CN110068623A

CN110068623A - 一种咪达那新中有关物质的检测方法

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Publication number: CN110068623A
Application number: CN201910275617.7A
Authority: CN
Inventors: 宋晓庆; 吴锦萍; 王华娟
Original assignee: Nanjing Haina Pharmaceutical Co Ltd; Nanjing Haina Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Current assignee: Nanjing Haina Pharmaceutical Co Ltd; Nanjing Haina Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Priority date: 2019-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2019-07-30
Anticipated expiration: 2039-04-08
Also published as: CN110068623B

Abstract

本发明属于化学药物分析技术领域，具体涉及一种咪达那新中有关物质检测的分析方法，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；其中，流动相A采用辛烷磺酸钠的磷酸溶液；流动相B采用乙腈。采用本发明的检测方法，检出的杂质多，主成分及各杂质在该流动相体系中保留能力较强，响应较高，各杂质间均能有效分离，能快速准确的监控咪达那新中的有关物质。

Description

一种咪达那新中有关物质的检测方法

技术领域

本发明属于化学药物分析技术领域，具体涉及一种咪达那新中有关物质检测的分析方法。

背景技术

咪达那新(imidafenacin)是由日本杏林制药株式会社与小野药品工业株式会社联合开发的新型二苯基丁酰胺类抗胆碱药，具有高度膀胱选择性，用于由膀胱过度活动而引起的尿急、尿频及尿失禁等一系列膀胱过度活动症的治疗，于2007年6月在日本上市。

膀胱过度活动症是一种以尿急症状为特征的症候群，常伴有尿频和夜尿症状，可伴或不伴有急迫性尿失禁。逼尿肌不稳定是引发膀胱过度活动症的重要原因之一。咪达那新选择性作用于逼尿肌上的M3和M1受体，阻断胆碱对逼尿肌的收缩作用，令逼尿肌松弛，可显著改善膀胱过度活动所引起的症状。咪达那新在治疗以上所述症状时，服用剂量较低，通常，成人每日2次，每次服用0.1mg，起效剂量低，故在药学研究阶段，对咪达那新质量的控制尤为重要。

咪达那新，化学名为4-(2-甲基-1-咪唑基)-2,2-二苯基丁酰胺，结构式如下：

目前，关于本品中有关物质的检测方法鲜有文献报道，或虽有专利报道，例如，CN103063795A和CN104614468A分别公开了采用高效液相测定咪达那新及有关物质，但其测定杂质的个数少，杂质谱覆盖面较小，对关键的及重要的降解产物未进行分析和检测，部分杂质易受溶剂峰干扰，杂质在报道的色谱系统中保留能力差、响应弱，对药品质量的评估存在一定的风险。

为了保证咪达那新制剂的安全有效，需要对原料药的有关物质进行研究、检测和控制。根据本品的合成工艺路线，有关物质主要是工艺副产物和降解产物，并对杂质谱进行梳理，对杂质的结构进行确认。本发明，可实现对咪达那新杂质的定位定量研究，为咪达那新制剂的质量评估奠定基础。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种咪达那新中有关物质的检测方法，检出的杂质多，主成分及各杂质在该流动相体系中保留能力较强，响应较高，各杂质间均能有效分离，能快速准确的监控咪达那新中的有关物质。

本发明的技术方案如下：

一种咪达那新中有关物质的检测方法，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；其中，流动相A采用辛烷磺酸钠的磷酸溶液；流动相B采用乙腈。

咪达那新及其杂质在一般缓冲盐溶液的流动相体系中，例如，磷酸二氢钠缓冲溶液、甲酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液，保留能力较差，有些杂质甚至没有保留能力，导致杂质漏检、少检。本发明采用辛烷磺酸钠的磷酸溶液作为流动相A，在其他条件的配合下，主成分及各杂质在该流动相体系中保留能力较强，响应较高，且杂质均能有效分离及检出。

本发明采用的流动相A为辛烷磺酸钠的磷酸溶液，在一种优选方案中，辛烷磺酸钠的磷酸溶液中辛烷磺酸钠的浓度为0.001mol/L～0.01mol/L；优选为0.003mol/L～0.007mol/L；更优选为0.005mol/L。

