CN109964727A - 一种利用光照提高蛹虫草富硒率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用光照提高蛹虫草富硒率的方法。本发明方法包括：将蛹虫草菌丝在黑暗条件下培养后，在蓝光光照条件下进行培养；其中，所述在蓝光光照条件下进行培养包括：在液体菌丝培养阶段以及/或者在固体培养的转色阶段进行蓝光照射条件下的培养。用蓝光替代传统的白光作为散射光光源，能够提高蛹虫草子坐的产量和富硒效率。本发明方法中，利用蓝光光照，可避免传统方法中采用白光作为光源所产生的蛹虫草对无机硒吸收的抑制作用。

Description

一种利用光照提高蛹虫草富硒率的方法

技术领域

本发明涉及微生物培养领域，具体而言，涉及一种利用光照提高蛹虫草富硒率的方法。

背景技术

硒是人体必需的微量元素，也是国际公认的人体免疫激活剂。因而，补硒已经成为关系人体健康的一个重要问题。无机硒由于其生理活性低、且具有一定的生物毒性等缺陷，因而作为硒元素补充剂的使用日益减少，人们越来越多的通过有机硒的摄入以实现对于硒元素的补充。

富硒菌是一种将无机硒与食用菌有机结合的产物，通过食用菌的吸收和发酵作用，能够将无机硒转化为有机硒，使得硒更易于为人体所吸收和利用。

蛹虫草[Cordycepsmilitaris(Vuill.)Fr.]是麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)的模式种，富含虫草素、虫草酸、虫草多糖等多种对人体有益的活性物质及微量元素，是冬虫夏草的理想替代品。同时，蛹虫草对于无机硒具有良好的耐受性，并具有较强富硒能力，而且其人工栽培操作简单、生产周期短、产量高。将蛹虫草与硒进行有机结合，可以使得硒与蛹虫草中的生理活性物质协同增效，有效提高蛹虫草的营养和保健功效。因而，以蛹虫草为载体生产富硒产品也就成了目前研究的热点所在。

然而，目前对于富硒蛹虫草的研究，多见于培养基成分和后续提取等方面，而对于培养条件，特别是光照条件对于蛹虫草富硒影响的研究并不多见。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种利用光照提高蛹虫草富硒率的方法，本发明所述的方法中，通过采用蓝光作为光源，能够有效提高蛹虫草的富硒效率。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种利用光照提高蛹虫草富硒率的方法，所述方法包括如下步骤：

将蛹虫草菌丝在黑暗条件下培养后，在蓝光光照条件下进行培养；其中，所述在蓝光光照条件下进行培养包括：在液体菌丝培养阶段以及/或者在固体培养的转色阶段进行蓝光照射条件下的培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中，在液体菌丝培养阶段，采用分步发酵过程进行虫草菌丝的富硒培养，即采用两阶段的方式培养富硒蛹虫草，首先将蛹虫草菌丝在完全黑暗条件下的基础培养基中进行一阶段液体培养；培养一段时间后进行二阶段培养。这样能够提高蛹虫草的富硒效率，并避免传统方法中采用白光作为光源所产生的蛹虫草对无机硒吸收的抑制作用。

同时，本发明中，在子实体培养阶段，同样也采用在蓝光照射条件下转色，相较于常规的白光转色而言，采用蓝光转色不仅不会影响转色过程，而且能够提高子实体的富硒率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

有鉴于目前对于富硒蛹虫草发酵培养的程序条件，特别是光照条件对于富硒率影响的研究并不多见，本发明在进行前期研究的基础上，提供了一种利用蓝光光照以提高蛹虫草富硒率的方法，通过在菌丝转色阶段采用蓝光作为散射光光源，从而改善了蛹虫草对于无机硒的吸收，这不仅提高了富硒效率，同时也能够避免无机硒在培养基中的残留，减少环境污染，同时保障了生产的安全性。

具体的，本发明所提供的蛹虫草菌丝富硒发酵培养方法分两个阶段进行：

第一阶段：在完全黑暗条件下进行蛹虫草菌丝发酵培养；

此阶段中，是将蛹虫草菌丝置于完全黑暗条件下进行培养，然后，在培养一段时间后，根据原基分化和子实体生长阶段需要散射光光照刺激的特点，再给予散射光光照，并在持续的光照条件下进行培养。

