CN108541513B - 一种冬荪液体菌种快繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬荪液体菌种快繁方法，该方法接种点制备简单、萌发快、分两个阶段液体摇瓶；二级液体菌种5天结束摇瓶，其中冬荪菌丝球大小均匀，菌丝球密度大、菌丝鲜重能达27g/L。同时产生的冬荪液体菌种适宜作为工厂化发酵的液体种子，液体摇瓶培养参数能为冬荪菌种高效、质优的工厂化生产奠定基础。

Description

一种冬荪液体菌种快繁方法

技术领域

本发明涉及农业科技种子生产技术领域，尤其是一种冬荪液体菌种快繁方法。

背景技术

冬荪，又称竹下菌、男荪、无裙荪等，为担子菌亚门、腹菌纲、鬼笔目、鬼笔科、鬼笔属真菌，包含白鬼笔、香笔菌、重脉鬼笔三个生物种。冬荪为人工驯化的新食用菌，目前在贵州毕节市已有较大面积的人工栽培，林下腐殖质层中单生或群生，其出菇温度较低，子实体开伞在秋冬季节，因此当地菇农又称其为冬荪，分布于贵州、四川、云南、安徽、广东等地。

冬荪是一种极佳的营养滋品，菌体洁白，久煮不糊，味道鲜美，口感松脆、细嫩、爽口，营养丰富。冬荪子实体中含有丰富的营养成分，有21种氨基酸，8种为人体所必须，约占氨基酸总量的1/3，其中谷氨酸含量尤其丰富，占氨基酸总量17%以上，为蔬菜与水果所不及，冬荪富含多种维生素和多种微量元素以及多糖等活动物质。同时冬荪菌柄可入药，药性为甘，淡，性温，有活血止痛，祛风除湿的功效。中世纪时，白鬼笔曾用于治疗痛风。因此，冬荪具有较高的营养和保健价值。

冬荪人工栽培起源于贵州省大方县，在上世纪80年代，就有收山货的商贩收购野生白鬼笔销往四川、江浙一带。在上世纪90年代初期大方县就出现自行分离菌种栽培白鬼笔，但20多年来，冬荪制种还是停留在固体菌种生产工艺上，即从竹蛋分离母种—母种扩大—原种扩繁—栽培种生产。同时冬荪菌丝生长速度缓慢，木屑培养基中长满瓶（体积500ml）需要4个月之久。传统的冬荪固体母种到栽培种的生产过程一般要经过大半年的时间，菌种生产周期较长,培养成本较高，不易量产；且长时间培养瓶/袋口菌丝极易吐黄水，造成同批次栽培种的菌龄与活力常常参差不齐，严重影响了冬荪的产量与品质。

目前冬荪驯化成功且大面积人工种植的3个品种中，白鬼笔、香笔菌、重脉鬼笔均未有液体菌种的相关研究报道。本专利采用的接种点制备简单、萌发快、分两个阶段液体摇瓶；二级液体菌种5天结束摇瓶，其中冬荪菌丝球大小均匀，菌丝球密度大、菌丝鲜重能达27g/L；使冬荪菌种的工厂化生产与应用真正成为可能，解决了冬荪制种中速度慢与质量差的技术难题，具有很大菌种工厂化生产应用和推广价值。

发明内容

本发明的目的是，提供一种冬荪液体菌种快繁方法，实现5天结束液体摇瓶，产生的冬荪菌丝球大小均匀、菌丝球密度大，适宜于工厂化液体发酵。为冬荪菌种高效、质优的工厂化生产奠定基础。

本发明是这样实现的，包含以下步骤：

1）一级液体培养基制做：按葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁1.5g/L、马铃薯100g/L（煮汁过滤）、酵母粉1.5g/L、VB1 0.01g/L、琼脂粉1.5 g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min）。

2）冬荪一级液体菌种制备：75%酒精表面消毒长满平皿的红托竹荪母种，置于超净工作台中；无菌条件下用解剖刀划取蚕豆大小的母种5块转接于冷却好的一级液体培养基中，完成接种后上摇床暗培养（23℃、180r/min）。接种点3天萌动，20天结束一级液体菌种的摇瓶培养。

3）二级液体培养基制做：按葡萄糖25g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁2g/L、马铃薯280g/L（煮汁过滤）、酵母粉0.5g/L、VB1 0.03g/L、琼脂粉1.5 g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min）。