本发明采用的流动相A的制备包括以下步骤：首先配制质量浓度为0.05～2.5％磷酸水溶液，将辛烷磺酸钠用配制好的磷酸水溶液制成浓度0.001mol/L～0.01mol/L的溶液，再用三乙胺调pH值至2.0-4.0，即得；优选地，用三乙胺调pH值至2.6-3.0；更优选地，用三乙胺调pH值至2.8。

在一种优选方案中，本发明采用的流动相A的制备包括以下步骤：首先配制质量浓度为0.1％磷酸水溶液，将辛烷磺酸钠用配制好的磷酸水溶液制成浓度0.05mol/L的溶液，再用三乙胺调pH值至2.0-4.0，即得；优选地，用三乙胺调pH值至2.6-3.0；更优选地，用三乙胺调pH值至2.8。

本发明提及的溶剂1为70％乙腈水；溶剂2为流动相A和流动相B的混合溶剂，与现有技术中溶解样品区别较大，采用溶剂1溶解主成分及各杂质，解决了杂质不能完全溶解于溶剂2中而配制成母液的问题，再以溶剂2定容及稀释，避免了用溶剂1配制的主成分和各杂质母液在进入高效液相色谱仪后出现溶剂化效应，两种溶剂结合使用，溶液稳定性更好，使用时间更长，使母液能够得到充分利用，节省了购买杂质的成本，且在其他条件的配合下，可以有效的保护色谱柱和高效液相色谱仪，检出的杂质多，各杂质间均能有效分离，能快速准确的监控咪达那新中的有关物质。

在一种优选方案中，本发明溶解样品包括如下步骤：以溶剂1溶解样品后，再以溶剂2定容及稀释；其中，溶剂1采用70％乙腈水；溶剂2采用流动相A和流动相B的混合溶剂；进一步优选地，流动相A和流动相B的体积比为55～80:45～20；更进一步优选地，流动相A和流动相B的体积比为67:33。

本发明进行梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从(82～78):(18～22)匀速渐变至60:40；(2)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至20:80；(3)在50-53分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持20:80等度洗脱；(4)在53-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比从20:80匀速渐变至(82～78):(18～22)；(5)在58-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持(82～78):(18～22)不变。

在一种优选方案中，梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从80:20匀速渐变至60:40；(2)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至20:80；(3)在50-53分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持20:80等度洗脱；(4)在53-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比从20:80匀速渐变至80:20；(5)在58-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持80:20不变。

在一种优选方案中，色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶；色谱柱型号为Inertsil ODS-3C18、InertSustain C18和Wondasil C18；优选为Inertsil ODS-3C18，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。

进一步的，检测器的检测波长为218～222nm；优选为220nm。

进一步的，柱温为20～30℃；优化为25℃。

更进一步的，进样量为50～150μl；优选为50～100μl，例如，进样量为50μl和100μl。

本发明采用高效液相色谱法，可以配制如下样品溶液：

各单个杂质对照品溶液：精密称取各杂质对照品适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解，再加溶剂2定容并稀释制成每1ml约含各杂质5μg的各单个杂质对照品溶液。

咪达那新混合杂质溶液：精密称取咪达那新对照品适量，加溶剂2溶解并制成一定浓度的母液，精密吸取该母液适量及各单个杂质对照品溶液各适量，加溶剂2稀释制成每1ml约含各杂质0.5μg和含咪达那新5μg的混合杂质溶液。

咪达那新供试品溶液：取本品适量，加溶剂2溶解并稀释制成浓度为0.5mg/ml的样品溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加溶剂2稀释制成每1ml中含5μg的溶液，作为对照溶液。

供试品加混合杂质溶液：精密称取本品适量置于容量瓶中，分别精密加入上述5μg/ml各单个杂质对照品溶液适量，加溶剂2稀释制成每1ml约含各杂质0.5μg、咪达那新0.5mg的供试品加混合杂质溶液。

本发明提供的一种咪达那新中有关物质的检测方法，其中有关物质包括以下物质：

采用本发明的技术方案，优势如下:

