CN108473487A - 一种蛋白激酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对蛋白激酶具有活性的新的氘代和非氘代环化合物及其相应的盐，特别是这些化合物用于对蛋白激酶的抑制作用。另外，本发明还涉及使用上述化合物及其盐制备治疗蛋白激酶介导的哺乳动物疾病或病症的用途。

Description

一种蛋白激酶抑制剂
技术领域：
本发明涉及一种新的氘代和非氘代的环状化合物及其盐，以及使用这些化合物制备治疗蛋白激酶介导的疾病或症状(如自身免疫性疾病和癌症)药物的用途。本发明还涉及含有所述化合物的制剂，以及该化合物与其它药物的复方制剂。
背景技术：
本节提供的信息和所引用的参考文献仅限于帮助读者理解，并非本发明的现有技术。
正如Lahiry等所述，确定疾病发生发展的分子机制是提高对人类某些疾病预防和治疗的主要挑战。(Lahiry P et al.Kinase mutations in human diseases：interpretinggenotype-phenotype.Nat Rev Genet,2010：11(1)：60-74)。
其中一个深入研究的主题是蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的异常调节在人类疾病中的作用(Lahiry同上)。蛋白激酶调节细胞信号的传导，其功能失调常见于癌症、自身免疫性疾病和许多其他疾病(Lahiry同上；Vargas L et al，Inhibitor of BTK and ITK：state of thenew drugs for cancer(2)：130-9；Nobel ME et al.Proteinase kinase inhibitors：insights into drug design from structure.Science.2004；303：1800-1805)。人类基因组编码超过500种蛋白质激酶，它们在催化结构域的基因序列和空间结构相似，但是催化调节方式明显不同(Manning G et al.The protein kinase complement of the humangenome.Science.2002；298：1912-1934；Nobel同上)。蛋白激酶调节控制参与关键生理功能信号的转导级联，这些生理功能包括细胞生长和增殖、细胞分化、细胞发育、细胞分裂、应激反应、转录调节、异常有丝分裂、血管发生、异常内皮细胞或血管发育期间的细胞-基质相互作用、炎症、Jun-N末端激酶(JNK)信号转导以及其他几种细胞功能(Manning同上)。
蛋白激酶抑制剂抑制癌细胞中过度活跃的蛋白激酶，已成为有希望的治疗癌症的药物(Gross S et al，Targeting cancer with kinase inhibitors.J Clin Invest.2015；125(5)：1780-1789；Vargas同上)。
部分蛋白激酶包括：ABL、ACK、ARG、BLK、BMX、BRK、BTK、CSK、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA1、FGR、FMS、FRK、FYN(a)、FYN(b)、HCK、KIT、LCK、LYNa、PDGFRα、PDGFRβ、SRC、SRM、YES、PIK3CA/PIK3R1(Manning同上)。在许多疾病状态中已经观察到异常的激酶活性，这些疾病包括良性和恶性肿瘤以及免疫和神经系统的疾病。
本发明的新化合物能够抑制一种或多种蛋白激酶的活性，有望用于治疗蛋白激酶介导的疾病或症状。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够抑制蛋白激酶活性的新型氘代和非氘代环化合物及其盐。
本发明的另一目的是使用这些化合物制备治疗蛋白激酶介导的哺乳动物疾病或症状的药物。
一方面，本发明提供了具有以下式I结构的化合物：
还包括该化合物所有的盐、前体药、对映异构体和几种对映异构体的混合物；
其中，W1、W2和W3分别为氢或氘；Y是碳或氮；R1是—Q—A，其中，Q是直接将A与环碳原子连接的单键，或者将A与环碳原子连接的亚甲基或亚乙基；
A是
其中，Y1和Y2分别为碳或氮；
Z1和Z2分别为氢、-(CH2)n-OR5或-NR5R6；所述-(CH2)n-OR5，其中n为0-4的整数，R5为氢、低级烷基或低级链烯基，条件是当n为1且R5为氢时，R1不是1-哌啶基，另一个条件是当n是2，且R5是氢，R1是1-哌嗪基时，W2是氘；所述-NR5R6中，R5和R6分别为氢、低级烷基或低级链烯基；
T1和T2分别为0-4的整数，条件是当T1或T2为0时，–(CH2)T1或–(CH2)T2是单键，以及T1和T2不会同时为0；
R2和R3分别为氢、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基被任选一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基是甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基；
R1、R2和R3的位置可以交换。
另一方面，本发明提供了具有式II结构的以下化合物，及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：
式中，W1、W2和W3分别为氢或氘；Y是碳或氮；
R2、R3和R4分别为氢、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基被任选一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基是甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基；且
X分别为氢、-(CH2)n-OR5或–NR5R6；所述-(CH2)n-OR5，其中n为0-4的整数，R5为氢、低级烷基或低级链烯基；所述-NR5R6中，R5和R6分别为氢、低级烷基或低级链烯基。
另一方面，本发明提供了具有式III结构的以下化合物，及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：
其中W1、W2和W3分别为氢或氘；R2、R3和R4分别为H、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基可被一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基。
另一方面，本发明提供了具有以下式IV结构的以下化合物，及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：
其中W2是氢或氘。
另一方面，本发明提供了式V结构的以下化合物，及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：
其中，W2是氢或氘。
代表性的化合物包括以下氘代和非氘代的环状化合物。
另一方面，本发明提供具有式I～式XIV结构的化合物，以及它们所有的盐和前体药：
本发明提供了一种用式I、II、III、IV、V和/或VI结构的化合物中的一种或几种制备治疗蛋白激酶介导的疾病或症状的药物的用途。以上化合物包括它们所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物。优选化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV。更优选优选化合物IV、V、X和/或XI。
所述蛋白激酶介导的疾病或症状包括自身免疫性疾病或癌症。这里所述自身免疫性疾病至少一种是系统性红斑狼疮(SLE)、移植排斥、多发性硬化症(MS)、系统性硬化症(SSc)、原发性干燥综合征(pSS)、类风湿性关节炎(RA)和牛皮癣中。所述癌症至少一种是费城染色体阳性(Ph+)慢性粒细胞白血病(CML)、费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、华氏巨球蛋白血症(WM)、T细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
本发明的上述所有化合物中的一种或几种还可以和其它一种或几种药物制成复方药物。
所述其它药物选自以下药物中的一种或几种：化疗药物、生物药、免疫抑制剂、类固醇激素或非甾体抗炎药。
经实验证实，本发明的化合物可以用于制备治疗蛋白激酶介导的疾病或症状包括自身免疫性疾病或癌症的药物。所述“治疗”，是指通过对接受治疗的对象使用有效剂量的化合物用来有效预防、治疗疾病，减轻或改善一种或多种症状，比如说药物适应症和/或延长生存期。术语“蛋白激酶介导的疾病或症状”是指某些疾病或症状的发生、发展受蛋白激酶生物学功能的影响。蛋白激酶介导的疾病或症状包括由于蛋白激酶活性增强引起的疾病或症状，蛋白激酶抑制剂(包括本发明所述的化合物)为这种疾病的患者或有这种疾病风险的人提供了一种治疗手段。
另一方面，用本发明的上述化合物可以制备成药物组合物，即含一种或多种选自式I、II、III、IV、V和/或VI结构的化合物的游离形式或药物可接受的盐形式和至少一种药物可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂形成的组合物。优选化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)。更优先选化合物IV，V，X和/或XI。
本发明所述的单个化合物或一组化合物包括这些化合物药物可接受的盐(除非有明确的相反指示)、前体药和所有的立体异构体及其混合物。
附图说明
图1：本发明相关化合物在人肝微粒体中的代谢稳定性。化合物I-XIII(1μM)分别与人肝微粒体(0.5mg/mL)在含有10mM MgCl2，1mM NADPH和2mM UDPGA的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中孵育至多1小时。孵育温度为37℃，并在特定时间点定量采取孵育液，用于LC-MS/MS测定化合物浓度。
图2：化合物IV和达沙替尼在Sprague-Dawley大鼠单次口服给药后的血浆药物浓度对时间的曲线。化合物IV和达沙替尼一起口服灌胃给药，各自剂量为2.5mg/kg。
图3：化合物III和V在Sprague-Dawley大鼠单次口服给药后的血浆药物浓度对时间的曲线。化合物III和V一起口服灌胃给药，各自剂量为2.5mg/kg。
图4：化合物X和III在Sprague-Dawley大鼠单次口服给药后的血浆药物浓度对时间的曲线。化合物X和III一起口服灌胃给药，各自剂量为5mg/kg。
图5：化合物XI和达沙替尼在Sprague-Dawley大鼠单次口服给药后的血浆药物浓度对时间的曲线。化合物XI和达沙替尼一起口服灌胃给药，各自剂量为5mg/kg。
图6：化合物X和达沙替尼在小鼠单次口服给药后肺组织浓度与血浆浓度平均比值对时间的曲线。化合物X和达沙替尼一起口服灌胃给药，各自剂量为5mg/kg(2合1给药，N＝3)。
图7：化合物XI和达沙替尼在小鼠单次口服给药后肺组织浓度与血浆浓度平均比值对时间的曲线。化合物XI和达沙替尼一起口服灌胃给药，各自剂量为5mg/kg(2合1给药，N＝3)。
具体实施方式
以下定义适用于本申请，除非另外明确指出。
“化学结构”或“亚化学结构”是指任何由可定义的原子或原子组构成的单独可识别的分子、分子的一部分(比如取代基部分)、被任选取代的分子核和其他类似的结构。通常，配体的化学亚结构可以在配体与靶分子的结合中起作用，或者可以影响配体的三维形状、静电荷和/或构象性质。
“前体药物”是指一种可在体内通过一个或多个步骤或代谢过程，或以其他方式转化为具有生物学、药学或治疗活性的化合物形式。为了制备前体药，对活性化合物进行修饰，使被修饰的前体药通过代谢或水解过程重新获得活性。
“结合”与靶点和潜在结合化合物之间的相互作用有关，通常是指与蛋白质的特异性结合，这种结合与非特异性结合相比有统计学的显著性差异。
如本发明所用，术语“调节”或“调节的”是指改变生物活性，特别是改变特定生物分子如蛋白激酶有关的生物活性的作用。例如，特定生物分子的激动剂或拮抗剂通过增加(例如激动剂、激活剂)或减少(例如拮抗剂、抑制剂)其活性来调节这一生物分子例如酶的活性。通常分别以活化剂或抑制剂的半最大效应浓度(EC50)或半抑制浓度(IC50)来表示这类活性。另外，抑制活性可以以百分比抑制和/或Ki表示。
关于发明化合物所使用的术语“合成”或相似的术语是指由一种或多种前体材料进行的化学合成。此外，“测定”是指建立实验条件和收集在实验条件下产生的特定结果的数据。例如，酶的活性可以通过其作用于可检测底物的能力来测定。化合物或配体可通过其结合特定目标分子的能力来测定。
“D”、“d”和“2H”是指氘原子，是质量(原子量为2.0144)为其两倍的氢的稳定同位素。氢自然地以同位素氢(1H)、氘(2H或D)和氚(3H或T)的混合物形式存在，其中氘的天然丰度约为0.015％。本领域技术人员都了解，所有含有氢原子的化合物实际上是作为H和D同位素的混合物存在的，其中约0.015％是氘同位素。氘水平高于其天然丰度0.015％的化合物被认为是非自然的，因此相对于其天然丰度对应物来说是新的化合物。本发明结构式和化学化合物中的D是指D的掺入的量大于0.015％.
