CN108774204A - 3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素及其应用 - Google Patents
3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了3,3′‑(3,5二氟苯亚甲基)‑双‑4‑羟基香豆素及其应用。本发明制备了3,3′‑(3,4‑二氯苯亚甲基)‑双‑4‑羟基香豆素并发现其具有良好的体外和体内活性,对于白血病肿瘤细胞具有较强的抑制作用,且该化合物毒性较小,安全性好。
Description
技术领域
本发明涉及3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素用于制备抗白血病药物的应用。
背景技术
白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞增殖失控、分化障碍和凋亡受阻,停滞在细胞发育的不同阶段,抑制了正常造血功能。近年来,我国白血病的患病率为2.76/10万,在恶性肿瘤死亡率中,白血病在男性和女性中分别居第6位和第8位,在儿童及35岁以下成人中居第l位。临床上治疗白血病的首选药物为伊马替尼和尼洛替尼,是酪氨酸激酶抑制剂。然而该类药物只针对15-20%的费城染色体阳性Bcr-Abl融合基因的白血病患者疗效较好,其耐药问题也给临床治疗带来了严峻挑战。
发明内容
本发明的3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素化学结构如式Ⅰ所示。发明人研究意外发现3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素具有抗白血病的活性,基于该发现,本发明提供了3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素用于制备抗白血病药物的应用。
相对于现有技术,本发明属于意外发现,所发现的3,3′-(3,4-二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素具有良好的体外和体内抗白血病活性,且该化合物毒性较小,安全性好。
附图说明
图1为50μg/ml 3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素(化合物2)处理K562细胞12和24小时后杀死肿瘤细胞的形态图;
图2化合物2对K562细胞增殖的抑制作用分析结果;
图3为不同浓度化合物2处理K562细胞24小时后的流式细胞图;
图4为不同浓度化合物2处理K562细胞24小时后对细胞凋亡影响的分析结果;
图5为50μg/ml化合物2处理K562细胞24小时后诱导细胞凋亡的透射电镜图;
图6不同浓度化合物2诱导慢性粒细胞白血病动物骨髓细胞凋亡的结果;A为慢性粒细胞白血病模型小鼠的骨髓细胞收集示意图;B为化合物2对细胞凋亡影响的流式细胞检测图;C为化合物2诱导白血病模型小鼠和正常对照小鼠骨髓细胞凋亡的结果分析;
图7化合物2与伊马替尼联合给药诱导白血病模型动物骨髓细胞凋亡的流式细胞图;
图8化合物2与伊马替尼联合给药诱导白血病模型动物骨髓细胞凋亡的分析结果;
图9化合物2与伊马替尼单独或联合给药后白血病模型动物生存曲线图。
具体实施方式
以下是发明人提供的具体实施例,以对本发明的技术方案做进一步解释说明。
实施例1:本发明的化合物的合成路线及方法
R=H、3,5-2F、3,5-2Cl、3,5-2Br、3,5-2OCH3或3,4-2CF3。
合成方法:
将20mmol 4-羟基香豆素和100mL无水乙醇混合后加热至4-羟基香豆素溶解后,加入10mmol系列含有不同取代基芳香醛类(化合物R=H的合成方法没有该步骤),加热回流,有白色固体颗粒析出,继续加热,待反应结束,冷却、抽滤,再用乙醇重结晶,最终得纯白色颗粒状结晶。
实施例2:结构鉴定
利用核磁共振波谱(NMR)对上述合成的系列4-羟基香豆素化合物进行分子量、结构和纯度等鉴定。
化合物1:
3,3′-苯亚甲基-双-4-羟基香豆素
3,3′-Benzylidene-bis-(4-hydroxycoumarin)
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):11.528(s,1H),11.299(s,1H),7.994-8.080(q,2H),7.606-7.649(m,2H),7.215-7.421(m,9H),6.104(s,1H).
化合物2:
3,3′-(3,5-二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素
3,3′-(3,5-Difluorobenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):11.666(s,1H),11.323(s,1H),8.033-8.109(q,2H),7.660-7.701(m,2H),7.427-7.462(t,4H),6.731-6.790(m,3H),6.051(s,1H).
化合物3:
3,3′-(3,5-二氯苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素
3,3′-(3,5-Dichlorobenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):11.630(s,1H),11.314(s,1H),8.042-8.114(m,2H),7.666-7.705(q,2H),7.432-7.468(t,4H),7.307-7.309(d,1H),7.106-7.113(t,2H),6.036(s,1H).
化合物4:
3,3′-(3,5-二溴苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素
3,3′-(3,5-Dibromobenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):11.616(s,1H),11.306(s,1H),8.042-8.111(q,2H),7.666-7.705(t,2H),7.608(s,1H),7.411-7.467(q,4H),7.294(s,2H),6.049(s,1H).
