CN108300669B - 一种腐乳促熟发酵复合菌剂及其制备方法 - Google Patents
一种腐乳促熟发酵复合菌剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
本发明涉及食品生物技术领域，尤其涉及一种腐乳促熟发酵复合菌剂及其制备方法。本发明选取具有高酶活性的毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种菌种，通过活化、扩繁、添加保护剂、冻干后得到菌种健壮、活性高，不退化，不感染噬菌体的复合菌剂。本发明的复合菌剂用于腐乳发酵，可有效地提升腐乳的发酵速度，极大的缩短腐乳生产所需的后酵时间，并提升腐乳的风味及氨基酸态氮含量，使最终生产得到的腐乳风味更佳，并极大的缩短生产所需时间，提升经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及食品生物技术领域，尤其涉及一种腐乳促熟发酵复合菌剂及其制备方法。
背景技术
腐乳，源于中国，至今已有一千多年的生产历史，与豆豉、酱油、豆酱并称为我国四大传统发酵大豆调味品，因其营养丰富、味道鲜美、风味独特、品种多样，倍受消费者青睐和学者关注，被欧美誉为“中国干酪”。腐乳，富含优质蛋白和不饱和脂肪酸(亚油酸、油酸等)，8种人体必需氨基酸齐全，且氨基酸模式可与牛奶和鸡蛋相媲美；不含胆固醇，对降低血清胆固醇，防止血管硬化、高血压和冠心病有一定作用；经微生物发酵后，腐乳消化率和生物效价也大幅提高，胀气因子、豆腥味及苦涩味均被消除，同时丰富的活性成分赋予其较好的保健功能，如降胆固醇、降血压、抗氧化、降血糖活性等。
《“十三五”食品科学学科发展战略》指出：我国酿造发酵食品制造业虽然发展较快，但普遍存在工艺技术落后、产品质量控制水平较低、资源利用率低、食品安全保障体系不健全等瓶颈问题，就其原因主要是缺乏相关基础性理论研究，如对传统发酵工艺过程中微生物群落的分析、风味微生物相互作用机制不清晰，导致酿造发酵食品关键风味物质代谢不稳定，生产难以调控。就腐乳而言，生产大多沿用传统工艺，后酵时间长达6-8个月，季节限制严重，厂房占用面积大，产品质量难保证，从而严重制约着其产业的发展，成为企业亟待解决的难题。有报道表明，要实现腐乳的优质、高效和安全的规模化生产，优良的菌株、适宜的原料以及合理的工艺是三大重要因素，其中优良的菌株起着至关重要的作用。因此，基于风味形成机理，制备安全益酵菌剂对缩短传统发酵食品的成熟周期，实现腐乳的优质、高效和安全的规模化生产具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种腐乳促熟发酵复合菌剂及其制备方法，具体是通过以下技术方案得以实现的：
一种腐乳促熟发酵复合菌剂，由发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)复配而成。
所述发酵毕赤酵母，是CICC编号33120的发酵毕赤酵母。
所述奥默柯达酵母，是CICC编号32993的奥默柯达酵母。
所述乳酸乳球菌乳亚种，是CICC编号21030的乳酸乳球菌乳亚种。
所述发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种是按如下重量份进行混合：发酵毕赤酵母30份-50份，奥默柯达酵母30份-50份，乳酸乳球菌乳亚种10份-30份。
所述的腐乳促熟发酵复合菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板涂布或划线，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养48h-56h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养24h-36h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括20％-30％山梨糖醇、10％-20％果胶、15％-25％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括15％-25％蔗糖、20％-30％山梨糖醇、5％-15％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括10％-20％蔗糖、5％-15％果胶、3％-7％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥56h-72h，制成单一的活性微生物菌剂，按比例复配后进行真空包装，即得。
所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g小麦粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g大豆粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
所述步骤(4)中，按比例复配，是将发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种按照如下重量比进行复配：发酵毕赤酵母30份-50份，奥默柯达酵母30份-50份，乳酸乳球菌乳亚种10份-30份。
风味，是腐乳品质评价的关键因素，决定着消费者可接受度。腐乳风味化合物的形成，除原料组成和热处理工艺的影响外，最重要的是毛坯微生物形成的大量菌丝体，借助盐溶作用释放出多种酶系，将原料中的蛋白质、脂肪、碳水化合物分解成短肽、游离氨基酸、脂肪酸、糖等呈味物质，并作为“风味前体库”在长期后酵过程中经过氨基酸代谢、醇发酵、酸发酵、酯化反应、氧化还原反应、美拉德反应等一系列生化反应，形成大量风味物质。
腐乳与干酪类似，均属高蛋白为主要基质的发酵食品，在风味物质形成的众多生化途径中，蛋白质降解及其氨基酸代谢最为关键。国外研究表明，转氨反应作为氨基酸代谢途径之一，是奶酪微生物转化氨基酸形成风味化合物的关键步骤，且风味前体氨基酸主要为支链氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)、含硫氨基酸(半胖氨酸和蛋氨酸)或天冬氨酸。氨基酸被转氨酶催化形成α-酮酸，而α-酮酸受体(常为谷氨酸盐)则转化成相应的氨基酸(谷氨酸)。已有研究显示，通过高转氨酶菌株强化发酵，并添加促进转氨反应的氨基受体(α-酮酸盐)，可促进奶酪风味形成，缩短酵期。氨基酸转化成香味化合物主要有两条途径：一是氨基酸裂解酶催化的消除反应，芳香族氨基酸生成酚和吲哚，蛋氨酸生成甲硫醇并进一步氧化形成二甲基二硫醚和二甲基三硫醚；二是转氨酶催化的转氨反应，芳香族氨基酸、支链氨基酸和蛋氨酸经α-酮酸中间体进一步降解成醛、醇、羧酸、羟酸，如苯乙醛便源于苯丙氨酸降解。
