CN109053479B - 一种季胺内盐的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种季胺内盐的合成方法，包括以下步骤：(a)还原反应：以具有如式I所示结构的化合物为原料，与主酶、脱氢酶、辅酶在一定pH范围和单糖中进行还原反应,活性炭除去酶，精馏制得还原产物，

X代表卤素中氯、溴、碘的一种；R代表饱和烷基或不饱和烷基中的一种；(b)季胺内盐的合成：所得产物在强碱下与三甲胺进行反应制得季胺盐酸盐，将所得季胺盐酸盐在离子交换树脂中进行交换除去卤素离子，浓缩后用醇和丙酮精制得季胺内盐。本发明各步收率高、操作简单、反应条件温和、用高选择性的酶催化方法引入手性结构，有效除去酶残留，再用可再生的树脂除盐，避免了高毒高污染试剂，得到高纯度产物及适合工业化生产等的优点。

Description

一种季胺内盐的合成方法

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及一种季胺内盐的合成方法。

背景技术

左卡尼汀(Levocarnitine)又名左旋肉毒碱。研究始于20世纪初期，1905年，俄国人Gulewitsch和Krimberg从肉类提取物中发现了左旋肉毒碱，自此以后，各国科学家进行了深入的研究，早期的研究发现左旋肉毒碱是一种类维生素营养素并将其命名为维生素Bt。20世纪80年代肉碱开始作为商品再国外上市，由于右旋肉毒碱的毒副作用，1993年起美国FDA禁止销售右旋肉毒碱和混旋肉毒碱，所以左旋肉毒碱的手性纯度必须严格控制。

左卡尼汀在国内外已经上市使用多年，左卡尼汀口服液可用于防治左卡尼汀缺乏，如慢性肾衰病人因血液透析所致的左卡尼汀缺乏；改善心肌缺血，抗心绞痛等。临床表现如心肌病、骨骼肌病(痛)、心律失常、高脂血症，以及低血压和透析中肌痉挛等；左卡尼汀注射液，适应症为适用于慢性肾衰长期血透病人因继发性肉碱缺乏产生的一系列并发症状，临床表现如心肌病、骨骼肌病、心律失常、高脂血症，以及低血压和透析中肌痉挛等。其化学名为(R)-3-Carboxy-2-hydroxy-N,N,N-trimethyl-1-propanaminium inner salt；结构式如下所示：

绿色化学是一门涉及有机合成、催化、生物化学、分析化学等学科，内容广泛。绿色化学倡导用化学的技术和方法减少或停止那些对人类健康、社区安全、生态环境有害的原料、催化剂、溶剂和试剂、产物、副产物等的使用与产生。绿色化学的定义是在不断地发展和变化的。刚出现时，它更多的是代表一种理念、一种愿望。但随着学科发展.它本身在不断的发展变化中逐步趋于实际应用，且其发展与化学密切相关。绿色化学倡导人、原美国绿色化学研究所所长、耶鲁大学教授P.T.Anastas教授在1992年提出的“绿色化学”定义是：Chemical products and processes that reduce or eliminate the use andgeneration of hazardous substancese.即“减少或消除危险物质的使用和产生的化学品和过程的设计”。从这个定义上看，绿色化学的基础是化学，而其应用和实施则更像是化工。绿色化学所涉及的内容越来越广。世界上很多国家已把“化学的绿色化”作为新世纪化学进展的主要方向之一

左卡尼汀的制备工艺可归纳为四大方法，具体阐述如下：

一类方法：消旋体拆分法

以氯代环氧丙烷为起始原料，经季胺化、氰基化、碱解、手性拆分、去离子化得到左卡尼汀，如Fig.1所示。Lorenz等发明的专利us3151149拆分剂有D-(+)-樟脑磺酸、二苯甲酰-D-酒石酸；Takenaka等发明的专利JP59231048拆分剂是(-)-扁桃酸；CN106748843提供了以环氧氯丙烷为起始物料，经胺化、氰化、在脂肪酶CALB作用下酯交换成相应的手性酯.

