CN108602832B - 一种吡咯并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备方法及其中间体 - Google Patents
一种吡咯并[3,2-d]嘧啶类化合物的制备方法及其中间体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种制备吡咯并[3,2‑d]嘧啶类化合物（式Ⅰ化合物）的方法及相应的中间体。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体而言，本发明涉及一种吡咯并[3，2-d]嘧啶类化合物的制备方法及相应的中间体。
背景技术
Toll样受体表达于多种免疫细胞。Toll样受体识别高度保守结构基序：由微生物病原体表达的病原体相关的微生物模式(PAMP)或由坏死细胞释放的损伤相关分子模式(DAMP)。通过相应的PAMP或DAMP刺激Toll样受体引发信号级联导致转录因子如AP-1、NF-κB和干扰素调节因子(脉冲响应函数)的激活。这导致多种细胞反应，包括生产干扰素、促炎性细胞因子和效应细胞因子，从而产生免疫应答。迄今为在止哺乳动物中已发现13种Toll样受体。Toll样受体1、2、4、5和6主要表达在细胞表面上，而Toll样受体3、7、8和9表达在内体中。不同的Toll样受体可以识别不同病原体衍生的配体。Toll样受体7(TLR7)主要由浆细胞样树突细胞(pDC)表达，并通过配体识别而诱导干扰素α(IFN-α)的分泌。Toll样受体7(TLR7)和Toll样受体8(TLR8)高度同源，因此TLR7配体在很多情况下也是TLR8配体。TLR8刺激主要诱导产生细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和趋化因子。干扰素α是治疗慢性乙型肝炎或丙型肝炎的主要药物之一，而TNF-α则是一种促炎细胞因子，其过多的分泌可能导致严重的副作用。迄今为止已经报道了几种TLR7激动剂，如咪喹莫特(Imiquimod，BritishJournal of Dermatology 2003；149(Suppl.66)：5-8)、瑞喹莫德(Resiquimod，AntiviralResearch 64(2004)79-83)、GS-9620(Gastroenterology(2013)，144(7)，1508-1517)，但对于具备更好的选择性、活性和安全性的新的TLR7激动剂仍然有很大需求。
中国专利申请201410405136.0(其内容整体援引加入本文)公开了多个作为TLR7激动剂的吡咯并嘧啶化合物。
发明内容
在一方面，本发明提供一种制备式I化合物的方法
所述方法包括使式VI化合物脱羟基以获得式I化合物：
其中，R1和R2独立地选自C1-4烷基，或者
R1、R2与所连N原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基的取代基取代。
具体实施方式
一般定义和术语
除非另有说明，本文所用的术语和短语具有下文所列的含义。特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域技术人员通常理解的含义进行解释。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
除非另外专门定义，本文中使用的比例(包括百分比)或份数均按重量计。
术语“约”、“大约”当与数值变量并用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如对于平均值95％的置信区间内)或在指定数值的±10％内，或更宽范围内。
表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由...组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由...组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由...组成”和“由...组成”。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
本文所用的术语“Cm-n”指该部分中具有m-n个碳原子。例如，“C1-4烷基”指具有1-4个碳原子的烷基。
本文中的数字范围涵盖给定范围中的各个整数以及由这些整数形成的亚范围。例如“C1-4”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子或4个碳原子。相应地，“C1-4烷基”涵盖“C2-3烷基”、“C1-3烷基”、“C2-4烷基”以及C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基等。
术语“被取代”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基代替，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。
除非另有规定，术语“杂”表示杂原子或杂原子团(即含有杂原子的原子团)，即碳和氢以外的原子或含有这些原子的原子团。优选地，杂原子独立地选自氧、氮、硫等。在出现两个或更多杂原子的实施方案中，所述两个或更多杂原子可彼此相同，或者所述两个或更多杂原子中的部分或全部彼此不同。