“低级烷基”是本领域公认的饱和脂族基团，包括直链烷基和支链烷基。在某些实施方案中，一条直链或支链烷基在其骨架中具有约6个或更少的碳原子(例如：直链C1-C6、支链C3-C6)。
“低级链烯基”是指具有至少一个碳—碳双键的不饱和直链或支链烃，例如2-6个碳原子的直链或支链基团，在此称为C2-C6链烯基。
“环烷基”是指含有3-7个碳原子的环烃，包括任选地被烷基、烯基、烷氧基，以及任选地被氨基、卤素、氰基(-CN)或硝基(-NO2)取代C3-C7单环。
“烷氧基”或“烷氧基”在本领域公认是指如上所定义的含氧的烷基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
“杂环”“杂环的”是指具有5-10个原子的、完全饱和以及不饱和的、至少含有一个碳原子的环，其中环中至少有一个杂原子(例如氧(“O”)、硫(“S”)或氮(“N”))，包括非芳香族(即“杂环烷基”)和芳香族(即“杂芳基”)。每个杂环可以具有1、2、3或4个杂原子，其中的杂原子氮和硫可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。进一步，杂环可以任选地被氨基(-NR5R6)取代，其中R5和R6分别是氢和/或低级烷基、羟基(-OH)、烷氧基、低级烷基或低级烯基，其中低级烷基或低级烯基可以任选被-OH或烷氧基取代。
“卤素”是指氯(“Cl”)、氟(“F”)、溴(“Br”)或碘(“I”)。
本发明提供的化合物可以包含手性中心，可以是(R)或(S)构型，或者是它们的混合物。因此，本发明提供的化合物可以是纯的对映异构体，或其立体异构体或非对映异构体混合物，其中包括外消旋混合物(约50：50比例的对映异构体)。
“药物可接受的”是指所述的材料不会让合理谨慎的医师在考虑到需要治疗的疾病或病症以及相应的给药途径时，避免给患者使用。例如，通常要求用于注射用材料起码是无菌的。
“药物可接受的盐”是指在其使用的剂量和浓度下无毒的盐。这种盐的制备可以通过改变化合物的物理特性而不妨碍其发挥生理作用来促进药理学应用。
“药物可接受的组合物”是指活性化合物和一种或多种药物可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂的组合物。
“治疗有效”或“有效剂量”是单次或多次、单独或与其它治疗药物一起产生疗效的药物制剂的量。这可能包括阻止疾病的进展或延迟发作或预防疾病或病症的发生，也可能意味着仅暂时减缓疾病或病症。
“蛋白激酶介导的疾病或病症”是指一种疾病或病症的发生、发展和/或疾病的症状受蛋白激酶生物学功能的影响。
“突变体”是指与野生型蛋白质氨基酸序列相比，蛋白质中的一个或多个氨基酸发生改变。
在本说明书全文的描述和权利要求中，词语“包括”和这个词的变异形式(诸如“包括着”和“包含”)意味着“包括但不限于”，并且没有排除其他用法的意图,例如添加剂、组分、整体或步骤。
本发明的化合物
一方面，本发明提供了以下式I的化合物：
其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物；
其中，W1、W2和W3分别为氢或氘；Y是碳或氮；R1是—Q—A，其中，Q是直接将A与环碳原子连接的单键，或者将A与环碳原子连接的亚甲基或亚乙基；
A是
其中，Y1和Y2分别为碳或氮；
Z1和Z2分别为氢、-(CH2)n-OR5或-NR5R6；所述-(CH2)n-OR5，其中n为0-4的整数，R5为氢、低级烷基或低级链烯基，条件是当n为1且R5为氢时，R1不是1-哌啶基，另一个条件是当n是2，且R5是氢，R1是1-哌嗪基时，W2是氘；所述-NR5R6中，R5和R6分别为氢、低级烷基或低级链烯基；
T1和T2分别为0-4的整数，条件是当T1或T2为0时，–(CH2)T1或–(CH2)T2是单键，以及T1和T2不会同时为0；
R2和R3分别为氢、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基被任选一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基是甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基；
R1、R2和R3的位置可以交换。
优选W2是氘或氢，更优选氢，并且W1和W3是氢。Y优选是氮。R2优选是低级烷基，更优选甲基。R3优选为低级烷基或氢，更优选为氢。R1优选为取代或未取代的饱和五元或六元含氮杂环。取代或未取代的饱和五元含氮杂环可以是取代或未取代的吡咯烷-1-基，优选3-羟基-或3-氨基-吡咯烷-1-基，更优选3-羟基吡咯烷-1-基。
一方面，本发明提供以下式II的化合物
其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：
式中，W1、W2和W3分别为氢或氘；Y是碳或氮；
R2、R3和R4分别为氢、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基被任选一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基是甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基；且
X分别为氢、-(CH2)n-OR5或–NR5R6；所述-(CH2)n-OR5，其中n为0-4的整数，R5为氢、低级烷基或低级链烯基；所述-NR5R6中，R5和R6分别为氢、低级烷基或低级链烯基。
优选W2是氘或氢，更优选氢，并且W1和W3是氢。Y优选是氮。R2优选是低级烷基，更优选甲基。R3优选为低级烷基或氢，更优选为氢。R4优选为低级烷基或氢，更优选为氢。X优选为氢，羟基或胺，更优选为羟基。
一方面，本发明提供以下式III的化合物：
其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：
其中W1、W2和W3分别为氢或氘；R2、R3和R4分别为H、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基可被一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基。
优选W2是氘或氢，更优选氢，并且W1和W3是氢。Y优选是氮。R2优选是低级烷基，更优选甲基。R3优选为低级烷基或氢，更优选为氢。R4优选为低级烷基或氢，更优选为氢。
本发明提供了下列式IV和式V的化合物及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：其中W2是氢或氘：
其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：其中W2是氢或氘。
一方面，本发明提供了以下式V的化合物：
示例性化合物
本发明提供以下式I～式XIV结构的化合物以及其所有的盐和前体药：
蛋白激酶靶点及本发明适用症
蛋白激酶在调节广泛多样的生物信号通路以及维持对细胞功能的控制方面起着关键作用。因此，以蛋白激酶为靶点的药物研发在小分子药物干预治疗方面引起了广泛的关注。目前已经发现了500多种蛋白激酶，有些特定激酶的功能和疾病的发生、发展、治疗密切相关。一方面，本发明提供了治疗人或者动物由蛋白激酶介导引起的疾病或病症的方法。这些疾病包括但不限于自身免疫性疾病、过度增殖性疾病、癌症、心血管疾病、炎性疾病、神经性疾病以及其他类的疾病或病症。
进一步讲，本发明所述的蛋白激酶介导的疾病或病症是指自身免疫性疾病或癌症。更进一步讲，是指至少一种下面列出的自身免疫性疾病或癌症：系统性红斑狼疮(SLE)、移植排斥、多发性硬化症(MS)、系统性硬化症(SSc)、原发性干燥综合征(pSS)、类风湿性关节炎(RA)、牛皮癣、费城染色体阳性慢性粒细胞白血病(Ph+CML)、费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、华氏巨球蛋白血症(WM)、T细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
另一方面，本发明也提供了一种调节蛋白激酶活性的方法，其中的蛋白激酶包括ABL、ACK、ARG、BLK、BMX、BRK、BTK、CSK、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA1、FGR、FMS、FRK、FYN、HCK、KIT、LCK、LYN、PDGFRα、PDGFRβ、SRC、SRM、YES、PIK3CA/PIK3R1。本方法包括给予有效剂量的一个或多个含有式I、II、III、IV和/或V结构的化合物，优先从化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)中选一个或多个化合物，更优先从IV、V、X和/或XI中选一个或多个化合物。这里激酶命名法中使用的字母的大写和小写在本发明中可互换使用。
本发明提供了治疗动物蛋白激酶介导的疾病或病症的方法。本方法包括给受试动物使用有效剂量的一个或多个含有式I、II、III、IV和/或V结构的化合物，优先从化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)中选一个或多个化合物,更优先从IV、V、X和/或XI中选一个或多个化合物。
本发明也提供了治疗由ABL、ACK、ARG、BLK、BMX、BRK、BTK、CSK、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA1、FGR、FMS、FRK、FYN(a)、FYN(b)、HCK、KIT、LCK、LYNa、PDGFRα、PDGFRβ、SRC、SRM、YES、PIK3CA/PIK3R1等蛋白激酶介导引起的疾病或病症的方法。治疗的方法包括给予一个或多个有效剂量的含有式I、II、III、IV和/或V结构的化合物，优先从化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)中选一个或多个化合物，更优先从IV、V、X和/或XI中选一个或多个化合物。
用于测定活性调节剂对特定激酶或激酶组活性和/或特异性的方法有许多种。除了在下面实施例中提到的测定方法之外，普通技术人员根据具体情况可以使用或修改其他方法用于激酶活性和/或特异性的测定。
体外激酶活性测定法被用来测定本发明化合物对蛋白激酶活性的抑制。用常规的筛选方法测定了包括ABL、ABL(E255K)、ACK、ARG、BLK、BMX、BRK、BTK、CSK、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA1、FGR、FMS、FRK、FYN、HCK、KIT、LCK、LYN、PDGFRα、PDGFRβ、SRC、SRM、YES和PIK3CA/PIK3R1在内的蛋白激酶(参见实施例15)。化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、和XIII对BTK、BMX、ABL、ABL(E255K)、SRC、ACK、ARG、BLK、DDR2、EPHA、FGR、FMS、FRK、FYN、HCK、LCK、LYN、PDGFRα、PDGFRβ、YES、以及PIK3CA/PIK3R1蛋白激酶的活性显示了很强抑制作用。
在上面提到的检测蛋白激酶抑制的体外测定法中(参见实施例15)，化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII在10nM浓度下对下列蛋白激酶活性的抑制大于50％：BTK、BMX、ABL、ABL(E255K)、SRC、ACK、ARG、BLK、DDR2、EPHA1、FGR、FMS、FRK、FYN(a)、HCK、LCK、LYNa、PDGFRα、PDGFRβ、YES和PIK3CA/PIK3R1。
在对本发明化合物进一步的细胞生物活性测试中发现，化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞株SU-DHL-4和SU-DHL-6以及慢性骨髓性白血病细胞株K-562细胞生长均有强的抑制作用，其IC50值均小于20nM(参见实施例16)。
化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV的蛋白激酶靶点包括但不限于以下的蛋白激酶：ABL、ACK、ARG、BLK、BMX、BRK、BTK、CSK、DDR1、DDR2、EGFR、EPHA1、FGR、FMS、FRK、FYN、HCK、KIT、LCK、LYN、PDGFRα、PDGFRβ、SRC、SRM、YES和PIK3CA/PIK3R1。
Tec激酶家族是继Src激酶家族(SFK)之后的第二大类胞质蛋白酪氨酸激酶，由五个成员组成：即Btk、Bmx(X染色体上的骨髓激酶，也称为Etk)、Itk(IL-2诱导型T细胞激酶)、Rlk(静止淋巴细胞激酶，也称为Txk)和Tec(Hartkamp et al.Bruton’s tyrosine kinase inchronic inflammation：from pathophysiology to therapy.Int J InterferonCytokine Mediat Res.2015；7：27-34)。大多Tec家族的激酶主要表达在造血系统中，但Tec和Bmx在基质组织(例如肝脏)和内皮细胞中也有表达。Tec家族激酶细胞表面受体的激活需要蛋白质重新定位到质膜来触发。这个过程是由活化的磷脂酰肌醇-3催化PH区域与脂质磷脂酰肌醇(3,4,5)P3的相互作用来完成。随后通过SFK的磷酸化和酪氨酸223的自磷酸化导致Tec家族激酶的完全激活。