具体的，在此阶段中，是将蛹虫草菌种接入基础培养基中，然后在优选的20℃、摇床(转速优选的为160r/min)条件下进行培养。

而如上所述的基础培养基的原料为马铃薯、葡萄糖，以及超纯水，本发明所用基础培养基中，不添加无机硒。

区别于过去一段式富硒培养蛹虫草菌丝的方式(即在培养的初始阶段就在培养基中加入无机硒)，本发明中对富硒培养蛹虫草菌丝进行二段式培养。在培养初期，蛹虫草菌丝的活性较低，如果直接在基础培养基中加入无机硒，则会造成活性较弱的蛹虫草无法耐受亚硒酸盐的毒害，从而影响生产效率。而采用二段式培育的方法，并在蛹虫草菌丝活性达到最强时期后再添加亚硒酸盐，则能够有效的避免上述不良影响，从而提高生产效率。

以制备1000ml基础培养基为例，对其制备方法步骤简述如下：称取马铃薯200g,葡萄糖20g,将马铃薯切成3mm左右的薄片，加入超纯水煮至用玻璃棒轻轻一戳就裂开即可，纱布过滤，加入葡萄糖，用超纯水定容至1000ml(无需进行pH调节的步骤)，所制备的基础培养基的初始pH值为5左右。

接入培养基中的蛹虫草菌丝在初始pH的条件下生长，随着生长时间的延长，菌丝会代谢酸类物质，导致培养基中pH值的下降，而这并不利于菌丝的正常生长。因而，在一阶段培养后，不仅需要进一步额外补充无机硒等微量元素，同时也需要对于培养基的pH进行调控，即进行二阶段的培养。

第二阶段：在蓝光光照条件下进行蛹虫草菌丝发酵培养

在黑暗条件下培养一段时间至蛹虫草菌丝活性达到最强后，向培养基中加入无机硒(优选的为亚硒酸钠)；同时，如前所述，由于前一阶段培养中代谢产物的生成导致培养基pH变化，而该pH条件不利于蛹虫草菌丝的正常生长，因而，也需要通过添加酸碱性物质(NaOH、HCl等)对培养基的pH进行调整；

优选的，通过上述调整，使得培养基中无机硒的浓度达到20～30μg/ml；更优选的，是使得培养基中无机硒的浓度达到25μg/ml；进一步优选的，是使得培养基中亚硒酸钠的浓度达到25μg/ml；

同时，通过上述调整，将培养基的pH调节至5。

然后，在优选的20℃、摇床(转速优选的为160r/min)条件下，继续进行培养，同时给予蓝光照射；

优选的，蓝光光照的强度为10～100lx；更优选的，蓝光的光照强度为30～50lx；进一步优选的，蓝光的光照强度为30lx。

菌丝的培养周期一般包括四个阶段，即营养菌丝生长阶段、菌丝转色形成阶段，原基形成阶段以及子实体生长阶段，本发明中如上所介绍的蛹虫草菌丝富硒发酵培养实际上即为营养菌丝生长阶段。

在如上的营养菌丝生长阶段后，菌丝会进入转色阶段，菌丝只有在转色后才能够形成原基，并进行进一步的子实体培养；而在转色过程中，通常需要给予一定的散射光光照，在传统的富硒蛹虫草培育方法中，大多采用白光作为光源(强度约为600lx)。