术语“烷基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的饱和的脂肪烃基团，其通过单键与分子的其余部分连接。C1-4烷基的非限制性实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
术语“C1-4烷氧基”表示通过“-O-”连接至分子的其余部分的“C1-4烷基”，其中“C1-4烷基”如上文所定义。
术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“羟基”指-OH基团。
表述“R1、R2与所连N原子”中的N原子指通式中
部分中所示的N原子。
术语“杂环烷基”是指饱和的单环或多环体系基团，其中部分环原子是选自N、O、S的杂原子，其余环原子为C。相应地，术语“4～8元杂环烷基”表示体系中包含4～8个环原子的杂环烷基，其中一个或多个环原子是选自N、O、S的杂原子。“4～8元杂环烷基”涵盖“4～7元”、“4～6元”、“5～7元”杂环烷基，例如但不限于4、5、6、7、8元杂环烷基。4元杂环烷基的实例包括但不限于吖丁啶基，5元杂环烷基的实例包括但不限于吡咯烷基、异噁唑烷基、噁唑烷基、异噻唑烷基、噻唑烷基、咪唑烷基，6元杂环烷基的实例包括但不限于哌啶基、吗啉基、哌嗪基，7元杂环烷基的实例包括但不限于氮杂环庚烷基、氧杂氮杂双环[2.2.1]庚基等。
术语“一个或多个”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个。
本文中采用下述缩略词：SEM代表2-(三甲硅烷基)乙氧基甲基；SEM-Cl代表2-(三甲硅烷基)乙氧基甲基氯；DIPEA代表二异丙基乙基胺；TFA代表三氟乙酸；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺；n-BuOH代表正丁醇。
式I化合物的制备方法
在一方面，本发明提供一种制备式I化合物的方法，所述方法包括使式VI化合物脱羟基以获得式I化合物：
其中，R1和R2独立地选自C1-4烷基，或者
R1、R2与所连N原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基的取代基取代。
在一实施方案中，本发明的制备式I化合物的方法包括如下步骤：
(a)使式II化合物和式III化合物在碱的存在下反应以获得式IV化合物
(b)使式IV化合物和式V化合物在还原剂的存在下反应以获得式VI化合物
(c)使式VI化合物脱羟基以获得式I化合物
其中，R1和R2独立地选自C1-4烷基，或者
R1、R2与所连N原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基的取代基取代。
在一实施方案中，所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、N，N-二甲氨基吡啶、哌啶、N-甲基哌啶、吗琳、N-甲基吗琳及其任意组合，优选碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾及其任意组合，最优选碳酸钾。
在一实施方案中，步骤(a)在溶剂中进行。在一优选的实施方案中，所述溶剂为异丙醇或其与水的混合物。
在一实施方案中，式II化合物与碱的摩尔比为1.0∶1.0～3.0，优选1.0∶1.0～1.5，更优选1.0∶1.2。
在一实施方案中，式II化合物与式III化合物的摩尔比为1.0∶1.0～3.0，优选1.0∶1.0～1.5，更优选1.0∶1.2～1.5。
在一实施方案中，步骤(b)在酸的存在下进行。在另一实施方案中，所述酸选自盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲酸、醋酸、丙酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、水杨酸、马来酸、三氟乙酸及其任意组合，优选醋酸。
在一实施方案中，在步骤(b)中，式IV化合物与酸的摩尔比为1.0∶1.0～3.0，优选1.0∶1.2～2.0，更优选1.0∶1.5。
在一实施方案中，步骤(b)在溶剂中进行。在一优选的实施方案中，所述溶剂为异丙醇或其与水的混合物。
在一实施方案中，所述还原剂选自BH3、NaBH4、NaBH3CN或NaBH(AcO)3及其任意组合，优选NaBH(AcO)3。
在一实施方案中，式IV化合物与还原剂的摩尔比为1.0∶1.0～3.0，优选1.0∶1.2～2.0，更优选1.0∶1.5。
在一优选实施方案中，脱羟基在三乙基硅烷和三氟乙酸的存在下进行。
在另一优选实施方案中，式VI化合物与三乙基硅烷的摩尔比为1∶1～10，优选1∶2～8，更优选1∶5。
在另一优选实施方案中，式VI化合物与三氟乙酸的摩尔比为1∶2～20，优选1∶5～15，更优选1∶10～12。
在一实施方案中，步骤(c)在溶剂中进行。在一优选的实施方案中，所述溶剂为二氯甲烷。
在另一实施方案中，本发明的制备式I化合物的方法包括如下步骤：
(a’)使式II化合物和式III’化合物在碱的存在下反应以获得得式VI化合物
(b’)使式VI化合物脱羟基以获得式I化合物
其中，R1和R2独立地选自C1-4烷基，或者
R1、R2与所连N原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基的取代基取代。
