CN110477102A - 一种奶啤饮料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶水解乳饮料生产技术领域，具体涉及一种奶啤饮料及其制备方法，将脱脂奶中加入低聚果糖和白砂糖配制成原奶液，再加入蛋白酶进行水解，经灭菌和灭酶后，接入德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)进行同步发酵，制得奶啤饮料。本发明通过蛋白酶将蛋白质水解成氨基酸和短肽解决蛋白质沉淀问题，从而改善奶啤外观稳定性。发酵过程添加低聚果糖，有利于保留乳的风味，改善其营养价值，同时还具有促进肠道消化功能，风味宜人爽口，稳定性良好，是一种营养丰富的饮品。
Description
技术领域
本发明涉及酶水解乳饮料生产技术领域，具体涉及一种奶啤饮料及其制备方法。
背景技术
奶啤是一种介于酒类、乳饮料类之间的“边缘”产品，兼具乳制品及酒的双重特征。对于不胜酒力的群体，可选含少量酒精的奶啤作为替代品，而且奶啤具有独特的风味，这是啤酒难以比拟的。此外新型葡萄奶啤还有很重要的保健功能，如延缓衰老，抗癌等。
奶啤含有大量的乳酪蛋白，极易发生蛋白质沉淀等外观不稳定的现象，发酵过程中所产生的二氧化碳气体和微量酒精给也奶啤的外观稳定性控制加大了难度，而采用保证产品外观稳定性的措施，使产品外观乳白、均匀、清爽不腻口，感官指标达到通常乳饮料的标准，是奶啤生产技术研究中的一项重要内容。目前维持奶啤稳定性方式是加入相关稳定剂，但是稳定剂会有污染环境和影响奶啤口感的缺陷。
申请号为201310486176.8的专利公开了“一种富含活菌的低脂奶啤饮料的生产方法”，使用脱脂牛乳为原料，克服了产品的如脂肪上浮的问题，增强其稳定性，但没有指出如何解决蛋白质沉淀、发酵过程中所产生的二氧化碳气体和微量酒精给奶啤的外观稳定性造成一定影响的问题。
目前没有通过酶水解方式来改善奶啤稳定性的研究。
发明内容
本发明提供了一种改善奶啤稳定性，以及提高营养价值的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种奶啤饮料的制备方法，将脱脂奶中加入低聚果糖和白砂糖配制成原奶液，再加入蛋白酶进行水解，经灭菌和灭酶后，接入德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)进行同步发酵，制得奶啤饮料。
所述脱脂奶为脱脂奶粉溶液或新鲜牛奶经过脱脂处理。脱脂奶不需要灭菌。
优选地，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中一种或两种以上，酶活范围为2～10万U/100mL。
优选地，所述德氏乳杆菌和嗜热链球菌的接种总量为108～1010CFU/100mL，其中接种比例杆菌：球菌为10:1～1:10。
优选地，所述德氏乳杆菌和嗜热链球菌的接种总量为109CFU/100mL，其中接种比例杆菌：球菌为2:1～1:5。
优选地，所述酿酒酵母的接种量为107～1010CFU/100mL。
优选地，所述酿酒酵母的接种量为109CFU/100mL。
优选地，按质量份计，所述原奶液中脱脂奶的固含量为5～25％、低聚果糖为0.5～5％，白砂糖为5～15％，余量为水。
优选地，所述原奶液中脱脂奶(以固含量计)，低聚果糖及白砂糖的总质量分数为21％，其余为水。
优选地，所述水解条件为：37～42℃下水解2～4h；所述发酵条件为：30～35℃下发酵10～15h。
优选地，所述灭菌温度为85～95℃，灭酶时间为15～20min。
优选地，所述德氏乳杆菌为(Lactobacillus delbrueckii)DMLD-H1，保藏编号为GDMCC NO.60645；所述嗜热链球菌为(Streptococcus thermophilus) DMST-H2，保藏编号为GDMCC No：60642。
所述奶啤酶水解最佳条件为：中性蛋白酶42℃水解4h，酶活为8万 U/100mL。
所述奶啤饮料中杆菌和球菌总数达到1012CFU/100mL,其中酵母数为 107CFU/100mL。
所述奶啤饮料经严格灭菌后，于4℃冰箱中保藏，口感更佳。
本发明通过蛋白酶将蛋白质水解成氨基酸和短肽不仅解决因蛋白质沉淀而影响奶啤外观稳定性，还促进了德氏乳杆菌，嗜热链球菌以及酿酒酵母的生长，极大程度上改善了奶啤风味。本发明还添加低聚果糖，增加奶啤促进肠道消化的功效。
