CN108289918B - 经巴氏灭菌的艾克曼菌用于治疗代谢病症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗有需要的受试者的代谢病症的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。本发明还涉及用于治疗代谢病症的包含经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的组合物、药物组合物和药物。本发明还涉及经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段用于促进有需要的受试者的体重减轻的用途。

Description

经巴氏灭菌的艾克曼菌用于治疗代谢病症的用途
技术领域
本发明涉及代谢病症的治疗，所述代谢病症诸如例如与超重和肥胖症有关的代谢病症，例如糖尿病或高胆固醇。本发明更具体地涉及用于治疗代谢病症的包含经巴氏灭菌的艾克曼菌属的种(Akkermansia spp.)或其片段的组合物。
背景技术
肥胖症是一个全球性问题，肥胖成人的估计数目为约6亿人。这种肥胖症的流行与肥胖症相关病症(诸如例如糖尿病、高血压、心脏病理和肝病)的患病率大幅增加有关。由于这些高度失能的病理，西方国家目前认为肥胖症是最重要的公共健康问题之一。因此，对用于治疗或预防肥胖症和/或肥胖症相关病症的组合物和方法存在真正需要。
肥胖症和肥胖症相关疾病与以下各项有关：(i)代谢功能障碍(例如，对葡萄糖稳态和脂质代谢有影响)；(ii)与较高的血液脂多糖(LPS)水平相关的低级炎症状态(也称为代谢性内毒素血症)；和(iii)导致细菌和/或微生物组分移位到诸如肝脏或脂肪组织等器官中的肠屏障功能受损(即肠通透性增加)。因此，为了治疗肥胖症，需要对这3种因子中的至少1种、优选2种、更优选3种的影响。在炎性肠病诸如例如克罗恩病、结肠炎、溃疡性结肠炎、肠疼痛(例如绞痛)和其它肠炎性疾病期间也观察到这些现象(即肠炎、LPS和细菌移位)。有趣的是，炎性肠病和肥胖症相关疾病都与肠微生物群组成的变化有关。因此，加强肠屏障功能是主要问题之一。
人类的肠道由代表超过1000种不同物种的多样的、复杂的和动态的微生物群落定殖，这些物种不断与宿主相互作用(Zoetendal等人，2008.Gut.57(11)：1605-1615；Rajilic-Stojanavic和de Vos，2014.FEMS Microbiol.Rev.38：996-1047)。肠微生物群的稳态依赖于宿主特征(年龄、性别、遗传背景…)和环境条件(应激、药物、胃肠手术、感染源和毒性剂…)，但也依赖于每天的饮食变化。
最近已承认的是，肠微生物群涉及许多脑病症例如焦虑、孤独症(Hsiao等人，2013.Cell.155(7)：1451-1463)、帕金森病(Scheperjans等人，2015.Mov.Disord.30(3)：350-8)、阿尔茨海默病(Harach等人，2015.arXiv：1509.02273)并涉及多发性硬化症(Berer等人，2011.Nature.479(7374)：538-41)。
也证明肠微生物群失衡是癌症例如结直肠癌发展的风险因素(Zitvogel等人，2015.Sci.Transl.Med.7(271)：271ps1；Louis等人，2014.Nat.Rev.Microbiol.12(10)：661-72)。
越来越多的证据也支持肠微生物群在肥胖症和相关病症(Delzenne&Cani，2011.Annu.Rev.Nutr.31：15-31)和肠炎症(Wlodarska等人，2015.Cell Host Microbe.17(5)：577-91)或肠疼痛(例如婴儿肠绞痛)(de Weerth等人，2013.Pediatrics.131：e550)的发展中的作用。在所有这些情形(肥胖症、肠炎症、绞痛)中，微生物群的生态失调可以进一步破坏器官之间的相互关系(crosstalk)以及肠屏障的完整性，从而导致症状。
因此，用靶向肠微生物群的产品进行治疗对于治疗肥胖症和相关病症似乎是有希望的治疗手段。这些产品可由活微生物组成(例如在大多数益生菌的情况下)，或含有死亡的微生物或其片段。此外，这些产品可以包含由肠微生物群利用的底物(例如在益生元的情况下)，或者包含改变肠微生物群平衡的化合物，如特定的抗微生物化合物。
例如，WO 2008/076696描述了肠微生物群作为治疗肥胖症和相关病症的治疗靶。WO 2008/076696具体描述了通过向受试者施用抗生素和/或益生菌来改变受试者肠中拟杆菌门(Bacteroidetes)和/或厚壁菌门(Firmicutes)的丰度的方法。
此外，EP 2 030 623涉及通过调节肠中肠细菌(Enterobacteria)的量来预防和/或治疗代谢病症，诸如例如肥胖症相关病症。EP 2 030 623公开了通过施用益生菌诸如例如双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)或乳杆菌属(Lactobacillus)来减少肠中的肠细菌的量。
专利申请US 2012/083514涉及包含非复制性益生菌微生物的婴儿谷类食品。US2012/083514描述了三种类型的热处理：140℃达15秒(超高温)；74℃、90℃和120℃，达15秒(高温短时间)；和85℃达20分钟(低温长时间)。然而，在该专利申请US 2012/083514中显示，在85℃进行热处理20分钟的细菌中，IL12/IL10的比率大大增加。IL12是一种促炎细胞因子，而IL10是一种抗炎细胞因子。因此，US 2012/083514证明，在85℃热处理20分钟增加受试者的炎性状态，因此不推荐用于治疗炎性病症。同时，US 2012/083514证明，细菌必须被加热很短的时间(15秒)以呈现抗炎特征。
此外，申请人描述了在益生元治疗的肥胖小鼠中肠微生物群被改变(Everard等人，2011Nov.Diabetes.60(11)：2775-86)。此外，益生元(1)改善肥胖和糖尿病小鼠中的葡萄糖和脂质代谢，(2)减少肥胖小鼠的血浆LPS并改善肠屏障功能(例如炎症减轻)，(3)诱导肥胖和糖尿病小鼠中肠内分泌L-细胞数增加，以及(4)改善饮食诱导的肥胖和糖尿病小鼠中的瘦蛋白敏感性和葡萄糖稳态。
申请人还描述了嗜粘蛋白艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)或其片段用于治疗肥胖症和相关病症的用途(WO 2014/076246)。此外，申请人还公开了患有溃疡性结肠炎的患者肠中嗜粘蛋白艾克曼菌的丰度降低(
Figure BDA0001653550700000031
M等人，2013Mar.Inflamm.Bowel Dis.19(3)：481-8)。在克罗恩病中，发现了大部分产生丁酸盐的细菌被消耗(Wlodarska等人，2015.Cell Host Microbe.17(5)：577-91)。然而，已经证明，产生短链脂肪酸丙酸盐和乙酸盐的嗜粘蛋白艾克曼菌也可以产生营养链，该营养链产生丁酸盐作为粘液的终产物。已知丁酸盐减少肠的疼痛感，并且像乙酸盐和丙酸盐一样，已知丁酸盐显示免疫信号传导。最后，已经证明，添加嗜粘蛋白艾克曼菌增加人细胞系中的屏障功能(Reunanen等人，2015.Appl.Environ.Microbiol.81(11)：3655-62)。因此，嗜粘蛋白艾克曼菌及其产物极有可能在健康人以及肠炎性疾病的患者中减少肠疼痛和炎症以及增强肠屏障。这可能不仅适用于成人，而且也适用于婴儿，因为减少丁酸盐产生者与小婴儿中的婴儿肠绞痛和特应性疾病中的过度哭闹有关(de Weerth等人，2013.Gut Microbes.4(5)：416-21；Nylund等人，2015.Allergy.70(2)：241-4)。
然而，在本文中，申请人出乎意料地证明，施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌比非经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌更有效增加屏障功能和治疗与肥胖症和相关病症有关的代谢功能障碍。因此，本发明涉及经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段用于增加屏障功能和治疗肥胖症和相关病症的用途。
发明内容
本发明涉及用于治疗有需要的受试者的代谢病症的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段，其中嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌。在一个具体的实施方案中，嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段用于治疗肥胖症。
