CN101225365A - 一种复合菌种发酵剂及其制备方法 - Google Patents

一种复合菌种发酵剂及其制备方法 Download PDF

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CN101225365A CNA2007100342969A CN200710034296A CN101225365A CN 101225365 A CN101225365 A CN 101225365A CN A2007100342969 A CNA2007100342969 A CN A2007100342969A CN 200710034296 A CN200710034296 A CN 200710034296A CN 101225365 A CN101225365 A CN 101225365A
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Abstract

本发明公开了一种复合菌种发酵剂及其制备方法,属于微生物发酵领域其主要是由等量的德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、克鲁维酵母和酒香酵母制成;本发酵剂的制备方法,主要是对上述菌种优化培养,分别发酵,离机处理,浓缩后加入细胞保护剂,真空冷冻。本发酵剂由多种功能菌复合组成,由此发酵剂制成的酸奶,风味独特,其功能指标和开菲尔粒子发酵的酸奶接近,可作为优良的直投式开菲尔发酵剂,其发酵酸奶对病原微生物有较强的抑制作用;对胃肠道疾病、代谢疾病、高血压、心脏病等也都具有良好的疗效。

Description

一种复合菌种发酵剂及其制备方法技术领域本发明属于生物工程微生物发酵领域,具体涉及一种乳酸菌——酵母菌复合发酵剂及其 制备方法。背景技术Kefir (开菲尔)起源于高加索山区,它是用开菲尔粒子发酵牛奶而产生的一种乳酸一 一酒精性发酵饮料,由于其复杂的菌系、特殊的营养作用和保健功能,引起人们对它广泛的 研究,但由于在不使用原粒子的情况下无法生成新粒,因此产业化难于发酵出和粒子发酵产 物一致或功能相近的饮料。发明内容本发明的目的在于模仿原始开菲尔的特性,用纯发酵剂复合和优化培养研制一种复合菌 种发酵剂,进而研制开菲尔饮料,该法制成的开菲尔可解决用开菲尔粒子直接发酵难于产业 化的问题,并能保持菌种在乳生产中的稳定性。本发明的另一个目的是提供了该复合菌种发 酵剂的制备方法。本发明的目的是这样实现的:利用公知菌种德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC No.33409*,乳酸乳球菌(L.lactis)CGMCC No.12030,肠膜明串珠菌 (L.mesenteroides) CCIC No.6055,嗜酸乳杆菌(L.acidophilus) ATCC No.43121,干酪乳杆菌 (L.casei)ATCC No.393,克鲁维酵母(Kluyveromyces)CCIC No.1772和酿酒酵母(saccharomyces cerevi)ATCC No.15248进行高密度培养后真空冷冻干燥,制成直投式单菌发酵剂再以等量细 胞数目复合成复合菌种发酵剂。该复合菌种发酵剂的制备方法如下:1、首先,对菌种德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳 球菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、克鲁维酵母和酒香酵母,进行高密度培养, 方法和步骤如下。各菌以3〜5%培养基的量接种到优化培养基中,全自动发酵罐培养,流加无菌30%Na2C03 溶液控制发酵过程中的pH值,培养3〜6小时后添加培养基量的0. 1〜20%增殖因子,培养3〜 6小时后流加相同体积的优化培养基继续培养,继续培养4〜10小时后收集发酵液。2、其次 对各菌种培养基再分别发酵。O)德氏乳杆菌保加利亚亚种:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化 培养基,以3〜5%麦芽汁+3〜5%酵母粉+5〜10%番茄汁为增殖因子,增殖因子添加量为培养基的10〜20%,控制pH值为6. 5,在半连续培养装置中3(TC连续培养16〜24小时,搅拌速度 是200〜250rpm,不通气发酵。