这类反应的起始原料氯代环氧丙烷是基因毒性杂质，且氰化钠是剧毒化合物，而且拆分收益小，有一半以上的副产物右旋肉毒碱；总体上，该类反应引入大量剧毒物质，三废大，已不适合现代药物合成的理念。

二类方法：手性原料化学合成法

以(R)-羟基-γ-丁内酯为起始原料，经硫磺酸酯化、季胺化、碱解、去离子化得到左卡尼汀，如Fig.2所示。McCarthy J.R等发明的专利us5473104S所述，ee值达到95％以上；Byun.I.S等发明的专利WO1999/005092收率达到55％.

这类反应避免了剧毒试剂，收率较一类方法高，但是磺酸等副产物处理的三废量大，起始原料(R)-羟基-γ-丁内酯价格相对昂贵，在手性纯度上要多次结晶才能达到EP药典要求；总体上，该类反应还是比较有工业前景的。

三类方法：不对称氢化还原法

以4-氯乙酰乙酸乙酯为起始原料，以Ru(OCOCH₃)₂((-)-BINAP)为催化剂，在100℃、9.8MPa下不对称氢化还原、季胺化、碱解、去离子化得到左卡尼汀，如Fig.3所示。Noyori R等发明的专利EP0339764和CN104030934所述.

这类反应需要高温高压条件及高压设备，局限了工业化生产，且手性纯度和催化剂密切相关；总体上，该类反应工业化条件苛刻，大批量生产有待考察。

四类方法：生物酶法

以4-氯乙酰乙酸乙酯为起始原料，生物酶催化、季胺化、碱解、去离子化得到左卡尼汀，如Fig.4所示。CN106947752所述，该生物酶为SEQID NO：2所示的氨基酸序列；所述生物酶的制备包含以下步骤：利用基因工程的手段将全基因合成的生物酶基因片段SEQIDNO：1克隆到高效表达载体中，构建了产左旋肉碱合成酶的基因工程菌株。

这类反应工艺简短，产物手性纯度高，转化率高，转化时间较短、反应条件友好，容易操作等优点，但该生物酶制备工艺复杂，酶制备条件较为苛刻；同时也未提供酶的除去和控制，酶的高效活性增加了药用风险，底物局限于4-氯乙酰乙酸乙酯，同时pH范围窄；总体上，该类反应具有较好的工业化前景。

发明内容

为了解决左卡尼汀规模化生产的需求，提倡绿色化学应用，避免使用高毒，高腐蚀试剂，同时满足高纯度原料，低污染，安全用药，广泛的适用的需求；本发明的目的在于提供一种制备高手性纯度季胺内盐的绿色化学合成方法，本发明特点有各步收率高、操作简单、反应条件温和、无高毒高腐蚀试剂、原料易得，所涉及的生物酶都是常规易得，适用范围广，且有明确的除去方法和检测标准，多种起始原料都可适用于生产要求，采用搪瓷釜搅拌代替操作繁琐的离子交换柱，离子交换树脂可回收再利用，得到产物手性纯度高，适用于药物工业化生产的优点。

1、一种季胺内盐的合成方法，包括以下步骤：

1)将

进行还原反应获得

2)将

与三甲胺发生季胺化反应获得

3)将

除去卤素离获得

进一步说明，步骤1)中所述原料式I中X代表卤素中氯、溴、碘中的一种；R代表饱和烷基或不饱和烷基中的一种。

进一步说明，步骤1)中原料式I包括4-氯乙酰乙酸乙酯，4-氯乙酰乙酸甲酯，4-氯乙酰乙酸丙酯，4-氯乙酰乙酸乙酯丁酯，4-氯乙酰乙酸异丙酯，4-溴乙酰乙酸乙酯，4-溴乙酰乙酸甲酯，4-溴乙酰乙酸丙酯，4-溴乙酰乙酸乙酯丁酯，4-溴乙酰乙酸异丙酯，4-碘乙酰乙酸乙酯，4-碘乙酰乙酸甲酯，