在一个实施方案中，嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段用于治疗代谢病症，其中所述代谢病症选自代谢综合征；胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关病症；糖尿病，包括2型糖尿病；葡萄糖耐受不良；脂质代谢异常；动脉粥样硬化；高血压；先兆子痫；心脏病理；中风；非酒精性脂肪肝病；高血糖；肝性脂肪变性；肝病，包括与肥胖症相关的纤维化和肝功能异常，更具体是胆汁产生和免疫力的变化；血脂异常；与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍；炎性免疫性屏障功能疾病，包括炎性肠病，更具体是克罗恩病和溃疡性结肠炎以及肠道易激综合征；心血管疾病；高胆固醇；甘油三酯升高；哮喘；睡眠呼吸暂停；骨关节炎；神经变性；胆囊疾病；X综合征；致动脉粥样硬化性血脂异常和癌症。
本发明还涉及嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段，其用于增加受试者的能量消耗，优选不影响所述受试者的食物摄入，其中嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌。
本发明的另一个目的是用于增加受试者的饱腹感的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段，其中嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌。
在一个实施方案中，经口施用如上所述供使用的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
在一个实施方案中，如上文所述供使用的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段以约1.104至约1.1012个细胞，更优选约1.105至约1.1011个细胞，甚至更优选约1.106至约1.1010个细胞的量被施用于受试者。
在本发明的一个实施方案中，如上所述供使用的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段每周施用至少三次。
在一个实施方案中，如上所述供使用的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段与另外的益生菌菌株和/或具有有益作用的另外的细菌和/或微生物和/或与一种或多种益生元共同施用。
本发明还涉及用于治疗受试者的代谢病症或增加受试者的能量消耗或增加受试者的饱腹感的组合物，所述组合物包含如上所述的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段以及赋形剂。
在一个实施方案中，所述供使用的组合物是营养组合物。在一个实施方案中，所述供使用的组合物是经口施用的。
本发明的另一个目的是用于治疗受试者的代谢病症或增加受试者的能量消耗或用于增加受试者的饱腹感的药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段以及药学可接受的载体。
本发明进一步涉及用于治疗受试者的代谢病症或增加受试者的能量消耗或用于增加受试者的饱腹感的药物，其包含如上所述的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
本发明还涉及嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段用于促进有需要的受试者的体重减轻的用途，其中嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌。
本发明的另一个目的是包含嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的美容组合物，其用于促进有需要的受试者的体重减轻，其中嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌。
定义
在本发明中，以下术语具有以下含义：
-“治疗(treatment)”意指预防(即防止发生)、减轻或缓解疾病、病症或病况的至少一种不利作用或症状。因此，该术语既指治疗性处理，也指预防或防止性措施；其中目的是预防或减缓(减轻)靶向的病理病况或病症。在本发明的一个实施方案中，需要治疗的受试者包括已经患有该病症的受试者以及易患有该病症的受试者或者待预防该病症的受试者。
-“有效量(effective amount)”是指药剂的水平或量，其在不对靶标造成显著负面或不利副作用的情况下旨在(1)延迟或预防代谢病症的发作；(2)减缓或停止代谢病症的一种或多种症状的进展、加剧或恶化；(3)引起代谢病症症状的缓解；(4)降低代谢病症的严重性或发生率；(5)治愈代谢病症；或(6)恢复待治疗的受试者的肠中嗜粘蛋白艾克曼菌的正常量和/或比例。有效量可以在代谢病症发作之前施用，用于预防或防止作用。可选地或另外地，有效量可以在代谢病症开始后施用，用于治疗作用。
-“嗜粘蛋白艾克曼菌”是指由Derrien鉴定的降解粘蛋白的细菌(Derrien等人，2004.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54：1469-1476)。细胞是椭圆形的、非运动性的和革兰氏染色阴性的。嗜粘蛋白艾克曼菌也可以被称为艾克曼菌属的种(Akkermansia spp.)或者艾克曼菌(Akkermansia)样细菌。它属于衣原体科(Chlamydiae)/疣微菌门(Verrucomicrobia)群；疣微菌门。如果分类学改变，则技术人员会知道如何适应分类学中的变化以推断可用于本发明的菌株。此外，申请人已确定嗜粘蛋白艾克曼菌的完整基因组(van Passel等人，2011.PLoS One.6(3)：e16876)。通常认为，通过DNA-DNA杂交经由实验确定的核苷酸相似度为约70％的菌株可以被认为是相同的物种——这对应于约95％的平均核苷酸同一性(ANI)(Goris等人，2007.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.57：81-91)。
-“经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌”是指经受加热处理的嗜粘蛋白艾克曼菌。在一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌是指在50℃至100℃的温度被加热至少10分钟的嗜粘蛋白艾克曼菌。
-“益生菌(Probiotics)”是指当以有效量施用时对受试者的保健或健康提供有益作用的微生物细胞制备物(例如活的微生物细胞)。根据定义，所有益生菌都具有经证明的非致病特性。在一个实施方案中，这些健康益处与改善胃肠道中人或动物微生物群的平衡和/或恢复正常微生物群相关。
-“益生元(Prebiotic)”是指一种物质，所述物质例如可能不被人消化，但通过肠内微生物对该物质的代谢来调节肠微生物群的组成和/或活性，从而赋予对宿主的有益生理作用。
-“受试者”是指动物，优选哺乳动物，更优选人。在一个实施方案中，受试者是雄性。在另一个实施方案中，受试者是雌性。在本发明的一个实施方案中，受试者还可以指宠物，例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠、雪貂、兔子等。
-“超重”是指其中受试者的体重指数(BMI)范围为25至30的所述受试者的状况。如本文所用，BMI被定义为个体的体重(以kg计)除以他/她的身高(以米计)的平方。
-“肥胖症(obesity)”是指其中受试者的BMI超过或等于30的所述受试者的状况。
-数字前面的“约”是指所述数字的值加或减20％，优选10％。
-“片段(fragment)”可以指由经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的代谢产生的细胞组分、代谢物、分泌的分子和化合物等。例如，可以通过在巴氏灭菌后回收嗜粘蛋白艾克曼菌培养物的上清液，或通过在巴氏灭菌后从嗜粘蛋白艾克曼菌培养物中提取细胞组分或细胞级分、代谢物或分泌的化合物来获得片段。术语片段也可以指降解产物。片段可对应于分离形式的组分或对应于来自经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的一种或多种组分的任何混合物。在一个实施方案中，片段可以对应于以另一种方式(例如使用重组DNA技术)在微生物宿主或任何其它(生物)合成过程中产生的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌中存在的这样的组分中的一种或多种。