② 乳酸乳球菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以5〜10%麦芽汁+1〜3%酵母粉 +15〜20mg/L Vc为增殖因子,增殖因子添加量为培养基的10〜20%,控制pH值为6.0,在半 连续培养装置中32'C连续培养16〜24小时,搅拌速度是200〜250rpm,不通气发酵。
③ 肠膜明串珠菌:以蛋白胨0. 5%+酵母膏0. 5%+葡萄糖1%+柠檬酸钠0. 15%+磷酸二氢钾 0. 1%为优化培养基,以0.005〜0. ll%Mg2++0.005〜0. 01窗112++3〜5%酵母粉为增殖因子,增殖 因子添加量为培养基的5〜10%,控制pH值为6. 5,在半连续培养装置中32'C连续培养16〜 24小时,搅拌速度200〜250rpm,通气量为1〜2vol/vol/min。
⑨嗜酸乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以3〜5%麦芽汁+3〜5%酵母粉 +15〜20%番茄汁为增殖因子,增殖因子添加量为培养基的10〜20%,控制pH值为6.5,在半 连续培养装置中35'C连续培养12〜14小时,搅拌速度200〜250rpm,通气量为l〜 2vol/vol/min发酵。
⑤干酪乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以5〜10%麦芽汁+2〜3%酵母粉 +5〜15%番茄汁为增殖因子,增殖因子添加量为培养基的10〜20%, pH值为6.5,在半连续 培养装置中3(TC连续培养16-24小时,搅拌速度200〜250rpm,不通气发酵。
⑤克鲁维酵母:以2%酵母膏+1%蛋白胨+2%葡萄糖+0. 1% KH2P04为优化培养基,以O. 15〜 0. 35mg/mL Zn2+ +45〜60u g/mL生物素+45〜60 u g/mL肌醇为增殖因子,增殖因子添加量为培 养基的0.30〜1%,控制pH值为6.5,在半连续培养装置中28。C连续培养16〜24小时,搅拌 速度是280〜300rpm,通氧气量为10〜20vol/vol/min发酵。
(D酒香酵母:以2%酵母膏+1%蛋白胨+2%葡萄糖+0. 1% KH2P04为优化培养基,以0.25〜 0. 35mg/mL Zn2+ + 60〜80 u g/mL生物素+35〜55 u g/mL肌醇为增殖因子,增殖因子添加量为 培养基的0.25〜1%,控制pH值为6.5,在半连续培养装置中28i:连续培养16〜24小时,搅 拌速度是250〜280rpm,通氧气量为10〜20vol/vol/min发酵。
3、分别将以上各单菌发酵液在0〜5'C条件下,转速为8000〜15000转/分钟由高速冷冻离 心机进行处理,离心后的浓縮菌体在无菌条件下加入细胞保护剂,各种浓縮菌体加入如下细 胞保护剂。
细胞保护剂 ^德氏保加利亚乳杆菌 5〜10%海藻糖+5〜10%山梨醇+5〜10%甘油+5〜10%低聚异麦芽糖;乳酸乳球菌40〜60g/kg蔗糖+10〜20g/kg甘油+ l〜3g/kg L-cys +13g/kg Vc;肠膜明串珠菌5〜10%蔗糖+5〜7. 5%聚乙二醇+5〜10%甘油;嗜酸乳杆菌5〜10%低聚异麦芽糖+5〜10%甘油+0. 05〜0. WVc+10〜20呢脱干酪乳杆菌5〜10%低聚异麦芽糖+5〜10%甘露醇+10〜20%脱脂奶;克鲁维酵母10〜20%脱脂乳粉+5〜10%甘油+2〜5%海藻糖溶液;酒香酵母3〜5%海藻糖+5〜10%乙二醇+10〜15%甘油+5〜10%低聚异麦芽糖。