CN115353995A - 一种复配发酵剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，公开了一种复配发酵剂及其制备方法和应用。本发明首次以源于中国传统发酵产品的德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2、植物乳杆菌9010以及凝结芽孢杆菌13002为研究对象，进行四株益生菌复配发酵剂的研制与应用。确定自主研制的复配发酵剂菌株最优配比为德氏乳杆菌H1与嗜热链球菌H2之和:凝结芽孢杆菌13002:植物乳杆菌9010＝2:1:4。加入的植物乳杆菌9010能够降胆固醇、缓解肠炎，调节肠道菌群，改善抑郁状态；凝结芽孢杆菌13002能够产生光学纯度高达99.8％以上的L‑乳酸。此复配发酵剂的菌株源于中国本土，更适合于中国人的肠道，并且添加的益生菌发酵的酸奶具有降胆固醇、缓解肠炎、改善抑郁的潜力。

Description

一种复配发酵剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一种复配发酵剂及其制备方法和应用。
背景技术
以乳酸菌为代表的益生菌如今已被证实对人体健康有着不可忽视的保健作用，如在平衡人体胃肠道中微生物系统、调节机体免疫系统等方面均发挥了一定的积极影响。随着全球消费者对功能食品需求量的增加，具有丰富营养价值及优良益生功效的发酵乳逐渐成为最佳选择。发酵剂作为发酵乳中的核心成分，是生产高品质发酵乳的关键因素。但相较于欧美洲国家，我国自主研发的发酵剂种类薄弱单一，且出于多方面因素的考虑，目前我国一些大型乳品企业仍在生产过程中使用着国外进口直投式发酵剂，使得国外企业占据了我国发酵剂市场90％～95％的份额，在一定程度上限制了我国乳品业的发展速度。
直投式发酵剂(Directed Vat Set，DVS)是经高效浓缩和标准化、冷冻干燥的固体粉末状菌种，可直接运用于发酵生产。直投式发酵剂具有活菌含量高(1010～1012CFU/mL)、菌株活力强、接种量少、便于储藏、保质期长(冻藏DVS>90天；冻干DVS>1年)、有效防止菌种污染及退化等优点，从而可在酸奶发酵过程中提高生产效率，发酵出的酸奶品质较其他种类发酵剂更高。因此，直投式发酵剂逐渐代替传统单一菌型发酵剂，成为现今主要的商业酸奶发酵剂。
优良的乳酸菌发酵剂需要能使发酵乳凝乳时间短、不会过度后酸化、产香物质含量高、粘性好、有柔和适口的感官质量。不同发酵剂中微生物组成比例不同，会使酸奶产生不同的风味、粘度、质地和口感。因此，筛选具有优良发酵理化性质的益生菌菌株，探究出混合发酵剂菌株间的最优配比，对于提升复配直投式发酵剂的发酵性能以及促进高品质发酵乳的生产，具有深远的积极意义。
因而，本研究从探究四株我国本土传统菌株的发酵理化特性入手，自主研制具有优良发酵性能的复配发酵剂，为我国乳品业不受制于进口菌种、降低生产成本提供一条思路。通过与市售商业发酵剂发酵性能对比，发现自主研制的复配发酵剂具有产酸性能较好、抗酸化能力好、产短链脂肪酸等有机酸能力较强等优势。
所挑选的菌株是本课题组从中国传统发酵制品中筛选的德氏乳杆菌(Lactobacillus delbruckii)H1、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)H2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMDL 9010以及凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)13002。本课题组前期研究表明，德氏乳杆菌H1本身具有抑制致病菌的性质，嗜热链球菌H2可以通过与致病菌的共凝集作用，减少致病菌在肠道中的数量，改变肠道中的菌群结构，改善肠道微环境。并且通过前期实验表明，嗜热链球菌或可通过共沉淀作用达到消除金黄色葡萄球菌等致病菌的作用，嗜热链球菌H2还可有效缓解AAD相关的肠道屏障损伤以及具有抗炎作用。然而，使用双菌株德式乳杆菌H1和嗜热链球菌H2混合发酵时，发酵乳的酸度偏低，合成的产香物质较少。