BTK是Tec激酶家族的重要成员，BTK基因突变能导致男性产生与X染色体相关的无丙种球蛋白血症，也能使小鼠产生X相关的免疫缺陷。BTK是B细胞发育、激活、信号传导和生存的关键调节者(Hartkamp id)。另外，BTK在许多其他造血细胞的信号传导中也起重要作用，例如Toll样受体(TLR)和细胞因子受体介导的TNF-α在巨噬细胞中的产生，IgE受体(FcepsilonR1)在肥大细胞中的信号传导，B系淋巴样细胞中Fas/APO-1细胞凋亡信号的抑制以及胶原刺激的血小板聚集。BTK和Tec家族的其他成员在很多自身免疫性疾病中扮演了重要角色，如系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症(MS)，1型糖尿病(T1D)，系统性硬化症(SSc)，原发性干燥综合征(pSS)和类风湿性关节炎(RA)。BTK抑制剂依鲁替尼(ibrutinib)对B细胞恶性肿瘤表现出高度的临床活性，尤其是对慢性淋巴细胞白血病(CLL)，套细胞淋巴瘤(MCL)和华氏巨球蛋白血症(WM)的患者。但是，依鲁替尼的抗药性已经在接受治疗患者的亚组中得到证实。抗药性主要是因为产生了BTK C481S的突变(Woyach J Ael al，Bruton's tyrosine kinase inhibitor ibrutinib.N Engl J Med.2014；370(24)：2286-94)。
酪氨酸激酶BMX调节由TNF诱导的炎症，也通过调节TAK1-TAB复合物来调控其他产生类似炎症的介质。(Gottar-Guillier M et al.The tyrosine kinase BMX is an essentialmediator of inflammatory arthritis in a kinase-J Immunology.2011；186(10)：6014)。BMX激酶可能与胶质母细胞瘤，前列腺癌，乳腺癌和肺癌的发病相关。已有报道显示BMX有潜力与放射线合用抗血管增生或用作化疗中的敏化剂。(Jarboe JS等，Mini-review：bmx kinase inhibitors for cancer therapy.Revat A Pat Anticancer DrugDiscov.2013；8(3)：228-38)。
Src蛋白激酶家族激酶(SFK)由11种非受体酪氨酸激酶组成，包括Src、Fyn、Yes、Blk、Yrk、Frk(也称为Rak)、Fgr、Hck、Lck、Srm和Lyn(Sen B，Johnson FM.Management of SRCfamily kinases in human cancers.J Signal Transduct.2011：ID865819)。Src存在于角质形成细胞中，Blk、Fgr、Hck、Lck和Lyn主要存在于造血细胞中,而Frk则主要表达在膀胱、乳房、脑、结肠和淋巴细胞中。Src家族的激酶参与了许多种细胞的增殖和迁移反应。
Src是在多个细胞信号传导中起不同作用的非受体蛋白酪氨酸激酶。Src参与许多细胞功能控制，包括细胞粘附、生长、运动和分化。Src在多种细胞类型中有广泛的表达，而且可以表达在细胞内不同的位置。众多人类恶性肿瘤显示SRC的表达和活性增加，表明SRC可能与肿瘤发生密切相关。SRC抑制剂bosutinib已经被用于治疗费城染色体阳性慢性粒细胞白血病(Ph+CML)，而saracatinib也已被用来研究治疗老年痴呆(Alzheimer’s disease)和精神分裂症的可能性。
ABL是存在于细胞质和细胞核的酪氨酸蛋白激酶，影响到细胞的分化、分裂、粘附和应激反应过程(Hantschel.Of Structure，regulation，signaling，and targeting of ablkinases in cancer.Genes Cancer.2012；3：436-46)。ABL突变与癌症密切相关，例如慢性粒细胞白血病(CML)，急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)。几种ABL抑制剂如伊马替尼(imatinib)，达沙替尼(dasatinib)和尼罗替尼(nilotinib)已被用于治疗CML，ALL和AML。达沙替尼是一种强效的BCR-ABL抑制剂，用于治疗不同期的费城染色体阳性慢性粒细胞白血病(Ph+CML)和费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)而患者对先前使用的伊马替尼治疗具有抗药性或不耐受性。但有报道达沙替尼与胸腔积液和肺动脉高压等严重呼吸毒性有关，这可能是因为达沙替尼在肺组织中积聚的结果。(Quintás-Cardama A等人，用伊马替尼治疗后使用达沙替尼治疗慢性粒细胞白血病患者的胸腔积液JClin Oncol.2007；25(25)：3908-14；Guignabert C等，达沙替尼诱导肺血管毒性及易发生肺动脉高压的倾向J Clin Invest.2016；126(9)：3207-18)。
LCK是由染色体Ip34.3编码的分子量为57.9kDa的细胞膜非受体酪氨酸激酶。蛋白质结构包含SH3和SH2结构域。LCK抑制剂可用于治疗急性淋巴细胞白血病、T细胞淋巴瘤、淋巴细胞减少症、肾癌、结肠癌、严重联合免疫缺陷、多发性硬化症、炎性肠和I型糖尿病。
Frk是由染色体6q21-q22.3编码的分子量为58.5kDa酪氨酸激酶。其蛋白结构包含SH2，SH3以及酪氨酸激酶结构域。抑制Frk可以帮助抑制I型糖尿病中的β细胞破坏,所以Frk抑制剂可用于治疗I型糖尿病.另外Frk抑制剂也可用于治疗急性骨髓性白血病。
Fyn是由染色体6q21编码的分子量为60.6kDa的非受体酪氨酸激酶。Fyn参与调节肥大细胞脱颗粒，这个过程是在蛋白激酶C和钙的水平上由Fyn和Lyn协同来实现的。Fyn抑制剂可用于治疗老年痴呆，精神分裂症和预防癌转移，例如在黑色素瘤和鳞状细胞癌中的转移。
HCK是由染色体20q11.2编码的分子量为59.5kDa的酪氨酸激酶。蛋白质结构包含SH3，SH2和二分子激酶结构域。HCK抑制剂可用于治疗慢性骨髓性白血病和急性淋巴细胞性白血病。
Kit是由染色体4q12编码的分子量为109.9kDa的跨膜酪氨酸激酶。Kit在黑色素细胞、肥大细胞、胚芽细胞和造血细胞的发育中起着重要的作用。Kit的异常表达和/或激活涉及多种病理状态。kit抑制剂可用于治疗恶性肿瘤，包括肥大细胞肿瘤、小细胞肺癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤(GIST)、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成神经细胞瘤、女性生殖道癌、神经外胚层来源的肉瘤、结直肠癌、与神经纤维瘤病有关的许旺氏细胞瘤、急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、肥大细胞增生症、黑色素瘤和肥大细胞瘤，以及炎症性疾病，包括哮喘、类风湿性关节炎、过敏性鼻炎、多发性硬化症、肠综合征、移植排斥和嗜酸性粒细胞增多症。
LCK是由染色体Ip34.3编码的分子量为57.9kDa的细胞膜非受体酪氨酸激酶。蛋白质结构包含SH3和SH2结构域。LCK抑制剂可用于治疗急性淋巴细胞白血病、T细胞淋巴瘤、淋巴细胞减少症、肾癌、结肠癌、严重联合免疫缺陷、多发性硬化症、炎性肠和I型糖尿病。(重复)
血小板源生长因子受体(PDGF-R)是血小板源生长因子家族(PDGF)的细胞表面酪氨酸激酶受体。PDGF有两个亚基(-A和-B)组成,是影响细胞增殖、分化、生长、发育以及包括癌症在内的许多疾病发生的重要因素。有两种不同的血小板源生长因子受体，即α和β，分别由不同的基因编码。PDGFRα是由染色体4q12编码的分子量为122.7kDa跨膜酪氨酸激酶(代码：PDGFRA)。PDGFRβ是由染色体5q31-q32编码的分子量为124.0kDa跨膜酪氨酸激酶(代码：PDGFRB)。PDGFR抑制剂可用于治疗各种疾病，例如特发性嗜酸性粒细胞过多综合征，慢性嗜酸细胞性白血病，神经胶质瘤，胃肠道间质瘤(GIST)，青少年骨髓单核细胞性白血病，转移性成神经管细胞瘤，动脉粥样硬化和再狭窄。
Yes是由染色体18p11.31-p11.21(代码：YES1)编码的分子量为60.8kDa酪氨酸激酶。Yes的结构包含SH3和SH2结构域，后面跟着一个TK结构域。YES癌基因与山口肉瘤病毒基因同源，氨基酸序列与Roussarcoma病毒的SRC基因产物高度同源。Yes激酶在多种哺乳动物各类细胞中高度表达，包括神经元、精子、血小板和上皮细胞。在多种癌症中发现Yes激酶被扩增和过度表达,所以Yes抑制剂可用于治疗多种癌症包括食管鳞状细胞癌。
一方面，式I、II、III、IV和V结构的化合物，优先从化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV选，包括它们的盐、前体药物和/或异构体，可以制备成药物，用来治疗由蛋白激酶介导引起的疾病或病症，尤其是自身免疫性疾病或癌症。
式I、II、III、IV和V结构的化合物以及化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和XIV，及其它们的盐、前体药物和/或异构体作为药物的用量，可以通过常规方法来确定。常规方法通常考虑下列因素：化合物的IC50值、生物半衰期以及病人的年龄、身材、体重和其它相关的状况。一般来讲，临床试验中的常规部分可确定每种药物获得最佳疗效的用量范围。对特定患者，要根据其状况和对药物的反应性，将用量调整到有效和安全的范围内。考虑到诸如年龄、性别、患者状况和身材等因素，最终的用药方案将根据主治医师的判断进行调整。通常，活性化合物的剂量范围可以从每天约0.01mg/kg到每天约1000mg/kg。本发明所述的化合物可以是单次给药或多次重复给药。
临床前药代动力学
体外代谢稳定性：化合物I-XIII和达沙替尼在人肝微粒体中进行了体外代谢稳定性研究(实验条件见实施例17)。这项研究的结果如图1和表1所示。
与达沙替尼相比，化合物I、IV、V、VI、VII、VIII、X、XI、XII和XIII表现出明显高的代谢稳定性。这些化合物在体外测定的半衰期(t1/2)均长于59分钟，而达沙替尼只有16分钟。这个体外代谢半衰期的显著增加是出乎意料的，意味着这些化合物在人体内的血浆半衰期也会长于达沙替尼。基于上面的数据可以预测这些化合物具有比达沙替尼更有利的药代动力学特征，特别是有更长的半衰期、更长的持续作用时间、更少的首过效应和更高的口服生物利用度。化合物I、IV、V、VI、VII、VIII、X、XI、XII和XIII的内在清除率都小于24μL/min/mg，而达沙替尼是88μL/min/mg。
化合物III是达沙替尼氘代化合物，显示了与达沙替尼具有相似的体外代谢稳定性(图1、表1)。这是一个意外的发现，在以前的报道中，达沙替尼在2-氯-6-甲基苯环的4-位上的羟基化是其氧化代谢的主要途径，当4-位氢被氘取代后，应该能阻断其氧化代谢，从而明显提高在肝微粒体中的代谢稳定性(Christopher LJ et al.Biotransformation of[14C]dasatinib：in vitro studies in rat，monkey，and human and disposition afteradministration to rats and monkey.Drug Metab.Dispos.2007；36(7)：1341-1356)。但实验结果却不是这样。
与达沙替尼和其氘代化合物相比，化合物I、IV、V、VI、VII、VIII、X、XI、XII和XIII在人肝微粒体中的代谢稳定性却出乎意料的显著增加。
表1人肝微粒体中化合物的体外半衰期(t1/2)和内在清除率(CLint)
*化合物I～XIII(1μM)分别与人肝微粒体(0.5mg/mL)在含有10mM MgCl2，1mM NADPH和2mM UDPGA的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中孵育至多1小时。孵育温度为37℃，并在特定时间点定量采取孵育液，用于LC-MS/MS测定化合物浓度。
体内药代动力学
通过口服和静脉给药研究了化合物III、IV、V、X、XI和达沙替尼在大白鼠体内的药物代谢动力学特征(实施例18为实验条件)。二个化合物同时给药(n＝2)，分以下4组：化合物IV和达沙替尼、化合物V和化合物III、化合物X和达沙替尼、化合物XI和化合物III。
结果显示在图2～图5以及表2和表3中。
表2化合物III、IV、V和达沙替尼大鼠给药的药代动力学数据(实施例18)
上表中，Dose：剂量；Cmax：口服给药后的血浆最高浓度；Tmax：口服给药后达到最高血浆浓度的时间；AUClast：血浆浓度-最后可检测浓度的时间曲线下面积；AUCinf：血浆浓度-时间曲线下的面积外推到时间无穷大；t1/2：血浆浓度半衰期；CL：血浆清除率；V-表观分布容积；F(％)：生物利用度
表3化合物III、X、XI和达沙替尼在大鼠中静脉或口服给药后的药代动力学参数
上表中，Dose：剂量；Cmax：口服给药后的血浆最高浓度；Tmax：口服给药后达到最高血浆浓度的时间；AUClast：血浆浓度-最后可检测浓度的时间曲线下面积；AUCinf：血浆浓度-时间曲线下的面积外推到时间无穷大；t1/2：血浆浓度半衰期；CL：血浆清除率；V-表观分布容积；F(％)：生物利用度
