CN109134557A - 从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法 - Google Patents

从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法，将多穗石柯叶片进行研磨，得到叶片粉末；将叶片粉末与乙醇水溶液混合均匀，再放入索氏提取器中，回流提取得到第一提取液，将第一提取液进行过滤，得到滤渣和第一提取液滤液，在滤渣中加入乙醇水溶液，再放入索氏提取器中，回流提取得到第二提取液，将第一提取液滤液和第二提取液混合，得到提取液，浓缩提取液，再冷冻干燥得到干粉；将干粉在第一层析柱中静态吸附，在第二层析柱中静态吸附，用乙醇水溶液对第二层析柱进行冲洗，得到第二洗脱液后进行蒸发，得到根皮苷干粉，本发明方法采用回流提取有机溶剂提取根皮苷的方式，大大缩短了有机溶剂浸提的时间，降低了后期纯化的难度。

Description

从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法
技术领域
本发明属于黄酮类化合物提取技术领域，具体来说涉及一种从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法。
背景技术
根皮苷是根皮素的2'-β-D-葡萄糖苷，为黄酮类中的二氢查尔酮苷。近年，根皮苷在多领域的作用被人们所发现。在医学方面除了用于糖尿病及其并发症的防治以外，对骨质疏松、记忆力减退、肥胖症以及心脑血管病都被证实有不错的防治效果。在化妆品行业,根皮苷可代替熊果苷作为增白剂。更能减缓皮脂的分泌,降低痤疮的发生。此外，根皮苷的甜度为葡萄糖的300倍，可用做天然非糖替代品又因其具有黄酮类的基本性质与功效可作为抗氧剂直接添加到食品中，在化学、食品、医学等领域均有广泛前景。壳斗科植物多穗石柯是一种富含根皮苷的植物，黄酮类化合物含量高达22.2％，其中根皮苷含量占黄酮总量的12.6％，是其他植物含量的数倍，是提取根皮苷绝佳原料。
迄今为止根皮苷提取的方法包括了煎煮法，虽成本低廉、设备简单、无毒安全但由于根皮苷不易溶于水，易溶于有机溶剂的特性，会出现提取液中杂质较多，收率较低等问题。
微波提取法通过在微波场中，对溶液中的部分组分被选择性加热，从而达到目标产物从基质中被溶解出的目的。目前微波提取还处于起步阶段受限于该微波设备和技术，且根皮苷热稳定性不佳等因素，难以达到预期目的。超声提取在直接打破细胞实现有效成分的溶出的同时，其他杂质也随着溶出加大了纯化的难度，对容器的要求高设备成本高也是超声提取的缺点。醇提法多采用乙醇安全无毒，较高程度上减少水溶性杂质的浸出，而回流提取又能减少有机试剂的用量且对设备的要求不高。
目前分离纯化根皮苷的主要方法有:大孔树脂吸附法、聚酰胺层析柱分离法、化学萃取法、絮凝法、高效离心分配色谱法(HPCPC)和高速逆流色谱法(HSCCC)。总体来看，以上方法虽均能达到纯化目的，但各自均有缺点。如絮凝法中PAC的产率较低而壳聚糖纯化效果差，HPCPC与HSCCC设备昂贵，单次样品制备量少，化学萃取与中试剂毒性等问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法，该方法尤其适用于实验用途，其采用聚酰胺与大孔树脂联用的分离方法，使粗提物在聚酰胺层析柱实现黄酮的分离后，在通过大孔树脂得到根皮苷，具有操作简单、分离效果好、负载量高、再生处理简单、解吸条件温和、使用周期长、吸附速度快且使用洗脱剂乙醇安全不污染环境成本低廉等优点。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法，包括以下步骤：
1)将多穗石柯叶片进行研磨，过100～200目筛，得到叶片粉末；
2)回流提取：将M1g叶片粉末与V1mL且乙醇体积浓度为70～80％的乙醇水溶液混合均匀，再放入索氏提取器中，回流提取至少4h后得到第一提取液，将第一提取液进行过滤，得到M2g滤渣和第一提取液滤液，在M2g滤渣中加入V2mL且乙醇体积浓度为70～80％的乙醇水溶液，再放入索氏提取器中，回流提取至少4h后得到第二提取液，其中，M1：V1＝1:(10～20)，M2：V2＝1:(10～20)；
在所述步骤2)中，所述过滤通过减压抽滤实现。
3)冷冻干燥：将步骤2)所得第一提取液滤液和第二提取液混合，得到提取液，浓缩所述提取液，直至除去提取液中的乙醇，再冷冻干燥得到M3mg干粉；
在所述步骤3)中，浓缩所述提取液通过旋转蒸发仪实现。