化合物5:
3,3′-(3,5-二甲氧基苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素
3,3′-(3,5-Dimethoxybenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):11.645(s,1H),11.269(s,1H),8.027-8.090(m,2H),7.628-7.671(m,2H),7.417-7.438(d,4H),6.393(s,3H),6.060(s,1H),3.743(s,6H).
化合物6:
3,3′-(3,5-二氟甲基苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素
3,3′-(3,5-Dimethoxybenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)
1H NMR(CDCl3,δ,ppm):11.645(s,1H),11.269(s,1H),8.027-8.090(m,2H),7.628-7.671(m,2H),7.417-7.438(d,4H),6.393(s,3H),6.060(s,1H),3.743(s,6H).
本发明以下实施例用细胞株、实验动物、试剂与耗材说明:
用于本实验的人慢性粒细胞白血病K562细胞株和人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞株由空军军医大学西京医院输血科和空军军医大学药学系药理学教研室保存。Tall-tTA以及Tet0-BCR/ABL1转基因小鼠由空军军医大学基础医学部遗传发育教研室保存。
细胞培养相关试剂:RPMI-1640培养基、MEM培养基,1×磷酸盐缓冲液(1×PBS)购自美国Corning公司;胎牛血清和0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司。
细胞增殖和凋亡检测主要试剂:MTT、磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)、三氯乙酸(TCA)、Tris-Base购自美国Sigma公司;冰乙酸购自北京化工厂。Annexin V-FITC/PI检测试剂盒购自南京凯基公司。
4-羟基香豆素化合物溶液配制:称量上述6种化合物10mg,加入1ml DMSO,涡旋震荡使其溶解,即为10mg/ml浓度溶液。过滤除菌后,置于-80°保存,使用时根据实验设计进行稀释。
实施例3:化合物1-6对人慢性髓系白血病细胞K562细胞和人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞增殖的抑制率
(1)采用MTT法检测化合物1-6对人慢性髓系白血病细胞K562细胞和人脐静脉内皮细胞HUVECs细胞增殖的抑制率,将K562细胞和HUVECs细胞培养至80%融合时进行传代,以2.0×105个/mL密度接种于96孔培养板中,于5%CO2、37℃孵箱培养过夜。弃上清,用含2%胎牛血清的RPMI-1640和MEM分别稀释实施例1得到的6种化合物,每孔分别加入上述化合物至终浓度为1、2、4、8、16、32、64、128、256μg/ml,设三个重复孔,并设置空白孔。MTT法检测24小时细胞存活率。细胞存活率=(A给药-A空白)/(A对照-A空白)。实验重复3次。根据细胞存活率计算化合物对K%^2细胞和HUVECs细胞的IC50值。
(2)结果说明
MTT实验结果显示,化合物1-6对K562细胞增殖具有明显的抑制作用,对K562的IC50分别为28.53μg/ml、39.01μg/ml、24.98μg/ml、35.26μg/ml、23.53μg/ml和27.82μg/ml。为了观察研究化合物的细胞毒性,发明人同时分析了化合物对HUVECs细胞增殖的抑制作用,化合物1、3、4、5、6对HUVECs细胞的IC50分别为71.25μg/ml、49.15μg/ml、98.15μg/ml、52.52μg/ml、56.89μg/ml,而化合物2对HUVECs细胞增殖的影响较小,IC50为450.37μg/ml(表1)。因此,化合物2对白血病有较好的体外抗肿瘤作用,同时对正常的哺乳细胞毒性小。
表1 6种4-羟基香豆素化合物处理K562细胞株和HUVECs细胞株24小时后的IC50值
实施例4:4-羟基香豆素化合物对白血病K562细胞的凋亡率和4-羟基香豆素化合物对白血病K562细胞的影响
(1)采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测4-羟基香豆素化合物对白血病K562细胞的凋亡率,根据上述IC50值,将化合物2浓度设置成50、100和200μg/ml,设三个重复孔,并设置空白孔。K562细胞用PBS洗涤后加入500μl Binding Buffer悬浮细胞,加入5μlAnnexin V-FITC混匀,随后再加入5μl PI,设置空白对照组和单色对照组。室温避光反应15分钟,使用流式细胞仪检测化合物对K562细胞凋亡的影响。
(2)采用透射电镜观察4-羟基香豆素化合物对白血病K562细胞的影响,离心收集空白对照和化合物2处理K562细胞(密度约5×106),用PBS洗涤两次后,弃上清,加1ml2.5%戊二醛悬浮细胞,移入1.5ml Ep管中,室温下4 000r/min离心15min,固定细胞0.5-1小时;在磷酸缓冲液里漂洗1-2小时,将戊二醛冼净,用1%的锇酸固定液固定1小时;固定完毕后加入50%乙醇脱水10分钟,70%乙醇10分钟,90%乙醇10分钟,90%丙酮10分钟,100%丙酮三次各10分钟;丙酮与环氧树脂1:1包埋2小时,再放入纯包埋剂(环氧树脂包埋全浸透)过夜;环氧树脂包埋,62℃烤箱二天,进行超薄切片,用醋酸铅铀双染法进行切片染色;在透射电子显微镜下观察细胞形态、细胞质及细胞核的变化,照相并记录实验结果。