在一实施方案中，所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、N，N-二甲氨基吡啶、哌啶、N-甲基哌啶、吗琳、N-甲基吗琳及其任意组合，优选碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾及其任意组合，最优选碳酸钾。
在一实施方案中，步骤(a’)在溶剂中进行。在一优选的实施方案中，所述溶剂为甲醇或其与水的混合物。
在一实施方案中，式II化合物与碱的摩尔比为1.0∶1.0～3.0，优选1.0∶1.0～1.5，更优选1.0∶1.2。
在一实施方案中，式II化合物与式III’化合物的摩尔比为1.0∶1.0～3.0，优选1.0∶1.0～1.5，更优选1.0∶1.2～1.5。
在一优选实施方案中，脱羟基在三乙基硅烷和三氟乙酸的存在下进行。
在另一优选实施方案中，式VI化合物与三乙基硅烷的摩尔比为1∶1～10，优选1∶2～8，更优选1∶5。
在另一优选实施方案中，式VI化合物与三氟乙酸的摩尔比为1∶2～20，优选1∶5～15，更优选1∶10～12。
在一实施方案中，步骤(b’)在溶剂中进行。在一优选的实施方案中，所述溶剂为二氯甲烷。
在一实施方案中，式V化合物选自：
优选
在优选的实施方案中，式I化合物选自如下编号所示的化合物：
中间体化合物及制备
本发明还提供作为中间体的式II和式VI化合物：
其中，R1和R2独立地选自C1-4烷基，或者
R1、R2与所连N原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基的取代基取代。
在一实施方案中，式VI化合物选自：
本发明的式II化合物可以采用如下方法制备，
其中，
使式VII化合物与SEM-Cl反应以获得式VIII化合物(优选在DMF中进行)；
使式VIII化合物与氨水反应以获得式IX化合物(优选在异丙醇中进行)；
使式IX化合物与正丁醇钠发生取代反应以生成式X化合物(优选在正丁醇中进行)；和
使式X化合物在TFA的作用下脱除SEM以获得式II化合物(优选在TFA中进行)。
有益效果
本发明的制备方法的反应条件温和，例如可以在常压(如约1atm)下进行，对反应温度的要求也不高。而且本发明的制备方法还避免使用价格昂贵和危险性高的试剂，因此特别适合工业化生产。
实施例
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。
制备实施例1
式I化合物的制备实施例：2-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苄基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺(编号为1的式I化合物)的制备
4-((4-氨基-2-丁氧基-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-7-基)-羟基甲基)苯甲醛(式IV化合物)的制备
将对苯二甲醛(790.64mg，5.82mmol)和异丙醇(10mL)投入至三口瓶中，在搅拌下加入2-丁氧基-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺(1.00g，4.85mmol)。使体系降温至0℃，之后继续搅拌10min。加入纯化水(10mL)和碳酸钾(804.17mg，5.82mmol)，在25℃下反应16hr，LCMS监控至原料反应完全。反应完全后，有固体析出。过滤，所得固体用20mL纯化水打浆，然后用30mL(乙酸乙酯/正庚烷＝1/20)打浆，过滤，干燥，得到黄色固体形式的标题化合物(1.50g，4.41mmol，收率：90.9％)。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ9.94(s，1H)，7.86(d，J＝8.16Hz，2H)，7.72(d，J＝8.16Hz，2H)，7.12-7.17(m，1H)，6.19(s，1H)，4.28(t，J＝6.53Hz，2H)，1.68-1.77(m，2H)，1.44-1.54(m，2H)，0.97(t，J＝7.34Hz，3H)。
(4-氨基-2-丁氧基-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(式VI-1化合物)的制备
将上文获得的式IV化合物4-((4-氨基-2-丁氧基-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-7-基)-羟基甲基)苯甲醛(450.0g，1.32mol)和异丙醇(4.5L)投入至30L反应釜中，搅拌5min，之后加入冰醋酸(119.0g，1.98mol)，搅拌使体系降温至0-10℃。滴加吡咯烷(112.4g，1.58mol)，在滴加中保持体系温度低于10℃。滴加完成后，分批次加入三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(AcO)3)(420.0g，1.98mol)，在10-20℃下反应3hr，液相监控至原料完全消失。反应完全后，加入纯化水5L，将溶液温度降至-10℃左右，加入15％氨水12L，加入过程中保持溶液温度低于0℃。搅拌有固体析出，过滤，将所得滤饼用2L水打浆，然后用2L×2乙酸乙酯打浆，过滤，在40℃减压烘干12hr，得到黄色固体形式的标题化合物(465.0g，1.18mol，收率89.4％，水分0.9％)。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.46(d，J＝7.91Hz，1H)，7.29(d，J＝8.03Hz，1H)，7.09(s，1H)，6.12(s，1H)，4.29(t，J＝6.53Hz，2H)，3.60(s，2H)，2.52(br.s.，4H)，1.66-1.83(m，6H)，1.49(d，J＝7.53Hz，2H)，0.98(t，J＝7.40Hz，3H)。