4)吸附：用乙醇体积浓度为80～95％的乙醇水溶液浸泡聚酰胺12～15h后，将聚酰胺取出并使用去离子水洗至排出的清洗液为中性，再用15～20wt％的氢氧化钠水溶液浸泡聚酰胺至少8h，将聚酰胺取出后用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性；然后再用体积浓度为15～20％的盐酸溶液浸泡聚酰胺至少8h，取出聚酰胺后用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性，将聚酰胺灌注到第一层析柱中，在第一层析柱中加入去离子水冲洗至该第一层析柱流出液无白色浑浊为止，将步骤3)得到的M3mg干粉用30～45℃的温水均匀分散成干粉浓度为30～80mg/mL的干粉液体，将干粉液体加入第一层析柱中静态吸附30～50min，其中，灌注到第一层析柱中聚酰胺所占该第一层析柱的体积为V3mL，M3：V3＝(35-90)：1；
5)除杂质：用蒸馏水对步骤4)所得第一层析柱进行冲洗至洗脱液澄清；
在所述步骤5)中，所述蒸馏水在第一层析柱中的流速为1～2mL/min。
6)解吸：用乙醇体积浓度为X的乙醇水溶液，以2～5mL/min的流速洗脱第一层析柱，得到第一洗脱液，将第一洗脱液蒸发至乙醇挥发，得到浓缩液体；
在所述步骤6)中，洗脱第一层析柱的所述乙醇水溶液的体积为该第一层析柱容积的至少6倍。
7)吸附：用15～20wt％的氢氧化钠水溶液浸泡大孔树脂至少8h，取出大孔树脂后再用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性，然后用15～20wt％盐酸溶液浸泡大孔树脂至少8h，取出大孔树脂，用去离子水冲洗大孔树脂直至排出的清洗液为中性，再用无水乙醇浸泡大孔树脂至少12h，取出大孔树脂，将大孔树脂灌注在第二层析柱中，在第二层析柱中加入去离子水冲洗至流出液无白色浑浊为止，将步骤7)所得浓缩液体加入第二层析柱中静态吸附30～50min，其中，灌注到第二层析柱中大孔树脂所占该第二层析柱的体积为V4mL，V3：V4＝1：(0.75-1.25)；
8)解吸：用乙醇体积浓度为X的乙醇水溶液以2～3mL/min的流速对第二层析柱进行冲洗，得到第二洗脱液；
在所述步骤8)中，洗脱第二层析柱的所述乙醇水溶液的体积为该第二层析柱容积的至少6倍。
9)冷冻干燥：将步骤8)所得第二洗脱液进行蒸发，以去除其中乙醇，再冷冻干燥，得到根皮苷干粉，
其中，所述X为70～90％。
在所述步骤9)中，所述蒸发采用旋转蒸发仪，所述旋转蒸发仪中的挥发物为乙醇。
在上述技术方案中，旋转蒸发仪的温度为45～50℃。
在上述技术方案中，所述乙醇水溶液的pH为7～8。
在上述技术方案中，所述冷冻干燥的步骤为：在-80～-70℃冷冻至少2小时，再于-50～40℃和0MPa的条件下保持至少12h。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明方法采用回流提取有机溶剂提取根皮苷的方式，大大缩短了有机溶剂浸提的时间，又在一定程度上减少了水溶性杂质的混入，降低了后期纯化的难度。提取溶剂乙醇不仅价格低廉，而且还可以在浓缩与冻干(冷冻干燥)的过程中实现回收。且对提取设备要求低、操作简单。
2、本发明方法采用聚酰胺与大孔树脂联用的方式对粗提产物进行纯化，纯化材料再生后可循环使用，从而降低成本。纯化过程中并未使用高温、高压工艺,在简便操作的同时，也在一定程度上避免了根皮苷的降解。采用乙醇为洗脱液，降低了试验毒性。
3、本发明方法采用冷冻干燥的方式制备根皮苷，低温的条件减少了根皮苷的损失进而提高产率。
4、本发明方法多次采用过滤，目的是为了减少提取液中大颗粒对聚酰胺与大孔树脂吸附过程的干扰，提高吸附效率增加根皮苷得率。
5、使用本方法提取根皮苷的产率达到5.12-5.5％，纯度达90％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
在下述实施例中，乙醇为色谱纯(天津市东天正精细化学试剂厂)，AB-8型大孔吸附树脂(东鸿化工有限公司)，聚酰胺树脂(30-60目，上海摩速科技有限公司)。
下述实施例涉及仪器为：十万分之一天平、SB-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司，减压抽滤)、GOLD-SIM冻干机和GZX电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司)。
下述实施例中，旋转蒸发仪的温度均为48℃。
第一层析柱规格为25ml(容积)，第二层析柱规格为25ml(容积)。