添加的植物乳杆菌9010以及凝结芽孢杆菌13002也具有一定的功能特性。植物乳杆菌9010在前期研究中表明具有高效降解胆固醇能力，植物乳杆菌9010及其产的多糖的摄入减轻了DSS诱导小鼠的结肠炎以及抑郁样行为障碍，其机理是9010及其多糖促进了抗炎细胞因子，减少了促炎细胞因子，增加了短链脂肪酸和神经递质，并改善了肠道菌群，而凝结芽孢杆菌13002具有耐高温、营养因子要求低等特点，培养基可以不灭菌直接进行发酵，而且，凝结芽孢杆菌13002生产的L-乳酸光学纯度高达99.8％以上，无需再用基因工程等手段对菌株进行调整，十分适合工业化生产的要求。然而，用三菌株混合发酵剂制备的发酵乳粘度极大降低，感官、质构变差。而四株菌株复配发酵剂发酵的酸奶具有更好的感官性质和风味。此复配发酵剂的菌株源于中国本土，更适合于中国人的肠道，并且添加的益生菌发酵的酸奶具有降胆固醇、缓解肠炎、改善抑郁的潜力。
发明内容
本发明的目的在于克服我国目前对外国企业的发酵乳直投式发酵剂(DVS)的依赖，严重限制了我国乳品行业的发展。因此利用课题组从中国传统发酵产品中筛选分离出的德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2、植物乳杆菌9010和凝结芽孢杆菌13002作为菌株，进行复配发酵剂的研究。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种复配发酵剂，包括德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2、植物乳杆菌9010以及凝结芽孢杆菌13002。
优选地，所述复配发酵剂中德氏乳杆菌H1和嗜热链球菌H2的冻干粉质量配比为1:1～1:200。
优选地，所述的复配发酵剂中德氏乳杆菌H1和嗜热链球菌H2的冻干粉质量配比为1:100。
优选地，所述的复配发酵剂中植物乳杆菌9010的添加量为30％～60％。
优选地，所述的复配发酵剂中凝结芽孢杆菌13002的添加量为10％～35％。
优选地，所述的复配发酵剂中发酵剂菌株冻干粉的质量比为德氏乳杆菌H1与嗜热链球菌H2之和:凝结芽孢杆菌13002:植物乳杆菌9010＝2:1:4。
优选地，一种以上述复配发酵剂发酵得到的发酵乳。
优选地，上述发酵乳的制备方法如下：将发酵剂接种于调制乳培养基中，在37～42℃中静置培养。
优选地，发酵剂的接种量为2×107～3×107CFU/mL，调制乳培养基中全脂乳粉含量为10～14％。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)确定自主研制的复配发酵剂菌株最优配比德氏乳杆菌H1与嗜热链球菌H2之和:凝结芽孢杆菌13002:植物乳杆菌9010＝2:1:4。，得到的发酵乳凝乳时间短、不会过度后酸化、产香物质含量高、粘性好、有柔和适口的感官质量。
(2)将同剂型的市售酸奶发酵剂作为主要参考，整体而言，自主研发的复配发酵剂具有较好的产酸能力以及抗后酸化能力，酸乳中的益生菌活性较好，在缩短了酸奶发酵凝乳时间的同时，保证了产品较长货架期；有较好的产糖能力，保证了适口的感官质量。本发明提供的复配发酵剂整体发酵效果与进口商业发酵剂差距较小，有望代替进口发酵剂的使用。
(3)本发明提供的复配发酵剂能够产生4种短链脂肪酸，比进口商业发酵剂多产生一种异丁酸，且所挑选的菌株源于中国传统发酵制品，更适合中国人的肠道。
(4)所使用的植物乳杆菌9010具有优异的功能特性，能够高效降解胆固醇，其进一步的开发为预防和治疗高胆固醇血症的益生菌制剂提供了可能。
所述德式乳杆菌H1(Lactobacillus delbrueckii DMLD-H1)于2019年4月16日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号是GDMCC No.60645。
所述嗜热链球菌H2(Streptococcus thermophilus DMST-H2)于2019年4月16日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(简称：GDMCC，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼)，保藏编号是GDMCC No.60642。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus sp.)DMDL 9010，保藏编号为CGMCC NO.5172，于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株已在中国专利CN102978134A中公开。