4）冬荪二级液体菌种制备：75%酒精表面消毒一级液体菌种；无菌条件下用无菌的5ml枪头吸取匀质的一级液体菌种转入二级液体培养基中培养（接种量体积比为1：30），完成接种后上摇床暗培养（23℃、180r/min），5天能结束二级液体菌种的摇瓶培养。

图1 冬荪液体菌种。

具体实施例。

2017年8-10月，在贵州省农作物品种资源研究所真菌室进行冬荪的液体摇瓶培养，具体步骤如下：

1）2017年8月底进行一级液体培养基制做：按葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁1.5g/L、马铃薯100g/L（煮汁过滤）、酵母粉1.5g/L、VB1 0.01g/L、琼脂粉1.5 g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min）、冷却后备用。

2）2017年9月初进行冬荪一级液体菌种制备：75%酒精表面消毒长满平皿的红托竹荪母种，置于超净工作台中；无菌条件下用解剖刀划取蚕豆大小的母种5块转接于冷却好的一级液体培养基中，完成接种后上摇床暗培养（23℃、180r/min）。接种点3天萌动，20天结束一级液体菌种的摇瓶培养。

3）2017年9月下旬进行二级液体培养基制做：按葡萄糖25g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁2g/L、马铃薯280g/L（煮汁过滤）、酵母粉0.5g/L、VB1 0.03g/L、琼脂粉1.5 g/L的配制比例准确称取上述物质煮溶于自来水中，定容后按150ml的量分装于三角瓶中（体积250ml），用透气封瓶膜封口后进行高压灭菌（121℃、20min）、冷却后备用。

4）2017年9月底进行冬荪二级液体菌种制备：75%酒精表面消毒一级液体菌种置于超净工作台灭菌；无菌条件下用无菌的5ml枪头吸取匀质的一级液体菌种转入二级液体培养基中培养（接种量体积比为1：30），完成传代后上摇床暗培养（23℃、180r/min），5天结束二级液体菌种的摇瓶培养。

5）2017年10月初进行冬荪二级液体菌种的验证，包括菌种一致性鉴定、菌丝产量等。将发酵好的冬荪二级液体菌种接种到PDA培养基中、25℃暗培养，同时提取菌丝球的DNA进行cDNA-ITS的扩增与GenBank比对鉴定；另外抽滤二级液体菌种直至不再滴水后，测定菌丝产量。结果表明：二级液体菌种转接到PDA培养基中，3天后开始萌动、1个星期菌丝扭结成菌束，这符合冬荪25℃暗培养的特征；同时GenBank中的cDNA-ITS比对的鉴定也为冬荪的生物种；抽滤法得到冬荪二级液体菌种菌丝鲜重为27.6g/L。

Claims (3)

1.一种冬荪液体菌种快繁方法，其特征在于：接种点制备简单、萌发快、分两个阶段液体摇瓶；二级液体菌种5天结束摇瓶，其中冬荪菌丝球大小均匀，菌丝球密度大、菌丝鲜重能达27g/L；

所述分两个阶段液体摇瓶是指，第一阶段摇瓶所得为一级液体菌种，利用一级液体菌种传代培养二级液体菌种； 两个阶段培养参数均为23℃暗培养、180r/min，二级液体菌接种量1:30(体积比)；

所述的一级液体摇瓶的培养基参数具体是指，葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁1.5g/L、马铃薯100g/L(煮汁过滤)、酵母粉1.5g/L、VB₁ 0.01g/L、琼脂粉1.5g/L，各成分充分溶解后装液量为150ml、封瓶灭菌；

所述的二级液体菌种的培养基成分参数是指，葡萄糖25g/L、磷酸二氢钾1g/L、蛋白胨2.5g/L、硫酸镁2g/L、马铃薯280g/L(煮汁过滤)、酵母粉0.5g/L、VB₁ 0.03g/L、琼脂粉1.5g/L，各成分充分溶解后装液量为150ml、封瓶灭菌；

冬荪二级液体菌种制备：75％酒精表面消毒一级液体菌种；无菌条件下用无菌的5ml枪头吸取匀质的一级液体菌种转入二级液体培养基中培养(接种量体积比为1：30)，完成接种后上摇床暗培养(23℃、180r/min)，5天能结束二级液体菌种的摇瓶培养。

2.根据权利要求1所述的一种冬荪液体菌种快繁方法，其特征在于，所述装液量具体指体积为250ml的玻璃三角瓶，装150ml液体培养基。

3.根据权利要求1所述的一种冬荪液体菌种快繁方法，其特征在于，所述封瓶灭菌，具体指用透气封瓶膜封口、121℃灭菌30min。