-“代谢病症(Metabolic disorde)”是指由以下引起或表征的病症、疾病和病况：异常体重增加、能量使用或消耗；对摄入的或内源性营养素、能量源、激素或体内其它信号传导分子的改变的反应；或改变的碳水化合物、脂质、蛋白质、核酸的代谢；或其组合。代谢病症可与导致碳水化合物、脂质、蛋白质和/或核酸的代谢失衡的代谢途径中的缺乏或过量相关。代谢病症的实例包括但不限于代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关病症、糖尿病(例如2型糖尿病)、葡萄糖耐受不良、脂质代谢异常、动脉粥样硬化、高血压、先兆子痫、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖、不同病因学的肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、神经变性、胆囊疾病、X综合征、炎性免疫性病症、致动脉粥样硬化性血脂异常和癌症。
具体实施方式
申请人在本文中证明，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌施用后比非经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌施用后观察到的对代谢的有益作用更重要(参见实施例)。
因此，本发明涉及用于治疗有需要的受试者的代谢病症的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
如本文所用，代谢病症是与改变的代谢稳态例如改变的葡萄糖或脂质稳态相关的病症。
在本发明的一个实施方案中，所述代谢病症是肥胖症。
其它代谢病症的实例包括但不限于代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关病症、糖尿病(例如2型糖尿病)、葡萄糖耐受不良、脂质代谢异常、动脉粥样硬化、高血压、先兆子痫、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖、肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍、肝病(例如与肥胖症相关的纤维化或肝功能异常，包括胆汁产生、免疫力等的变化)、炎性免疫性屏障功能疾病(inflammatory，immune and barrierfunction diseases)(例如炎性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎以及肠道易激综合征)、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、神经变性、胆囊疾病、X综合征、炎性和免疫病症、致动脉粥样硬化性血脂异常和癌症。
在另一个实施方案中，所述代谢病症是超重和/或肥胖症相关的代谢病症，即可与超重和/或肥胖症相关或由超重和/或肥胖症引起的代谢病症。超重和/或肥胖症相关代的谢病症的实例包括但不限于代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗相关病症、糖尿病(例如2型糖尿病)、葡萄糖耐受不良、脂质代谢异常、动脉粥样硬化、高血压、心脏病理、中风、非酒精性脂肪肝病、高血糖、肝性脂肪变性、血脂异常、与超重和肥胖症相关的免疫系统功能障碍、心血管疾病、高胆固醇、甘油三酯升高、哮喘、睡眠呼吸暂停、骨关节炎、神经变性、胆囊疾病、X综合征、炎性和免疫病症、致动脉粥样硬化性血脂异常和癌症。
在一个实施方案中，所述代谢病症是糖尿病，优选2型糖尿病。在另一个实施方案中，所述代谢病症是高胆固醇血症(也称为高胆固醇)。在一个实施方案中，高胆固醇血症对应于超过或等于2g/L或5mmol/L的血浆胆固醇浓度。在另一个实施方案中，高胆固醇血症对应于高于或等于4.5∶1、优选5∶1的总胆固醇血浆浓度：HDL(高密度脂蛋白胆固醇)的血浆浓度的比率。
如本文所用，术语“经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌”意指经受加热的嗜粘蛋白艾克曼菌。在一个实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在50℃至100℃，优选60℃至95℃，更优选70℃至90℃的温度加热。在一个实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在50、51、52、53、54、55、56、57、58或59℃的温度加热。在另一个实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在60、61、62、63、64、65、66、67、68或69℃的温度加热。在又一个实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在70、71、72、73、74、75、76、77、78或79℃的温度加热。在又一个实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在80、81、82、83、84、85、86、87、88或89℃的温度加热。在又一个实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在90、91、92、93、94、95、96、97、98、99℃或100℃的温度加热。
在一个实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌未在高于100℃的温度加热。在一个具体的实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌不在超高温，例如在110℃至140℃的温度加热。在一个实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌未在高于90℃的温度加热。因此，在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白艾克曼菌未被灭菌。灭菌是旨在破坏、杀死或灭活所有生命形式和其它生物剂的处理。这包括微生物及其孢子以及病毒和朊病毒。与灭菌不同，巴氏灭菌并不意图杀死所有的微生物，而是通常应用于食物，目的是减少活病原体的数量。
在本发明的一个实施方案中，将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热至少10分钟。在本发明的另一个实施方案中，将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热至少15、20、25、30、35或45分钟。在一个实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热10至45分钟的时间段。
在一个实施方案中，不将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌短时间加热。在一个具体的实施方案中，不将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热1至30秒、1至60秒、1至90秒或1至120秒的时间。在一个优选的实施方案中，不将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热少于1分钟的时间，优选少于5、6、7、8或9分钟的时间。
在一个实施方案中，将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在50℃至100℃的温度加热至少10分钟。在一个具体的实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热至60℃达20或30分钟。在另一个具体的实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热至70℃达20或30分钟。在另一个具体实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热至80℃达20或30分钟。在另一个具体实施方案中，将本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌加热至90℃达20或30分钟。
在一个具体的实施方案中，不将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在高于110℃的温度加热约1至120秒。在另一个具体的实施方案中，不将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在高于100℃的温度加热约1至120秒。在另一个具体的实施方案中，不将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌在高于90℃的温度加热约1至120秒。