4、将以上各单菌分别冻干:在-60〜-4(TC预冻24小时后真空冷冻,冷冻干燥温度-60 °C,真空度为3〜6pa,真空冷冻干燥24〜36小时得到单菌冻干制品,各单菌冻干制品等细 胞数目均匀混合后用锡箔密封真空包装即为复合菌种发酵剂成品。本发明的优点在于:1、 本发明综合考虑各增殖方法后利用分离耦合生物反应器对几种乳酸菌和酵母菌进行了 高密度连续培养。培养液中乳酸菌的浓度可达到107 mL以上,酵母菌浓度达到107 mL以 上;2、 该发酵剂含菌量达到10"个/mL以上,性能稳定,使用方便,可作为直投式发酵剂使用;3、 本发酵剂由多种功能菌复合组成,风味独特,其功能指标和开菲尔粒子发酵的酸奶接 近,可作为优良的直投式开菲尔发酵剂;4、 其发酵酸奶对病原微生物有较强的抑制作用;对胃肠道疾病、代谢疾病、高血压、心 脏病等也都具有良好的疗效;产品中含有的多糖对抗肿瘤有良好的效果,B族维生素含量较 普通酸乳多;经常饮用可加速人体尿液的稀释,排泄。具体实施方式用等细胞数量的德式乳杆菌保加利亚亚种;乳酸乳球菌;肠膜明串珠菌;嗜酸乳杆菌; 干酪乳杆菌;克鲁维酵母和酿酒酵母分别在全自动发酵罐中进行半连续高密度培养,各菌的 增菌培养条件如下:德氏乳杆菌保加利亚亚种:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,德 氏乳杆菌保加利亚亚种以5%的量接种到优化培养基中,pH值6.5,搅拌速度250rpm, 30'C不 通气连续培养6小时,流加增殖因子5%麦芽汁+3%酵母粉+10%番茄汁,流加量为培养基的20%, 继续培养,培养6小时后流加相同体积的优化培养基,再培养6小时后收集发酵液。乳酸乳球实施例l菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以5M的量接种到优化培养基中,控制pH值6.0, 32°C,搅拌速度250rpm不通气培养6小时后,流加增殖因子1(^麦芽汁+3呢酵母粉+20mg/L Vc 继续培养,流加量为培养基的20%,培养4小时后再流加相同体积的优化培养基培养10小时 后收集发酵液。肠膜明串珠菌:优化培养基由蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,葡萄糖1%,柠檬 酸钠0. 15%,磷酸二氢钾0. 1%组成,菌株接种量为5%, pH值6. 5, 32。C培养,搅拌速度为200rpm, 通氧气量为lvol/vol/min发酵培养4小时后,流加10%培养基量的增殖因子 0. 01%Mg2++0. 01WMn"+39&酵母粉,培养4小时后再流加相同体积的优化培养基继续培养6小时 后收集培养液。嗜酸乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,嗜酸乳杆菌以5%的量 接种到优化培养基中,控制pH值为6.5, 35°C,搅拌200rpm,通氧气量为2vol/vol/min培 养3小时后流加增殖因子5%麦芽汁+3%酵母粉+15%番茄汁,流加量为培养基的20%,在半连续 培养装置中连续培养3小时后再流加相同体积的优化培养基继续培养5小时后收集菌液。干 酪乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,干酪乳杆菌以5%的量接种到优化培养基 中控制pH值为6. 5, 30°C,搅拌200rpm不通气连续培养6小时,以10%麦芽汁+2%酵母粉+5% 番茄汁为增殖因子,流加量为培养基的20%,再培养6小时,流加相同体积的优化培养基继 续培养10小时后收集发酵掖。克鲁维酵母:以2%酵母膏+1%蛋白胨+2%葡萄糖+0. 1% KH2P04 为优化培养基,克鲁维酵母菌以5%的量接种到优化培养基中,控制pH值为6. 5, 28°C, 280rpm 搅拌,通氧气量为20vol/vol/min发酵培养4小时后流加培养基量0.25%的增殖因子 0. 