口服给药后，化合物IV、V、X和XI血浆峰值(Cmax)明显高于达沙替尼。化合物IV、V、X和XI的Cmax值分别是82±13，35±19，93±101和102±86ng/mL，达沙替尼的Cmax值是15±5和7±7ng/mL，达沙替尼的氘代化合物(化合物III)的Cmax为9±6和11±11ng/mL。化合物IV、V、X和XI的口服生物利用度(F％)分别为为18.9±6.7，11.1±4.3，18.9±2和24±33.1，而达沙替尼口服生物利用度(F％)是3.9±1和9.8±3.6，达沙替尼的氘类似物(化合物III)的口服生物利用度(F％)是6±0.9和7.2±4.2。该研究结果还显示化合物IV、V、X和XI的血浆清除率明显低于达沙替尼和化合物III，体内血浆清除率的结果与体外代谢稳定性的数据是一致的。
另外，化合物IV、V、X和XI的表观分布容积非常明显低于达沙替尼和化合物III，表明这些化合物不会像达沙替尼和化合物III那样广泛地分布到组织中去。这个结果进一步说明化合物IV、V、X和XI诱发器官毒性的可能达沙替尼低。
上述结果表明，与达沙替尼相比，嘧啶环-4位取代产生的这些新化合物(化合物IV、V、X和XI)显著地改变了其药代动力学的特征。
体内组织分布：口服灌胃给药后，在小鼠中测定了化合物X、XI和达沙替尼在肺组织和血浆中的浓度以及其比率(实验条件请参见实施例19)。结果显示在图6和图7中。
在所有测试的时间点，化合物X和XI在肺组织和血浆中的浓度比率(C肺/C血浆)都明显低于达沙替尼(图6和图7)。这些结果显示与达沙替尼相比，化合物X和XI更少地分布于肺组织中。
有文献报道达沙替尼与严重的呼吸毒性相关，如胸腔积液和肺动脉高压。这个肺毒性被认为是由于达沙替尼在肺组织中的积聚造成的。(Quintás-Cardama A et al.Pleuraleffusion in patients with chronic myelogenous leukemia treated with dasatinibafter imatinib failure.J Clin Oncol 2007；25(25)：3908-14；Wang X etal.Differential effects of dosing regimen on the safety and efficacy ofdasatinib：retrospective exposure–response analysis of a Phase III study.ClinPharmacol，2013；5：85-97；Guignabert C et al.Dasatinib induces lung vasculartoxicity and predisposes to pulmonary hypertension.J Clin Invest 2016；126(9)：3207-18；Iurlo A，et al.Pleural effusion and molecular response in dasatinib-treated chronic myeloid leukemia patients in a real-life Italian multicenterseries.Ann Hematol.2017；Oct 2.Doi：10.1007/soo277-017-3144-1)。
与达沙替尼相比，化合物X和XI从血浆分布到肺组织中的比率明显降低。这是一个意想不到的发现，说明这些化合物在肺组织中积聚的少，因此导致肺毒性的潜在性低。
联合治疗
具有多个不同药理活性的化合物可以组成联合用药。这些活性化合物可以包括一个或多个具有式I、II、III、IV和V结构的化合物，优先从化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)中选一个或多个化合物，更优先从化合物IV、V、X和/或XI中选一个或多个化合物，包括它们的盐、前体药物和/或异构体，以及对治疗相同疾病或病症有附加或协同作用其它药物。
更优选的是，本发明提供了用于治疗人或动物由蛋白激酶功能异常介导的疾病或病症的联合治疗方法，即联合其它治疗措施向受施者使用有效剂量的一个或多个具有式I、II、III、IV和/或V的化合物，优先从化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)中选一个或多个化合物，更优先从化合物IV、V、X和/或XI中选一个或多个化合物，包括这些的盐、前体药物和/或异构体。这里所指其他治疗措施可以包括医疗程序(例如手术)、药物治疗和/或放射治疗。药物治疗包括使用化学药物、生物制剂和免疫制剂的治疗。联合治疗可以包括与其它一种或多种治疗措施同时使用或者在不同时间使用本发明所包括的一个或多个化合物。在一些实施例中，可以对本发明的一个或多个化合物或其他联合使用的药物进行剂量调整，比如与单独使用时的剂量相比减少剂量。
可以理解的是，联合治疗包括与其他治疗措施包括医疗程序、治疗方法和药物治疗的合用，其中其他治疗措施可以在短时间内实施，比如1、2、3或者4-24小时，也可以在长时间内实施，比如1-2天、2-4天、4-7天或1-4周内。本发明化合物可以与一次性的或不常使用的医疗程序(例如手术)联合实施，可用在实施这些医疗程序之前或之后，或长或短的时间内使用。
给药方式
本发明所述方法和化合物通常用于治疗人类由激酶介导引起的疾病或病症。但是也可以用于其他动物相似的或相同的适应症。在本发明中，术语“受试者”、“动物受试者”及类似的描述是指人类和非人类的脊椎哺乳动物，例如非人类灵长类动物，竞赛类和商业类动物，例如马科、牛科、猪科动物、羊、啮齿动物以及像犬科动物和猫科动物类的宠物。
具有有结构式I、II、III、IV和V的化合物，进一步讲是化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV，更进一步讲是化合物IV、V、X和XI在某些情况下可形成盐，这些盐也包括在本发明涵盖的范围内。本发明所用的术语“盐”表示与无机和/或有机酸和碱形成的酸性盐和/或碱性盐。
与酸形成盐的例子包括有乙酸盐(例如用乙酸或三卤乙酸如三氟乙酸形成的盐)、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、水杨酸盐、丙酸盐等。
与碱形成盐的例子包括有铵盐、碱金属盐(如钠盐、锂盐和钾盐)、碱土金属盐(如钙盐和镁盐)、以及与有机碱(例如有机胺)形成的盐等。
包括化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)在内的式I、II、III、IV和V结构的化合物及其盐、前体药物和/或异构体可以通过静脉内、肌内、皮下、口服、透皮、透粘膜、直肠或吸入给药。静脉内给药可以是静脉推注或输液。
用于口服使用的药物可以是由一个或多个具有式I、II、III、IV和V结构的化合物，优先选化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)，更优先选化合物IV、V、X和/或XI，以及它们的盐、前体药物和/或异构体与固体赋形剂混合，研磨后加入合适的助形剂(如果需要)再加工成片剂或糖衣丸。合适的赋形剂包括像糖类填充剂(例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇)；纤维素制剂(例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮)等。如果需要的话，还可以加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸、或者海藻酸盐(例如海藻酸钠)。
注射用药可以是由一个或多个具有式I、II、III、IV和V结构的化合物，优先选化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII和/或XIV(化合物I-XIV)，更优先选化合物IV、V、X和/或XI，以及它们的盐、前体药物和/或异构体在无菌液体溶液中配制，优先选用生理兼容的缓冲溶液和溶液，例如生理盐水、Hank's溶液或林格溶液。另外，化合物也可以做成固体制剂，在使用前溶解或悬浮，也可以是冷冻干燥形式。
本发明所述的化合物可以与化疗或者放疗同时或相继使用。众所周知，在治疗疾病或病症的过程中，其他治疗方式或者药物可以使用与本发明的化合物相同的或不同的给药途径。
另一方面，本发明的化合物可以以任何给药方式与一种或多种其他药物联合使用，包括使用任何剂型以相同的途径同时给药，或是分别在1小时、2小时、3小时，最多24小时内，使用由不同剂型以不同的途径给药。
本发明也提供了一种组合的药物制剂方法(例如试剂盒)，其包含(a)一个或多个在此公开的本发明化合物的游离形式或药学接受的盐的形式，和(b)至少有一种合用的其他成分。试剂盒可以包含使用说明。
一般合成方法
本发明还包括用于制备新的氘代和氘代的化合物的合成方法。在所描述的反应中，可能有必要保护反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫基或羧基(在最终产物中需要这些官能团)，以避免它们参与不希望地反应。常规的保护基可以根据标准实践使用，例如参见TW Greene and PGM Wutsin Protective Groups in Organic Chemistry，John Wileyand Sons，1991。
具有结构式I、II、III、IV和V的化合物，包括示例性化合物在内，通常可以通过对下面的合成路线1(和其他适用的合成路线)中的试剂，由实验人员根据专业基本原理的理解，适当的变更来合成。应注意的是，非氘代中间体通常是可商购的，所以可以使用适当的市售中间体，例如化合物7，(参见合成路线8-14中的化合物7H)开始合成。
化合物I可以通过以下合成路线所示的方法合成。
化合物I的合成
化学方法的初始步骤包括使4-溴-2-氯-6-甲基苯胺(1)与烯丙基溴反应以形成中间体2。在氮气下在约-70℃向中间体2的无水四氢呋喃溶液中滴加正丁基锂(约1.5摩尔正丁基锂至1摩尔中间体2)。约40分钟后，用d1-甲醇(CH3OD；99％氘，商品号550574；Lot#MKBW0355V，Sigma-Aldrich，St Louis，MO)淬灭中间的锂配合物以选择性地将氘置于4位并给出中间体3。通过标准方法除去烯丙基保护基，得到苯胺中间体4。使中间体4与3-乙氧基丙烯酰氯反应形成丙烯酰胺中间体5，然后用N-溴代琥珀酰亚胺和硫脲处理，形成噻唑中间体6。用碱氢化钠处理，接着加入4，6-二氯-2-甲基嘧啶，形成2-[(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基]-N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺(中间体7)。使中间体7与哌啶和N，N-二异丙基乙胺反应，形成所需的产物化合物I(8)。
化合物II的合成
在化合物II的合成中，该方法中的前6个步骤与合成化合物I以产生中间体7中使用的那些完全相同。合成的最后一个步骤使用4-羟基哌啶和N，N-二异丙基乙基胺与中间体7反应形成所需的产物化合物II。
化合物III的合成：
在化合物III的合成中，该方法的前6个步骤与用于合成化合物I以制备中间体7的步骤完全相同。合成的最后一步使用1-(2-羟乙基)哌嗪(Sigma-Aldrich；密苏里州圣路易斯)和N，N-二异丙基乙胺与中间体7反应，形成所需的加成产物化合物III。
化合物VI的合成：
在化合物IV的合成中，该方法中的前6个步骤与合成化合物I以产生中间体7中使用的完全相同。中间体7与(S)-3-羟基吡咯烷和N，N-二异丙基乙胺反应以形成所需的产物化合物IV。
化合物V的合成：
在化合物V的合成中，该方法中的前6个步骤与合成化合物I以制备中间体7中使用的那些完全相同。中间体7与(R)-3-羟基吡咯烷和N，N-二异丙基乙胺反应以形成所需的产物化合物V。
化合物VI的合成：
在化合物VI的合成中，该方法的前6个步骤与合成化合物I以制备中间体7所用的完全相同。中间体7与(S)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁酯和N，N-二异丙基乙胺在二恶烷中反应以形成化合物300-100。将化合物300-100脱保护以产生产物化合物VI。
化合物VII的合成：
在化合物VII的合成中，该方法中的前6个步骤与合成化合物I以制备中间体7中使用的完全相同。中间体7与(R)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁酯和N，N-二异丙基乙胺在二恶烷中反应以形成化合物300-98。将化合物300-98脱保护以产生产物化合物VII。
化合物VIII的合成：
在化合物VIII的合成中，使可商购的中间体7H(Combi-Blocks，Inc.，San Diego，CA)与哌啶和N，N-二异丙基乙胺在二氧杂环己烷中反应以形成期望的产物化合物VIII。
化合物IX的合成：
在化合物IX的合成中，使可商购的中间体7H与4-羟基哌啶和N，N-二异丙基乙胺在二氧杂环己烷中反应，形成所需产物化合物IX。
化合物X的合成：
在化合物X的合成中，使可商购的中间体7H与(S)-吡咯烷-3-醇盐酸盐和N，N-二异丙基乙胺在二恶烷中反应，形成所需的产物化合物X.