因此，可借鉴奶酪促熟思路，通过前期筛选的高酶活核心功能菌株进行强化发酵，缩短后熟期。
与本发明针对腐乳需长期后熟的技术“瓶颈”，以中国八大名优特色腐乳为试材，集成SIMCA、R以及Cytoscape软件，剖析优势菌与特征挥发性风味成分的交互关联，确定了6株产特征风味的核心菌株，分别为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis，CICC编号10071)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.，CICC编号23243)、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcuslactis subsp.lactis，CICC编号21030)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans；CICC编号33120)、奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri；CICC编号32993)、鲁氏酵母(Saccharomycesrouxii；CICC编号32899)。以风味前体氨基酸代谢为切入点，以转氨酶、肽酶、蛋白酶、谷氨酸脱氢酶等为指标，从中筛选出3株高酶活的菌株(毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种)并制备成发酵复合菌剂。本发明所选菌种均来源于各菌种保藏中心，是纯化菌株有保障。这种粉末状的发酵剂，能保证菌种健壮、活性高，不退化，不感染噬菌体，运输、保藏、使用都非常方便。并且保证每批生产的产品质量稳定，大大地降低生产成本。
现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
本发明选取具有高酶活性的毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种菌种，通过活化、扩繁、添加保护剂、冻干后得到菌种健壮、活性高，不退化，不感染噬菌体的复合菌剂。本发明的复合菌剂用于腐乳发酵，可有效地提升腐乳的发酵速度，极大的缩短腐乳生产所需的后酵时间，并提升腐乳的风味及氨基酸态氮含量，使最终生产得到的腐乳风味更佳，并极大的缩短生产所需时间，提升经济效益。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
一种腐乳促熟发酵复合菌剂，通过如下方法制备：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板涂布，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养52h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养30h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括25％山梨糖醇、15％果胶、20％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括20％蔗糖、25％山梨糖醇、10％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括15％蔗糖、10％果胶、5％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥64h，制成单一的活性微生物菌剂，按发酵毕赤酵母40g，奥默柯达酵母40g，乳酸乳球菌乳亚种20g进行复配后真空包装，即得。
所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g小麦粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g大豆粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
实施例2
一种腐乳促熟发酵复合菌剂，通过如下方法制备：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板划线，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养48h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养24h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括20％山梨糖醇、10％果胶、15％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括15％蔗糖、20％山梨糖醇、5％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括10％蔗糖、5％果胶、3％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥56h，制成单一的活性微生物菌剂，按发酵毕赤酵母40g，奥默柯达酵母40g，乳酸乳球菌乳亚种20g进行复配后真空包装，即得。
所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g小麦粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g大豆粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
实施例3
一种腐乳促熟发酵复合菌剂，通过如下方法制备：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板涂布，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养56h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养36h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括30％山梨糖醇、20％果胶、25％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括25％蔗糖、30％山梨糖醇、15％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括20％蔗糖、15％果胶、7％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥72h，制成单一的活性微生物菌剂，按发酵毕赤酵母40g，奥默柯达酵母40g，乳酸乳球菌乳亚种20g进行复配后真空包装，即得。