在下述实施例中，多穗石柯叶片采于广西巴马瑶族自治县且为无病虫害的新鲜叶片，用流水清洗多穗石柯叶片表面的杂质，风干后置于恒温干燥箱中60℃烘干4h直至无明显潮意，用于下述实施例。
下述实施例中冷冻干燥的步骤为：在-80℃冷冻2小时，再于-40℃和0MPa的条件下保持12h。
一种从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法，包括以下步骤：
1)将多穗石柯叶片放入研钵中充分研磨，过100目筛，再将粒度大于100目的粉末重复研磨，直至全部通过100目筛，得到叶片粉末；
2)回流提取：将10g叶片粉末与乙醇体积浓度为75％的200ml乙醇水溶液混合均匀(乙醇水溶液的pH＝7.5)，再放入索氏提取器中，回流提取4h后得到第一提取液，通过减压抽滤对第一提取液进行过滤，得到M2g滤渣和第一提取液滤液，在M2g滤渣中加入乙醇体积浓度为70％的V2mL乙醇水溶液，再放入索氏提取器中，回流提取4h后得到第二提取液，其中，M2：V2＝1:10；
3)冷冻干燥：将步骤2)所得第一提取液滤液和第二提取液混合，得到提取液，采用旋转蒸发仪浓缩提取液，直至除去提取液中的乙醇，再冷冻干燥得到M3mg干粉，M3mg＝800mg；
4)吸附：用乙醇体积浓度为95％的500ml乙醇水溶液(pH＝7.5)浸泡15g聚酰胺12h后，将聚酰胺取出并使用去离子水洗至排出的清洗液为中性，再用500ml的15wt％的氢氧化钠水溶液浸泡取出的聚酰胺8h，将聚酰胺取出后用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性；然后再用体积浓度为15％的500ml盐酸溶液浸泡聚酰胺8h，取出聚酰胺后用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性，将聚酰胺灌注到第一层析柱中，在第一层析柱中加入去离子水冲洗至该第一层析柱流出液无白色浑浊为止，将步骤3)得到的800mg干粉用40℃温水均匀分散成干粉浓度为80mg/mL的干粉液体，将10ml干粉液体加入第一层析柱中静态吸附30min，其中，灌注到第一层析柱中聚酰胺所占该第一层析柱的体积为V3mL，M3：V3＝64:1；
5)除杂质：用500ml蒸馏水对步骤4)所得第一层析柱进行冲洗至洗脱液澄清，蒸馏水在第一层析柱中的流速为1.5mL/min；
6)解吸：用乙醇体积浓度为X的200mL乙醇水溶液(pH＝7.5)，以2mL/min的流速洗脱第一层析柱，得到第一洗脱液，将第一洗脱液通过旋转蒸发仪蒸发至乙醇挥发(无明显醇味)，得到浓缩液体；
7)吸附：用500ml的15wt％的氢氧化钠水溶液浸泡15g AB-8型大孔树脂8h，取出AB-8型大孔树脂后再用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性，然后用500ml的15wt％盐酸(水)溶液浸泡AB-8型大孔树脂8h，取出AB-8型大孔树脂，用去离子水冲洗AB-8型大孔树脂直至排出的清洗液为中性。再用500ml无水乙醇浸泡AB-8型大孔树脂12h，取出AB-8型大孔树脂，将AB-8型大孔树脂灌注在第二层析柱中，在第二层析柱中加入去离子水冲洗至流出液无白色浑浊为止，将步骤7)所得浓缩液体加入第二层析柱中静态吸附30min，其中，灌注到第二层析柱中大孔树脂所占该第二层析柱的体积为V4mL，V3：V4＝1:1；
8)解吸：用200mL乙醇体积浓度为X的乙醇水溶液(pH＝7.5)以2mL/min的流速对第二层析柱进行冲洗，以洗脱吸附含有根皮苷的大孔树脂，得到第二洗脱液；
9)冷冻干燥：将步骤8)所得第二洗脱液通过旋转蒸发仪进行蒸发，以去除其内乙醇，再冷冻干燥，得到根皮苷干粉，其中，旋转蒸发仪中的挥发物为乙醇，挥发物经过冷凝器冷凝，即可回收乙醇。
表1为实施例1～3中X以及实施例1～3所得根皮苷干粉的产率及纯度。
产率计算方法：步骤9)得到的根皮苷干粉的质量与步骤1)所得叶片粉末的质量的比。
纯度计算方法：用无水乙醇将步骤9)得到的根皮苷干粉均匀分散，再经UPLC(超高效液相)检测后即可得到其纯度。
在本发明的具体实施方式中，通过调整乙醇水溶液中乙醇的体积浓度、聚酰胺加入第一层析柱中的量、大孔树脂加入第二层析柱中的量以及吸附、清洗所用溶液的浓度等均能实现与上述实施例一致的技术效果。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从多穗石柯叶片中提取根皮苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多穗石柯叶片进行研磨，过100～200目筛，得到叶片粉末；