所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)13002由本实验室从中国传统自制发酵泡菜中分离筛选得到，并于2013年4月12日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保存的菌株编号为CGMCC NO.7431。
附图说明
图1四株单菌发酵期间pH变化
图2两菌复配发酵剂性能：(a)发酵期间pH变化；(b)发酵期间滴定酸度变化；(c)储藏期间pH变化；(d)酸奶粘力对比；(e)储藏期乙醛含量变化；(f)储藏期双乙酰含量变化。
图3三菌复配(9010)发酵剂性能：(a)发酵期间pH变化；(b)发酵期间滴定酸度变化；(c)储藏期间pH变化；(d)酸奶粘力对比；(e)储藏期乙醛含量变化；(f)储藏期双乙酰含量变化。
图4三菌复配(13002)发酵剂性能：(a)发酵期间pH变化；(b)发酵期间滴定酸度变化；(c)储藏期间pH变化；(d)酸奶粘力对比；(e)储藏期乙醛含量变化；(f)储藏期双乙酰含量变化。
图5四菌复配发酵剂性能：(a)发酵期间pH变化；(b)发酵期间滴定酸度变化；(c)储藏期间pH变化；(d)酸奶粘力对比；(e)储藏期乙醛含量变化；(f)储藏期双乙酰含量变化。
图6发酵期间三组发酵乳pH变化(a)及储藏期间三组发酵乳pH变化(b)。
图7发酵期三组发酵乳活菌数变化。
图8样品色谱图：图8(a)短链脂肪酸其他有机酸标准品样品色谱图(注：峰1～6分别是乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸)；
图8(b)其他有机酸短链脂肪酸标准样品色谱图(注：峰1～6分别是草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、D-乳酸、L-乳酸)；
图8(c)L组发酵乳色谱图；
图8(d)X组发酵乳色谱图；
图8(e)Ba组发酵乳色谱图。
图9样品色谱图：图9(a)混合标准品样品色谱图(注：峰1～4分别是蔗糖、葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇)；
图9(b)L组发酵乳色谱图；
图9(c)X组发酵乳色谱图；
图9(d)Ba组发酵乳色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1：两菌不同配比复配对酸奶的影响
(1)实验菌株的分离与保存：本实验中用于发酵剂复配的四株益生菌为课题组从中国传统发酵制品中筛选分离所得，利用甘油管保存于实验室-40℃冷藏箱中。将三次活化后的菌液接种于液体培养基中，经离心、无菌生理盐水洗涤操作后取菌泥，与保护剂(10％的脱脂奶粉及10％的海藻糖溶于0.9％的生理盐水，85℃灭菌30min)按照1:3比例混匀后冷冻干燥，制成冻干菌粉并进行活菌计数测定其含菌量，于-20℃下保存备用。
表1中所示即为实验菌株及其冻干菌粉含菌量。
表1实验菌株及其冻干菌粉
Figure BDA0003808984670000061
(2)发酵乳的制备
在超净工作台中，将德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2冻干粉分别按照1:1，1:10和1:100的质量比进行混合，将单菌株冻干粉或实验菌株混合冻干粉(将菌株冻干粉按照质量进行配比)始终按照发酵乳含菌量为2×107CFU/mL的总量接种于用全脂乳粉制备的12.5％调制乳培养基中，适当摇晃发酵瓶使发酵剂分布均匀，在42℃水浴锅中静置培养。
(3)产酸及后酸化的测定
①pH的测定
酸奶发酵期间，每间隔1h抽取5g发酵乳样品于小烧杯中，利用便携式pH计测定其pH，记录数值稳定后的pH值，直至发酵终点pH 4.6，分析产酸速率。酸奶4℃储藏期间，于第0、1、7、14、21d测定样品pH，方法同上，分析后酸化能力。每个样品的测定均重复三组平行实验，结果取平均值。