4-碘乙酰乙酸丙酯，4-碘乙酰乙酸乙酯丁酯，4-碘乙酰乙酸异丙酯中的一种。

进一步说明，步骤1)中的还原反应的过程为将原料溶解于溶剂中，在该溶液中添加主酶、辅酶、脱氢酶和单糖进行还原反应至产物式Ⅱ。

进一步说明，步骤1)中的溶剂为水或甲苯水溶液中的一种。

进一步说明，步骤1)中添加的主酶为1.0％～2.0％乙醇脱氢酶、辅酶为0.1％～0.5％葡糖脱氢酶和0.5％～5.0％脱氢酶，以上百分比为各组分占还原反应中总物料的质量百分比。

进一步说明，步骤1)中的单糖为葡萄糖、果糖或半乳糖中的一种。

进一步说明，步骤1)中的还原反应所获得的产物，要用除酶试剂进行精馏纯化。

进一步说明，步骤1)中所述除酶试剂为硅藻土或活性炭中的一种。

进一步说明，步骤2)中的季胺化反应温度为-20～60℃。

本发明的有益效果：

1、主酶、辅酶、脱氢酶是常见易得的生物酶，适用于多种起始原料。纯化酶是利用硅藻土吸附酶，利用精馏手段提取低沸点产物，并分离残留的酶和杂质。

2、得到产物手性纯度高且收率高。

3、操作简单、反应条件温和、无高毒高腐蚀试剂，离子交换树脂可回收再利用。

4、适合药物工业化生产的优点。

附图说明

图1实施例11中(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的核磁图谱

氢谱：1.2(m,3H，-CH₃)；2.6(m,2H，-CH₂)；3.1(S,1H，-OH)；3.5(m,2H，-CH2)；4.1(m,2H，-CH₂)；4.2(m,1H，-CH)

图2实施例12左卡尼汀的有关物质检测结果整体图，依据EP药典8.0检测方法

图3实施例12左卡尼汀的有关物质检测结果局部放大图，依据EP药典8.0检测方法

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照本文或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

通过下面的技术方案，对发明内容做进一步的说明

参照下式，在下列实施例中，本发明按以下反应式进行左卡尼汀的制备：

式Ⅰ、II、III中，X代表卤素中氯、溴、碘的一种；R代表饱和烷基或不饱和烷基中的一种；单糖代表葡萄糖、果糖、半乳糖中的一种；强碱为氢氧化钠、氢氧化钾的一种。

一种制备高手性纯度季胺内盐的绿色化学合成方法，其特征是包括以下步骤：

(a)还原反应：以具有如式Ⅰ所示结构的化合物为原料，与主酶、辅酶、脱氢酶、单糖进行还原反应制得还原产物，

式Ⅰ中，X代表卤素中氯、溴、碘的一种；R代表饱和烷基或不饱和烷基中的一种；

(b)季胺化反应：步骤(a)所得还原产物与三甲胺在强碱存在下进行季胺化反应制得左卡尼汀盐酸盐；在搪瓷釜中与离子交换树脂进行除盐，再用醇和丙酮精制得左卡尼汀。

在步骤(a)中，所述的原料为4-氯乙酰乙酸乙酯，4-氯乙酰乙酸甲酯，4-氯乙酰乙酸丙酯，4-氯乙酰乙酸乙酯丁酯，4-氯乙酰乙酸异丙酯，4-溴乙酰乙酸乙酯，4-溴乙酰乙酸甲酯，4-溴乙酰乙酸丙酯，4-溴乙酰乙酸乙酯丁酯，4-溴乙酰乙酸异丙酯，4-碘乙酰乙酸乙酯，4-碘乙酰乙酸甲酯，4-碘乙酰乙酸丙酯，4-碘乙酰乙酸乙酯丁酯，4-碘乙酰乙酸异丙酯中的一种。