15mg/mL Zn2+ +45 u g/mL生物素+60 y g/mL肌醇,再培养4小时后流加相同体积的培养基继 续培养6小时,收集发酵液。酒香酵母:以2%酵母膏+1%蛋白胨+2%葡萄糖+0. 1%1(貼04为优化 培养基,酒香酵母以5%的量接种到优化培养基中,用3(ENa2C03控制pH值为6.5,在半连续 培养装置中28°C,搅拌速度为280rpm,通氧气量为20vol/vol/min连续培养4小时后流加培 养基量的0. 30%的增殖因子0. 25mg/mL Zn2+ + 60 u g/mL生物素+55 u g/mL肌醇,培养4小时 后流加相同体积的优化培养基继续培养6小时后收集发酵液。分别将以上各单菌发酵液在-5'C条件下,转速为10000转/分钟由高速冷冻离心机进行 处理,离心后的浓縮菌体在无菌条件下加入和菌体等质量的细胞保护剂混合,各种浓縮菌体 加入的细胞保护剂如下:德氏乳杆菌保加利亚亚种:10%海藻糖+5%山梨醇+10%甘油+5%低聚异 麦芽糖;乳酸乳球菌:40g/kg蔗糖+10g/kg甘油+lg/kg L-cys +lg/kg Vc;肠膜明串珠菌: 5%蔗糖+5%聚乙二醇+10%甘油;嗜酸乳杆菌:5%低聚异麦芽糖+5%甘油+0.05%¥0+10%脱脂乳; 干酪乳杆菌:5%低聚异麦芽糖+5%甘露醇+10%脱脂奶;克鲁维酵母:脱脂乳粉10%+甘油8%+2%海藻糖溶液;酒香酵母:3%海藻糖+5%乙二醇+10%甘油+5%低聚异麦芽糖。将以上各混合液置于-6(TC下预冻24小时再进行冻干,在-60°C,真空度为3pa下真空冷冻干燥36小时后得 冻干制品,各单菌冻干制品再以等细胞数目均匀混合后用锡箔密封包装即为复合菌种发酵剂成品°实施例2用等细胞数量的德氏乳杆菌保加利亚亚种;乳酸乳球菌;肠膜明串珠菌;嗜酸乳杆菌; 干酪乳杆菌;克鲁维酵母和酿酒酵母分别在全自动发酵罐中进行半连续高密度培养,各菌的 增菌培养条件如下:德氏乳杆菌保加利亚亚种:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,德 氏乳杆菌保加利亚亚种以5%的量接种到优化培养基中,pH值6.5,搅拌速度250rpm, 3(TC不 通气连续培养4小时,流加增殖因子3%麦芽汁+5%酵母粉+10%番茄汁,流加量为培养基的15%, 继续培养,培养4小时后流加相同体积的优化培养基,再培养8小时后收集发酵液。乳酸乳球 菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以5%的量接种到优化培养基中,控制pH值6. 0, 32°C,搅拌速度250rpm不通气培养4小时后,流加增殖因子5y。麦芽汁+W酵母粉+15mg/L Vc 继续培养,流加量为培养基的15%,培养6小时后再流加相同体积的优化培养基培养10小时 后收集发酵液。肠膜明串珠菌:优化培养基由蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,葡萄糖1%,柠檬 酸钠0.15%,磷酸二氢钾0.1%组成,菌株接种量为5。/。,pH值6. 5,32。C培养,搅拌速度为200rpm, 通氧气量为lvol/vol/min发酵培养6小时后,流加l(W培养基量的增殖因子 0. 0075%Mg2++0. 01%^&12++5%酵母粉,培养4小时后再流加相同体积的优化培养基继续培养6小 时后收集培养液。嗜酸乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,嗜酸乳杆菌以5% 的量接种到优化培养基中,控制pH值为6.5, 35°C,搅拌200卬m,通氧气量为2vol/vol/min 培养3小时后流加增殖因子5%麦芽汁+5%酵母粉+15%番茄汁,流加量为培养基的20%,在半连 续培养装置中连续培养4小时后再流加相同体积的优化培养基继续培养5小时后收集菌液。 