(1)本发明提供的咪达那新中有关物质的检测方法，监测的杂质种类及个数多，各杂质间及杂质与主成分间分离度良好，能快速准确的监控咪达那新中的有关物质。

(2)本发明采用的流动相体系提高了主成分及各杂质的保留能力，各成分响应较高，解决了咪达那新及其杂质在一般缓冲盐溶液中保留能力差、响应弱的难题，从而避免了杂质的漏检及少检，对咪达那新质量的监控具有重要作用。

(3)本发明采用溶剂1溶解主成分及各杂质，解决了杂质不能完全溶解于溶剂2中而配制成母液的问题，再以溶剂2定容及稀释，避免了用溶剂1配制的主成分和各杂质母液在进入高效液相色谱仪后出现溶剂化效应，两种溶剂结合使用，溶液稳定性更好，使用时间更长，使母液能够得到充分利用，节省了购买杂质的成本。

附图说明

图1是实施例1咪达那新混合杂质溶液高效液相色谱图；

图2是实施例2咪达那新混合杂质溶液高效液相色谱图；

图3是实施例2咪达那新供试品有关物质高效液相色谱图；

图4是实施例2咪达那新供试品加混合杂质溶液高效液相色谱图；

图5是对比例1咪达那新混合杂质溶液高效液相色谱图；

图6是对比例2咪达那新混合杂质溶液20μl进样高效液相色谱图；

图7是对比例3咪达那新样品加混合杂质溶液高效液相色谱图。

具体实施方式

以下通过实施例形式，对本发明涉及的咪达那新中有关物质检测方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1：

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Inertsil ODS-3C18(250×4.6mm，5μm)，以辛烷磺酸钠的磷酸溶液(取1.08g辛烷磺酸钠，加质量浓度为0.1％磷酸溶液溶解并稀释至1000ml，用三乙胺调pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温25℃，进样量100μl。溶剂1为70％乙腈水，溶剂2为流动相A和流动相B体积比67:33的混合溶液。

梯度洗脱程序为：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从80:20匀速渐变至60:40；(2)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至20:80；(3)在50-53分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持20:80不变；(4)在53-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比从20:80匀速渐变至80:20；(5)在58-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持80:20不变。

样品溶液的配制：

咪达那新混合杂质溶液：精密称取咪达那新及杂质对照品适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解，再加溶剂2定容并稀释制成每1ml约含各杂质0.5μg和含咪达那新5μg的混合杂质溶液。

取咪达那新混合杂质溶液100μl进样，记录色谱图。结果见附图1，混合杂质溶液中各杂质间及杂质与主成分间分离度较高，基线平稳，理论板数较高。

实施例2：

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Inertsil ODS-3C18(250×4.6mm，5μm)，以辛烷磺酸钠的磷酸溶液(取1.08g辛烷磺酸钠，加质量浓度为0.1％磷酸溶液溶解并稀释至1000ml，用三乙胺调pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温25℃，进样量50μl。溶剂1为70％乙腈水，溶剂2为流动相A和流动相B体积比67:33的混合溶液。

样品溶液的配制：

咪达那新供试品溶液：取本品适量，加溶剂2溶解并稀释制成浓度为0.5mg/ml的样品溶液，作为供试品溶液。

取咪达那新混合杂质溶液50μl分别进样，记录色谱图。结果见附图2，各成分均能达到定量限的要求。

对有关物质检测方法进行验证，如下：

1、专属性

取空白溶剂、各单个杂质对照品溶液、咪达那新供试品溶液、供试品加混合杂质溶液各50μl，进样分析，记录色谱图，考察各成分的保留时间、分离度及理论板数。结果见表1及附图3和附图4。

表1专属性试验结果

结果表明，在该色谱条件下，基线平稳，对本品杂质测定无干扰。各杂质在该色谱条件下均可被检出，各杂质均仅在末端有最大吸收，在220nm附近均有较大吸收，在样品加混合杂质溶液中，各杂质间及杂质与主成分间分离度良好。