本发明于与现有技术相比，具有如下优点：
(1)本发明首次利用酶解法改善奶啤稳定性，具体为用蛋白酶水解奶啤中蛋白质，将大分子蛋白质转变为小分子氨基酸和肽。
(2)蛋白酶水解产物有助于德氏乳杆菌，嗜热链球菌及酿酒酵母的生长，改善奶啤口感风味以及提高营养价值。
(3)德氏乳杆菌和嗜热链球菌为自主筛选菌株，纯度更高，发酵效果更好。
(4)利用发酵菌株来解决苦味问题，解决了酶解法会产生苦味的难题。
(5)既具备酸奶的酸甜的特点，又具备酒的爽口的特点，是一种健康的低脂低醇型饮品，适用于多种场合，适合肠胃不佳或不胜酒力的人饮用。
(6)用酶代替奶啤中稳定剂的使用，且酶易降解，减少对环境的破坏。
(7)酿酒酵母和乳酸菌同时发酵，并且原奶液水解前不需灭菌，酶水解后灭菌灭酶同步进行，因此工艺简便高效，节约了时间和生产成本。
本发明德氏乳杆菌为(Lactobacillus delbrueckii)DMLD-H1，已于2019年 4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，保藏编号为 GDMCC NO.60645。地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
本发明嗜热链球菌为(Streptococcus thermophilus)DMST-H2，于2019年 4月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称GDMCC，保藏编号为 GDMCC No：60642。地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
附图说明
图1为奶啤饮料加工工艺流程图。
图2为实例1中不同酶种类对奶啤的影响。
图3为实例2中不同酶活对奶啤的影响。
图4为实例3中不同保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌对奶啤的影响。
图5为实例4中不同酵母含量对奶啤的影响。
图6为实例5中酶解产物对单菌株数量的影响。
图7为实例6中不同杆菌：球菌比例与酶活对酵母数量的影响。
图8为实例6中不同酶活与接入酵母数对酵母量的影响。
图9为实例6中不同杆菌：球菌比例与接入酵母数对酵母总数的影响。经过响应面优化，根据拟合二阶模型公式得到理论上奶啤发酵工艺的最优条件为杆菌：球菌＝1.41，酵母接种量为1.2×109/100mL，酶活为7.92万U/100mL。考虑到实际操作的可行性，将上述最优条件修正为杆菌：球菌＝1.5，酵母接种量为1.0×109/100mL，酶活为8万U/100mL。
图10为不同样液的电泳图，从左往右：标准蛋白—原奶液—2万U/100mL 中性蛋白酶水解液—8万U/100mL中性蛋白酶水解液—2万U/100mL奶啤发酵液—6万U/100mL奶啤发酵液—保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌＝1：1的发酵液—保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌＝1：2的发酵液—标准蛋白。
图11为实施例1中性蛋白酶水解液的发酵奶啤外观图(a)与原奶直接发酵的奶啤外观图(b)。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。
实施例1：探究不同酶种类对奶啤的影响
第一步配制原乳液：按质量分数为脱脂奶粉：白砂糖：益生元：水＝10:10:1:79的比例溶解，摇匀，使其充分溶解。
第二步加酶水解：待牛奶冷却至室温时，分别加入中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶水解4h，酶活均为6万U/100mL。
第三步加热灭酶：85℃20min
第四步酶解液发酵：待冷却至37℃～42℃时，接种德氏乳杆菌和嗜热链球菌109CFU/100mL，比例为1：1，同时接种酿酒酵母109CFU/100mL,于30℃发酵15h，制得新型奶啤。
第五步于100mL奶啤中吸取0.1mL进行梯度稀释，用MRS琼脂培养基接种奶啤中德氏乳杆菌和嗜热链球菌，用孟加拉红培养基接种酿酒酵母(安琪高活性干酵母)；同时用pH计测定奶啤中pH值。