干酪乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,干酪乳杆菌以5%的量接种到优化培养 基中控制pH值为6.5, 30°C,搅拌200rpm不通气连续培养6小时,以5%麦芽汁+3%酵母粉 +10%番茄汁为增殖因子,流加量为培养基的20%,再培养6小时,流加相同体积的优化培养 基继续培养10小时后收集发酵掖。克鲁维酵母:以2%酵母膏+1%蛋白胨+2%葡萄糖+0.1%KH2P04 为优化培养基,克鲁维酵母菌以5%的量接种到优化培养基中,控制pH值为6. 5, 28'C, 280rpm 搅拌,通氧气量为20vol/vol/min发酵培养4小时后流加培养基量0.25%的增殖因子 0. 35mg/mL Zn2+ +45 n g/mL生物素+45 u g/mL肌醇,再培养4小时后流加相同体积的培养基继 续培养6小时,收集发酵液。酒香酵母:以2%酵母膏+1%蛋白胨+2%葡萄糖+0.1%1(貼04为优化 培养基,酒香酵母以5%的量接种到优化培养基中,用30。/。Na2C03控制pH值为6.5,在半连续培养装置中28°C,搅拌速度为280rpm,通氧气量为20vol/vol/min连续培养4小时后流加培 养基量的0. 30%的增殖因子0. 35mg/mL Zn2+ + 75 y g/mL生物素+45 u g/mL肌醇,培养4小时 后流加相同体积的优化培养基继续培养6小时后收集发酵液。分别将以上各单菌发酵液在-5'C条件下,转速为10000转/分钟由高速冷冻离心机进行 处理,离心后的浓縮菌体在无菌条件下加入和菌体等质量的细胞保护剂混合,各种浓縮菌体 加入的细胞保护剂如下:德氏乳杆菌保加利亚亚种:5%海藻糖+10%山梨醇+5%甘油+5%低聚异 麦芽糖;乳酸乳球菌:60g/kg蔗糖+15g/kg甘油+2g/kg L-cys +lg/kg Vc;肠膜明串珠菌: 10%蔗糖+5%聚乙二醇+5%甘油;嗜酸乳杆菌:10%低聚异麦芽糖+5%甘油+0. 075呢Vc+15W脱脂乳; 干酪乳杆菌:5%低聚异麦芽糖+10%甘露醇+20%脱脂奶;克鲁维酵母:15%脱脂乳粉+5%甘油+5%海藻糖溶液;酒香酵母:3%海藻糖+10%乙二醇+5%甘油+7%低聚异麦芽糖。将以上各混合液置于-60。C下预冻24小时再进行冻干,在-6(TC,真空度为3pa下真空冷冻干燥32小时后得 冻干制品,各单菌冻干制品再以等细胞数目均匀混合后用锡箔密封包装即为复合菌种发酵剂 成品。实施例3用等细胞数量的德氏乳杆菌保加利亚亚种;乳酸乳球菌;肠膜明串珠菌;嗜酸乳杆菌; 干酪乳杆菌;克鲁维酵母和酿酒酵母分别在全自动发酵罐中进行半连续高密度培养,各菌的 增菌培养条件如下:德氏乳杆菌保加利亚亚种:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,德 氏乳杆菌保加利亚亚种以5%的量接种到优化培养基中,pH值6.5,搅拌速度200rpm, 30'C不 通气连续培养6小时,流加增殖因子3.5%麦芽汁+3.5%酵母粉+10%番茄汁,流加量为培养基 的15%,继续培养,培养6小时后流加相同体积的优化培养基,再培养6小时后收集发酵液。 乳酸乳球菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以3%的量接种到优化培养基中,控制 pH值6.0, 32°C,搅拌速度200rpm不通气培养6小时后,流加增殖因子7. 5%麦芽汁+2%酵母 粉+15mg/L Vc继续培养,流加量为培养基的20%,培养5小时后再流加相同体积的优化培养 基培养8小时后收集发酵液。肠膜明串珠菌:优化培养基由蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,葡萄 糖1%,柠檬酸钠0.15%,磷酸二氢钾0.1%组成,菌株接种量为5%, pH值6.5, 32'C培养,搅 拌速度为200rpm,通氧气量为lvol/vol/min发酵培养4小时后,流加10%培养基量的增殖因 子0. 0075%Mg2++0. 