②滴定酸度(TA)的测定
酸奶发酵期间，每隔1h于发酵瓶中抽取1g发酵乳于50mL锥形瓶中，准确记录发酵乳称取质量m，加入适量蒸馏水，并将0.5％酚酞酒精溶液作为指示剂加入溶液中，摇匀。用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液依次滴定，直至溶液中微红色的出现，且颜色在30s内不消失。记录每次氢氧化钠标准溶液的使用滴定体积V。每个样品的测定均重复三组平行实验，结果取平均值。
滴定酸度°T按照公式(1-1)所示：
°T＝(c×V×100)/(m×0.1) (1-1)
式中，c为氢氧化钠标准溶液的浓度(mol/L)；V为所消耗氢氧化钠标准溶液的体积(mL)；m为称取发酵乳样品的质量(g)；0.1为酸度理论定义氢氧化钠溶液的浓度(mol/L)。
(4)黏度测定：
将使用不同发酵菌株发酵的酸奶样品在4℃条件下冷藏12～24h后，测定其黏度。
使用美国Brookfield CT3质构仪，通过质构仪自带软件对测试样品黏度等指标进行测定，并生成检测报告。测试条件如下：测试类型：TPA质构分析。测试目标：目标类型：距离；目标值：1.5mm；等待时间：0s。通用测试参数：触发点负载：1g；测试速度：1.00mm/s；探头：TA3/100；夹具：TA-RT-KIT。
每个样品的测定均重复三组平行实验，结果取平均值。
(5)产香物质测定
①双乙酰含量的测定
绘制双乙酰浓度标准曲线。测定样品中双乙酰含量：发酵乳4℃储藏期间，于第0、1、7、14、21d抽取5mL发酵乳样品/全脂乳溶液与8％TCA溶液等体积混合，震荡均匀，在4℃8000r/min条件下离心20min后，取1mL上清液，加入0.05mL 1％邻苯二胺溶液，摇匀后用锡纸完全包裹反应30min，后立即加入0.2mL 4.0mol/L盐酸溶液使进行中的反应停止。将最终的混合溶液加入96孔板，用酶标仪检测335nm波长下溶液的吸光值。每个样品在板中加3个孔，结果取平均值。用未发酵的全脂乳溶液按照以上相同处理作为未发酵样品空白，其吸光值即为全脂乳中原本的双乙酰含量。最终计算时，将所测得的发酵乳中双乙酰含量减去空白样中双乙酰含量，即为全脂乳经发酵后的双乙酰产量。
②乙醛含量的测定
发酵乳4℃储藏期间，于第0、1、7、14、21d抽取5mL发酵乳样品/全脂乳溶液与8％TCA溶液等体积混合，振荡均匀，在4℃8000r/min条件下离心20min后，取上清液5mL于50mL锥形瓶中。在锥形瓶中加入1mL 1％亚硫酸钠溶液混匀，在室温下放置1h充分反应，反应结束后以淀粉溶液作为指示剂，并用0.1mol/L和0.01mol/L的碘液滴定至终点，无需记录用量。再加入10mL 1mol/L碳酸氢钠溶液，充分震荡至溶液中颜色消失，最后用0.01mol/L碘标准溶液滴定至终点，记录消耗碘标准溶液的体积V1。用以上同样的方法做空白实验，记录滴定使用的碘标准溶液体积V2。每个样品的测定均重复三组平行实验，结果取平均值。
发酵乳中乙醛含量计算公式如公式(1-2)所示。
Figure BDA0003808984670000081
式中，V1为样品消耗碘标准溶液的体积(mL)；V2为空白样消耗碘标准溶液的体积(mL)；c为1/2碘标准溶液的浓度(mol/L)；5为样品称量量(mL)；0.022位乙醛化学反应基本单位。
图2中为H1、H2两株益生菌三组不同复配比例发酵剂酸奶的发酵情况(以下简称为1:1、1:10、1:100组)。
从图2(d)中可以看出，两菌复配发酵剂的产黏性能较好，其中1:100组的酸奶粘力可以达到18.5g，优于单菌株发酵酸奶的粘力(H1：13g，H2：16.5g，9010和13002：5.5g)。但是，两菌复配发酵剂的酸度较低，产香物质较少。从图2(a)(b)中可以看出，仅1:100组酸奶的酸度可以在发酵8小时后达到70°T，1:10组和1:1组酸奶的酸度都低于70°T，达不到国家标准中对于酸奶酸度的规定。从图2(e)(f)中可以看出，两菌复配发酵剂产乙醛浓度最高为19.75μg/mL，产双乙酰浓度最高为5.8μg/mL。
实施例2：三菌复配不同配比发酵剂对酸奶的影响(植物乳杆菌9010)