在步骤(a)中，所述的主酶为乙醇脱氢酶(简称ADH，cas：9031-72-5)，辅酶为葡糖脱氢酶(简称NADP+，cas：37250-84-3)，脱氢酶为(简称NAD，cas：53-84-9)；所述的单糖为葡萄糖、果糖、半乳糖的一种，优选作为葡萄糖或果糖做为反应试剂；所述的反应溶剂为水，甲苯和水的混合物的一种，优选甲苯和水的混合物作为反应溶剂；所述的主酶为起始物料的1.0％～2.0％质量，辅酶为起始物料的0.1％～0.5％质量，脱氢酶为起始物料的0.5％～5.0％质量；所述的pH范围为5.5～7.5。

在步骤(b)中，所述的强碱为氢氧化钠、氢氧化钾一种。

在步骤(b)中，所述的反应温度为-20℃至60℃，优选-5℃～5℃。

在步骤(b)中，所述的交换树脂是为IR-120H型。

在步骤(b)中，所述的离子交换设备是搪瓷釜。

进一步具体指出反应的步骤如下：

(1)还原反应：将式I和0.1MPBS缓冲液加入甲苯和单糖糖。搅拌并调节混合溶液pH值5.5～7.5，将主酶，辅酶和脱氢酶加入反应体系中反应。加入硅藻土和甲苯，过滤。有机相用氯化钠水溶液洗涤后，浓缩得式II；

(2)季胺化反应：将步骤(1)所得产物的乙醇溶液加入强碱水溶液和三甲胺水溶液至0±5℃搅拌反应，混合物减压蒸馏至无馏分得到油状物，加入去离子水和IR-120H离子交换树脂。在搪瓷釜中搅拌。过滤回收交换树脂，母液浓缩得油状物，再用乙醇、丙酮精制，过滤，滤饼减压干燥得到左卡尼汀。

实施例1：(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备

将15.0g4-氯乙酰乙酸乙酯和150mL0.1MPBS缓冲液、30.0g葡萄糖。室温下搅拌调节pH值5.8，将0.2g主酶，0.02g辅酶和0.7g脱氢酶一次性的加入反应体系中，反应至完全。加入1g硅藻土、150ml甲苯，搅拌，过滤。滤液用10wt％氯化钠水溶液洗涤后，有机层浓缩得到13.5g棕黄色液体，即(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。按WOOD法未检出活性酶。

实施例2：左卡尼汀的制备

将13.0g(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯加入6g氢氧化钠的水溶液和27g三甲胺水溶液加入反应瓶中，搅拌，冷却至0±5℃。反应完全将反应混合物减压蒸馏至无馏分得到油状物，加入100mL去离子水，130gR-120H离子交换树脂在500ml反应瓶中搅拌。过滤，母液浓缩得油状物，用150mL(乙醇/丙酮＝1/2，体积比)的溶剂精制，过滤，滤饼在45℃减压干燥。得到8.9g左卡尼汀内盐(ee％为99.87％，含量为98.2％，以EP药典检测方法为准)。按WOOD法未检出活性酶。

实施例3：(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸异丙酯的制备

将15.0g 4-氯乙酰乙酸异丙酯和150mL 0.1M PBS缓冲液、25.0g果糖。室温下搅拌调节pH值7.2，将0.3g主酶，0.02g辅酶和0.5g脱氢酶一次性的加入反应体系中，反应至完全。加入1.2g硅藻土、150ml甲苯，搅拌，过滤。滤液用10wt％氯化钠水溶液洗涤后，有机层浓缩得到14.3g棕黄色液体，即(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸异丙酯。按WOOD法未检出活性酶。

实施例4：左卡尼汀的制备

将14.0g(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸异丙酯加入6.5g氢氧化钠的水溶液和31g三甲胺水溶液加入反应瓶中，搅拌，冷却至0±5℃。反应完全将反应混合物减压蒸馏至无馏分得到油状物，加入120mL去离子水，140g R-120H离子交换树脂在500ml反应瓶中搅拌。过滤，母液浓缩得油状物，用130mL(乙醇/丙酮＝1/2，体积比)的溶剂精制，过滤，滤饼在45℃减压干燥。得到9.2g左卡尼汀内盐(ee％为99.74％，含量为97.8％，以EP药典检测方法为准)。按WOOD法未检出活性酶。