2、破坏试验

取本品适量，分别于各严苛条件下进行破坏试验，考察降解产物的来源、降解产物与主成分的分离情况及物料平衡。

①未破坏：取本品适量，加溶剂2溶解并稀释制成每1mL约0.5mg的供试品溶液，摇匀，即得。

②光破坏：取本品适量于玻璃皿中，置强光(4500lx)下照射4小时，取样品适量，加溶剂2溶解并稀释制成每1mL约含咪达那新0.5mg的供试品溶液。

③酸加热破坏：取本品适量，加1mol/L的盐酸溶液1mL，置100℃水浴中加热破坏4小时后，加1mol/L的氢氧化钠溶液1mL中和，加溶剂2溶解并稀释制成每1mL约含咪达那新0.5mg的供试品溶液。

④碱加热破坏：取本品适量，加1mol/L的氢氧化钠溶液1mL，置100℃水浴中加热破坏4小时后，加1mol/L的盐酸溶液1mL中和，加溶剂2溶解并稀释制成每1mL约含咪达那新0.5mg的供试品溶液。

⑤酸碱空白：取1mol/L氢氧化钠溶液1ml，加入等量的1mol/L盐酸溶液，置20ml量瓶中，于100℃水浴中加热破坏4小时后，加溶剂2稀释至刻度，即得。

⑥氧化破坏：取本品适量，加3％双氧水溶液1mL，密封，置于60℃烘箱中，放置6小时，加溶剂2溶解并稀释制成每1mL约含咪达那新0.5mg的供试品溶液。

⑦氧化空白：取3％双氧水1ml，置20ml量瓶中，密封，置于60℃烘箱中，放置6小时，加溶剂2稀释至刻度，即得。

⑧高温破坏(固体)：精密称取本品约10mg，置20ml量瓶中，置100℃条件下破坏4小时后，放冷，加溶剂2溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

⑨高温破坏(液体)：精密称取本品约10mg，置20ml量瓶中，加适量溶剂2溶解后，置于水浴锅中破坏4小时后，放冷，加溶剂2溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

⑩氧化破坏+混合杂质：取本品适量，加3％双氧水溶液1mL，密封，置于60℃烘箱中，放置6小时，取出，放至室温，精密加入混合杂质溶液适量，加溶剂2稀释至刻度，制成含杂质0.5μg/ml的氧化破坏加混合杂质溶液。

取各破坏条件下的样品各50μl，进样分析，记录色谱图。

结果显示，本品在高温、光照条件下均比较稳定，未见明显杂质产生；在酸破坏和碱破坏条件下，产生的主要杂质是杂质1；在氧化条件下产生的杂质较多，降解明显，通过采集氧化破坏+混合杂质溶液，发现降解产物主要是杂质7～10，且各降解产物与主峰的分离度良好，主峰及较大杂质的峰纯度较高(峰纯度值均大于阈值980)，说明主峰中不包含未能分离的杂质或降解产物，即拟定有关物质色谱条件适用于本品的有关物质检测。

物料平衡考察结果见表2。

表2物料平衡考察

物料平衡考察数据表明，各破坏条件下样品物料基本守恒，各破坏溶液的总峰面积与未破坏溶液总峰面积之比均在90～110％之间；各破坏条件主峰峰纯度良好(峰纯度值大于设定的阈值980)，物料平衡。

3、定量限检测限

取咪达那新混合杂质溶液50μl，进样分析，记录色谱图，以信噪比S/N≈3、S/N≈10分别测定检测限及定量限。结果见表3。

表3检测限定量限结果

由表3可以看出，咪达那新及各杂质检测限定量限均较小，充分验证了本发明的检测方法检测灵敏度高。

4、溶液稳定性

在室温下，供试品溶液在12小时内主峰归一化含量RSD小于2.0％，总杂归一化含量在0.03％～0.04％范围内波动；杂质混合对照品溶液，各杂质峰面积RSD均小于2.0％，结果表明，在此测定条件下，供试品溶液和杂质混合对照品溶液在室温下放置12小时内稳定性良好。

5、线性

精密称取咪达那新、杂质1～3、5、6对照品各适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解后加溶剂2稀释制成约0.5mg/ml的主成分及各杂质对照品母液；精密称取杂质7～10对照品各适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解后加溶剂2稀释制成约0.1mg/ml的各杂质对照品母液。精密量取各对照品母液适量，加溶剂2稀释制成每1ml约含各杂质5μg和咪达那新50μg的混合对照储备溶液，分别精密吸取混合对照储备溶液适量置10ml量瓶中，用溶剂2稀释制成一系列浓度的溶液，作为各成分的线性溶液；精密吸取上述系列梯度浓度溶液各50μl，从低浓度到高浓度依次进样分析，记录色谱图。以杂质对照品溶液浓度C(μg/ml)为横坐标，杂质对照品峰面积为纵坐标，进行线性回归并计算回归方程。结果见表4。