0075MMr^+4W酵母粉,培养4小时后再流加相同体积的优化培养基继续培养 6小时后收集培养液。嗜酸乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,嗜酸乳杆菌以 5%的量接种到优化培养基中,控制pH值为6. 5, 35°C ,搅拌250rpm,通氧气量为lvol/vol/min 培养3小时后流加增殖因子4. 5%麦芽汁+3. 5%酵母粉+10%番茄汁,流加量为培养基的15%,在半连续培养装置中连续培养3小时后再流加相同体积的优化培养基继续培养5小时后收集菌 液。干酪乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,干酪乳杆菌以5%的量接种到优化 培养基中控制pH值为6. 5, 30°C ,搅拌200rpm不通气连续培养6小时,以7. 5%麦芽汁+2. 5% 酵母粉+10%番茄汁为增殖因子,流加量为培养基的10%,再培养6小时,流加相同体积的优 化培养基继续培养9小时后收集发酵掖。克鲁维酵母:以2%酵母膏+1%蛋白胨+2%葡萄糖+0. 1% KH2P04为优化培养基,克鲁维酵母菌以5%的量接种到优化培养基中,控制pH值为6.5, 28°C, 280rpm搅拌,通氧气量为20vol/voi/min发酵培养4小时后流加培养基量0. 25%的增殖因子 0. 30mg/mL ZrT +55 u g/mL生物素+60u g/mL肌醇,再培养4小时后流加相同体积的培养基继 续培养6小时,收集发酵液。酒香酵母:以2%酵母膏+1%蛋白胨+2%葡萄糖+0. 1% 1(貼04为优化 培养基,酒香酵母以5%的量接种到优化培养基中,用30y。Na2C03控制pH值为6.5,在半连续 培养装置中28°C,搅拌速度为280卬m,通氧气量为20vol/vol/min连续培养4小时后流加培 养基量的0. 30%的增殖因子0. 25mg/mL Zn2+ + 55 u g/mL生物素+45 u g/mL肌醇,培养4小时 后流加相同体积的优化培养基继续培养6小时后收集发酵液。分别将以上各单菌发酵液在Ot:条件下,转速为8000转/分钟由高速冷冻离心机进行处 理,离心后的浓縮菌体在无菌条件下加入和菌体等质量的细胞保护剂混合,各种浓縮菌体加 入的细胞保护剂如下:德氏乳杆菌保加利亚亚种:5%海藻糖+5%山梨醇+5%甘油+10%低聚异麦 芽糖;乳酸乳球菌:50g/kg蔗糖+10g/kg甘油+2g/kg L-cys +lg/kg Vc;肠膜明串珠菌:5% 蔗糖+5%聚乙二醇+10%甘油;嗜酸乳杆菌:10%低聚异麦芽糖+5%甘油+0. 05MVc+l(^脱脂乳;干 酪乳杆菌:5%低聚异麦芽糖+7.5%甘露醇+10%脱脂奶;克鲁维酵母:10%脱脂乳粉+10%甘油 +2%海藻糖溶液;酒香酵母:5%海藻糖+7. 5%乙二醇+10%甘油+5%低聚异麦芽糖。将以上各混合 液置于-60'C下预冻24小时再进行冻干,在-60°C,真空度为5pa下真空冷冻干燥36小时后 得冻干制品,各单菌冻干制品再以等细胞数目均匀混合后用锡箔密封包装即为复合菌种发酵 剂成品。

Claims (3)

1. 一种复合菌种发酵剂,其特征在于它主要是由下列等量重量比原料制成:德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、克鲁维酵母、酿酒酵母,进行高密度培养后真空冷冻干燥,制成直投式单菌发酵剂再以等量细胞数目复合成复合菌种发酵剂。