实施例5：(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯的制备

将12.5g 4-氯乙酰乙酸甲酯和125mL 0.1M PBS缓冲液、15.0g葡萄糖。室温下搅拌调节pH值6.7，将0.15g主酶，0.01g辅酶和0.5g脱氢酶一次性的加入反应体系中，反应至完全。加入0.8g硅藻土、150ml甲苯，搅拌，过滤。滤液用10wt％氯化钠水溶液洗涤后，有机层浓缩得到10.4g棕黄色液体，即(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯。按WOOD法未检出活性酶。

实施例6：左卡尼汀的制备

将9.5g(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸甲酯加入3g氢氧化钾的水溶液和21g三甲胺水溶液加入反应瓶中，搅拌，冷却至0±5℃。反应完全将反应混合物减压蒸馏至无馏分得到油状物，加入100mL去离子水，90g R-120H离子交换树脂在500ml反应瓶中搅拌。过滤，母液浓缩得油状物，用80mL(乙醇/丙酮＝1/2，体积比)的溶剂精制，过滤，滤饼在45℃减压干燥。得到8.2g左卡尼汀内盐(ee％为99.52％，含量为98.7％，以EP药典检测方法为准)。

实施例7：(R)-(+)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯的制备

将19.5g 4-溴乙酰乙酸乙酯和200mL 0.1M PBS缓冲液、15.0g葡萄糖。室温下搅拌调节pH值5.5～7.5，将0.4g主酶，0.02g辅酶和0.2g脱氢酶一次性的加入反应体系中，反应至完全。加入2.0g硅藻土、200ml甲苯，搅拌，过滤。滤液用10wt％氯化钠水溶液洗涤后，有机层浓缩得到16.1g棕黄色液体，即(R)-(+)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯。按WOOD法未检出活性酶。

实施例8：左卡尼汀的制备

将15.0g(R)-(+)-4-溴-3-羟基丁酸乙酯加入4.2g氢氧化钾的水溶液和15.9g三甲胺水溶液加入反应瓶中，搅拌，冷却至0±5℃。反应完全将反应混合物减压蒸馏至无馏分得到油状物，加入150mL去离子水，140g R-120H离子交换树脂在500ml反应瓶中搅拌。过滤，母液浓缩得油状物，用120mL(乙醇/丙酮＝1/2，体积比)的溶剂精制，过滤，滤饼在45℃减压干燥。得到10.0g左卡尼汀内盐(ee％为99.64％，含量为98.3％，以EP药典检测方法为准)。

实施例9：(R)-(+)-4-碘-3-羟基丁酸丁酯的制备

将28.4g 4-碘乙酰乙酸丁酯和200mL 0.1M PBS缓冲液、25.0g葡萄糖。室温下搅拌调节pH值5.5～7.5，将0.3g主酶，0.02g辅酶和1.2g脱氢酶一次性的加入反应体系中，反应至完全。加入2.0g硅藻土、500ml甲苯，搅拌，过滤。滤液用10wt％氯化钠水溶液洗涤后，有机层浓缩得到27.3g棕黄色液体，即(R)-(+)-4-碘-3-羟基丁酸丁酯。按WOOD法未检出活性酶。

实施例10：左卡尼汀的制备

将27.0g(R)-(+)-4-溴-3-羟基丁酸丁酯加入5.0g氢氧化钠的水溶液和28.0g三甲胺水溶液加入反应瓶中，搅拌，冷却至0±5℃。反应完全将反应混合物减压蒸馏至无馏分得到油状物，加入250mL去离子水，280g R-120H离子交换树脂在1000ml反应瓶中搅拌。过滤，母液浓缩得油状物，用240mL(乙醇/丙酮＝1/2，体积比)的溶剂精制，过滤，滤饼在60℃减压干燥。得到11.8g左卡尼汀内盐(ee％为99.80％，含量为99.0％，以EP药典检测方法为准)。