表4线性关系考察结果

由表4可以看出，咪达那新及各杂质在线性范围内线性关系良好。

6、校正因子测定

在2台液相色谱仪上，使用3根色谱柱，以P³ ₂排列组合，共计6次，以各杂质及主成分的定量限浓度、杂质规定限度(0.1％)浓度的50％、80％、100％(限度浓度)、120％、150％和200％分别配制杂质及主成分的对照品溶液，以质量浓度对峰面积进行回归，并计算杂质相对咪达那新的校正因子，测定结果见表5。

表5校正因子测定结果

由表5可以看出，杂质7、杂质10、杂质8和杂质1需按照上表得出的校正因子带入计算，其他杂质校正因子在0.9～1.1之间，不需带入校正因子计算。

7、准确度

精密称取咪达那新样品九份，分别加入杂质限量的80％、100％、120％的杂质对照品溶液，加溶剂2溶解并稀释至刻度，分别精密量取50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以各杂质的[(测得量-本底量)/加入量]计算回收率，结果见表6。

表6杂质回收率测定结果

杂质编号	回收率结果(％)	平均回收率(％)	RSD(％)
				5	101.9～104.9	103.5	0.01
9	95.92～101.5	98.17	0.02
				7	101.5～104.1	102.4	0.01
10	99.96～100.6	100.4	0.003
				2	99.33～101.4	99.90	0.01
8	98.72～101.5	99.53	0.01
				6	99.73～101.4	100.7	0.01
1	96.22～98.99	97.60	0.01
				3	98.79～101.1	100.3	0.01

由表6可以看出，各个杂质回收率均在95％～105％之间，RSD均小于5.0％，回收率良好；表明本发明的方法适用于本品有关物质的测定。

8、中间精密度

在本测试条件下，用同一均质供试品，在不同时间，不同仪器，由不同分析人员经多次取样进行一系列检测，分别以外标法和加校正因子的自身对照法计算已知杂质2的检测结果，考察中间精密度，结果见表7。

表7杂质2中间精密度试验结果(外标法和加校正因子的自身对照法)

由表7可以看出，已知杂质采用外标法与加校正因子的自身对照法计算，结果无差异，RSD均在10.0％以内，表明本发明测定方法的中间精密度良好。

实施例3：

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Inertsil ODS-3C18(250×4.6mm，5μm)，以辛烷磺酸钠的磷酸溶液(取1.08g辛烷磺酸钠，加质量浓度为0.1％磷酸溶液溶解并稀释至1000ml，用三乙胺调pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长分别为218nm和222nm，柱温25℃，进样量50μl。溶剂1为70％乙腈水，溶剂2为流动相A和流动相B体积比67:33的混合溶液。

样品溶液的配制：

咪达那新混合杂质溶液：精密称取咪达那新和各杂质对照品适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解，再加溶剂2定容并稀释，制成每1ml约含各杂质0.5μg和含咪达那新5μg的混合对照品溶液。

取上述溶液各50μl，进样分析，记录色谱图。

本例将波长调整为218nm和222nm，考察咪达那新峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例2。

综上所述，波长在218nm～222nm范围内，检测效果良好。

实施例4：

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Inertsil ODS-3C18(250×4.6mm，5μm)，以辛烷磺酸钠的磷酸溶液(取1.08g辛烷磺酸钠，加质量浓度为0.1％磷酸溶液溶解并稀释至1000ml，用三乙胺调pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温分别为20℃和30℃，进样量50μl。溶剂1为70％乙腈水，溶剂2为流动相A和流动相B体积比67:33的混合溶液。

样品溶液的配制：

咪达那新混合杂质溶液：精密称取咪达那新和各杂质对照品适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解，溶剂2定容并稀释，制成每1ml约含各杂质0.5μg和含咪达那新5μg的混合对照品溶液。