所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g小麦粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g大豆粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
实施例4
一种腐乳促熟发酵复合菌剂，通过如下方法制备：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板涂布，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养52h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养30h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括25％山梨糖醇、15％果胶、20％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括20％蔗糖、25％山梨糖醇、10％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括15％蔗糖、10％果胶、5％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥64h，制成单一的活性微生物菌剂，按发酵毕赤酵母30g，奥默柯达酵母30g，乳酸乳球菌乳亚种30g进行复配后真空包装，即得。
所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g小麦粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g大豆粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
实施例5
一种腐乳促熟发酵复合菌剂，通过如下方法制备：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板涂布，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养52h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养30h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括25％山梨糖醇、15％果胶、20％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括20％蔗糖、25％山梨糖醇、10％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括15％蔗糖、10％果胶、5％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥64h，制成单一的活性微生物菌剂，按发酵毕赤酵母50g，奥默柯达酵母50g，乳酸乳球菌乳亚种10g进行复配后真空包装，即得。
所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g小麦粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g大豆粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
实施例6
一种腐乳促熟发酵复合菌剂，通过如下方法制备：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板涂布，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养52h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养30h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括25％山梨糖醇、15％果胶、20％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括20％蔗糖、25％山梨糖醇、10％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括15％蔗糖、10％果胶、5％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥64h，制成单一的活性微生物菌剂，按发酵毕赤酵母40g，奥默柯达酵母40g，乳酸乳球菌乳亚种20g进行复配后真空包装，即得。
所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g小麦粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g大豆粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
所述发酵毕赤酵母，是CICC编号33120的发酵毕赤酵母。
所述奥默柯达酵母，是CICC编号32993的奥默柯达酵母。
所述乳酸乳球菌乳亚种，是CICC编号21030的乳酸乳球菌乳亚种。
实施例7
一种腐乳促熟发酵复合菌剂，通过如下方法制备：
将直接购置的发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种，通过如下重量进行复配：发酵毕赤酵母40g，奥默柯达酵母40g，乳酸乳球菌乳亚种20g，然后真空包装，即得。
对比例制备：
通过如下方法制备各微生物，并分开保存：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板涂布，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养52h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养30h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括25％山梨糖醇、15％果胶、20％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括20％蔗糖、25％山梨糖醇、10％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括15％蔗糖、10％果胶、5％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥64h，制成单一的活性微生物菌剂分别真空包装，即得。