根据一个实施方案，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌是非活细胞。如本文所用，“非活细胞(non-viable cell)”意指不能增殖的细胞。细胞存活力和增殖的测量可以是本领域技术人员已知的任何方法。例如，可以通过将包含经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的溶液涂敷在培养皿上或使用任何其它培养方法，并在最佳生长条件下温育确定的时间后计数克隆的数量或光密度，来评估细胞存活力和增殖。此外，通过显微观察，还可以确定细胞(包括活细胞以及非活细胞)的数量，至少因为细胞的完整性不受损害。尽管相差显微术是这样做的众所周知的方法，但可以通过用染料、荧光探针或抗体进行特异性染色来进一步显现微生物细胞。这有助于显微观察，同时染色细胞的数量也可以通过流式细胞术计数。Derrien等人(2008.Appl.Environ.Microbiol.74：1646-8)、Derrien等人(2011.Frontiers Microbiol.2：166-175)或Reunanen等人(2015.Appl.Environ.Microbiol.81(11)：3655-62)已经提供了使嗜粘蛋白艾克曼菌细胞可视化或对其计数的实例。
在一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段是基本上纯化的。如本文所用，术语“基本上纯化的(substantially purified)”意指经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段包含在样品中，在所述样品中，其占所述样品的细菌菌株或其片段的至少约50％，优选至少约60、70、80、85、90、95、99％或更多。
本发明还涉及用于治疗代谢病症或在所述治疗中被使用的包含有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的组合物。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的有效量对应于足以恢复受试者肠内嗜粘蛋白艾克曼菌的正常量和/或比例的细菌的量。在本发明的一个实施方案中，嗜粘蛋白艾克曼菌的正常量和/或比例对应于存在于健康受试者肠中的嗜粘蛋白艾克曼菌的量和/或比例。
如本文所用，术语“健康受试者(healthy subject)”用于定义不受待治疗疾病影响的受试者。例如，如果将经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段用于治疗肥胖症，则健康受试者不受肥胖症的影响。优选地，健康受试者与待治疗的受试者共有共同特征，例如相同的性别(gender)、年龄、性别(sex)、饮食、药物摄取或地理位置。
在本发明的一个实施方案中，肠内的嗜粘蛋白艾克曼菌的正常比例范围为约0.1％至约10％(以嗜粘蛋白艾克曼菌细胞的数量相对于肠的细菌细胞总数计)，优选约0.3％至约5％，更优选约1％至约3％。
在一个实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的有效量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为从约1.102至约1.1015cfu、优选从约1.104至约1.1012cfu、更优选从约1.105至约1.1010cfu、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu的嗜粘蛋白艾克曼菌的量，其中cfu代表“菌落形成单位”。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的有效量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为从约1.106至约1.1010cfu、优选从约1.108至约1.1010cfu、更优选从约1.109至约1.1010cfu的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的有效量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为从约1.106至约1.1011cfu、优选从约1.108至约1.1011cfu、更优选从约1.1010至约1.1011cfu的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在一个实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的有效量范围为约1.102至约1.1015个细胞、优选从约1.104至约1.1012个细胞、更优选从约1.105至约1.1010个细胞、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的有效量范围为约1.106至约1.1010个细胞、优选从约1.108至约1.1010个细胞、更优选从约1.109至约1.1010个细胞。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的有效量范围为约1.106至约1.1011个细胞、优选从约1.108至约1.1011个细胞、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的有效量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为约1.102至约1.1015cfu、优选从约1.104至约1.1012cfu、更优选从约1.105至约1.1010cfu、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu、的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量，其中cfu代表“菌落形成单位”。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的有效量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为约1.106至约1.1010cfu、优选从约1.108至约1.1010cfu、更优选从约1.109至约1.1010cfu的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的有效量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为约1.106至约1.1011cfu、优选从约1.108至约1.1011cfu、更优选从约1.1010至约1.1011cfu的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的有效量范围为约1.102至约1.1015个细胞、优选从约1.104至约1.1012个细胞、更优选从约1.105至约1.1010个细胞、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞的衍生片段。在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的有效量范围为约1.106至约1.1010个细胞、优选从约1.108至约1.1010个细胞、更优选从约1.109至约1.1010个细胞的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的有效量范围为约1.106至约1.1011个细胞、优选从约1.108至约1.1011个细胞、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞的衍生片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为约1.102至约1.1015cfu/g组合物、优选从约1.104至约1.1012cfu/g组合物、更优选从约1.105至约1.1010cfu/g组合物、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu/g组合物的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为约1.102至约1.1015cfu/mL组合物、优选从约1.104至约1.1012cfu/mL组合物、更优选从约1.105至约1.1010cfu/mL组合物、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu/mL组合物的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为约1.106至约1.1010cfu/g或cfu/mL组合物、优选从约1.108至约1.1010cfu/g或cfu/mL、更优选从约1.109至约1.1010cfu/g或cfu/mL的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为约1.106至约1.1011cfu/g或cfu/mL组合物、优选从约1.108至约1.1011cfu/g或cfu/mL、更优选从约1.1010至约1.1011cfu/g或cfu/mL的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的量的范围为约1.102至约1.1015个细胞/g组合物、优选从约1.104至约1.1012个细胞/g组合物、更优选从约1.105至约1.1010个细胞/g组合物、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞/g组合物。