所述式VI-1化合物还可以按照如下方法制备：
(4-氨基-2-丁氧基-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(式VI-1化合物)的制备
在25℃下，向2-丁氧基-5H并吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺(3.00g，14.55mmol)、4-(吡咯烷-1-基甲基)苯甲醛(4.13g，21.82mmol)、甲醇(30mL)和水(30mL)的混合物中加入碳酸钾(2.41g，17.46mmol)并搅拌。然后在25℃下继续搅拌12小时，薄层色谱监控至原料反应完全。反应完全后，有固体析出。加入30mL水，将固体过滤并干燥，得到白色固体形式的标题化合物(3.50g，8.85mmol，收率：60.82％)。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.46(d，J＝7.91Hz，1H)，7.29(d，J＝8.03Hz，1H)，7.09(s，1H)，6.12(s，1H)，4.29(t，J＝6.53Hz，2H)，3.60(s，2H)，2.52(br.s.，4H)，1.66-1.83(m，6H)，1.49(d，J＝7.53Hz，2H)，0.98(t，J＝7.40Hz，3H)。
2-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苄基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺(编号为1的式I化合物)的制备
将式VI-1化合物(4-氨基-2-丁氧基-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-7-基)(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯基)甲醇(440.0g，1.11mol)和二氯甲烷(7.0L)投入20L反应釜中，搅拌使体系降温至-15℃以下，滴加三乙基硅烷(880mL，5.55mol)后，继续滴加三氟乙酸(880mL，11.84mol)，在滴加中保持体系温度低于-10℃。滴加完毕后，在0℃下反应2hr，液相监控至原料点消失。反应完全后，将反应液浓缩至干，加入乙酸乙酯2.2L，搅拌使体系降温至0℃以下，之后加入饱和碳酸钠溶液调节溶液pH＝9-10，此过程中保持温度低于10℃。过滤，将所得滤饼用2.2L水打浆后过滤，减压烘干，得到白色固体形式的2-丁氧基-7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苄基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺550g(标题化合物的三氟乙酸盐)。将所得白色固体在碱性条件下脱盐得到标题化合物，这例如可以通过常规手段进行。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.27(d，J＝8.0Hz，2H)，7.22(d，J＝8.0Hz，2H)，7.04(s，1H)，4.32(t，J＝6.6Hz，2H)，3.99(s，2H)，3.60(s，2H)，2.55-2.52(m，4H)，1.85-1.71(m，6H)，1.55-1.48(m，2H)，1.00(t，J＝7.4Hz，3H)。
制备实施例2：式II化合物
2，4-二氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶
将2，4-二氯-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶(4.00kg，21.28mol)溶解于DMF(20.00L)；在室温(25℃)下分批加入DIPEA(2.58kg，20.00mol)，随后搅拌30min。将反应液用冰浴降温至0℃，然后在5小时内，以1～2滴/秒的滴速，缓慢滴加SEM-Cl(4.00kg，24.00mol)。滴加完成后，将反应液在0℃下搅拌反应4小时，HPLC监测反应完全。将反应液用70L水淬灭稀释后，用乙酸乙酯(15L×3)萃取。将合并的有机相依次用1M盐酸水溶液(5L×2)和饱和食盐水(7L×2)洗涤，减压蒸馏除去溶剂后得标题化合物(6.40kg，20.11mol，产率94.50％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.24-8.35(m，1H)，6.70-6.85(m，1H)，5.77(s，2H)，3.45-3.57(m，2H)，0.74-0.86(m，2H)，0.00(s，9H)。