化合物XI的合成：
在化合物XI的合成中，使可商购的中间体7H与(R)-吡咯烷-3-醇盐酸盐和N，N-二异丙基乙胺在二恶烷中反应，形成所需的产物化合物XI。
化合物XII的合成：
在化合物XII的合成中，使可商购的中间体7H与(S)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁酯和N，N-二异丙基乙胺在二氧六环中反应以形成中间体300-92。中间体300-92脱保护生成化合物XII。
化合物XIII的合成：
在化合物XIII的合成中，可商购的中间体7H与(R)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁酯和N，N-二异丙基乙胺在二氧杂环己烷中反应以形成中间体300-90。中间体300-90脱保护生成化合物XII。
化合物XIV的合成：
在化合物XIV的合成中，可商购的中间体7H与吡咯烷和N，N-二异丙基乙胺在二甲基亚砜(DMSO)中反应以形成化合物XIV。
具体实施方式
以下实施例仅用于举例说明本发明的方法和装置，并不限定本发明的范围。对于本领域技术人员来说，可以对其进行各种修改或改变或使用替代技术，均包括在本发明的精神实质中。
在一些实例中，质谱结果表明由于分子中原子的同位素分布，例如具有溴或氯取代基的化合物，化合物可具有多于一个值。
实施例1N-(2-氯-4-氘-6-甲基-苯基)-2-[[2-甲基-6-(1-哌啶基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物I)
N，N-二烯丙基-4-溴-2-氯-6-甲基苯胺(2)的制备：向250mL烧瓶中加入4-溴-2-氯-6-甲基苯胺(3g，13.61mmol)，二甲基甲酰胺(DMF)(50mL)和碳酸钠(6.37g，60.09mmol，4.4当量)。在氮气和0-5℃条件下，边搅拌，边滴加烯丙基溴(9.4mL，108.62mmol，8当量)。加完后，将混合物在室温下搅拌20分钟，并在120℃氮气下加热3小时，此时TLC分析显示不存在起始材料。然后将该混合物冷却至室温并倒入冷水中，然后用乙酸乙酯(EtOAc)(2×150mL)萃取。将合并的有机层用盐水(3×100mL)洗涤，干燥(硫酸钠，Na2SO4)，减压浓缩，得到黑褐色液体残余物，将其通过柱层析(仅用己烷)纯化，得到中间体2(3.9g，95％)，为浅棕色液体。
N，N-二烯丙基-2-氯-4-氘代-6-甲基苯胺(3)的制备：在氮气和-70℃条件下，向化合物2(2g，6.65mmol)的四氢呋喃(THF)溶液滴加2.5M正丁基锂(4ml，10mmol)溶液。加入后，将混合物在-70℃搅拌40分钟，然后通过滴加氘化甲醇(MeOD)(2mL，49.2mmol，99％氘，#550574：Lot#MKBW0355V，Aldrich，St Louis，MO)淬灭中间的锂配合物。当薄层色谱(TLC)分析(仅用己烷)显示反应完成时，反应混合物在-70℃至-20℃搅拌40分钟。将混合物倒入冷水(100mL)中，然后用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，并减压浓缩。将残余物通过柱色谱纯化(仅用己烷，然后EtOAc：己烷；1：20)，得到浅黄色液体的化合物中间体3(1.38g，93％)。1H NMR(CDCl3)：7.20(s,1H)，7.09(s,1H)，5.95(m,2H)，5.21-5.20(m,4H)，3.79(d,4H)，2.41(s,3H)。1H NMR显示化合物3的4位没有质子信号。
制备2-氯-4-氘代-6-甲基苯胺(4)：向搅拌的苯胺3(3g，13.31mmol)的DCM(130mL)溶液中加入N，N-二甲基巴比妥酸(8.3g，53当量，4当量)和Pd(PPh3)4(0.5g，0.43mmol，0.032当量)。将混合物在氮气下加热回流4小时。TLC分析(EtOAc：己烷：1：9)显示反应完成。混合物冷却至室温后，减压浓缩。将残余物溶于EtOAc(120mL)，有机层用10％碳酸氢钠(NaHCO3)溶液(4×60mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过柱色谱(EtOAc：己烷：1：9)纯化粗产物，得到所需苯胺4(1.67g，88％)，为浅褐色液体。
制备N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)-3-乙氧基丙烯酰胺(5)：向化合物4(460mg，3.23mmol)，吡啶(0.4mL，4.95mmol，1.5eq)和THF(25mL)的混合物中逐滴加入3-乙氧基丙烯酰氯(666mg，4.95mmol，1.5当量)。加完后，将混合物在室温下在氮气下搅拌过夜。TLC分析(EtOAc：己烷；1：2)显示不存在起始材料。将EtOAc(80mL)和水(80mL)加入到混合物中，分离有机层，用1N盐酸(HCl)溶液，水和5％NaHCO3溶液洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到中间体5，为白色固体，将其不经纯化用于下一步。
制备2-氨基-N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺(6)：向丙烯酰胺5(900mg，3.74mmol)，1，4-二恶烷(7mL)和水(7mL)的混合物中加入N-溴代琥珀酰亚胺(730mg，4.10mmol，1.1当量)。浆液在室温下搅拌3小时。加入硫脲(285mg，3.75mmol，1当量)并将混合物加热至80℃。3小时后，将该混合物冷却至室温，随后加入浓氢氧化铵溶液(1mL)。搅拌后，将EtOAc(80mL)和水(80mL)加入到混合物中。将有机层分离并将水层用EtOAc(80mL)萃取。将合并的有机层用水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。将残余物进行柱色谱(EtOAc-己烷，1：4至1：2)，得到呈浅棕色固体的中间体6(0.82g，82％)。液相色谱-质谱(LC-MS)分析显示质子化分子离子在269.14(M+H)。
制备2-[(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基]-N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺(7)：向氢氧化钠(60％，67mg，1.67mmol)和THF(15mL)的混合溶液中，温度为0℃时，分批加入化合物6(150mg，0.56mmol)。将混合物在0℃搅拌30分钟，滴加4，6-二氯-2-甲基嘧啶(109mg，0.67mmol，1.2当量)的溶液。当LC-MS分析显示不存在原料时，将所得混合物在室温下搅拌3小时。浓缩混合物以提供粗制中间体7，将其不经纯化即用于下一步。
制备N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(哌啶-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(8，化合物I)：向未经纯化的化合物7(约0.56mmol)与二恶烷(10mL)混合物中加入哌啶(143mg，1.68mmol，3当量)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(217mg，1.68毫摩尔，3当量)。将混合物在85-90℃在氮气下搅拌20小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。混合物不是清澈的溶液。将混合物浓缩至干，悬浮于含有20％HPLC级水的50mL乙腈中。然后将混合物以4000rpm离心15分钟。沉淀重新悬浮于乙腈中，并以4000rpm再次离心15分钟。最终的颗粒在氮气下干燥，回收为目标化合物I(化合物8)的灰白色固体(12mg)。通过液相色谱-紫外-质谱(LC-UV-MS)确定最终产物的纯度大于95％。LC-MS：444.14(M+H)；1HNMR(DMSO-d6)：11.52(s，1H.NH)，9.82(s,1H,NH)，8.18(s,1H)，7.39(s,1H)，7.21(s,1H)，6.00(s,1H)，3.55(m,4H)，3.22(s,3H)，2.43(s,3H)，1.65(m,6H)。1HNMR显示化合物I的4位没有质子信号。
实施例2制备N-(2-氯-4-氘-6-甲基-苯基)-2-[[6-(4-羟基-1-哌啶基)-2-甲基-嘧啶-4-基]氨基]5-甲酰胺(化合物II)
化合物II是由2-[(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基]-N-(2-氯-4-氘-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺(中间体7)开始，按合成路线2中所示合成。
2-[(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基]-N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺(中间体7)是从4-溴代-2-氯-6-甲基苯胺开始以六个步骤制备，如实例1所述。
制备N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(4-羟基哌啶-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物II)：在室温下，向未经纯化的中间体7(约0.56mmol)的二恶烷(10mL)混合物中加入4-羟基哌啶(170mg，1.68mmol，3当量)和DIEA(217mg，1.68mmol，3eq)。将混合物在85-90℃在氮气下搅拌20小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。混合物不是清澈的溶液。将混合物浓缩至干，然后悬浮于50mL乙腈中。将混合物以4000rpm离心15分钟。将沉淀溶于甲醇中，用柱层析(甲醇-二氯甲烷，1：9)纯化。将仅包含化合物II的柱层析组分合并并在氮气流下干燥，并回收为目标化合物II(17mg)的灰白色固体。通过LC-UV-MS确定最终产物的纯度大于95％。LC-MS：460.14(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：11.42(s，1H.NH)，9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.40(s,1H)，7.24(s,1H)，6.05(s,1H)，4.78(s,1H)，3.95(m,2H)，3.75(m,1H)，3.22(s,3H)，3.18(m,2H)，2.43(s,3H)，1.85(m,2H)，1.35(m,2H)。1H NMR显示在化合物II的4位没有质子信号。
实施例3制备N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(4-(2-羟基乙基)哌啶-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物III)
室温下，向未经纯化的中间体7(约0.56mmol)和二恶烷(10mL)的混合物中加入4-(2-羟乙基)哌啶(219mg，1.68mmol，3当量)和DIEA(217mg，1.68mmol，3eq)。然后将混合物在85-90℃在氮气下搅拌20小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。混合物不是清澈的溶液。将混合物冷却至室温，减压浓缩至干燥，并悬浮于含有20％乙腈的50mL水(HPLC等级)溶液中。然后将混合物以4000rpm离心15分钟。沉淀重新悬浮于乙腈中，并以4000rpm再次离心15分钟。最终的颗粒在氮气下干燥，并回收为灰白色固体的目标化合物III(约40mg)的灰白色固体。LC-MS：489.16(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：11.42(s，1H.NH)，9.83(s,1H,NH)，8.20(s,1H)，7.40(s,1H)，7.24(s,1H)，6.05(s,1H)，4.42(m,1H)，3.35(m,2H)，2.48(m，8H)，2.40(s,3H)，2.15(m,2H)。实施例4制备N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((S)-3-羟基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物IV)
向未经纯化的中间体7(约0.56mmol)和二恶烷(10mL)的混合物中加入(S)-吡咯烷-3-醇盐酸盐(208mg，1.68mmol，3当量)和DIEA(400mg，3.1mmol，5.5当量)。然后将混合物在85-90℃在氮气下搅拌6小时。LC-MS分析显示产物产物质子化分子离子峰。混合物不是清澈的溶液。将混合物冷却至室温并减压浓缩至干，将所得残余物悬浮于50mL乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。然后将沉淀物悬浮在冷却的80％乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀重新悬浮于冷却的80％乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。将上清液合并并浓缩至干，得到目标化合物IV(约60mg)，为灰白色固体。LC-MS：446(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：11.40(s，1H.NH)，9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.40(s,1H)，7.24(s,1H)，5.80(s,1H)，4.98(s,1H)，4.35(s,1H)，2.53(s,3H)，2.20(s,2H)，2.12(s,2H)，1.85(m,2H)。
