CN108659073B - 一种从镰形棘豆中制备oxytroflavoside六种化合物的方法及其用途 - Google Patents
一种从镰形棘豆中制备oxytroflavoside六种化合物的方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种从镰形棘豆中制备Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G的方法，包括以下步骤：(1)提取：取镰形棘豆粉碎，用乙醇提取得提取液，回收乙醇即得粗提取液；(2)除杂：取上述粗提取液，用陶瓷膜过滤后用大孔树脂柱分离，依次用40％乙醇溶液，60％乙醇溶液进行洗脱，收集60％乙醇洗脱液，回收乙醇后得粗提物；(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用C18色谱柱进行梯度洗脱后即得Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4四个组分；(4)二维分离制备：分别将步骤(3)所得4个组分用C18色谱柱洗脱，即得Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G。本发明的方法操作简便、得到的产物纯度高，具有广阔的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种从镰形棘豆中制备oxytroflavoside六种化合物的方法及其用途。
背景技术
镰形棘豆(Oxytropis falcate Bunge)是豆科棘豆属的一种药用植物，多年生草本，广泛分布于我国西藏、青海、甘肃南部、四川西部及新疆海拔2700-4 300m的海滩、沙地、山坡、沟谷、草甸，资源丰富，藏药称“莪大夏”、“达夏”，具有清热解毒、生肌愈疮、涩脉止血、通利大便等功效，是我国青藏高原常用的民间草药之一。
镰形棘豆中主要含有生物碱、黄酮类等化合物，其中黄酮类成分具有抗菌、抗氧化自由基、抗肿瘤、止咳等活性。目前已分离得到的黄酮类化合物多达二十余种，主要以黄酮苷、黄酮及二氢黄酮、黄酮醇、查耳酮、氢查耳酮、异黄烷及黄烷酮等形式存在。
Wang等人(Wang S S,Zhang X J,Que S,et al.3-Hydroxy-3-methylglutarylflavonol glycosides from Oxytropis falcata.[J].Journal of Natural Products,2012,75(7):1359-1364)首次从镰形棘豆中提取出7种黄酮醇衍生物：Oxytroflavoside A、B、C、D、E、F、G，然而提取方法却复杂繁琐，而且分离方法采用常规的硅胶柱层析方法，周期长，重复性差，而且对环境有很大的影响。
因此，现在仅需一种高效、简便的同时制备oxytroflavoside A、B、C、D、F、G的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的镰形棘豆oxytroflavoside A、B、C、D、F、G的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取：取镰形棘豆粉碎，用乙醇提取得提取液，回收乙醇即得粗提取液；
(2)除杂：取上述粗提取液，用陶瓷膜过滤后用大孔树脂柱分离，依次用40％乙醇溶液，60％乙醇溶液进行洗脱，收集60％乙醇洗脱液，回收乙醇后得粗提物；
(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用C18色谱柱进行梯度洗脱后即得Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4四个组分；
洗脱条件为：流动相A为0.2％V/V乙腈溶液，流动相B为0.2％V/V的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％A；
(4)二维分离制备：分别将步骤(3)所得4个组分用C18色谱柱洗脱，即得Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G；
洗脱条件为：流动相A为0.2％V/V乙腈溶液，流动相B为0.2％V/V的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％A。
进一步地，步骤(1)中，乙醇的体积浓度为5～95％。
进一步地，步骤(1)中，镰形棘豆与乙醇的重量体积比为1:5～30kg/L。
进一步地，步骤(2)中，所述陶瓷膜的孔径为0.1μm～0.5μm。
进一步地，步骤(2)中，所述大孔树脂柱的型号为AB-8或D101。
进一步地，步骤(3)中，所述梯度洗脱的流速为10ml/min。
进一步地，步骤(3)中，所梯度洗脱的检测波长为280nm。
本发明还提供了上述方法制备的Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G在制备抗炎药物中的用途。
本发明还提供了一种抗炎的药物组合物，它是以Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G中的任意一种或多种为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
进一步地，所述活性成分的浓度为30μM；所述制剂为口服制剂、注射剂、外用制剂。
实验结果表明，采用本发明的方法，可以同时制备得到了镰形棘豆Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G六种化合物，该制备方法的操作简便、得到的产物纯度高，具有广阔的市场应用前景。并且本发明的发明人意外的发现6种镰形棘豆Oxytroflavoside化合物在30μM的浓度下抗炎效果明显，为镰形棘豆的抗炎物质基础提供理论依据。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明实施例1步骤(3)中4种组分的色谱图。
图2为本发明实施例1步骤(4)中Fr.2与Fr.3二维制备色谱图，其中，A图为Fr.2的二维制备色谱图，色谱峰从左到右依次为oxytroflavoside F、A、B、C；B图为Fr.3的二维制备色谱图，色谱峰从左到右依次为oxytroflavoside A、B、C。