取上述溶液各50μl，进样分析，记录色谱图。

本例将柱温调整为20℃和30℃，考察咪达那新峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例2。

综上所述，柱温在20℃～30℃范围内，检测效果良好。

实施例5：

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Inertsil ODS-3C18(250×4.6mm，5μm)，以辛烷磺酸钠的磷酸溶液(取1.08g辛烷磺酸钠，加质量浓度为0.1％磷酸溶液溶解并稀释至1000ml，用三乙胺调pH值至2.6或3.0)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温25℃，进样量50μl。溶剂1为70％乙腈水，溶剂2为流动相A和流动相B体积比67:33的混合溶液。

样品溶液的配制：

取上述溶液各50μl，进样分析，记录色谱图。

本例流动相A的pH值调整为2.6和3.0，考察咪达那新峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例2。

综上所述，流动相A的pH值在2.6～3.0范围内，检测效果良好。

实施例6：

高效液相色谱条件：

梯度洗脱程序为：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从82:18匀速渐变至60:40；(2)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至20:80；(3)在50-53分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持20:80不变；(4)在53-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比从20:80匀速渐变至82:18；(5)在58-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持82:18不变。

样品溶液的配制：

取上述溶液各50μl，进样分析，记录色谱图。

本例将梯度洗脱程序起始比例流动相A和流动相B的体积比从80:20调整为82:18，相应的调整了洗脱程序的终止比例，考察咪达那新峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例2。

实施例7：

高效液相色谱条件：

梯度洗脱程序为：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从78:22匀速渐变至60:40；(2)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至20:80；(3)在50-53分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持20:80不变；(4)在53-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比从20:80匀速渐变至78:22；(5)在58-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持78:22不变。

样品溶液的配制：

取上述溶液各50μl，进样分析，记录色谱图。

本例将梯度洗脱程序起始比例流动相A和流动相B的体积比从80:20调整为78:22，相应的调整了洗脱程序的终止比例，考察咪达那新峰与杂质峰及杂质与杂质之间分离度，以及样品中杂质检测情况。结果显示，各成分间分离度良好，检测效果同实施例2。

综上所述，梯度洗脱步骤：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从(82～78):(18～22)匀速渐变至60:40；(2)40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至20:80；(3)50-53分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持20:80等度洗脱；(4)53-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比从20:80匀速渐变至(82～78):(18～22)；(5)58-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持(82～78):(18～22)不变，当起始洗脱比例及终止洗脱比例发生变化时，检测效果良好。

对比例1：

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以辛烷磺酸钠的磷酸溶液(取1.08g辛烷磺酸钠，加质量浓度为0.1％磷酸溶液溶解并稀释至1000ml，用三乙胺调pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温25℃，进样量20μl。溶剂1为70％乙腈水，溶剂2为流动相A和流动相B体积比67:33的混合溶液。

梯度洗脱程序为：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从67:33匀速渐变至25:75；(2)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持25:75不变；(3)50-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比从25:75匀速渐变至67:33。

样品溶液的配制：

精密称取咪达那新及各杂质对照品适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解，溶剂2定容并稀释制成每1ml约含咪达那新4.5μg及各杂质0.45μg的混合杂质溶液。

取上述溶液20μl进样，记录色谱图。结果见附图5，混合杂质溶液中各杂质保留时间分别为：杂质5＝2.778min，杂质9＝4.945min，杂质2＝7.193min，杂质7＝7.327min，杂质8＝7.756min，咪达那新＝8.019min，杂质10＝8.599min，杂质1＝9.940min，杂质3＝12.810min。在该色谱条件下，杂质5出峰时间较早，易受溶剂干扰；杂质2与杂质7、杂质8与主成分间均未达到基线分离。

对比例2：

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为Inertsil ODS-3C18(250×4.6mm，5μm)，以辛烷磺酸钠的磷酸溶液(取1.08g辛烷磺酸钠，加质量浓度为0.1％磷酸溶液溶解并稀释至1000ml，用三乙胺调pH值至2.8)为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温25℃，进样量20μl。溶剂1为70％乙腈水，溶剂2为流动相A和流动相B体积比67:33的混合溶液。