三菌复配实验中，在标杆发酵菌株H1:H2＝1:100的比例基础上，复配植物乳杆菌9010探究植物乳杆菌的添加对于酸奶发酵剂性能(产酸及后酸化、产香、产黏能力)的影响。拟探究(H1:H2):9010＝1:2、1:1、2:1比例下三菌发酵剂的发酵性能，并挑选出最优配比，用于四菌复配实验中。
在超净工作台中，将德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2冻干粉按照1:100的质量比进行混合后，按照冻干粉质量比分别为(德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2):植物乳杆菌9010＝2:1、1:1、1:2进行配比，始终按照发酵乳含菌量为2×107CFU/mL的总量接种于用全脂乳粉制备的12.5％调制乳培养基中，适当摇晃发酵瓶使发酵剂分布均匀，在42℃水浴锅中静置培养。
图3展示了利用9010进行三菌复配发酵各项性能探究的结果(以下简称为2:1、1:1、1:2组)。总体来看，加入植物乳杆菌9010后，酸奶的产酸能力和产香能力提高，但是产黏能力下降了。
从图3(b)可以看出，1:1组和1:2组酸奶的酸度约在发酵后的6小时左右达到70°T，比两菌复配发酵时缩短了2小时。从图3(e)(f)可以看出，最优组1:2和1:1中产乙醛含量达28.08μg/mL和29.70μg/mL，产双乙酰含量最高达8.65μg/mL，产香物质较两菌复配发酵时明显提高。但是，图3(d)的结果显示，加入植物乳杆菌9010后，酸奶的粘力显著降低，最优组(1:2)的粘力仅为11g。结合以上分析，选出发酵性能较好的(H1:H2):9010＝1:2和1:1组，并将其分别命名为a、b，用于四株益生菌的复配发酵实验。
实施例3：三菌复配不同配比发酵剂对酸奶的影响(凝结芽孢杆菌13002)
三菌复配实验中，在标杆发酵菌株H1:H2＝1:100的比例基础上，复配凝结芽孢杆菌13002探究凝结芽孢杆菌的添加对于酸奶发酵剂性能(产酸及后酸化、产香、产黏能力)的影响。拟探究(H1:H2):13002＝1:2、1:1、2:1比例下三菌发酵剂的发酵性能，并挑选出最优配比，用于四菌复配实验中。
在超净工作台中，将德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2冻干粉按照1:100的质量比进行混合后，按照冻干粉质量比分别为(德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2):凝结芽孢杆菌13002＝2:1、1:1、1:2进行配比，始终按照发酵乳含菌量为2×107CFU/mL的总量接种于用全脂乳粉制备的12.5％调制乳培养基中，适当摇晃发酵瓶使发酵剂分布均匀，在42℃水浴锅中静置培养。
图4为利用芽孢乳杆菌13002进行三菌复配的实验探究结果图(以下简称为2:1、1:1、1:2组)。
在前期对凝结芽孢杆菌13002的单菌株理化性质探究中，发现其具有发酵稳定、有较强抗后酸化能力、菌株易繁殖且在冷藏期间仍能保持较高活性、产香能力较好等诸多优势。根据复配结果，总体看来，在两菌复配发酵剂中加入凝结芽孢杆菌13002后，酸奶的产酸能力和产香能力都大大提高了，但是酸奶的产黏性能显著降低。
从图4(b)可以看出，2:1组和1:1组酸奶的酸度约在发酵后的3～4小时左右达到70°T，比两菌复配发酵时缩短了4小时。添加13002菌株对于提升发酵剂抗后酸化能力(c)有明显效果，pH值仅下降0.03～0.06，符合其菌种抗逆性好的特征。从图4(e)(f)可以看出，最优组(1:2)中产乙醛含量达32μg/mL，产双乙酰含量最高达6.88μg/mL，产香物质较两菌复配发酵时明显提高。但是，图4(d)的结果显示，加入凝结芽孢杆菌13002后，酸奶的粘力显著降低，最优组(1:2)的粘力仅为10g。结合以上分析，选出发酵性能较好的(H1:H2):13002＝1:2和2:1组，并将其分别命名为A、B，用于四株益生菌的复配发酵实验。
实施例4：四菌复配不同配比发酵剂对酸奶的影响
根据三菌复配实验结果，选出(H1:H2):13002＝1:2、2:1，并将两组分别命名为A、B；选出(H1:H2):9010＝1:2、1:1，并将两组分别命名为a、b。根据排列组合，分别进行Aa、Ab、Ba、Bb四组不同比例四株益生菌复配发酵实验，并通过发酵及性能对比，从中选出复配发酵剂中四株益生菌最优复配比例。