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的量的范围为约1.102至约1.1015个细胞/mL组合物、优选从约1.104至约1.1012个细胞/mL组合物、更优选从约1.105至约1.1010个细胞/mL组合物、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞/mL组合物。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的量的范围为约1.106至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL组合物、优选从约1.108至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL、更优选从约1.109至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的量的范围为约1.106至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL组合物、优选从约1.108至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为约1.102至约1.1015cfu/g或cfu/mL组合物、优选从约1.104至约1.1012cfu/g或cfu/mL组合物、更优选从约1.105至约1.1010cfu/g或cfu/mL组合物、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu/g或cfu/mL组合物的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为约1.106至约1.1010cfu/g或cfu/mL组合物、优选从约1.108至约1.1010cfu/g或cfu/mL、更优选从约1.109至约1.1010cfu/g或cfu/mL的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为约1.106至约1.1011cfu/g或cfu/mL组合物、优选从约1.108至约1.1011cfu/g或cfu/mL、更优选从约1.1010至约1.1011cfu/g或cfu/mL的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的量的范围为约1.102至约1.1015个细胞/g或个细胞/mL组合物、优选从约1.104至约1.1012个细胞/g或个细胞/mL组合物、更优选从约1.105至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL组合物、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞/g或个细胞/mL组合物的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的量的范围为约1.106至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL组合物、优选从约1.108至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL、更优选从约1.109至约1.1010个细胞/g或个细胞/mL的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的组合物包含的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的量的范围为约1.106至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL组合物、优选从约1.108至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞/g或个细胞/mL的衍生片段。
本发明还涉及药物组合物，其包含有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段和至少一种药学上可接受的赋形剂。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗或预防代谢病症。在本发明的另一个实施方案中，所述药物组合物用于在有需要的受试者的肠中恢复嗜粘蛋白艾克曼菌的正常比例或增加嗜粘蛋白艾克曼菌的任何活性化合物的丰度。
如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂(pharmaceutically acceptableexcipient)”是指当施用于动物、优选人时不产生不利反应、过敏反应或其它不良反应的赋形剂。它可以包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人类施用，制剂应满足FDA生物制品标准局(FDA Office of Biologics standards)要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
本发明还涉及药物，其包含有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。在本发明的一个实施方案中，本发明的药物用于治疗或预防代谢病症。在本发明的另一个实施方案中，所述药物用于在有需要的受试者的肠中恢复嗜粘蛋白艾克曼菌的正常比例。
本发明还涉及用于治疗或预防有需要的受试者的代谢病症的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
本发明的另一目的是用于在有需要的受试者的肠中恢复嗜粘蛋白艾克曼菌、嗜粘蛋白艾克曼菌的片段或其它活性化合物的正常比例的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
在一个实施方案中，本发明的方法包括向受试者施用有效量的本发明的组合物、药物组合物或药物。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或所述组合物、药物组合物或药物每周施用至少一次，优选每周施用至少两次，更优选每周施用至少三次，甚至更优选每周施用至少四次。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或所述组合物、药物组合物或药物每天施用至少一次，优选每天施用至少两次。
在一个实施方案中，在1周期间，优选在2、3、4、5、6、7或8周或更多周期间，施用本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或组合物、药物组合物或药物。
在一个实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或组合物、药物组合物或药物被施用持续直至达到所需的结果(例如，体重减轻，代谢病症治疗，胆固醇血浆水平降低…)的时间段。