所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g小麦粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g大豆粉(过40目筛)，按料液比1:20(g/mL)加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
对比例1：上述对比例制备方法制备得到的发酵毕赤酵母100g。
对比例2：上述对比例制备方法制备得到的奥默柯达酵母100g。
对比例3：上述对比例制备方法制备得到的乳酸乳球菌乳亚种100g。
将实施例1-7、对比例1-3、及市售腐乳发酵菌剂按照现有的腐乳发酵方法进行发酵，将所得腐乳的营养价值进行对比：
所述现有的腐乳发酵方法是通过如下步骤进行：
(1)白坯制备：将10kg大豆去杂、清洗后,室温下浸泡,使搓开豆瓣后中间稍有凹心,中心色泽稍暗。按每1kg泡好的大豆加3kg水进行磨制,过100目筛,用水调豆浆浓度为4°Bé。将过滤的豆浆加热，在95-100℃保持5min,再冷却至90℃,加入18°Bé的浓盐卤点浆。将点浆后的豆腐花舀入木框中,压榨,成为含水量为65％-69％的豆腐。
(2)毛坯制备：将所得的豆腐切成3.1*3.1*1.8的小块,喷洒对应发酵菌剂,摆放在塑料托盘中,在温度为25℃、相对湿度为90％的环境中培菌48h,成为毛坯。
(3)腌制：将毛坯凉花、撮毛后，加入19％的食盐，腌制4d。
(4)保温后酵：将盐坯放入灭菌的瓶中,加入汤料后,在25-28℃温度下保温后酵，直至发酵完成即可。
对比可知，本发明的腐乳促熟发酵复合菌剂可以有效提升腐乳的氨基酸态氮和水溶性蛋白含量，并降低总酸含量，远优于市售发酵菌种；将发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种按本发明的比例进行复配后，发酵效果远优于仅使用发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种中任一单一菌种的发酵效果；本发明的腐乳促熟发酵复合菌剂可以有效提升腐乳的发酵效率，极大程度的缩短腐乳发酵所需时间，提升经济效益。
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种腐乳促熟发酵复合菌剂，其特征在于，由发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种复配而成，所述发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种是按如下重量份进行混合：发酵毕赤酵母30份-50份，奥默柯达酵母30份-50份，乳酸乳球菌乳亚种10份-30份。
2.根据权利要求1所述的腐乳促熟发酵复合菌剂，其特征在于，所述发酵毕赤酵母，是CICC编号33120的发酵毕赤酵母。
3.根据权利要求1所述的腐乳促熟发酵复合菌剂，其特征在于，所述奥默柯达酵母，是CICC编号32993的奥默柯达酵母。
4.根据权利要求1所述的腐乳促熟发酵复合菌剂，其特征在于，所述乳酸乳球菌乳亚种，是CICC编号21030的乳酸乳球菌乳亚种。
5.权利要求1所述的腐乳促熟发酵复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌株活化
根据目标菌株生理生化特性，分别采用营养琼脂培养基、孟加拉红培养基和PDA琼脂培养基进行平板涂布或划线，并置于恒温生化培养箱中活化两代后备用，其中发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于5°Bé麦芽汁琼脂培养基，在27℃-29℃条件下培养48h-56h，乳酸乳球菌乳亚种接种于乳酸菌培养基，在36℃-38℃条件下培养24h-36h；
(2)扩繁培养
将经步骤(1)活化后的菌种，分别接种于基质载体培养基，进行扩繁培养，其中，发酵毕赤酵母与奥默柯达酵母接种于小麦粉基质载体培养基，乳酸乳球菌乳亚种接种于大豆粉基质载体培养基；
(3)添加冷冻保护剂
扩繁培养结束后，于无菌条件下向扩繁后的菌种中添加复合冷冻保护剂，并混合均匀，其中发酵毕赤酵母所添加的复合冷冻保护剂包括20％-30％山梨糖醇、10％-20％果胶、15％-25％谷氨酸钠；奥默柯达酵母所添加的复合冷冻保护剂包括15％-25％蔗糖、20％-30％山梨糖醇、5％-15％谷氨酸钠；乳酸乳球菌乳亚种所添加的复合冷冻保护剂包括10％-20％蔗糖、5％-15％果胶、3％-7％谷氨酸钠；
(4)冷冻干燥
将添加符合冷冻保护剂后的菌种，于-60℃条件下预冻2h，然后置于真空冷冻干燥机中在-20℃条件下干燥56h-72h，制成单一的活性微生物菌剂，按比例复配后进行真空包装，即得。
6.根据权利要求5所述的腐乳促熟发酵复合菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤(1)，其中5°Bé麦芽汁琼脂培养基是1.0L 5°Bé麦芽汁中加入琼脂18.0g制得；乳酸菌培养基由酵母膏7.5g，葡萄糖10.0g，番茄汁100mL，蛋白胨7.5g，磷酸二氢钾2.0g，琼脂18.0g，吐温0.5mL，蒸馏水900mL组成，且pH为7.0。
7.根据权利要求5所述的腐乳促熟发酵复合菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，小麦粉基质载体培养基，是由2g过40目筛小麦粉，按料液比1:20g/mL加入蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠，121℃灭菌20min得到；大豆粉基质载体培养基，是由2g过40目筛大豆粉，按料液比1:20g/mL加入适量蒸馏水，再加入2％葡萄糖、0.5％氯化钠、10％番茄汁，121℃灭菌20min得到。
8.根据权利要求5所述的腐乳促熟发酵复合菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，按比例复配，是将发酵毕赤酵母、奥默柯达酵母、乳酸乳球菌乳亚种按照如下重量比进行复配：发酵毕赤酵母30份-50份，奥默柯达酵母30份-50份，乳酸乳球菌乳亚种10份-30份。
9.权利要求1-4所述的腐乳促熟发酵复合菌剂在腐乳、腐乳酱的制备方面的应用。
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