不同发酵剂菌株比例及比例组缩写如表2中所示。
表2发酵剂菌株比例及比例组缩写
Figure BDA0003808984670000101
图5展示了四株益生菌按照不同比例进行复配的发酵剂性能探究实验结果(以下简称为Aa、Ab、Ba、Bb组)。总体来看，四株益生菌之间的协同作用使混合菌株复配发酵剂的性能有明显的提升，使得制备的酸奶产酸能力、产香能力保持较优的同时，产黏性能显著提高。
从图5(b)可以看出，Aa组和Ab组酸奶的酸度约在发酵后的3～4小时左右达到70°T，Ba组酸奶的酸度在发酵后的6小时左右达到70°T。
从图5(e)(f)可以看出，Aa组和Ba组中产乙醛含量分别达33.25μg/mL和32.34μg/mL，产双乙酰含量分别达8.87μg/mL和8.51μg/mL，产香物质较三菌复配发酵时略有提高。双乙酰被认为是主要的芳香化合物之一，其带有奶油香味，双乙酰是酸奶后发酵过程中一些香味细菌产生，在0～7d后发酵过程，双乙酰含量增加，而随着酸奶酸度的增加，乳酸菌与某些香味细菌存活率降低且伴随着乳糖利用率降低，这可能是导致7d后双乙酰含量下降的原因；乙醛也是酸奶滋味的主要风味物质之一，随着细胞浓度增加和pH的降低，乙醛含量增加，而随着时间微生物酶会水解乙醛形成其他物质，且随着酸度增加，细菌存活率降低使得乙醛含量下降。
另外，图5(d)的结果显示，四菌复配发酵的酸奶粘力显著高于三菌复配发酵酸奶，最优组(Ba)的粘力可达14g。
表3发酵乳感官评价表
Figure BDA0003808984670000111
表4四菌复配发酵乳感官评价
Figure BDA0003808984670000112
表4中对于四组发酵乳的各项感官评分其单项评分及总分均有明显的提升(两菌复配发酵乳的感官评价1:1组、1:10组、1:100组评分分别为74、74、77；三菌复配(9010)发酵乳感官评价2:1组、1:1组、1:2组评分分别为78、79、81；三菌复配(13002)发酵乳感官评价2:1组、1:1组、1:2组评分分别为80、78、79)。发酵乳呈诱人的乳白色，滋气味更加醇厚浓郁。Aa组与Bb组中有少量乳清析出，相较而言，Ab组与Ba组的发酵乳质地均匀细腻，有明显的拉丝现象，无裂纹、无气泡，有较好的发酵乳感官特征。
综合以上所有实验与分析，最终选出四株益生菌复配发酵剂性能最优组Ba，即四株益生菌的比例为(H1:H2):13002:9010＝2(1:100):1:4。
实施例5：复配发酵剂发酵酸奶特性评价(产酸及后酸化)
发酵乳的制备：
以自主研制的复配发酵剂(以下简称Ba)、市售Angel安琪酸奶发酵剂(以下简称L)和佰生优希腊酸奶发酵菌粉(以下简称X)作为发酵剂，分别制备发酵乳：在超净工作台中，将Ba、L、X始终按照发酵乳含菌量为2×107CFU/mL的总量接种于用全脂乳粉制备的12.5％调制乳培养基中，适当摇晃发酵瓶使发酵剂分布均匀，在42℃水浴锅中静置培养。
在发酵期间，每隔1h从发酵瓶中抽样测定发酵乳pH、滴定酸度、活菌数，直至pH4.6凝乳完全后停止发酵，在4℃条件下冷藏。储藏期间，于第0、1、7、14、21d，抽样测定发酵乳后熟情况、乙醛及双乙酰含量，并在12～24h后，进行发酵乳黏度测定以及感官测评。
实验使用的两种市售商业酸奶发酵剂生产厂家及益生菌型见表5。
表5两种市售商业发酵剂
Figure BDA0003808984670000121
将制得的三种发酵乳的发酵特性进行对比，从而评价自主研制复配发酵剂的性能。
图6中将Ba与L和X的产酸能力进行了对比。从图6(a)中可以发现，Ba的pH值下降速率较其余二者快，说明复配发酵剂Ba的发酵能力更强。图6(b)中展示了三组发酵乳的后酸化能力。在储藏期的前24h内，Ba组发酵乳有较好的后熟阶段，促进发酵乳丰富风味的产生。在第1～21d，Ba组的pH值仅下降0.09，小于L和X组pH下降值，体现出良好的抗后酸化能力。
实施例6：复配发酵剂发酵酸奶特性评价(活菌数的测定)
酸奶发酵期间，每隔1h在超净工作台中从发酵瓶中抽取0.5mL发酵乳并进行梯度稀释至10-7，并选取10-6和10-7两个浓度的稀释菌液进行活菌计数。