在一个实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或组合物、药物组合物或药物的施用是永久性的，即在时间上不受限制。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为从1.102至约1.1015cfu/天、优选从约1.104至约1.1012cfu/天，、更优选从约1.105至约1.1010cfu/天、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu/天的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为从1.106至约1.1010cfu/天、优选从约1.108至约1.1010cfu/天、更优选从约1.109至约1.1010cfu/天的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量对应于在巴氏灭菌步骤之前范围为从1.106至约1.1011cfu/天、优选从约1.108至约1.1011cfu/天、更优选从约1.1010至约1.1011cfu/天的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量范围为从1.102至约1.1015个细胞/天、优选从约1.104至约1.1012个细胞/天、更优选从约1.105至约1.1010个细胞/天、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞/天。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量范围为从1.106至约1.1010个细胞/天、优选从约1.108至约1.1010个细胞/天、更优选从约1.109至约1.1010个细胞/天。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量范围为从1.106至约1.1011个细胞/天、优选从约1.108至约1.1011个细胞/天、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞/天。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为1.102至约1.1015cfu/天、优选从约1.104至约1.1012cfu/天、更优选从约1.105至约1.1010cfu/天、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu/天的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为1.106至约1.1010cfu/天、优选从约1.108至约1.1010cfu/天、更优选从约1.109至约1.1010cfu/天的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量对应于在巴氏灭菌步骤之前从范围为1.106至约1.1011cfu/天、优选从约1.108至约1.1011cfu/天、更优选从约1.1010至约1.1011cfu/天的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量的范围为1.102至约1.1015个细胞/天、优选从约1.104至约1.1012个细胞/天、更优选从约1.105至约1.1010个细胞/天、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞/天的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量的范围为1.106至约1.1010个细胞/天、优选从约1.108至约1.1010个细胞/天、更优选从约1.109至约1.1010个细胞/天的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量的范围为1.106至约1.1011个细胞/天、优选从约1.108至约1.1011个细胞/天、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞/天的衍生片段。
在本发明的一个实施方案中，受试者超重。在另一个实施方案中，受试者是肥胖的。
在本发明的一个实施方案中，受试者被诊断患有代谢病症，例如超重和/或肥胖症相关的代谢病症。在本发明的一个实施方案中，受试者被诊断患有代谢病症，例如患有正常体重和/或空腹血糖受损和/或高甘油三酯血症和/或任何相关代谢病症或具有心血管风险因子。
在另一个实施方案中，受试者处于发生代谢病症(例如超重和/或肥胖症相关的代谢病症)的风险中。在一个实施方案中，所述风险与受试者超重或肥胖的事实有关。在另一个实施方案中，所述风险对应于易感性，例如对代谢病症(例如超重和/或肥胖症相关代谢病症)的家族易感性。
在本发明的一个实施方案中，受试者呈现肠微生物群组成的失调。优选地，所述受试者的肠微生物群中的嗜粘蛋白艾克曼菌菌株被耗尽。在一个实施方案中，嗜粘蛋白艾克曼菌在受试者肠中的比例低于1％，优选低于0.5％，更优选低于0.1％，所述比例以嗜粘蛋白艾克曼菌细胞数量对肠中细菌细胞总数表示。
本发明还涉及经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段用于促进受试者体重减轻的美容用途。
因此，本发明的另一个目的是包含美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的美容组合物，及其用于促进受试者体重减轻的用途。如本文所用，“美容有效量”是指对于促进美容效果(例如诱导受试者的体重减轻)必需和足够的美容组合物的量。
本发明还涉及用于促进有需要的受试者的体重减轻的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
在一个实施方案中，本发明的方法包括向受试者施用美容有效量的本发明的组合物或美容组合物。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的美容有效量对应于范围为约1.102至约1.1015cfu、优选从约1.104至约1.1012cfu、更优选从约1.105至约1.1010cfu、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的美容有效量对应于范围为约1.106至约1.1010cfu、优选从约1.108至约1.1010cfu、更优选从约1.109至约1.1010cfu的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的美容有效量对应于范围为约1.106至约1.1011cfu、优选从约1.108至约1.1011cfu、更优选从约1.1010至约1.1011cfu的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的美容有效量范围为约1.102至约1.1015个细胞、优选从约1.104至约1.1012个细胞、更优选从约1.105至约1.1010个细胞、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的美容有效量范围为约1.106至约1.1010个细胞、优选从约1.108至约1.1010个细胞、更优选从约1.109至约1.1010个细胞。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的美容有效量范围为约1.106至约1.1011个细胞、优选从约1.108至约1.1011个细胞、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的美容有效量对应于从范围为约1.102至约1.1015cfu、优选从约1.104至约1.1012cfu、更优选从约1.105至约1.1010cfu、甚至更优选从约1.106至约1.109cfu的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的美容有效量对应于从范围为约1.106至约1.1010cfu、优选从约1.108至约1.1010cfu、更优选从约1.109至约1.1010cfu的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的美容有效量对应于从范围为约1.106至约1.1011cfu、优选从约1.108至约1.1011cfu、更优选从约1.1010至约1.1011cfu的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的美容有效量范围为约1.102至约1.1015个细胞、优选从约1.104至约1.1012个细胞、更优选从约1.105至约1.1010个细胞、甚至更优选从约1.106至约1.109个细胞的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的美容有效量范围为约1.106至约1.1010个细胞、优选从约1.108至约1.1010个细胞、更优选从约1.109至约1.1010个细胞的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的美容有效量范围为约1.106至约1.1011个细胞、优选从约1.108至约1.1011个细胞、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞的衍生片段。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或所述组合物或美容组合物每周施用至少一次，优选每周施用至少两次，更优选每周施用至少三次，甚至更优选每周施用至少四次。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或所述组合物或美容组合物每天施用至少一次，并且优选每天施用至少两次。