实施例5制备N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物V)
向未经纯化的中间体7(约0.56mmol)和二恶烷(10mL)的混合物中加入(R)-吡咯烷-3-醇盐酸盐(208mg，1.68mmol，3当量)和DIEA(400mg，3.1mmol，5.5当量)。然后将混合物在85-90℃在氮气下搅拌6小时。LC-MS分析显示产物分析显示产物质子化分子离子峰。。混合物不是清澈的溶液。将混合物冷却至室温并减压浓缩至干，将所得残余物悬浮于50mL乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。然后将沉淀物悬浮在冷却的80％乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀重新悬浮于冷却的80％乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。将上清液合并并浓缩至干，得到目标化合物V(约103mg)，为灰白色固体。LC-MS：446(M+H)；1H NMR(DMSO-dNH)，9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.40(s,1H)，7.24(s,1H)，5.80(s,1H)，4.98(s,1H)，4.35(s,1H)，2.53(s,3H)，2.20(s,2H)，2.12(s,2H)，1.85(m,2H)。
实施例6制备N-(2-氯-4-二氟代-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((S)-3-氨基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物VI，300-101)
室温下，向未经纯化的中间体7(300-97)(200mg，0.51mmol)的二恶烷(8mL)混合物中加入(S)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁基酯(186mg，1mmol，2当量)和DIEA(147mg，1mmol，2当量)。然后将混合物在90-91℃在氮气下搅拌12小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。将混合物冷却至室温，减压浓缩，加入甲醇(4mL)后，将混合物再浓缩，得到中间体300-100，为灰色固体。LC-MS：545.12(M+H)。
向未经纯化的中间体(300-100)中加入DCM(4mL)。将该混合物冷却至5℃，然后滴加TFA-DCM(1：1，5mL)的混合物。加完后，混合物在室温下搅拌3小时，减压浓缩。将残余物与甲醇(4mL)混合，然后加入三乙胺(2mL)并搅拌一会儿。将混合物浓缩至干，然后悬浮于50mL蒸馏水中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀用50mL蒸馏水重悬，然后以4000rpm离心15分钟。用100mL 80％乙腈进一步悬浮沉淀，并以4000rpm离心15分钟。将上清液蒸发至干，得到目标化合物VI(300-101)(约108mg)，为灰白色固体。LC-MS：445(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.30(s,1H)，7.19(s,1H)，5.80(s,1H)，3.60-3.35(m,2H)，2.43(s,3H)，2.20(s,2H)，2.12(s,2H)，1.85(m,2H)。
实施例7制备N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物VII，300-99)
2-[(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基)氨基]-N-(2-氯-4-氘代-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺中间体7(300-97)的制备。在0-5℃温度和搅拌下，向原料300-77-2(200mg，0.74mmol)，4，6-二氯-2-甲基嘧啶(147mg，0.90mmol，1.2当量)和THF(4mL)的混合物中滴加入叔丁醇钠的THF溶液(2M，1.31mL，2.62mmol，3.5当量)。加完后，混合物在室温下搅拌1.5小时，再冷却至0-5℃。滴加2N HCl溶液(1mL)。将该混合物搅拌15分钟并减压浓缩。将残余物与EtOAc-己烷(1：1)混合并搅拌5分钟。过滤固体并用EtOA-己烷(1：1)洗涤并干燥，得到黄色固体(210mg)，将其不经纯化用于下一步。LC-MS：395.03(M+H)。
制备N-(2-氯-4-二氟代-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物VII，300-99)。中间体7(300-97，1.14毫摩尔，2当量)(R)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁基酯(186mg，1mmol，2当量)和DIEA(147mg，0.5mmol)加至。然后将混合物在90-91℃在氮气下搅拌12小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。将混合物冷却至室温，减压浓缩。加入甲醇(4mL)后，将混合物再浓缩，得到中间体300-98，为灰色固体。LC-MS：545.12(M+H)。
向未经纯化的中间体(300-98)中加入二氯甲烷(DCM)(4mL)。将混合物冷却至5℃，然后滴加三氟乙酸(TFA)-DCM(1：1，5mL)的混合物。加完后，混合物在室温下搅拌3小时，减压浓缩。将残余物与甲醇(4mL)混合，然后加入三乙胺(2mL)并搅拌。将混合物浓缩至干，然后悬浮于50mL蒸馏水中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀用50mL蒸馏水重悬，然后以4000rpm离心15分钟。用100mL 80％乙腈进一步悬浮沉淀，并以4000rpm离心15分钟。将上清液蒸发至干，得到目标化合物VII(300-99)，为灰白色固体LC-MS：445(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H),7.30(s,1H)，7.19(s,1H)，5.80(s,1H)，3.60-3.35(m,2H)，2.43(s,3H)，2.20(s,2H)，2.12(s,2H)，1.85(m,2H)。
实施例8制备N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(哌啶-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物VIII，H-20)
在室温下，向起始原料7H(150mg，0.38mmol)和二恶烷(8mL)的混合物中加入哌啶(97mg，1.14mmol，3当量)和DIEA(147mg，1.14mmol，3当量)。将混合物在90-91℃在氮气下搅拌15小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。混合物不是清澈的溶液。将混合物浓缩至干，悬浮于含有20％HPLC级水的50mL乙腈中。然后将混合物以4000rpm离心15分钟。沉淀重新悬浮于乙腈中，并以4000rpm再次离心15分钟。最终的颗粒在氮气下干燥，得到目标化合物VIII(H-20)为灰白色固体。LC-MS：443.14(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：11.52(s,1H.NH)，9.82(s,1H,NH)，8.18(s,1H)，7.39(m,1H)，7.21(m,2H)，6.00(s,1H)，3.55(m,4H)，3.22(s,3H)，2.43(s,3H)，1.65(m,6H)。
实施例9制备N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(4-羟基哌啶-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物IX，H-21)
室温下，向起始原料7H(150mg，0.38mmol)和二烷(8mL)的混合物中加入4-羟基哌啶(115mg，1.14mmol，3当量)和DIEA(147mg，1.14mmol，3当量)。然后将混合物在90-92℃在氮气下搅拌10小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。混合物不是清澈的溶液。将混合物浓缩至干，悬浮于50mL乙腈含有20％的HPLC等级的水中。然后将混合物以4000rpm离心15分钟。沉淀重新悬浮于乙腈中，并以4000rpm再次离心15分钟。最终的颗粒在氮气下干燥，得到目标化合物IX(H-21)(130mg)，为灰白色固体。LC-MS：459.14(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：11.42(s，1H.NH)，9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.40(m,1H)，7.24(m,2H)，6.05(s,1H)，4.78(s,1H)，3.95(m,2H)，3.75(m,1H)，3.22(s,3H)，3.18(m,2H)，2.43(s,3H)，1.85(m,2H)，1.35(m,2H)。
实施例10制备N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((S)-3-羟基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物X，H-31，300-89)
室温下，向起始原料7H(150mg，0.38mmol)和二烷(8mL)的混合物中加入(S)-吡咯烷-3-醇盐酸盐(141mg，1.14mmol，3eq)和DIEA(245mg，1.90mmol)。然后将混合物在90-92℃在氮气下搅拌12小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。混合物不是清澈的溶液。将混合物冷却至室温并减压浓缩至干，将所得残余物悬浮于50mL乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。然后将沉淀物悬浮在冷却的80％乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀重新悬浮于冷却的80％乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。将上清液合并并浓缩至干，得到目标化合物X(H-31)(105mg)，为灰白色固体。LC-MS：445(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：11.40(s，1H.NH)，9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.40(m,1H)，7.24(m,2H)，5.80(s,1H)，4.98(s,1H)，4.35(s,1H)，2.53(s,3H)，2.20(s,2H)，2.12(s,2H)，1.85(m,2H)。
实施例11制备N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((R)-3-羟基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物XI，H-30，300-87)
在室温下，向起始原料7H(150mg，0.38mmol)和二烷(8mL)的混合物中加入(R)-吡咯烷-3-醇(100mg，1.1mmol，3当量)和DIEA(147mg，1.14mmol)。然后将混合物在90-92℃在氮气下搅拌12小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。混合物不是清澈的溶液。将混合物冷却至室温并减压浓缩至干，将所得残余物悬浮于50mL乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。然后将沉淀物悬浮在冷却的80％乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀重新悬浮于冷却的80％乙腈中，并以4000rpm离心15分钟。将上清液合并并浓缩至干，得到目标化合物XI(H-30)为灰白色固体。LC-MS：445(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)11.40(s，1H.NH)，9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.40(m,1H)，7.24(m,2H)，5.80(s,1H)，4.98(s,1H)，4.35(s,1H)，2.53(s,3H)，2.20(s,2H)，2.12(s,2H)，1.85(m,2H)。
实施例12制备N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((S)-3-氨基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物XII，H-41，300-93)
室温下，向起始原料7H(150mg，0.38mmol)和二烷(8mL)的混合物中加入(S)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁酯(142mg，0.76mmol，2eq)和DIEA(147mg，0.76mmol，2eq)。然后将混合物在90-91℃在氮气下搅拌10小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。将混合物冷却至室温，减压浓缩。加入甲醇(4mL)后，将混合物再浓缩，得到中间体300-92，为灰色固体。LC-MS：544.12(M+H)。