(3)结果说明
用50μg/ml化合物2处理K562细胞12和24小时后,在光镜下观察到化合物2能够明显杀死白血病K562细胞(图1),化合物2抗白血病具有时间依赖性。与此同时,随着浓度的增加,化合物2对K562细胞增殖的抑制率明显增强,呈浓度依赖性(图2)。
流式细胞术检测结果显示(图3),随着化合物2浓度的升高(50μg/ml,100μg/ml和200μg/ml),K562凋亡细胞比例逐渐增加,和DMSO处理对照组相比较,具有统计学差异(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)(图2)。透射电镜结果显示(图4),与空白对照组细胞(control)相比,100μg/ml化合物2处理的K562细胞(compound 2)染色质固缩并凝结成块,聚集在核膜周边呈新月状或环状小体,细胞浆浓缩,内质网变疏松并与胞膜融合,形成一个个空泡,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(箭头所示)。坏死细胞的染色质稀疏呈细颗粒状,分布无规律,边界不清,细胞浆肿胀,细胞器结构破坏,细胞膜不完整。
实施例5:4-羟基香豆素化合物对白血病模型动物的治疗作用
(1)白血病模型动物的制备:建立能由Tet-off调控的慢性髓系白血病(chronicmyeloid leukemia,CML)动物模型,利用在骨髓干/祖细胞上表达四环素调控转录激活蛋白(tetracycline-controlled transactivator protein,tTA)的Tall-tTA转基因小鼠,以及四环素反应原件(tetracycline-responsive element,TRE)调控BCR/ABL表达的Tet0-BCR/ABL1转基因小鼠,将以上两种小鼠交配后获得的SCL-tTA/BCR-ABL双转基因小鼠。在此基础上,进一步通过Tel-off诱导表达系统成功诱导其BCR-ABL的表达,建立与人类慢性髓系白血病慢性期的疾病模型。
(2)模型动物骨髓细胞的提取分离:脱臼处死小鼠,投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟,游离小鼠的下肢,取下胫骨和股骨,并放到装有75%酒精的培养皿中;用20ml的注射器吸取已配好的1640培养液,插入骨髓(bone marrow,BM)腔,对准一个无菌50ml离心管,将细胞冲出;将骨髓细胞冲出后,4300rpm离心5分钟,去上清;加3-4ml的红细胞裂解液静置3-4分钟,加入30-40ml无菌的PBS(按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS);将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中;4300rpm离心5min,弃上清,得到骨髓细胞沉淀。
(3)化合物2和伊马替尼给药方法:在上述离体培养的模型动物骨髓细胞,分别或联合给予不同浓度(50,100,200μg/ml)化合物2以及伊马替尼,观察药物诱导细胞凋亡的作用;在慢性粒细胞白血病模型小鼠,腹腔灌胃给予化合物2(100mg/kg)或伊马替尼(50mg/kg),以及两者联合给药,连续观察三周,记录空白对照组、伊马替尼给药组、化合物2给药组以及联合给药组的小鼠生存率。
(4)结果说明:
在收集慢性粒细胞白血病模型小鼠的骨髓细胞后(图6A),利用流式细胞术分析化合物2诱导细胞凋亡的作用(图6B),结果显示,100μg/ml和200μg/ml的化合物2能明显诱导模型小鼠骨髓细胞凋亡(*p<0.05)。与此相比,化合物2对正常对照小鼠骨髓细胞没有诱导细胞凋亡作用,化合物2处理组和正常对照组相比较有统计学差异(**p<0.01)(图6C)。为了进一步观察化合物2和伊马替尼联合使用诱导白血病模型小鼠骨髓细胞凋亡的情况,流式细胞术结果显示(图7),50、100和200μg/ml化合物2与伊马替尼联合使用后也能明显诱导细胞凋亡,但与化合物2单独给药组相比没有统计学差异(图8)。
为了观察化合物2及与伊马替尼联合用药对白血病模型小鼠的治疗作用,我们将模型动物分为空白对照组(control),伊马替尼组(IM),化合物2给药组(compound 2),伊马替尼与化合物2联合给药组(IM+compound 2),每组8只小鼠。连续给药3周后,空白对照组小鼠生存率为25%,伊马替尼组小鼠生存率为50%,伊马替尼与化合物2联合给药组小鼠生存率为75%,而化合物2单独给药组小鼠全部存活(图9)。上述结果显示化合物2对慢性白血病动物模型有很好的治疗作用,但与伊马替尼联合使用时并不存在协同作用。
Claims (2)
1.3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素化合物,该化合物的结构式如式Ⅰ所示:
2.3,3′-(3,5二氟苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素用于制备抗白血病药物的应用。
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