然而，经进一步的研究发现，在转色形成阶段中，如果采用传统光照条件，蛹虫草菌丝对无机硒的吸收明显受到了抑制，而这对于培养基中硒元素的富集而言，明显是不利的。

而本发明中，通过将散射光源调整为蓝光，则不仅能够促进蛹虫草菌丝的正常转色，同时还不会抑制培养过程中蛹虫草菌丝对于硒的吸收和富集，从而保证蛹虫草的正常栽培与生产。

因而，本发明还可以进一步提供一种利用蓝光照射提高菌丝转色阶段富硒率的方法。具体的，该方法中，可以按照如下两种方式进行：

(i)首先按照如上的蛹虫草菌丝富硒发酵培养方法，得到对应的富硒蛹虫草菌丝，然后将其接入固体培养基中，进行蓝光照射条件下的转色培养；

(ii)将蛹虫草菌丝直接接入固体培养基中，待发酵培养至转色阶段后，进行蓝光条件下的照射培养。

在如上(i)、(ii)的培养方法中，在蓝光条件下进行转色培养前，同样需要加入无机硒(优选的为亚硒酸钠)，使得培养基中无机硒的浓度达到20～30μg/ml；更优选的，是使得培养基中无机硒的浓度达到25μg/ml；进一步优选的，是使得培养基中亚硒酸钠的浓度达到25μg/ml。在固体培养基中的转色培养阶段，无需对所用固体培养基的pH进行调整。

同时，蓝光光照的强度为10～100lx；更优选的，蓝光的光照强度为30～50lx；进一步优选的，蓝光的光照强度为30lx。进一步的，所用固体培养基可以为常规固体培养基，例如按照小麦：水为1:1.5的比例配成小麦固体培养基。

需要说明的是，以下实施例1-5中，所用基础培养基由如下方法制得：称取马铃薯200g,葡萄糖20g,将马铃薯切成3mm左右的薄片，加入超纯水煮至用玻璃棒轻轻一戳就裂开即可，纱布过滤，加入葡萄糖，用超纯水定容至1000ml(无需进行pH调节的步骤)。

实验例5-7中所用固体培养基由如下方法制得：市售无霉变小麦，按照小麦：水为1:1.5的比例配成小麦固体培养基，灭菌备用。

实验例1

将蛹虫草液体菌丝接入基础培养基后，在黑暗条件下，20℃，160r/min摇床培养，培养一段时间至菌丝活性最强；

然后，调节培养基的pH至5，并添加Na₂SeO₃调节浓度至25μg/ml进行富硒培养，作为对照组；

另一组蛹虫草液体菌丝接入pH＝5，且添加有浓度为25μg/ml Na₂SeO₃的基础培养基中，并在黑暗条件下，20℃，160r/min摇床培养相同时间，作为处理组；

每组至少存在三个对照组。

将对照组和处理组继续在20℃，160r/min摇床培养一段时间，并分别测量蛹虫草菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量。

测量结果表明：对照组的菌丝生物增长量基本无变化(差异不显著)，对Na₂SeO₃的吸收总量基本无增加(差异不显著)；

处理组的菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量为1.771±0.066mg，生物增长量为2.85±0.467mg，富硒率为70.8％；

此时两组菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量以及生物增长量存在显著性差异(p<0.05)。

由实验例1的结果可知，采用本发明培育方式，并在培养富硒蛹虫草一段时间后转接有利于增强菌丝活性，能够避免直接添加亚硒酸盐对活性较弱的菌丝产生毒害，从而提高生产效率。

实验例2

将蛹虫草液体菌丝接入基础培养基中，在20℃，160r/min在黑暗条件下进行摇床培养，培养一段时间至菌丝活性最强，调节培养基的pH为5并添加Na₂SeO₃调节浓度至25μg/ml进行富硒培养；

其中，一组置于黑暗处摇床培养作为对照组，另一组其他条件相同置于600lx的白光照射下摇床培养作为处理组。每组至少存在三个对照组。

继续20℃，160r/min摇床培养40h，测量蛹虫草菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量。

测量结果表明：处理组的菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量为1.519±0.250mg，富硒率为60.2％；

对照组的菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量为1.771±0.066mg，富硒率为70.8％；

此时两组菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量存在显著性差异(p<0.05)。

由此可见，600lx的白光光照对蛹虫草菌丝吸收亚硒酸盐产生抑制作用，抑制率为15％。

由实验例2的结果可知，后期调节培养基的pH为5这一正常生长pH范围培养富硒蛹虫草过程中，白光光照对蛹虫草菌丝吸收亚硒酸盐产生抑制作用，不应该添加白光照射。因此调节培养基的pH为5这一正常生长范围时，不应该在白光照射下培养富硒蛹虫草菌丝，避免亚硒酸盐在培养基中的残留，提高富硒效率，减少环境污染，从而保证生产安全性。