2-氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺
在10L高压釜中，将2，4-二氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶(1.60kg，5.03mol)溶于异丙醇(1.60L)，在室温(25℃)下一次性加入氨水(4L)。将反应混合物在95摄氏度下搅拌7小时，HPLC监测反应完毕。使反应液自然冷却到室温，经布氏漏斗过滤后得到黑褐色固体。将该固体依次用乙酸乙酯/正庚烷(1/1，5L×2)打浆，用乙酸乙酯(4L)打浆，得到棕色固体形式的标题化合物(1.25kg，4.18mol，产率83.1％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.61-7.77(m，1H)，6.97-7.19(m，2H)，6.28-6.38(m，1H)，5.54-5.67(m，2H)，3.43-3.53(m，2H)，0.76-0.91(m，2H)，0.07(s，9H)。
2-丁氧基-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺
在氮气保护下，将金属钠(525.05g，22.84mol)缓慢分批加入到n-BuOH(17.0L)中；加入完毕后，将体系升温至60℃，并在该温度下持续搅拌，直至金属钠全部溶解。随后，使体系冷却至25℃，将2-氯-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺(1.95kg，6.53mol)分批加入，搅拌混合均匀后，将反应物在90℃下持续搅拌8小时，HPLC监测反应完全。使反应混合物自然降温至25℃后，缓慢倒入30L饱和氯化铵水溶液中，随后用乙酸乙酯(15L×3)萃取。将合并的有机相用饱和食盐水(20L×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，减压蒸馏除去溶剂后，将残余物在正庚烷(4L)中打浆，过滤分离得到固体，再在乙酸乙酯(5L)中打浆，得到黄白色固体形式的标题化合物(1.53kg，4.55mol，69.7％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.49-7.54(m，1H)，6.54-6.62(m，2H)，6.15-6.20(m，1H)，5.54(s，2H)，4.10-4.22(m，2H)，3.42-3.55(m，2H)，1.58-1.73(m，2H)，1.35-1.47(m，2H)，0.90-0.96(m，3H)，0.83-0.89(m，2H)，0.05(s，9H)。
2-丁氧基-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺
将2-丁氧基-5-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-5H-吡咯并[3，2-d]嘧啶-4-胺(1.10kg，3.27mol)溶于TFA(5.50L)。将反应液在25℃下持续搅拌16小时，HPLC监测反应完全。减压蒸馏除去TFA，将剩余物溶解在甲醇(1.2L)和冰水(1.2L)中，在均匀搅拌下，用浓氨水调节体系pH至12，然后搅拌2小时。溶液中不断有沉淀析出，过滤后，滤饼为白色固体。将其依次用15％的氨水(1.2L×3)和乙酸乙酯(4L)打浆，得到白色固体标题化合物(550.00g，2.67mol，81.7％)。
1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.37(d，J＝2.89Hz，1H)，6.29(d，J＝3.01Hz，1H)，4.27(t，J＝6.53Hz，2H)，1.75(d，J＝7.91Hz，2H)，1.44-1.61(m，2H)，1.00(t，J＝7.40Hz，3H)。
药物活性效果实施例
Toll样受体7和Toll样受体8体外受体结合活性筛选试验
试剂
HEK-blue hTLR7细胞和HEK-blue hTLR8细胞(来源于InvivoGen公司)
DMEM培养基
热灭活胎牛血清
抗支原体试剂NormocinTM
博来霉素
杀稻瘟菌素
所用的GS-9620和R848的结构如下，其中GS-9620可以参考US20100143301中公开的方法制备；R848购自百奇生物(货号IMG-2208，规格0.5mg)。
方案
1. 96孔化合物板的准备：利用液体工作站POD将化合物从10毫摩尔/升浓度起始，用DMSO做3倍梯度稀释，共稀释10个点(从第2列到第11列，每个点2个重复)。在第12列加入1微升5毫克/毫升的阳性化合物R848作为阳性对照，在第1列加入1微升DMSO作为阴性对照。每孔中含有的DMSO体积都是1微升。
2.收取细胞培养瓶中的细胞，将细胞密度稀释成250,000个细胞/毫升。
3.加入200微升(50,000个细胞/孔)细胞悬液至准备好的化合物板中。每孔中DMSO终浓度为0.5％。
4.将含有细胞和化合物的培养板放入CO2培养箱中培养24小时，培养条件为37℃，5％CO2浓度。
5.培养24小时后，从细胞培养板中每孔取出20微升上清液转移到一块96孔透明检测板中。然后向检测板中每孔加入180微升Quanti-Blue试剂，并置于37℃，5％CO2培养箱孵育1小时。