图3为本发明实施例1步骤(4)中6种化合物的色谱图，其中1为oxytroflavosideG，2为oxytroflavoside F，3为oxytroflavoside A，4为oxytroflavoside B，5为oxytroflavoside C，6为oxytroflavoside D。
具体实施方式
实施例1、Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G的制备
(1)提取：取2kg镰形棘豆粉碎，用60L 5％V/V的乙醇溶液提取得提取液，回收乙醇即得粗提取液。
(2)除杂：
a取上述粗提取液，用0.1μm～0.5μm的陶瓷膜过滤(压力：3MPa，流速50～500ml/min)除去细渣子、泥土等杂质后的提取液；
b取步骤a所得提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯洗涤，洗涤后的水相用AB-8大孔树脂吸附，水洗树脂柱后，先用40％的乙醇溶液洗脱除杂，再用60％的乙醇溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，回收乙醇后即得粗提物。
(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用C18色谱柱洗脱后即得Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4四个组分，所得色谱图见图1。
洗脱条件为：流动相A为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％A；流速为10ml/min，检测波长为280nm。
(4)二维分离制备：分别步骤(3)所得4个组分用XCharge C18色谱柱洗脱，即得Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G。其中，Fr.2与Fr.3二维制备色谱图见图2，6种化合物的纯度色谱图见图3。
洗脱条件为：流动相A为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％A。
通过4个组分的二维制备色谱图可知Fr.1为oxytroflavoside G，Fr.2为oxytroflavosideF、A、B、C混合物，Fr.3为oxytroflavoside A、B、C混合物，Fr.4为oxytroflavoside D。
所得Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G的结构分别如下：
实施例2、Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G的制备
(1)提取：取2kg镰形棘豆粉碎，用10L 95％V/V的乙醇溶液提取得提取液，回收乙醇即得浸膏。
(2)除杂：
a取上述浸膏，加水溶解后，用0.1μm～0.5μm的陶瓷膜过滤(压力：3MPa，流速50～500ml/min)除去细渣子、泥土等杂质后的提取液；
b取步骤a所得提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯洗涤，洗涤后的水相用D101大孔树脂吸附，水洗树脂柱后，先用40％的乙醇溶液洗脱除杂，再用60％的乙醇溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，回收乙醇后即得粗提物。
(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用C18色谱柱洗脱后即得Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4四个组分。
洗脱条件为：流动相A为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％A；流速为10ml/min，检测波长为280nm。
(4)二维分离制备：分别步骤(3)所得4个组分用XCharge C18色谱柱洗脱，即得Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G。
洗脱条件为：流动相A为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％A。
实施例3、Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G的制备
(1)提取：取2kg镰形棘豆粉碎，用40L 50％V/V的乙醇溶液提取得提取液，回收乙醇即得浸膏。
(2)除杂：
a取上述浸膏，加水溶解后，用0.1μm～0.5μm的陶瓷膜过滤(压力：3MPa，流速50～500ml/min)除去细渣子、泥土等杂质后的提取液；
b取步骤a所得提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯洗涤，洗涤后的水相用D101大孔树脂吸附，水洗树脂柱后，先用40％的乙醇溶液洗脱除杂，再用60％的乙醇溶液洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，回收乙醇后即得粗提物。
(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用C18色谱柱洗脱后即得Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4四个组分。
洗脱条件为：流动相A为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％A；流速为10ml/min，检测波长为280nm。
(4)二维分离制备：分别步骤(3)所得4个组分用XCharge C18色谱柱洗脱，即得Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G。
洗脱条件为：流动相A为体积分数为0.2％的乙腈溶液，流动相B为体积分数为0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％A。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1、本发明6种Oxytroflavoside的抗炎作用