2、 根据权利要求1所述的一种复合菌种发酵剂的制备方法如下-(1) 对菌种德氏乳杆菌保加利亚亚种、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌、嗜酸乳杆菌、干酪 乳杆菌、克鲁维酵母和酒香酵母,进行高密度培养,方法和步骤如下;各菌以3〜5%培养基 的量接种到优化培养基中,全自动发酵罐培养,流加无菌3(mNa2C03溶液控制发酵过程中的pH 值,培养3〜6小时后添加培养基量的0. 1〜20%增殖因子,培养3〜6小时后流加相同体积的 优化培养基继续培养,继续培养4〜10小时后收集发酵液;(2) 对各菌种培养基再分别发酵;① 德氏乳杆菌保加利亚亚种:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以3〜5%麦芽汁 +3〜5%酵母粉+5〜10%番茄汁为增殖因子,增殖因子添加量为培养基的10〜20%,控制pH值 为6. 5,在半连续培养装置中3(TC连续培养16〜24小时,搅拌速度是200〜250rpm,不通气 发酵;② 乳酸乳球菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以5〜10%麦芽汁+1〜3%酵母粉 +15〜20mg/L Vc为增殖因子,增殖因子添加量为培养基的10〜20%,控制pH值为6.0,在半 连续培养装置中32。C连续培养16〜24小时,搅拌速度是200〜250rpm,不通气发酵;③ 肠膜明串珠菌:以蛋白胨0. 5%+酵母膏0. 5%+葡萄糖1%+柠檬酸钠0. 15%+磷酸二氢钾 0. 1%为优化培养基,以0. 005〜0. ll%Mg2++0.005〜0.01%Mn2++3〜5%酵母粉为增殖因子,增殖 因子添加量为培养基的5〜10%,控制pH值为6.5,在半连续培养装置中32'C连续培养16〜 24小时,搅拌速度200〜250rpm,通气量为1〜2vol/vol/min;④ 嗜酸乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以3〜5%麦芽汁+3〜5%酵母粉 +15〜20%番茄汁为增殖因子,增殖因子添加量为培养基的10〜20%,控制pH值为6.5,在半 连续培养装置中35。C连续培养12〜14小时,搅拌速度200〜250rpm,通气量为l〜 2vol/vol/min发酵;⑤ 干酪乳杆菌:以12%脱脂奶+蛋白水解酶为优化培养基,以5〜10%麦芽汁+2〜3%酵母粉 +5〜15%番茄汁为增殖因子,增殖因子添加量为培养基的10〜20%, pH值为6.5,在半连续 培养装置中3(TC连续培养16-24小时,搅拌速度200〜250rpm,不通气发酵;第(2)种方法制得的氯化镁载体复合后过渡金属催化剂A100毫克,将压力升至并维持1.0MPa,在70'C反应2小时。聚合反应结束后,收集聚乙烯颗粒 粉料,称重得183克,催化剂的效率为915gPE/gcath,堆密度(BD)为0.37g/ml。 通过电镜观察树脂颗粒呈球形。聚乙烯的Mn:30000, Mw/Mn:19.8,枝化度为 4.7。实施例7在2升的不锈钢高压聚合釜中,用氮气和乙烯各置换三次,然后加入200 毫升己烷溶剂,将釜温升至70。C,再加入其余800毫升己烷溶剂,随着己烷的 加入,将1.0毫升2摩尔/升的三异丁基铝己垸溶液加入,接着加入实施例1中 第(2 )种方法制得的氯化镁载体复合后过渡金属催化剂A 102毫克,将压力 升至并维持l.OMPa,在5(TC反应2小时。聚合反应结束后,收集聚乙烯颗粒 粉料,称重得145克,催化剂的效率为704gPE/gcath,堆密度(BD)为0.35g/ml。 通过电镜观察树脂颗粒呈球形。聚乙烯的Mn:33200, Mw/Mn:17.6,枝化度为 5.4。实施例8在2升的不锈钢高压聚合釜中,用氮气和乙烯各置换三次,然后加入200 毫升己烷溶剂,将釜温升至70。C,再加入其余800毫升己烷溶剂,随着己烷的 加入,将1.0毫升2摩尔/升的三异丁基铝己烷溶液加入,接着加入实施例1中 第(2)种方法制得的氯化镁载体复合后过渡金属催化剂A 95毫克,将压力 升至并维持0.5 MPa,在7(TC反应2小时。聚合反应结束后,收集聚乙烯颗粒 粉料,称重得134克,催化剂的效率为705gPE/gcat'h,堆密度(BD)为0.36g/ml。
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