实验例3

将蛹虫草液体菌丝接入基础培养基中，在20℃，160r/min在黑暗条件下进行摇床培养，培养一段时间至菌丝活性最强，调节培养基的pH为5，并添加Na₂SeO₃调节浓度至25μg/ml进行富硒培养；

一组黑暗处摇床培养作为对照组，一组其他条件相同置于30lx的蓝光照射下摇床培养作为处理组。每组至少存在三个对照组。

继续20℃，160r/min摇床培养40h，测量蛹虫草菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量。

测量结果表明：处理组的菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量为1.950±0.110mg，富硒率为77.5％；

对照组的菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量为1.771±0.066mg，富硒率为70.8％；

此时两组菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量不存在显著性差异(p>0.05)。

由实验例3的结果可知，在后期调节培养基的pH为5这一正常生长pH范围培养富硒蛹虫草过程中，30lx的蓝光照射下的蛹虫草菌丝对亚硒酸盐的吸收不存在抑制作用。因此调节培养基的pH为5这一正常生长范围时，应该在30lx的蓝光照射下培养富硒蛹虫草菌丝，从而避免亚硒酸盐在培养基中的残留，提高富硒效率，减少环境污染，从而保证生产安全性。

实验例4

将蛹虫草液体菌丝接入基础培养基中，在20℃，160r/min在黑暗条件下进行摇床培养，培养一段时间至菌丝活性最强，调节培养基的pH为8，并添加Na₂SeO₃调节浓度至25μg/ml进行富硒培养；

一组黑暗处摇床培养作为对照组，一组其他条件相同置于30lx的蓝光照射下摇床培养作为处理组。每组至少存在三个对照组。

继续20℃，160r/min摇床培养40h，测量蛹虫草菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量。

测量结果表明：处理组的菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量为1.792±0.317mg，富硒率为74.2％；

对照组的菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量为1.940±0.294mg，富硒率为76.7％；

此时两组菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量不存在显著性差异(p>0.05)。

由实验例4的结果可知，后期调节培养基的pH为8这一碱性生长pH范围培养富硒蛹虫草过程中，蓝光光照对蛹虫草菌丝吸收亚硒酸盐不产生抑制作用，因此调节培养基的pH为8这一碱性生长范围时，可以在蓝光照射下培养富硒蛹虫草菌丝。

由实验3和4可知，在蓝光照射条件下，培养基的pH分别调节为pH＝5和pH＝8两种状态时，虫草菌丝对硒的吸收总量存在显著差异(p>0.05)，pH＝5时，硒吸收总量明显高于pH＝8时，其增加量达8.82％。

实验例5

将蛹虫草液体菌丝接入基础培养基中，在20℃，160r/min在黑暗条件下进行摇床培养，培养一段时间至菌丝活性最强，调节培养基的pH为5，并添加Na₂SeO₃调节浓度至25μg/ml在黑暗条件下进行富硒培养；继续20℃，160r/min摇床培养40h，测量蛹虫草菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量。

测量结果表明：处理组的菌丝对Na₂SeO₃的吸收总量为2.137±0.16mg，富硒率为86％；

将富硒蛹虫草液体菌丝接入固体培养基，一组添加Na₂SeO₃调节浓度至25μg/ml作为处理组，一组其他条件相同不添加Na₂SeO₃作为对照组，两组置于蓝光照射下静置培养。

继续20℃，静置培养，观测子实体在蓝光照射下的转色情况并测量蛹虫草子实体对Na₂SeO₃的吸收总量。

观测结果表明：蛹虫草子实体在蓝光照射条件下转色正常。

测量结果表明：蓝光照射条件下,处理组的子实体对Na₂SeO₃的吸收总量为5.90±0.02mg，生物量为28.19±3.55g；

对照组的子实体对Na₂SeO₃的吸收总量为4.54±0.02mg,生物量为20.77±3.4g。

此时两组子实体对Na₂SeO₃的吸收总量不存在显著性差异(p>0.05)；两组子实体的生物量存在显著性差异(p<0.05)。

由实验例5可知：在蓝光条件下培养富硒蛹虫草过程中，添加Na₂SeO₃的处理组的子实体生物量与对照组的子实体生物量存在显著性差异，因此在蓝光条件下培养富硒蛹虫草子实体，需添加一定量的Na₂SeO₃，促进子实体生物量的增长，从而提高生产效率。