向粗样品(300-92)中加入DCM(4mL)。将该混合物冷却至5℃，然后滴加TFA-DCM(1：1，5mL)的混合物。加完后，混合物在室温下搅拌3小时，减压浓缩。将残余物与甲醇(4mL)混合，然后加入TEA(2mL)并搅拌一会儿。将混合物浓缩至干，然后悬浮于50mL蒸馏水中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀用50mL蒸馏水重悬，然后以4000rpm离心15分钟。用100mL 80％乙腈进一步悬浮沉淀，并以4000rpm离心15分钟。将上清液蒸发至干，得到目标化合物XII(H-41)，为灰白色固体(约88mg)。LC-MS：444(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.40(m,1H)，7.24(m,2H)，5.80(s,1H)，3.60-3.35(m,2H)，2.53(s,3H)，2.20(s,2H)，2.12(s,2H)，1.85(m,2H))。
实施例13制备N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-((R)-3-氨基吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物XIII，H-40，300-91)
室温下，向起始原料7H(150mg，0.38mmol)和二烷(8mL)的混合物中加入(R)-吡咯烷-3-基氨基甲酸叔丁酯(142mg，0.76mmol，2eq)和DIEA(147mg，0.76mmol，2eq)。然后将混合物在90-91℃在氮气下搅拌12小时。LC-MS分析显示产物质子化分子离子峰。将混合物冷却至室温，减压浓缩。加入甲醇(4mL)后，将混合物再浓缩，得到中间体300-90，为灰色固体。LC-MS：544.12(M+H)。
向粗样品(300-90)中加入DCM(4mL)。将该混合物冷却至5℃，然后滴加TFA-DCM(1：1，5mL)的混合物。加完后，混合物在室温下搅拌3小时，减压浓缩。将残余物与甲醇(4mL)混合，随后加入三甲胺(TEA)(2mL)并搅拌一会儿。将混合物浓缩至干，然后悬浮于50mL蒸馏水中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀用50mL蒸馏水重悬，然后以4000rpm离心15分钟。用100mL80％乙腈进一步悬浮沉淀，并以4000rpm离心15分钟。将上清液蒸发至干，得到目标化合物XIII(H-40)，为灰白色固体(约96mg)。LC-MS：444(M+H)；1H NMR(DMSO-d6)：9.83(s,1H,NH)，8.19(s,1H)，7.40(m,1H)，7.24(m,2H)，5.80(s,1H)，3.60-3.35(m,2H)，2.53(s,3H)，2.20(s,2H)，2.12(s,2H)，1.85(m,2H)。
实施例14制备N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[2-甲基-6-(吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基]氨基]噻唑-5-甲酰胺(化合物XIV，H-50)
室温下，向起始材料7H(300mg，0.76mmol)和DMSO(10mL)的混合物中加入吡咯烷(162mg，2.28mmol，3当量)和DIEA(294mg，2.28mmol，3当量)和DMAP(3mg)。然后在氮气下将该混合物加热至110℃并在110℃下搅拌15小时。LC-MS分析显示完全反应。将混合物浓缩至干，然后悬浮于50mL蒸馏水中，并以4000rpm离心15分钟。将沉淀用50mL蒸馏水重悬，然后以4000rpm离心15分钟。用100mL 80％乙腈进一步悬浮沉淀，并以4000rpm离心15分钟。将上清液蒸发至干，得到目标化合物XIV(H-50)，为灰白色固体(约314mg)。LC-MS：429(M+H)；1HNMR(DMSO-d6)：11.52(s，1H.NH)，9.82(s,1H,NH)，8.18(s,1H)，7.39(m,1H)，7.21(m,2H)，5.79(s,1H)，3.35(m,4H)，2.39(s,3H)，2.23(s,3H)，1.90(m,4H)。
实施例15蛋白激酶抑制研究
使用Carna Biosciences公司(Natick，MA)的片外迁移率方法(Off-chip MobilityShift Assay，MSA)测定激酶活性和抑制。
1)用缓冲液(20mM HEPES，0.01％Triton X-100，2mM DTT，pH 7.5)制备5μL x4倍浓度化合物溶液，5μL x4倍浓度底物/ATP/金属溶液和10μL x2倍浓度激酶溶液，混合后在室温下在聚丙烯384孔微孔板中温育1或5小时(取决于激酶)。
2)将70μL的终止缓冲液(QuickScout Screening Assist MSA；Carna Biosciences)加入到孔中。
3)反应混合物用LabChip系统(Perkin Elmer)分离产物和底物肽峰并进行定量。
4)通过由产物(P)和底物(S)肽的峰高度(P/(P+S)计算的产物比来评估激酶反应。
5)按照Carna Biosciences公司(BMA 3F，1-5-5Minatojima-Minamimachi，Chuo-ku，Kobe 650-0047，Japan；www.carnabio.com)的测定方法设定反应条件。
6)数据分析：将对照组(完全反应混合物)的读数值设定为0％抑制，并将背景组(没有加酶)的读数值设定为100％抑制，然后计算每种测试测试溶液的抑制百分比。
化合物I在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：ABL、ABL(E255K)、ACK、ARG、BLK、BMX、BTK、DDR2、EPHA1、FGR、FMS、FRK、FYNa、LCK、LYNa、PDGFRα、PDGFRβ、SRC、YES。化合物I显示对重组BTK、ACK和PDGFRα活性有浓度依赖性抑制，其IC50分别为约0.2，0.5和1.4nM。化合物I抑制重组PIK3CA/PIK3R1活性，其IC 50约为12nM。
在下列重组激酶中，化合物I在10nM显示>50％抑制：YES、FRK、SRC、LYNa、FMS、BMX、ABL、FYN(b)、FGR、HCK、FYN(a)、LCK、DDR2、ARG、ABL(E255K)、BTK、EPHA1、BLK、ACK、SRM、PDGFRβ、PIK3CA/PIK3R1、PDGFRα、CSK、KIT(D816V)、KIT(D816Y)、BRK。
在下列重组激酶中，化合物I在10nM显示<50％抑制：PDGFRα(V561D)、DDR1、KIT、KIT(V560G)、HER4、KIT(D816E)、EGFR(L858R)、KIT(V654A)、PDGFRα(D842V)、EGFR、EGFR(L861Q)、EGFR(d746-750)、JAK1、RET、RET(S891A)、FGFR3、ALK、WNK3、RET(Y791F)、BRAF(V600E)、RAF1、ROCK1、AurA、MAP2K2、RET(M918T)、KDR、FGFR2、Erk1、EGFR(T790M)、RET(G691S)、PDGFRα(T674I)、p38α、HER2、JAK3、MAP2K1、p38β、EGFR(T790M/L858R)、FLT1、BRAF、KIT(T670I)、MET、skMLCK、MNK1、MST1、PKD1、JAK2、YES(T348I)、FGFR1、EGFR(d746-750/T790M)。
化合物II在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、FRK，FYN(a)、FYN(b)、TEC、BMX、LYNb、ABL、FGR、FMS、BLK、EPHA1、ABL(E255K)。化合物II在1nM对以下重组激酶显示<50％的抑制：PDGFRβ、PDGFRα、PIK3CA/PIK3R1、KIT、KIT(V560G)、EGFR、HER2、YES(T348I)、ITK、p38α、ABL(T315I)、RAF1、p38β、BRAF。化合物II显示对重组BTK活性有浓度依赖性抑制，其IC50<1nM。
化合物II在10nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：BTK、PDGFRβ、KIT(V560G)、PDGFRα、KIT。化合物II在10nM对以下重组激酶显示<50％的抑制PIK3CA/PIK3R1、EGFR、p38α、RAF1、HER2，p38β、BRAF。
化合物II在100nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：PDGFRα、KIT(V560G)、KIT、PDGFRβ、EGFR。化合物II在100nM下对以下重组激酶显示<50％的抑制p38α、RAF1、PIK3CA/PIK3R1、HER2、p38β、BRAF。
化合物IV在1nM对以下重组激酶显示出>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC、BMX、ABL、ABL(E255K)。
化合物V在1nM对下列重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC、BMX、ABL、ABL(E255K)。
化合物VI在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC，BMX、ABL、ABL(E255K)。
化合物VII在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC、BMX，ABL、ABL(E255K)。
化合物VIII在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC、BMX、ABL、ABL(E255K)。
化合物IX在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC、BMX、ABL、ABL(E255K)。
化合物X在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC、BMX、ABL、ABL(E255K)。化合物X显示对重组ABL、ABL(E255K)、BTK和BTK(C481S)活性有浓度依赖性抑制，其IC50值分别<1nM。
化合物XI在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC、BMX、ABL、ABL(E255K)。化合物XI显示对重组ABL、ABL(E255K)、BTK和BTK(C481S)活性有浓度依赖性抑制，其IC50值分别<1nM。
化合物XII在1nM对以下重组激酶显示>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC，BMX、ABL、ABL(E255K)。
化合物XIII在1nM下对以下重组激酶显示出>50％的抑制：SRC、YES、LCK、HCK、BTK、LYNa、TEC、BMX、ABL、ABL(E255K)。
实施例16细胞抑制测定
实验用细胞株SU-DHL-4(CRL-2957TM)、K-562(CCL-243TM)和Mino(CRL-3000TM)从美国细胞培养保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，Manassas，VA)购买。SU-DHL-4细胞和Mino细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)(Gibco，Life Technologies)的RPMI-1640培养基(ATCC)中培养，K-562细胞在补充有10％胎牛血清的Iscove's Modified Dulbecco's(IMDM)培养基(ATCC)中培养。细胞培养箱的条件是37℃、5％CO2和饱和湿度，细胞扩增培养在T-75培养皿中。当细胞生长至约1×106细胞/mL时，每种细胞用相应的培养基稀释至2.5-5×104个细胞/mL。然后将200μL/孔的细胞悬液加入到已预先加入1μL/孔待测化合物储备液的96孔板中，在细胞培养箱中孵育48小时。在孵育结束时，将10μL/孔的Presto Cell Viability试剂(ThermoFisher Scientific)加入到96孔板中，并在细胞培养箱孵育约60分钟。孵育结束时，用SpectraMax Microplate检测仪(Molecular Devices)测量在570nm和600nm波长的吸收。按照 CellViability试剂盒说明计算细胞活性，使用中值效应图法(TC-Chou.Theorytical basis，experimental design，and computerized simulation of synergism and antagonismin drug combination studies.Pharmacol Rev.2006；58：621-681)计算IC50。
化合物I，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，IX，X，XI，XII，XIII和XIV分别显示对SU-DHL-4生长有浓度依赖性抑制，其IC50值分别<15nM。
化合物I，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，IX，X，XI，XII，XIII和XIV分别显示对K562细胞生长有浓度依赖性抑制，IC50值分别<2nM。
化合物I，II，III，IV，V，VI，VII，VIII，IX，X，XI，XII，XIII和XIV分别显示对Mino生长有浓度依赖性抑制，其IC50值分别<50nM。