抽取稀释菌液0.1mL于无菌培养皿中，将温度降至45℃以下的MRS琼脂培养基缓慢倾倒入培养皿中，轻摇培养皿至其混合均匀，并注意防止飞溅。待培养基凝固后，在培养皿外围用封口膜密封，倒置放入37℃恒温培养箱中厌氧恒温培养，48h后，选取菌落数在30～300之间的平板记录各平板中的菌落总数，按照公式(1-3)以CFU/mL为单位得到发酵乳中菌液浓度c。每个样品的测定均重复三组平行实验，结果取平均值。
c＝菌落数×稀释倍数×10 (1-3)
式中，c为发酵乳中菌液浓度(CFU/mL)。
结果如图7所示，Ba、L、X组在发酵结束后最终含菌量分别为3.68×108CFU/mL、3.85×108CFU/mL、3.76×108CFU/mL，差距较小，且均达到了市售发酵乳的产品要求。
实施例7：复配发酵剂发酵酸奶特性评价(有机酸测定)
发酵乳中有机酸的测定：
采用HPLC探究三种发酵剂产乳酸及短链脂肪酸的能力。
标品制备：将标准品用蒸馏水梯度稀释为2.5、5、10、20、40mmol/L的混合标准品，经0.22μm水相滤膜过滤除杂后待上机分析。实验所用混标包括5种有机酸(草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸)和6种短链脂肪酸混标(乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸)。
样品处理：发酵乳样品在4℃条件下经8000r/min离心10min，取上清液，用0.22μm水相滤膜过滤除杂，并超声脱气移至进样瓶中。
液相系统：流动相及洗针液为0.005mol/L H2SO4溶液，使用前经0.22μm水相滤膜过滤除杂，超声脱气。
色谱柱：Rezex ROA-Organic Acid H+，300×7.8mm(美国菲罗门公司)，柱温40℃；检测波长为210nm。
进样体积为10μL，流速为0.6mL/min，总冲洗时间为60min，样品分析时间为50min。
有机酸的含量计算采用峰面积外标法，即将混标中各种有机酸的浓度作为横坐标(mmol/L)，该有机酸对应的峰面积(mAU*min)作为纵坐标，制作标准曲线，得到不同有机酸的回归方程，进而推算出发酵乳样品中有机酸的种类与含量。
利用HPLC方法对短链脂肪酸混合标准样品(a)、其他有机酸混合标准样品(b)以及L组(c)、X组(d)、Ba组(e)发酵乳上清液样品进行检测，检测结果色谱图如图8所示。
根据色谱图可以发现，在发酵乳样品中短链脂肪酸的种类诸多，但L组与X组中主要检测出3种，Ba组中主要监测出4种，增加了异丁酸。
短链脂肪酸对人体有诸多益生作用。SCFAs是由1～6个碳原子组成的有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸。其中乙酸、丙酸和丁酸为碳水化合物在肠道菌群作用下产生的代谢产物，是宿主肠上皮细胞的能量来源，能降低结肠pH值，抑制有害菌生长，调节宿主肠道免疫力，降低结肠炎症反应，还可以通过一系列复杂的机制调节基因表达进而影响机体能量平衡，与结肠炎、肿瘤、肥胖、营养不良及肠道感染有密切关系。
异丁酸和异戊酸属于支链SCFAs，为蛋白质代谢产物，能调节电解质的吸收与分泌。异丁酸由缬氨酸发酵产生，是肠腔内蛋白质分解的标志物。异丁酸、异戊酸等支链SCFAs有可能和胆汁酸等代谢产物一样，具有某些基本的信号功能，有研究表明给予火麻仁油后，乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸含量均显著增加，非常有可能与火麻仁油改善衰老小鼠模型的肠道菌群结构有一定关系。初步研究表明，与SCFAs类似，支链SCFAs能够调节肝脏中葡萄糖和脂质代谢，异丁酸可增强胰岛素刺激下的葡萄糖摄取，有助于改善代谢紊乱个体的胰岛素敏感性。在丁酸缺乏的条件下，异丁酸可作为肠上皮细胞的能量来源。
实施例8：复配发酵剂发酵酸奶特性评价(糖类物质的测定)
发酵乳中糖类物质的测定：
采用HPLC探究三种发酵剂产糖类物质的能力。
标品制备：称取各种糖类物质0.1g，用蒸馏水溶解并定容至100mL制成混合标准品储备液。储备液用蒸馏水梯度稀释为为1.0、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL的混合标准品溶液，经0.22μm水相滤膜过滤除杂后待上机分析。实验所用混标中包括中包含4种糖类物质(蔗糖、葡萄糖、D-果糖、D-甘露醇)。