在一个实施方案中，在1周期间，优选在2、3、4、5、6、7或8周或更多周期间，施用本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或组合物或美容组合物。
在一个实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或组合物或美容组合物被施用持续直至达到所需的结果(例如，体重减轻…)的时间段。
在一个实施方案中，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或组合物或美容组合物的施用是永久性的，即在时间上不受限制
在本发明的一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量对应于范围为从1.102至约1.1015cfu/天、优选从约1.105至约1.1012cfu/天、更优选从约1.108至约1.1010cfu/天、甚至更优选从约1.109至约1.1010cfu/天的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量对应于范围为从1.106至约1.1010cfu/天、优选从约1.108至约1.1010cfu/天、更优选从约1.109至约1.1010cfu/天的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量对应于范围为从1.106至约1.1011cfu/天、优选从约1.108至约1.1011cfu/天、更优选从约1.1010至约1.1011cfu/天的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌的量。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量范围为从1.102至约1.1015个细胞/天、优选从约1.105至约1.1012个细胞/天、更优选从约1.108至约1.1010个细胞/天、甚至更优选从约1.109至约1.1010个细胞/天。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量范围为从1.106至约1.1010个细胞/天、优选从约1.108至约1.1010个细胞/天、更优选从约1.109至约1.1010个细胞/天。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的每日量范围为从1.106至约1.1011个细胞/天、优选从约1.108至约1.1011个细胞/天、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞/天。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量对应于从范围为约1.102至约1.1015cfu/天、优选从约1.105至约1.1012cfu/天、更优选从约1.108至约1.1010cfu/天、甚至更优选从约1.109至约1.1010cfu/天的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量对应于从范围为约1.106至约1.1010cfu/天、优选从约1.108至约1.1010cfu/天、更优选从约1.109至约1.1010cfu/天的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量对应于从范围为约1.106至约1.1011cfu/天、优选从约1.108至约1.1011cfu/天、更优选从约1.1010至约1.1011cfu/天的、在巴氏灭菌步骤之前的嗜粘蛋白艾克曼菌衍生的片段的量。
在本发明的一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量的范围为约1.102至约1.1015个细胞/天、优选从约1.105至约1.1012个细胞/天、更优选从约1.108至约1.1010个细胞/天、甚至更优选从约1.109至约1.1010个细胞/天的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量的范围为约1.106至约1.1010个细胞/天、优选从约1.108至约1.1010个细胞/天、更优选从约1.109至约1.1010个细胞/天的衍生片段。
在本发明的另一个实施方案中，每日施用的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的片段的每日量的范围为约1.106至约1.1011个细胞/天、优选从约1.108至约1.1011个细胞/天、更优选从约1.1010至约1.1011个细胞/天的衍生片段。
在一个实施方案中，所述受试者不是肥胖受试者。在另一个实施方案中，所述受试者超重。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物还包含另外的益生菌菌株或菌种，例如细菌益生菌菌株或菌种；细菌以外的原核生物益生菌；或真菌菌株或菌种，优选酵母菌株或菌种。在一个实施方案中，所述另外的益生菌菌株或菌种选自天然存在于受试者肠中、优选天然存在于人肠中、更优选天然存在于健康人受试者的肠中的那些益生菌菌株或菌种。
可用于本发明的细菌益生菌菌株或菌种的实例包括但不限于乳杆菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、韦荣球菌属(Veillonella)、德库菌属(Desemzia)、克里斯滕森菌属(Christensenella)、Allobaculum、粪球菌属(Coprococcus)、柯林斯菌属(Collinsella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Turicibacter、萨特氏菌属(Sutterella)、罕见小球菌属(Subdoligranulum)、链球菌属、Sporobacter、Sporacetigenium、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、罗氏菌属(Roseburia)、变形杆菌属(Proteus)、丙酸杆菌属(Propionobacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属、普氏菌属(Prevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、Papillibacter、颤螺旋菌属(Oscillospira)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、多尔氏菌属(Dorea)、小杆菌属(Dialister)、梭菌属(Clostridium)、西地西菌属(Cedecea)、链型杆菌属(Catenibacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、布雷德菌属Bulleidia、嗜胆菌属(Bilophila)、拟杆菌属(Bacteroides)、Anaerovorax、Anaerostopes、厌氧细杆菌属(Anaerofilum)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、硬壁细菌类(Fermicutes)、奇异菌属(Atopobium)、另枝菌属(Alistipes)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Slackie、志贺氏菌属(Shigella)、希瓦氏菌属(Shewanella)、
沙雷氏菌属(Serratia)、Mahella、毛螺菌属(Lachnospira)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、海源菌属(Idiomarina)、梭杆菌属(Fusobacterium)、栖粪杆菌属(Faecalibacterium)、真杆菌属(Eubacterium)、肠球菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、埃格特菌属(Eggerthella)。