选用不同蛋白酶种类，探究其对奶啤的影响，如图2所示。由图2可知，木瓜蛋白酶极大程度促进德氏乳杆菌和嗜热链球菌的增殖，含量达 1012CFU/mL，但是对酿酒酵母的增殖效果不明显；菠萝蛋白酶很好促进酿酒酵母的生长，含量高达107CFU/mL，但是对德氏乳杆菌和嗜热链球菌促进效果较差；而中性蛋白酶对德氏乳杆菌和嗜热链球菌及酿酒酵母的促进效果都较好；对于pH值，木瓜蛋白酶pH值最高，中性蛋白酶次之，菠萝蛋白酶最低，但中性蛋白酶与菠萝蛋白酶pH相差不大；以菌量高及pH低为参照，中性蛋白酶对奶啤的效果更好。
选用不同蛋白酶种类，探究其对奶啤风味的影响，如表1所示；由表1 可知，酶水解液发酵的一大难题就是会产生疏水性氨基酸和小肽，致使水解液呈现苦味，但是小分子的多肽和氨基酸可以作为菌株的增殖因子促进菌株的生长，故经过多菌协调发酵后，苦味显著降低，而且在一定程度上增加奶啤的风味。
选用不同蛋白酶种类，探究其对奶啤稳定性的影响，如表1和图11所示；由表1和图11可知，运用中性蛋白酶水解液发酵的奶啤无分层，较澄清，稳定性好。而运用原奶液直接发酵的奶啤有大量沉淀，分层严重，稳定性较差。
表1不同酶种类的感官测评
实施例2：探究不同酶活对奶啤的影响
第一步配制原乳液：按质量分数为脱脂奶粉：白砂糖：益生元：水＝10:10:1:79的比例溶解，摇匀，使其充分溶解。
第二步加酶水解：待牛奶冷却至室温时，加入中性蛋白酶水解4h，酶活分别为2万U/100mL,4万U/100mL,6万U/100mL,8万U/100mL,10万U/100mL。
第三步加热灭酶：85℃20min
第四步酶解液发酵：待冷却至37℃～42℃时，接种德氏乳杆菌和嗜热链球菌109CFU/100mL，比例为1：1，同时接种酿酒酵母109CFU/100mL,于30℃发酵15h，制得新型奶啤。
第五步于100mL奶啤中吸取0.1mL进行梯度稀释，用MRS琼脂培养基接种奶啤中德氏乳杆菌和嗜热链球菌，用孟加拉红培养基接种酿酒酵母；同时用 pH计测定奶啤中pH值。
选用不同酶活范围，探究其对奶啤的影响，如图3所示。由图3可知，酶活为4万U/100mL的pH＝4.55最低，酶活为8万U/100mL的pH次之；对酵母增殖效果最好的是8万U/100mL，含量达107CFU/mL，酶活为6万U/100mL 次之；对杆菌和球菌增殖效果最好的是酶活为10万U/100mL，含量达 1013CFU/mL，酶活为4万U/100mL次之，并且酶活为8万U/100mL的促进效果与酶活为4万U/100mL的相当；以菌量高及pH低为参照，最优酶活范围为8万U/100mL。注：酶活为4万U/100mL对奶啤的促进效果与酶活为8万 U/100mL相差不大，为了节约生产成本，可以考虑选用酶活为4万U/100mL。
实施例3：探究不同杆菌：球菌比例对奶啤的影响
第一步配制原乳液：按质量分数为脱脂奶粉：白砂糖：益生元：水＝10:10:1:79的比例溶解，摇匀，使其充分溶解。
第二步加酶水解：待牛奶冷却至室温时，加入中性蛋白酶水解4h，酶活为6万U/100mL。
第三步加热灭酶：85℃20min
第四步酶解液发酵：待冷却至37℃～42℃时，接种德氏乳杆菌和嗜热链球菌109CFU/100mL，杆菌：球菌比例为10：1，5：1，2：1，1：1，1：2，1： 5，1：10，同时接种酿酒酵母109CFU/100mL,于30℃发酵15h，制得新型奶啤。
第五步于100mL奶啤中吸取0.1mL进行梯度稀释，用MRS琼脂培养基接种奶啤中德氏乳杆菌和嗜热链球菌，用孟加拉红培养基接种酿酒酵母；同时用 pH计测定奶啤中pH值。
选取不同杆菌：球菌的比例，探究对奶啤的影响，如图4所示。由图4可知，pH值最低奶啤的杆菌：球菌的比例为1：5，其次是2：1；对酵母促进作用最好的杆菌：球菌比例为2：1，其次是1：2；对德氏乳杆菌和嗜热链球菌总量促进效果最佳的是杆菌：球菌＝1：5，其次是2：1；以菌量高及pH低为参照，同时考虑奶啤的感官风味，最优杆菌：球菌的比例为2：1。
实施例4：探究不同酵母含量对奶啤的影响
第一步配制原乳液：按质量分数脱脂奶粉：白砂糖：益生元：水＝10:10:1:79 的比例溶解，摇匀，使其充分溶解。
第二步加酶水解：待牛奶冷却至室温时，加入中性蛋白酶水解4h，酶活为6万U/100mL。
第三步加热灭酶：85℃20min