6. 1小时后，用酶标仪OD650读板检测20微升上清液中碱性磷酸酶的含量。
7.利用Prism软件分析数据，得出各化合物的EC50。
实验结果如表1所示：
表1
| 化合物 | TLR7 EC<sub>50</sub> | 化合物 | TLR7 EC<sub>50</sub> |
| 化合物1 | B | 化合物9 | B |
| 化合物2 | C | 化合物10 | B |
| 化合物3 | B | 化合物11 | B |
| 化合物4 | B | 化合物12 | B |
| 化合物5 | B | 化合物13 | B |
| 化合物6 | C | 化合物14 | B |
| 化合物7 | C | 化合物15 | B |
| 化合物8 | B | 化合物16 | B |
注：1nM≤A≤100nM；100nM＜B≤1000nM；1000nM＜C≤50μM。
化合物1与对照品Toll样受体7激动剂GS-9620测试实验结果如表2所示：
表2
本发明的化合物表现出比对照品Toll样受体7激动剂GS-9620更高的与Toll样受体7体外受体结合活性以及比对照品Toll样受体7激动剂GS-9620更低的与Toll样受体8体外受体结合活性。本发明的化合物对不同受体具有明显的选择性差异，且效果优于现有技术。
Claims (23)
1.一种制备式Ⅰ化合物的方法，所述方法包括使式Ⅵ化合物脱羟基以获得式Ⅰ化合物
其中，
R1和R2独立地选自C1～C4烷基，或者
R1、R2与所连N原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个选自羟基、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基取代。
2.权利要求1的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)使式Ⅱ化合物和式Ⅲ化合物在碱的存在下反应以获得式Ⅳ化合物
(b)使式Ⅳ化合物和式Ⅴ化合物在还原剂的存在下反应以获得式Ⅵ化合物
(c)使式Ⅵ化合物脱羟基以获得式Ⅰ化合物
3.权利要求2的方法，所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、N,N-二甲氨基吡啶、哌啶、N-甲基哌啶、吗琳、N-甲基吗琳及其任意组合。
4.权利要求3的方法，所述碱选自碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾及其任意组合。
5.权利要求4的方法，所述碱选自碳酸钾。
6.权利要求2的方法，所述步骤(b)在酸的存在下进行。
7.权利要求6的方法，所述酸选自盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲酸、醋酸、丙酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、水杨酸、马来酸、三氟乙酸及其任意组合。
8.权利要求7的方法，所述酸选自醋酸。
9.权利要求2的方法，所述还原剂选自BH3、NaBH4、NaBH3CN或NaBH(AcO)3及其任意组合。
10.权利要求9的方法，所述还原剂选自NaBH(AcO)3。
11.权利要求2的方法，其中所述式Ⅴ化合物选自：
12.权利要求11所述的方法，其中所述式Ⅴ化合物选自
13.权利要求1的方法，所述方法包括如下步骤：
(a’)使式Ⅱ化合物和式Ⅲ’化合物在碱的存在下反应以获得式Ⅵ化合物
(b’)使式Ⅵ化合物脱羟基以获得式Ⅰ化合物，
14.权利要求13的方法，所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾、碳酸氢钾、碳酸铯、氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾、三乙胺、二异丙基乙基胺、吡啶、N,N-二甲氨基吡啶、哌啶、N-甲基哌啶、吗琳、N-甲基吗琳及其任意组合。
15.权利要求14的方法，所述碱选自碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾及其任意组合。
16.权利要求15的方法，所述碱选自碳酸钾。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述脱羟基在三乙基硅烷和三氟乙酸的存在下进行。
18.权利要求17的方法，其中
式Ⅵ化合物与三乙基硅烷的摩尔比为1：1～10；
式Ⅵ化合物与三氟乙酸的摩尔比为1：2～20。
19.权利要求18的方法，其中
式Ⅵ化合物与三乙基硅烷的摩尔比为1：2～8；
式Ⅵ化合物与三氟乙酸的摩尔比为1：5～15。
20.权利要求19的方法，其中
式Ⅵ化合物与三乙基硅烷的摩尔比为1：5；
式Ⅵ化合物与三氟乙酸的摩尔比为1：10～12。
21.权利要求1-11或13-16任一项的方法，其中式Ⅰ化合物选自：
22.式Ⅵ化合物：
其中，
R1和R2独立地选自C1～C4烷基，或者
R1、R2与所连N原子一起形成4～8元杂环烷基，所述杂环烷基任选地被一个或多个选自羟基、卤素、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基取代。
23.权利要求22的式Ⅵ化合物，其选自：
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