样品处理：发酵乳样品在4℃条件下经8000r/min离心10min，取上清液，用0.22μm水相滤膜过滤除杂，并超声脱气后移至进样瓶中。
液相系统：流动相为乙腈:水＝90:10，使用前经0.22μm水相滤膜过滤除杂，超声脱气。
色谱柱：RezexRCM-Monosaccharide columb(8％)，300×7.8mm(美国菲罗门公司)，柱温65℃；检测波长为210nm。
进样体积为20μL，流速为0.6mL/min，总冲洗时间为60min，样品分析时间为20min。
糖类物质的含量计算采用峰面积外标法，即将混标中各种糖类物质的浓度作为横坐标(mg/mL)，该糖类物质对应的峰面积(m AU*min)作为纵坐标，制作标准曲线，得到不同糖类物质的回归方程，进而推算出发酵乳样品中糖类物质的种类与含量。
利用HPLC方法对糖类物质混合标准样品(a)、以及L组(b)、X组(c)、Ba组(d)发酵乳上清液样品进行检测，检测结果色谱图如图9所示。
表6发酵乳中糖类物质的含量
Figure BDA0003808984670000151
对比表中的各项数据可知，相较于市售发酵剂发酵的酸奶，Ba发酵乳中葡萄糖浓度较低为33.16mg/mL，但蔗糖含量与D-果糖含量均较其余两组含量高，分别为7.65mg/mL和19.06mg/mL，更好的促进了发酵乳产品具有优良的感官特性。
综上所述，自制的复配发酵剂具有较好的产酸能力以及抗后酸化能力，保证产品不会因过度的后酸化缩短产品的货架期，同时也具有酸奶特有的香气、粘性。实验中用于复配发酵剂的菌株，均为从中国传统发酵制品中筛选出的益生菌株，本研究可应用于更适于中国人肠胃道的直投式发酵剂的研制，发展我国自主研发的发酵剂。
四株益生菌在发酵乳体系中的相互协同作用使发酵剂整体性能有了明显提升。发酵结束后，利用复配发酵剂生产的酸奶中滴定酸度达90.25°T，在消费者可接受范围内(滴定酸度小于120°T)，有较好抗后酸化能力；活菌数达3.68×108CFU/mL，高于国标中对于发酵乳产品活菌数的要求(活菌数大于106CFU/mL)；储藏期第7d乙醛与双乙酰浓度达最大值32.34μg/mL和8.51μg/mL，粘力达14g；持水力和脱水收缩敏感性分别为45.25％和43.75％。将同剂型的市售酸奶发酵剂作为主要参考，自主研发的复配发酵剂具有较好的产酸能力以及抗后酸化能力，酸乳中的益生菌活性较好，在缩短了酸奶发酵凝乳时间的同时，保证了产品较长货架期；有较好的产糖能力，与进口商业发酵乳中的差距较小，有望代替进口发酵剂的使用。另外，本发明提供的四菌复配发酵剂有更好的产短链脂肪酸等有机酸的能力，能够产生4种短链脂肪酸，比进口发酵剂多产生一种异丁酸，且菌株全部源于中国传统发酵制品，更适合中国人的肠道。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种复配发酵剂，其特征在于，包括德氏乳杆菌H1、嗜热链球菌H2、植物乳杆菌9010以及凝结芽孢杆菌13002。
2.根据权利要求1所述的复配发酵剂，其特征在于，德氏乳杆菌H1和嗜热链球菌H2的冻干粉质量配比为1:1～1:200。
3.根据权利要求1或2所述的复配发酵剂，其特征在于，德氏乳杆菌H1和嗜热链球菌H2的冻干粉质量配比为1:100。
4.根据权利要求3所述的复配发酵剂，其特征在于，植物乳杆菌9010冻干粉的添加量为30％～60％。
5.根据权利要求3所述的复配发酵剂，其特征在于，凝结芽孢杆菌13002冻干粉的添加量为10％～35％。
6.根据权利要求4或5所述的复配发酵剂，其特征在于，发酵剂菌株冻干粉的质量比为德氏乳杆菌H1与嗜热链球菌H2之和:凝结芽孢杆菌13002:植物乳杆菌9010＝2:1:4。
7.一种以权利要求1～6任意一项复配发酵剂发酵得到的发酵乳。
8.一种权利要求7所述的发酵乳的制备方法，其特征在于，将发酵剂接种于调制乳培养基中，在37～42℃中静置培养。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，发酵剂的接种量为2×107～3×107CFU/mL，调制乳培养基中全脂乳粉含量为10～14％。
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