第四步酶解液发酵：待冷却至37℃～42℃时，接种德氏乳杆菌和嗜热链球菌109CFU/100mL，杆菌：球菌比例为1：1，同时接种酿酒酵母含量分别为 107CFU/100mL，108CFU/100mL，109CFU/100mL，1010CFU/100mL，于30℃发酵15h，制得新型奶啤。
第五步于100mL奶啤中吸取0.1mL进行梯度稀释，用MRS琼脂培养基接种奶啤中德氏乳杆菌和嗜热链球菌，用孟加拉红培养基接种酿酒酵母；同时用 pH计测定奶啤中pH值。
选取不同酵母含量，探究其对奶啤的影响，如图5所示。由图5可知，奶啤pH值最低的为酵母含量为107CFU/100mL，其次为酵母含量108CFU/100mL；对德氏乳杆菌和嗜热链球菌促进效果最佳的为酵母含量1010CFU/100mL，其次为109CFU/100mL；酵母菌总量是随着加入酵母量增加而增加；以德氏乳杆菌和嗜热链球菌总量高及pH低为参照，最优酵母接种量为109CFU/100mL。
实施例5：探究酶水解液对单菌株发酵的影响
第一步配制原乳液：按质量分数为脱脂奶粉：白砂糖：益生元：水＝10:10:1:79的比例溶解，摇匀，使其充分溶解。
第二步加酶水解：待牛奶冷却至室温时，一份加入中性蛋白酶水解，酶活为6万U/100mL，另一份为原奶样液不水解。
第三步加热灭酶及灭菌：85℃20min
第四步单菌株发酵：待冷却至37℃～42℃时，中性蛋白酶水解液分别接种德氏乳杆菌109CFU/100mL，嗜热链球菌杆菌109CFU/100mL，安琪酵母 109CFU/100mL；原奶液分别接种德氏乳杆菌109CFU/100mL，嗜热链球菌杆菌109CFU/100mL，酿酒酵母109CFU/100mL；均于30℃发酵15h。
第五步于100mL奶啤中吸取0.1mL进行梯度稀释，用MRS琼脂培养基接种奶啤中德氏乳杆菌和嗜热链球菌，用孟加拉红培养基接种酿酒酵母。
选取单菌株发酵，探究蛋白酶的水解产物对各单菌株的影响，如图6所示。由图6可知，与原奶液相比，蛋白酶水解液可以明显促进德氏乳杆菌，嗜热链球菌及酿酒酵母的生长；与多菌协同发酵相比，蛋白酶水解产物对单菌株的促进效果更低。
实施例6：响应面法确定奶啤发酵的最佳工艺
由实例2，实例3，实例4可知，单因素为酶活8万U/100mL,杆菌：球菌＝2：1，酵母含量为109CFU/100mL。由此确定的因素水平表如表2，Box-Behnken 设计方案及实验结果如表3。
表2水平因素表
表3 Box-Behnken设计方案及实验结果
具体操作步骤如下：
第一步配制原乳液：按质量分数为脱脂奶粉：白砂糖：益生元：水＝10:10:1:79的比例溶解，摇匀，使其充分溶解。
第二步加酶水解：待牛奶冷却至室温时，按表2加入中性蛋白酶，酶活分别为7万U/100mL,8万U/100mL,9万U/100mL,于42℃中水解4h。
第三步加热灭酶：85℃20min
第四步酶解液发酵：待冷却至37℃～42℃时，按表2接种德氏乳杆菌，嗜热链球菌及酿酒酵母于30℃发酵15h，制得新型奶啤。
第五步于100mL奶啤中吸取0.1mL进行梯度稀释，用MRS琼脂培养基接种奶啤中德氏乳杆菌和嗜热链球菌，用孟加拉红培养基接种酿酒酵母；同时用pH计测定奶啤中pH值。
回归方程的建立与显著分析：
由表4，表5，表6可知，因变量为酵母数的回归方程模型P值为0.000 7<0.01，表明该方程拟合度较好。失拟项P值为0.1160>0.01，表明失拟项不显著，模型不失拟，选择合理；因变量为pH的回归方程模型P值为0.0668，表明该方程拟合度不好；因变量为细菌数的回归方程模型P值为0.3085，表明该方程拟合度不好；因此可用因变量为酵母数的模型对奶啤发酵工艺进行分析和预测。
表4酵母数回归模型的方差分析
表5 pH回归模型的方差分析
表6细菌数回归方程模型的方差分析
利用Design-Expert 8.06软件对酵母数试验结果进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型方程
Y＝85.43-2.71A-3.59B+16.37C-0.15AB-8.40AC-3.09BC+12.24A2+1.02B2-71.54C2
根据回归方程一次项系数绝对值的大小，可知影响酵母菌数的主次因素为 C(酵母接入数目)>B(酶活)>A(杆菌：球菌)。模型的一次项C对结果影响显著(P<0.01)；二次项C2对结果影响极显著(P<0.01),B2显著(P<0.05)；交叉项AC对结果影响极显著(P<0.01)，其他项对结果影响均不显著(P>0.05)。