1实验材料
小鼠巨噬细胞RAW264.7巨噬细胞株、LPS、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)检测试剂盒、前列腺素E2(PEG2)检测试剂盒(sigma公司)
本发明制备的Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G。
2实验方法
小鼠RAW246.7巨噬细胞加入含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素的RMPI1640培养基，置于含5％CO2、37℃培养箱中培养。细胞生长至70％～80％融合后进行传代，1～2d换液1次，4～6d传代1次。
实验分为8组，分别为正常组，LPS模型组和Oxytroflavoside A组(30μM)、OxytroflavosideB组(30μM)、OxytroflavosideC组(30μM)、OxytroflavosideD组(30μM)、OxytroflavosideF组(30μM)、OxytroflavosideG组(30μM)。将密度为1×106个/ml的RAW264.7细胞悬液加入6孔板内，每孔1ml，每组设6个平行孔，置于37℃、5％CO2孵箱培养。各实验组处理方法如下:①正常组，在培养基中培养；②LPS模型组，在培养基中加入浓度为1μg/ml LPS培养；③Oxytroflavoside A组、B组、C组、D组、F组、G组(30μM)，在培养基中分别加入浓度为1μg/ml LPS和30μM的Oxytroflavoside A(或OxytroflavosideB、C、D、F、G)共培养。培养24h后，收集上清液，采用ELISA法进行PEG2、TNF-α含量检测，具体方法按试剂盒说明进性。
2、实验结果
表1LPS诱导细胞PEG2含量变化
| 浓度(uM) | PEG2(pg/ml) | |
| 空白 | 1633.38 | |
| LPS | 3345.28 | |
| oxytroflavoside A | 30 | 2339.25 |
| oxytroflavoside B | 30 | 2456.12 |
| oxytroflavoside C | 30 | 2567.65 |
| oxytroflavoside D | 30 | 2395.30 |
| oxytroflavoside F | 30 | 2422.81 |
| oxytroflavoside G | 30 | 2472.49 |
表2TNF-α含量变化
从表1和表2可以看出，本发明制备的镰形棘豆Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G化合物主要通过抑制炎症因子TNF-α、PEG2等释放，直接发挥抑制作用，从而表现出抗炎作用。
综上，采用本发明的方法，可以同时制备得到了镰形棘豆Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G六种化合物，该制备方法的操作简便、得到的产物纯度高，具有广阔的市场应用前景。并且本发明的发明人意外的发现6种镰形棘豆Oxytroflavoside化合物在30μM的浓度下抗炎效果明显，为镰形棘豆的抗炎物质基础提供理论依据。
Claims (10)
1.一种从镰形棘豆中制备Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)提取：取镰形棘豆粉碎，用乙醇提取得提取液，回收乙醇即得粗提取液；
(2)除杂：取上述粗提取液，用陶瓷膜过滤后用大孔树脂柱分离，依次用40％乙醇溶液，60％乙醇溶液进行洗脱，收集60％乙醇洗脱液，回收乙醇后得粗提物；
(3)一维分离制备：取步骤(2)所得粗提物，采用C18色谱柱进行梯度洗脱后即得Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4四个组分；
洗脱条件为：流动相A为0.2％V/V乙腈溶液，流动相B为0.2％V/V的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-35min，30～45％A；
(4)二维分离制备：分别将步骤(3)所得4个组分用C18色谱柱洗脱，即得Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G；
洗脱条件为：流动相A为0.2％V/V乙腈溶液，流动相B为0.2％V/V的甲酸水溶液，梯度洗脱条件为：0-30min，34％A。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，乙醇的体积浓度为5～95％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，镰形棘豆与乙醇的重量体积比为1:5～30kg/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述陶瓷膜的孔径为0.1μm～0.5μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述大孔树脂柱的型号为AB-8或D101。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述梯度洗脱的流速为10ml/min。
7.根据权利要求1～6任一项所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所梯度洗脱的检测波长为280nm。
8.权利要求1～7任一项所述方法制备的Oxytroflavoside A、B、C、D、F或G作为唯一活性成分在制备抗炎药物中的用途。
9.一种抗炎的药物组合物，其特征在于：它是以Oxytroflavoside A、B、C、D、F、G中的任意一种为唯一活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于：所述活性成分的浓度为30μM；所述制剂为口服制剂、注射剂、外用制剂。
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