实施例11：(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的工业化生产

将35.0kg4-氯乙酰乙酸乙酯和150L 0.1M PBS缓冲液加入500L搪瓷釜中，加入10L甲苯和58.0kg葡萄糖。在室温下搅拌并调节混合溶液pH值6.50，将0.5kg主酶，0.3kg脱氢酶和0.2kg脱氢酶加入反应体系中，反应结束时加入硅藻土5kg和140L甲苯搅拌30分钟，过滤。有机相用200L氯化钠水溶液洗涤后，有机层在50℃下浓缩至无液体流出，转为常压精馏，收集沸点93～95℃棕黄色液体得到34.8kg。(即(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；摩尔收率94.6％；含量98.0％；ee％为99.86％)按WOOD法未检出活性酶。

实施例12：左卡尼汀的工业化生产

将335kg氢氧化钠水溶液和46.0kg三甲胺水溶液加入1000L搪瓷釜中，加入34.8kg(R)-(+)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，在0±5℃搅拌反应，混合物在减压蒸馏至无馏分得到油状物，加入130L去离子水、400L IR-120H离子交换树脂装入1000L搪瓷釜中，搅拌至氯离子检测＜0.2％。过滤，回收离子交换树脂，浓缩母液得油状物。用670L(乙醇/丙酮＝1/2，体积比)的溶剂精制，离心，滤饼在50℃减压干燥。得到28.0kg左卡尼汀内盐。(摩尔收率88.7％；含量99.8％；ee％为99.85％；按WOOD法未检出活性酶)。

表一左卡尼汀的主要检测结果

表二实施例12左卡尼汀有关物质检测结果

信号：VWD1A,波长＝205nm

组份名称	出峰时间	宽	面积	峰高	面积％
						1	7.028分钟	0.152	3.322	0.365	0.050
2	7.398分钟	0.168	3.327	0.330	0.050
						3	11.778分钟	0.079	0.825	0.173	0.012
4	14.403分钟	0.443	6600.615	194.098	99.787
						5	17.273分钟	0.495	6.596	0.222	0.100

Claims (4)

1.一种季胺内盐的合成方法，包括以下步骤：

1)将

进行还原反应获得

2)将

与三甲胺发生季胺化反应获得

3)将

除去卤素离获得

步骤1)中原料式I选自4-氯乙酰乙酸甲酯，4-氯乙酰乙酸丙酯，4-氯乙酰乙酸异丙酯，4-溴乙酰乙酸乙酯，4-溴乙酰乙酸甲酯，4-溴乙酰乙酸丙酯，4-溴乙酰乙酸异丙酯，4-碘乙酰乙酸乙酯，4-碘乙酰乙酸甲酯，4-碘乙酰乙酸丙酯，4-碘乙酰乙酸异丙酯中的一种；

步骤1)中的还原反应过程为将原料溶解于溶剂中，在该溶液中添加主酶、辅酶、脱氢酶和单糖进行还原反应至产物式Ⅱ；

步骤1)中的溶剂为水或甲苯水溶液中的一种；

步骤1)中添加的主酶为1.0％～2.0％乙醇脱氢酶、辅酶为0.1％～0.5％葡糖脱氢酶和0.5％～5.0％脱氢酶，以上百分比为各组分占还原反应中总物料的质量百分比；

步骤1)中的单糖为葡萄糖、果糖或半乳糖中的一种。

2.根据权利要求1所述季胺内盐的合成方法，其特征在于，步骤1)中的还原反应所获得的产物，要用除酶试剂进行精馏纯化。

3.根据权利要求2所述季胺内盐的合成方法，其特征在于，步骤1)中所述除酶试剂为硅藻土或活性炭中的一种。

4.根据权利要求1所述季胺内盐的合成方法，其特征在于，步骤2)中的季胺化反应温度为-20～60℃。

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