抗肝纤维化的作用，可以作为新的抗肝纤维化药物开发利用。
实施例3分子水平的抗肝纤维化活性实验
本实施例针对本发明所述15个化合物分别进行分子水平的抗肝纤维化活性实验。
MMP2活性Elisa试剂盒，MMP9活性Elisa试剂盒，TGF-β1活性Elisa试剂盒以及MMP2、MMP9、TGF-β1蛋白标准液均由北京冬歌生物科技有限公司提供。
15个化合物分别配置五个浓度梯度，每个浓度梯度相差10倍。分别将不同浓度的15个化合物与不同的蛋白标准液分别混合，采用Elisa试剂盒检测各个样品中蛋白的活性。
试剂盒的使用流程如下：
(1)准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30min；
(2)配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液；
(3)加入待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍)；空白对照孔不加；
(4)温育：恒温箱温育30min；
(5)洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次；
(6)加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加；
(7)温育：37℃恒温箱温育30min；
(8)洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次；
(9)显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，平板混匀器混匀30s，37℃避光显色15min；
(10)终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应；
(11)测定：以空白孔调零，在终止后15min内，用450nm波长测量各孔的吸光值。
实验数据如表5所示。
表5
由表5数据表明，本发明中的化合物对于与肝纤维化相关的蛋白：基质金属蛋白酶-2(MMP2)，基质金属蛋白酶-9(MMP9)和转化生长因子-β1(TGF-β1)均有较低的IC50值。即有良好的结合并抑制其生物活性的作用。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims (3)

1.一种二芳基丁内酯类木脂素类化合物在制备抗肝纤维化药物中的应用，所述二芳基丁内酯类木脂素类化合物具有式2所示的结构：
R1 R2 R3 R4 R5 化合物2a OCH<sub>3</sub> O OCH<sub>3</sub> OH OCH<sub>3</sub> 化合物2b H H<sub>2</sub> OCH<sub>3</sub> OCH<sub>3</sub> OH。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述二芳基丁内酯类木脂素类化合物自天然竹叶柴胡提取分离而得。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述二芳基丁内酯类木脂素类化合物的制备方法包括步骤：
1)取干燥的竹叶柴胡药材粉碎成粗粉，用8-10倍量75％乙醇加热回流提取2-4次，每次1-2h，过滤，合并滤液，减压浓缩除去乙醇，搅拌加水稀释，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取；收集萃取液，旋转蒸发，得到各个萃取部分；
2)将乙酸乙酯萃取部分溶于乙酸乙酯中使其浓度达到20-50mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，按照体积比采用石油醚-乙酸乙酯系统以4:1，1:1，1:8，1:20，纯甲醇系统梯度洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发，得到1:20的洗脱部分；
3)将1:20的洗脱部分溶于乙酸乙酯中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，按照体积比采用石油醚-乙酸乙酯系统以2:1等度洗脱；每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按馏分极性合并，得到待分离的洗脱馏分94-109#和110-128#；
4)将待分离的洗脱馏分94-109#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行60％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集41-43min出现的化合物吸收峰；馏分命名为化合物4b；
5)将待分离的洗脱馏分110-128#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行50％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集12-14min出现的化合物吸收峰；馏分命名为化合物1a，收集22-25min出现的化合物吸收峰；馏分命名为化合物4a；
6)正丁醇萃取部分按3倍量丙酮溶液加热回流提取3次，每次30min。收集提取液，旋转蒸发，得到正丁醇萃取的丙酮可溶部分和正丁醇萃取的丙酮不可溶部分；
7)将正丁醇萃取的丙酮可溶部分溶于丙酮中使其浓度达到20-50mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，按照体积比采用乙酸乙酯-甲醇系统以100：1，75:1，25:1，纯甲醇系统梯度洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发，得到75:1的洗脱部分；
8)将75:1的洗脱部分溶于丙酮中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，按照体积比采用环己烷-丙酮系统以4:1，3:2，1:2梯度洗脱。每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按极性合并，得到待分离的洗脱馏分3-5#和6-10#；
9)将待分离的洗脱馏分3-5#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行55％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集45-47min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物3a；收集48-49min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物5a；收集61-63min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物2a；
10)将待分离的洗脱馏分6-10#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行45％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集30-32min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物2b；收集35-37min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物5b；收集45-49min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物3b；
11)将正丁醇萃取的丙酮不可溶部分溶于丙酮中使其浓度达到20-50mg/ml，过100-200目的硅胶柱色谱，按照体积比采用乙酸乙酯-甲醇系统以100：1，4:1，1:1，纯甲醇系统梯度洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发，得到4:1的洗脱部分；
12)将4:1的洗脱部分溶于丙酮中使其浓度达到30-80mg/ml，过200-300目的硅胶柱色谱，按照体积比采用乙酸乙酯-甲醇系统以3:4等度洗脱；每个馏分收集50ml，记第一个馏分为1#，依次编号，旋转蒸发后按极性合并，得到待分离的洗脱馏分1-3#，4-8#和9-12#；
13)将待分离的洗脱馏分1-3#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行35％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集18-20min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1e；收集26-29min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1d；
14)将待分离的洗脱馏分4-8#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行35％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集31-33min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物6a；收集36-37min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1b；
15)将待分离的洗脱馏分4-8#溶于乙腈中使其浓度达到30-80mg/ml，采用反相C18柱经行30％乙腈的等度洗脱，紫外检测器的检测波长为230-280nm，收集25-28min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物1c；收集48-50min出现的化合物吸收峰，馏分命名为化合物7a。
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