样品溶液的配制：

取咪达那新混合杂质溶液20μl进样，记录色谱图。结果见附图6，当进样量为20μl时，各杂质和主成分的S/N值均较低，部分杂质达不到定量限的要求。

对比例3：

高效液相色谱条件：

色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为InertSustain C18(250×4.6mm，5μm)，以0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm，柱温25℃，进样量40μl。溶剂1为70％乙腈水，溶剂3为流动相A和流动相B体积比67:33的混合溶液。

梯度洗脱程序为：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从80:20匀速渐变至60:40；(2)在40-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至52:48；(3)在45-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持52:48不变；(4)在50-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比从52:48匀速渐变至10:90。

样品溶液的配制：

精密称取咪达那新样品适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解，再加溶剂3定容制成0.22mg/ml的母液；精密称取各杂质对照品适量，先加溶剂1(70％乙腈水)溶解，再加溶剂3定容制成4.5μg/ml的混合杂质母液；分别精密量取咪达那新样品母液和混合杂质母液各适量，加溶剂3定容并稀释制成每1ml约含咪达那新0.11mg及各杂质2.25μg的样品加杂质混合溶液。

取咪达那新样品加杂质混合溶液40μl进样，记录色谱图。结果见附图7，样品加杂质混合溶液中，杂质出峰较早，部分杂质受溶剂峰干扰严重，各杂质间及杂质与主成分间分离度较差，峰形差，各杂质浓度约为2.25μg/ml，但各杂质峰面积及峰高均较低，响应较弱。

本发明专属性良好，准确度高，检测灵敏，测定杂质种类及个数较多，通过严谨的校正因子计算，为计算结果提供支持依据，为咪达那新中有关物质的快速准确监控提供方法。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。

Claims

1.一种咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，该检测方法采用高效液相色谱法，其色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱；所述流动相A采用辛烷磺酸钠的磷酸溶液；所述流动相B采用乙腈。

2.根据权利要求1所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，溶解样品包括如下步骤：以溶剂1溶解样品后，再以溶剂2定容及稀释；所述溶剂1采用70％乙腈水；所述溶剂2采用流动相A和流动相B的混合溶剂；优选地，流动相A和流动相B的体积比为55～80:45～20；更优选地，流动相A和流动相B的体积比为67:33。

3.根据权利要求1所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从(82～78):(18～22)匀速渐变至60:40；(2)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至20:80；(3)在50-53分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持20:80等度洗脱；(4)在53-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比从20:80匀速渐变至(82～78):(18～22)；(5)在58-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持(82～78):(18～22)不变。

4.根据权利要求3所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-40分钟，流动相A和流动相B的体积比从80:20匀速渐变至60:40；(2)在40-50分钟内，流动相A和流动相B的体积比从60:40匀速渐变至20:80；(3)在50-53分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持20:80等度洗脱；(4)在53-58分钟内，流动相A和流动相B的体积比从20:80匀速渐变至80:20；(5)在58-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持80:20不变。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，所述辛烷磺酸钠的磷酸溶液中辛烷磺酸钠的浓度为0.001mol/L～0.01mol/L；优选为0.003mol/L～0.007mol/L；更优选为0.005mol/L。

6.根据权利要求5所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A的制备包括以下步骤：首先配制质量浓度为0.05～2.5％磷酸水溶液，将辛烷磺酸钠用配制好的磷酸水溶液制成浓度0.001mol/L～0.01mol/L的溶液，再用三乙胺调pH值至2.0-4.0，即得；优选地，用三乙胺调pH值至2.6-3.0；更优选地，用三乙胺调pH值至2.8。

7.根据权利要求6所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A的制备包括以下步骤：首先配制质量浓度为0.1％磷酸水溶液，将辛烷磺酸钠用配制好的磷酸水溶液制成浓度0.05mol/L的溶液，再用三乙胺调pH值至2.0-4.0，即得；优选地，用三乙胺调pH值至2.6-3.0；更优选地，用三乙胺调pH值至2.8。

8.根据权利要求1所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶；优选地，色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。

9.根据权利要求1所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件包括：检测器的检测波长为218～222nm；优选为220nm；柱温为20～30℃；优选为25℃；进样量为50～150μl；优选为50～100μl。

10.根据权利要求1所述的咪达那新中有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质包括以下物质：