酵母菌数响应面分析与优化各个因素间的交互作用对酵母菌数影响的响应面曲面图如图7，8，9所示。
实施例7：电泳法探究蛋白水解液增殖菌株的原理
第一步制胶：配制12％的分离胶，5％的浓缩胶。
12％的分离胶的配制：1.6mL蒸馏水，2mL 30％丙烯酰胺，1.3mL Tris pH8.8,0.08mL 10％SDS,0.08mL 10％AP,0.003mL TEMED
5％的浓缩胶的配制：3.4mL蒸馏水，0.83mL 30％丙烯酰胺，0.63mL Tris pH6.8,0.05mL 10％SDS,0.05mL 10％AP,0.005mL TEMED
第二步制样：取0.1mL样品，加入加样缓冲液溶解，混匀，于100℃沸水浴中加热3～5min。
加样缓冲液的配制：50mmol/L Tri-HCl(pH6.8)缓冲溶液3.2mL，10％SDS 25mL,β-巯基乙醇2.5mL,溴酚蓝2mg以及甘油5mL，用水溶解并定容至50mL。
第三步加样：用移液器吸取20-25uL样液，将枪头伸进样品槽内，接近其底部，并注入样品于槽内。
第四步电泳：150V 2h
第五步染色：加入染色液，于微波炉中加热7min。染色液：称取0.5g考马斯亮蓝R-250溶于甲醇(80mL)和冰醋酸(20mL)混合液中，过滤备用。
第六步脱色：加热脱色液，蒸馏水清洗后静置。脱色液：取150mL甲醇于50mL冰醋酸混溶，加蒸馏水至500mL。
第七步观察：电泳结果如图10所示。
电泳法探究发酵缓解酶水解液苦肽的原理，如图10所示。由图10可知，加入蛋白酶，原奶中蛋白质被水解成小分子的多肽和氨基酸；酶水解液有苦味，说明酶水解产生疏水性氨基酸或疏水性多肽；加入德氏乳杆菌和嗜热链球菌及酿酒酵母发酵后，通过感官品尝，酶水解液苦味显著降低；并且，经过多菌协同发酵制得的奶啤对产生一些其他多肽类物质。
Claims (10)
1.一种奶啤饮料的制备方法，其特征在于，将脱脂奶中加入低聚果糖和白砂糖配制成原奶液，再加入蛋白酶进行水解，经灭菌和灭酶后，接入德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)进行同步发酵，制得奶啤饮料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中一种或两种以上，酶活范围为2～10万U/100mL。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述德氏乳杆菌和嗜热链球菌的接种总量为108～1010CFU/100mL，其中接种比例杆菌：球菌为10:1～1:10；所述酿酒酵母的接种量为107～1010CFU/100mL。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述德氏乳杆菌和嗜热链球菌的接种总量为109CFU/100mL，其中接种比例杆菌：球菌为2:1～1:5。
5.根据权利要4所述方法，其特征在于，所述酿酒酵母的接种量为109CFU/100mL，蛋白酶的酶活为8万U/100mL。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，按质量份计，所述原奶液中脱脂奶的固含量为5～25％、低聚果糖为0.5～5％，白砂糖为5～15％，余量为水。
7.根据权利要求1～6任意一项所述方法，其特征在于，所述水解条件为：37～42℃下水解2～4h；所述发酵条件为：30～35℃下发酵10～15h。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述灭菌温度为85～95℃，灭酶时间为15～20min。
9.根据权利要1～6任意一项所述方法，其特征在于，所述德氏乳杆菌为(Lactobacillus delbrueckii)DMLD-H1，保藏编号为GDMCC NO.60645；所述嗜热链球菌为(Streptococcus thermophilus)DMST-H2，保藏编号为GDMCC No：60642。
10.一种由权利要求1～9任意一项方法制备的奶啤饮料。
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