2)回流提取：将M1g叶片粉末与V1mL且乙醇体积浓度为70～80％的乙醇水溶液混合均匀，再放入索氏提取器中，回流提取至少4h后得到第一提取液，将第一提取液进行过滤，得到M2g滤渣和第一提取液滤液，在M2g滤渣中加入V2mL且乙醇体积浓度为70～80％的乙醇水溶液，再放入索氏提取器中，回流提取至少4h后得到第二提取液，其中，M1：V1＝1:(10～20)，M2：V2＝1:(10～20)；
3)冷冻干燥：将步骤2)所得第一提取液滤液和第二提取液混合，得到提取液，浓缩所述提取液，直至除去提取液中的乙醇，再冷冻干燥得到M3mg干粉；
4)吸附：用乙醇体积浓度为80～95％的乙醇水溶液浸泡聚酰胺12～15h后，将聚酰胺取出并使用去离子水洗至排出的清洗液为中性，再用15～20wt％的氢氧化钠水溶液浸泡聚酰胺至少8h，将聚酰胺取出后用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性；然后再用体积浓度为15～20％的盐酸溶液浸泡聚酰胺至少8h，取出聚酰胺后用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性，将聚酰胺灌注到第一层析柱中，在第一层析柱中加入去离子水冲洗至该第一层析柱流出液无白色浑浊为止，将步骤3)得到的M3mg干粉用30～45℃的温水均匀分散成干粉浓度为30～80mg/mL的干粉液体，将干粉液体加入第一层析柱中静态吸附30～50min，其中，灌注到第一层析柱中聚酰胺所占该第一层析柱的体积为V3mL，M3：V3＝(35-90)：1；
5)除杂质：用蒸馏水对步骤4)所得第一层析柱进行冲洗至洗脱液澄清；
6)解吸：用乙醇体积浓度为X的乙醇水溶液，以2～5mL/min的流速洗脱第一层析柱，得到第一洗脱液，将第一洗脱液蒸发至乙醇挥发，得到浓缩液体；
7)吸附：用15～20wt％的氢氧化钠水溶液浸泡大孔树脂至少8h，取出大孔树脂后再用去离子水冲洗至排出的清洗液为中性，然后用15～20wt％盐酸溶液浸泡大孔树脂至少8h，取出大孔树脂，用去离子水冲洗大孔树脂直至排出的清洗液为中性，再用无水乙醇浸泡大孔树脂至少12h，取出大孔树脂，将大孔树脂灌注在第二层析柱中，在第二层析柱中加入去离子水冲洗至流出液无白色浑浊为止，将步骤7)所得浓缩液体加入第二层析柱中静态吸附30～50min，其中，灌注到第二层析柱中大孔树脂所占该第二层析柱的体积为V4mL，V3：V4＝1：(0.75-1.25)；
8)解吸：用乙醇体积浓度为X的乙醇水溶液以2～3mL/min的流速对第二层析柱进行冲洗，得到第二洗脱液；
9)冷冻干燥：将步骤8)所得第二洗脱液进行蒸发，以去除其中乙醇，再冷冻干燥，得到根皮苷干粉，
其中，所述X为70～90％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述过滤通过减压抽滤实现。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，浓缩所述提取液通过旋转蒸发仪实现。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤5)中，所述蒸馏水在第一层析柱中的流速为1～2mL/min。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述步骤6)中，洗脱第一层析柱的所述乙醇水溶液的体积为该第一层析柱容积的至少6倍。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤8)中，洗脱第二层析柱的所述乙醇水溶液的体积为该第二层析柱容积的至少6倍。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步骤9)中，所述蒸发采用旋转蒸发仪，所述旋转蒸发仪中的挥发物为乙醇。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，旋转蒸发仪的温度为45～50℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的pH为7～8。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述冷冻干燥的步骤为：在-80～-70℃冷冻至少2小时，再于-50～40℃和0MPa的条件下保持至少12h。
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