实验例6

将蛹虫草液体菌丝接入以固体培养基中，其中一组添加Na₂SeO₃调节浓度至25μg/ml为处理组，一组其他条件相同不添加Na₂SeO₃作为对照组，在20℃温度、黑暗条件下进行静置培养；待菌丝萌发需至要转色时，两组置于白光照射下继续静置培养；观测光照对两组虫草转色的影响，并测量两组蛹虫草子实体产量性状和对Na₂SeO₃的吸收总量。

观测结果表明：两组蛹虫草菌丝体在白光照射条件下转色正常，无差异。

测量结果表明：处理组白光照射下，出草平均重量为25.93±2.04g，对照组出草平均重量为18.81±3.01g，两组差异极显著(P<0.01)，说明，25μg/ml硒处理浓度在白光照射下，有促进虫草生长的效果。

处理组的子实体对Na₂SeO₃的吸收总量为1.943±0.19mg，富硒率为82％；

由实验例6可知：在采用白光转色条件下培养富硒蛹虫草过程中，添加Na₂SeO₃的处理组的子实体生物量与对照组的子实体生物量存在显著性差异，因此在白光条件下培养富硒蛹虫草子实体，需添加一定量的Na₂SeO₃，促进子实体生物量的增长，从而提高生产效率。

实验例7

将蛹虫草液体菌丝接入固体培养基中，其中一组添加Na₂SeO₃调节浓度至25μg/ml为处理组，一组其他条件相同不添加Na₂SeO₃作为对照组，在20℃温度、黑暗条件下进行静置培养；

待菌丝萌发需至要转色时，两组置于蓝光光照射下继续静置培养；观测光照对两组虫草转色的影响，并测量两组蛹虫草子坐产量性状和对Na₂SeO₃的吸收总量。

观测结果表明：两组蛹虫草菌丝体在蓝光照射条件下转色正常，无差异。

测量结果表明：处理组蓝光照射下，出草平均重量为28.31±2.89g，对照组出草平均重量为20.86±3.35g，两组差异极显著(P<0.01)，说明，25μg/ml硒处理浓度在蓝光照射下，有促进虫草生长的效果。

处理组的子坐对Na₂SeO₃的吸收总量为2.128±0.22mg，富硒率为85％；

由实验例7可知：在采用蓝光转色条件下培养富硒蛹虫草过程中，添加Na₂SeO₃的处理组的子实体生物量与对照组的子实体生物量存在显著性差异，因此在蓝光条件下培养富硒蛹虫草子实体，需添加一定量的Na₂SeO₃，促进子实体生物量的增长，从而提高生产效率。

由实验例6和实验例7结果可知，蓝光光照后，处理组的生物量较白光光照差异显著(P<0.05)；对照组在蓝光光照后的生物量较白光光照差异不显著(P>0.05)。蓝光光照对蛹虫草子坐生长和硒富集量有显著性影响。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种利用光照提高蛹虫草富硒率的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

将蛹虫草菌丝在黑暗条件下培养后，在蓝光光照条件下进行培养；

其中，所述在蓝光光照条件下进行培养包括：在液体菌丝培养阶段以及/或者在固体培养的转色阶段进行蓝光照射条件下的培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，蓝光光照的强度为10～100lx。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，蓝光的光照强度为30～50lx。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还进一步包括在黑暗条件下培养后、蓝光光照条件下进行培养前，向培养基中添加无机硒的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在蓝光光照条件下进行培养前，对培养基的pH进行调节的步骤；

优选的，所述对培养基的pH进行调节包括调节培养基的pH至5～8；

更优选的，所述对培养基的pH进行调节包括调节培养基的pH至5。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述无机硒包括亚硒酸盐。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无机硒为亚硒酸钠。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述无机硒的浓度为20～30μg/ml。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述无机硒的浓度为25μg/ml。