实施例17代谢稳定性测定
肝微粒体中的代谢稳定性：本发明相关化合物及达沙替尼与人肝微粒体(0.5mg/mL)在含有10mM MgCl2、1mM NADPH和2mM UDPGA的0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)中孵育0-60分钟(见图1)。孵育在37℃水浴箱中进行，通过加入3x体积的含有100nM利血平的乙腈在不同时间点淬灭终止孵育反应。将淬灭的孵育样品以4000RPM离心10分钟，分离上清液用于LC/MS/MS分析。LC/MS/MS系统配有Shimadzu Prominence UFLCXR 20HPLC系列(包括CBM-20A控制器、两个LC-20ADXR溶剂输送装置、SIL-20AC HT自动进样、CTO-20A柱温箱和SPD-20A UV检测器)和AB Sciex 4000Q Trap。样品在Phenomenex Columbus柱(C18、4μm、50×2mm)上分离，从25％流动相B开始以线性梯度洗脱，其中流动相A是含有0.1％甲酸的2mM乙酸铵水溶液、流动相B是甲醇。采用正离子模式的电喷雾电离来获取LC/MS/MS数据，使用先前报道的方法(Obatch S.Prediction of human clearance of twenty-nine drugs from hepaticmicrosomal intrinsic clearance data：An examination of in vitro half-lifeapproach and nonspecific binding to microsomes.Drug Metab Dispos.1999；27(11)：1350-9)计算体外半衰期和内在清除率。达沙替尼(HY10181/CS0100，302962-49-8，批号：13044)购自MedChemExpress USA(Monmouth Junction，NJ)。
实施例18药物代谢动力学测定
将化合物IV和达沙替尼同时(2-in-1)溶于含有2.5％DMSO、20％丙二醇300和8％右旋糖溶液(50％)的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.2mg/mL，此溶液用于静脉给药。将化合物IV和达沙替尼同时(2-in-1)溶于含有5％DMSO、20％丙二醇300和10％右旋糖溶液(50％)的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.25mg/mL，该溶液用于口服给药。
将化合物V和化合物III同时(2-in-1)溶于含有2.5％DMSO、20％丙二醇300和8％右旋糖溶液(50％)的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.2mg/mL，此溶液用于静脉给药。将化合物V和化合物III同时(2-in-1)溶于含有5％DMSO、20％丙二醇300和10％右旋糖溶液(50％)的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.25mg/mL，该溶液用于口服给药。
将化合物X和达沙替尼同时(2-in-1)溶于含有2.5％DMSO、30％丙二醇300和10％右旋糖溶液(50％)的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.2mg/mL，此溶液用于静脉给药。将化合物X和达沙替尼同时(2-in-1)溶于含有5％DMSO、50％丙二醇300和10％HS 15(Sigma-Aldrich)的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.5mg/mL，该溶液用于口服给药。
将化合物XI和化合物III同时(2-in-1)溶于含有2.5％DMSO、30％丙二醇300和10％右旋糖溶液(50％)的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.2mg/mL，此溶液用于静脉给药。将化合物XI和化合物III同时(2-in-1)溶于含有5％DMSO、50％丙二醇300和10％HS 15(Sigma-Aldrich)的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.5mg/mL，该溶液用于口服给药。
药代动力学实验在Sprague-Dawley大鼠(大约重量275-300g)上进行，每组3只，静脉注射剂量为5mL/kg，口服灌胃给药剂量为10mL/kg。静脉给药的采血时间点是给药后0、0.25、0.5、1、2、4、8、10和24小时，口服给药后的采血时间点是给药后0、0.5、1、2、4、8、10和24小时。血样收集到含有EDTA抗凝剂的试管中，通过离心方法制备血浆样品。将血浆样品与3倍体积的含有100nM利血平作为内标物的乙腈混合，然后以4000RPM转速离心15分钟，分离上清液用于LC/MS/MS分析。LC/MS/MS系统配有Shimadzu Prominence UFLCXR 20HPLC系列(包括CBM-20A控制器、两个LC-20ADXR溶剂输送装置、SIL-20AC HT自动进样、CTO-20A柱温箱和SPD-20A UV检测器)和AB Sciex 4000Q Trap。样品在Phenomenex Luna C8(2)、5μm、50×2mm柱上分离，从25％流动相B开始以线性梯度洗脱，其中流动相A是含有0.1％甲酸的2mM乙酸铵水溶液、流动相B是甲醇。采用正离子模式的电喷雾电离来获取LC/MS/MS数据，使用标准曲线分别定量化合物III、IV、V、X、XI和达沙替尼的血浆浓度。
实施例19组织分布测定
将化合物X和达沙替尼同时(2-in-1)溶于含有5％DMSO、50％丙二醇300和9％HS 15的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.5mg/mL。
将化合物XI和达沙替尼同时(2-in-1)溶于含有5％DMSO、20％丙二醇300和9％HS 15的蒸馏水中，其各自的终浓度均为0.5mg/mL。
CD-1小鼠(大约30g)通过口服灌胃给药，每个时间点3只小鼠，给药剂量为10mL/kg。在化合物X和达沙替尼组，动物在给药前和给药后1、2、3、8、10和24小时断头处死，采集肺组织，血液样品收集在含有EDTA作为抗凝血剂的试管中。在化合物XI和达沙替尼组，动物在给药后1、2、4、10小时断头处死，采集肺组织，血液样品收集在含有EDTA作为抗凝血剂的试管中。血浆样品通过离心制备，肺样品在4倍体积的蒸馏水(v/w)中匀浆制备。将血浆样品和匀浆的肺组织样品与3倍体积的含有100nM利血平作为内标的乙腈混合，然后4000RPM离心15分钟，分离上清液用于LC/MS/MS分析。LC/MS/MS系统配有Shimadzu Prominence UFLCXR20HPLC系列(包括CBM-20A控制器、两个LC-20ADXR溶剂输送装置、SIL-20AC HT自动进样、CTO-20A柱温箱和SPD-20A UV检测器)和AB Sciex 4000Q Trap。样品在PhenomenexColumbus柱(C18、4μm、50×2mm)上分离，从25％流动相B开始以线性梯度洗脱，其中流动相A是含有0.1％甲酸的2mM乙酸铵溶液、流动相B是甲醇。采用正离子模式的电喷雾电离来获取LC/MS/MS数据，使用标准曲线分别定量化合物X、XI和达沙替尼的血浆和组织浓度。

Claims (26)

1.具有下列式I结构的化合物及其所有的盐、前体药、对映异构体和几种对映异构体的混合物：
其中，W1、W2和W3分别为氢或氘；Y是碳或氮；R1是—Q—A，其中，Q是直接将A与环碳原子连接的单键，或者将A与环碳原子连接的亚甲基或亚乙基；
A是
其中，Y1和Y2分别为碳或氮；
Z1和Z2分别为氢、-(CH2)n-OR5或-NR5R6；所述-(CH2)n-OR5，其中n为0-4的整数，R5为氢、低级烷基或低级链烯基，条件是当n为1且R5为氢时，R1不是1-哌啶基，另一个条件是当n是2，且R5是氢，R1是1-哌嗪基时，W2是氘；所述-NR5R6中，R5和R6分别为氢、低级烷基或低级链烯基；
T1和T2分别为0-4的整数，条件是当T1或T2为0时，–(CH2)T1或–(CH2)T2是单键，以及T1和T2不会同时为0；
R2和R3分别为氢、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基被任选一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基是甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基；
R1、R2和R3的位置可以交换。
2.具有下列式II结构的化合物及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：
式中，W1、W2和W3分别为氢或氘；Y是碳或氮；
R2、R3和R4分别为氢、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基被任选一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基是甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基；且
X分别为氢、-(CH2)n-OR5或–NR5R6；所述-(CH2)n-OR5，其中n为0-4的整数，R5为氢、低级烷基或低级链烯基；所述-NR5R6中，R5和R6分别为氢、低级烷基或低级链烯基。
3.具有下列式III结构的化合物及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物：
其中W1、W2和W3分别为氢或氘；R2、R3和R4分别为H、卤素、烷氧基、低级烷基、低级链烯基或取代的杂环；所述低级烷基或低级链烯基可被一个或多个选自-OH和烷氧基的取代基取代；所述烷氧基为甲氧基、乙氧基、丙氧基或叔丁氧基；所述取代的杂环，其中被任选的取代基包括–NR5R6，其中R5和R6分别为氢、低级烷基或低级烯基。
4.权利要求1的化合物，其中W2是氘，W2和W3分别是氢。
5.权利要求4的化合物选自以下化合物I～化合物VII，以及它们所有的盐和前体药；
6.权利要求1的化合物，其中W2、W2和W3分别是氢。
7.权利要求6的化合物，其中所述化合物选自以下化合物VIII～化合物XIV，以及它们所有的盐和前体药；
8.一种药物组合物，含有权利要求1所述的式I结构的化合物及其所有的盐、前体药、对映异构体和几种对映异构体的混合物，以及药物可接受的赋形剂或载体。
9.权利要求8所述的药物组合物，其中所述化合物结构式中W2是氘，W1和W3分别是氢。
10.权利要求9所述的药物组合物，其中所述化合物选自权利要求5所述的化合物I、II、III、IV、V、VI或VII，以及它们所有的盐和前体药物。
11.权利要求8所述的药物组合物，其中所述化合物结构式中W1、W2和W3分别是氢。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中所述化合物选自权利要求7所述的化合物VIII、IX、X、XI、XII、XIII或XIV，以及它们所有的盐和前体药物。
13.用权利要求1所述式I结构的化合物及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物制备治疗蛋白激酶介导的疾病或症状的药物的用途。
14.用权利要求2所述式II结构的化合物及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物制备治疗蛋白激酶介导的疾病或症状的药物的用途。
15.用权利要求3所述式III结构的化合物及其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物制备治疗蛋白激酶介导的疾病或症状的药物的用途。
16.权利要求13所述的用途，其中所述式I结构的化合物中，W2是氘，W1和W3分别是氢。
17.权利要求16的用途，其中所述化合物选自权利要求5所述的化合物I、II、III、IV、V、VI或VII，以及它们所有的盐和前体药物。
18.权利要求13所述的用途，其中所述化合物结构式中W1、W2和W3分别是氢。
19.权利要求18的用途，其中所述化合物选自选自权利要求7所述的化合物VIII、IX、X、XI、XII、XIII或XIV，以及它们所有的盐和前体药物。
20.权利要求13～19中任一所述的用途，其中所述蛋白激酶介导的疾病或症状是自身免疫性疾病或癌症。
21.权利要求20所述的用途，其中所述自身免疫性疾病是系统性红斑狼疮(SLE)、移植排斥、多发性硬化症(MS)、系统性硬化症(SSc)、原发性干燥综合征(pSS)、类风湿性关节炎(RA)或牛皮癣。
22.权利要求20所述的用途，其中所述癌症是费城染色体阳性(Ph+)慢性粒细胞白血病(CML)、费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)、T细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。
23.一种复方药物，含有式I结构的化合物和其它药物，所述式I结构的化合物包括其所有的盐、前体药、对映异构体和对映异构体混合物，以及药物可接受的赋形剂或载体。
24.权利要求23所述的复方药物，其中所述具有式I结构的化合物结构式中，W2是氘或氢、W1和W3分别是氢。
25.权利要求24所述的复方药物，其中所述化合物选自化合物I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII或XIV，以及它们所有的盐和前体药物。
26.权利要求23～25中任一所述的复方药物，所述其它药物选自以下药物中的一种或几种：化疗药物、生物药、免疫抑制剂、类固醇激素或非甾体抗炎药。
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