在一个具体的实施方案中，所述细菌益生菌菌株或菌种选自包括双歧杆菌属和乳杆菌属的列表。在一个实施方案中，双歧杆菌属益生菌菌株或菌种优选选自动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、更优选动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalis spp.lactis)和乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)。在一个实施方案中，乳杆菌属益生菌菌株或菌种优选选自鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
可用于本发明的原核生物菌株或菌种的实例包括但不限于古细菌(Archaea)、厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门、克里斯滕森菌属、拟杆菌门(例如Allistipes、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、Bacteroides splachnicus、粪便拟杆菌(Bacteroidesstercoris)、副拟杆菌属、栖瘤胃普氏菌(Prevotella ruminicola)、紫单胞菌科(Porphyromondaceae)和相关属)、变形菌门(Proteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)(例如水杆菌属(Aquabacterium)和伯克氏菌属(Burkholderia))、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)(例如黄单胞菌科(Xanthomonadaceae))、放线菌(Actinobacteria)(例如放线菌科(Actinomycetaceae)和奇异菌属)、梭菌属(Fusobacteria)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)、螺旋体属(Spirochaetes)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、异常球菌属(Deinococcus)、栖热菌属(Thermus)、蓝细菌(Cyanobacteria)、甲烷短杆菌(Methanobrevibacteria)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、瘤胃球菌属、粪球菌属、Subdolingranulum、多尔氏菌属、布雷德菌属(Bulleidia)、Anaerofustis、孪生球菌属(Gemella)、罗氏菌属、小杆菌属、
厌氧棍状菌属(Anaerotruncus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、微球菌属(Micrococcus)、丙酸杆菌属(Propionobacteria)、肠杆菌科、Faecalibacterium、拟杆菌属、副拟杆菌属、普氏菌属、真杆菌属、杆菌(Bacilli)(例如唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)和相关种)、气球菌属(Aerococcus)、颗粒链菌属(Granulicatella)、牛链球菌(Streptococcus bovis)和相关属以及中间链球菌(Streptococcus intermedius)和相关属)、梭菌属(例如霍氏真杆菌(Eubacterium hallii)、淤泥真杆菌(Eubacterium limosum)和相关属)和丁酸弧菌属。
可用于本发明的真菌益生菌菌株或菌种、优选酵母益生菌菌株或菌种的实例包括但不限于子囊菌纲(Ascomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)，优选选自以下群：曲霉属(Aspergillus)、球拟酵母属(Torulopsis)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、棒孢酵母属(Clavispora)、酒香酵母属(Bretanomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、淀粉霉属(Amylomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、内孢霉属(Endomycess)、生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)、接合酵母属、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、亚罗酵母属(Yarrowia)、内孢霉属(Endomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)和/或青霉菌属(Penicillium)。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物不包含细菌菌株乳杆菌属-肠球菌属、拟杆菌属和/或奇异菌属。
在本发明的一个实施方案中，包含在所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物中的唯一一种微生物菌株或菌种、优选细菌菌株或菌种是嗜粘蛋白艾克曼菌。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物由经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌组成。
在本发明的另一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物基本上由经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌组成，其中“基本上由…组成”在本文中意指嗜粘蛋白艾克曼菌是包含在所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物中的唯一的微生物菌株或菌种、优选唯一的细菌菌株或菌种。
在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段激活或抑制肠微生物群的其它细菌菌株或菌种的生长和/或生物活性。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物还包含益生元。
可用于本发明的益生元的实例包括但不限于菊粉和菊粉型果聚糖、低聚果糖、β-葡聚糖、木糖、阿拉伯糖、阿拉伯基木聚糖、核糖、半乳糖、鼠李糖、纤维二糖、果糖、乳糖、水杨苷、蔗糖、葡萄糖、七叶苷、tween 80、海藻糖、麦芽糖、甘露糖、蜜二糖、粘液或粘蛋白、棉子糖、果寡糖、低聚半乳糖、氨基酸、醇、可发酵的碳水化合物及其任何组合。
益生元的其它非限制性实例包括水溶性纤维素衍生物、水不溶性纤维素衍生物、未加工的燕麦片、欧车前亲水胶(metamucil)、全麸(all-bran)及其任何组合。
水溶性纤维素衍生物的实例包括但不限于甲基纤维素、甲基乙基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、阳离子羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素。
本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或组合物、药物组合物、美容组合物或药物可以通过几种施用途径施用。适合的施用途径的实例包括但不限于经口施用、直肠施用、通过食管胃十二指肠镜检查施用、通过结肠镜检查施用、使用鼻胃管或口胃管施用等。
根据一个实施方案，本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或组合物、药物组合物、美容组合物或药物为适合经口施用的形式。根据第一实施方案，适于经口施用的形式是选自片剂、丸剂、胶囊、软明胶胶囊、糖衣丸剂、口分散片剂、泡腾片剂或其它固体的固体形式。根据第二实施方式，适于经口施用的形式为液体形式(例如可饮用溶液)、脂质体形式等。
在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、美容组合物或药物进一步包含针对预期施用途径选择的赋形剂、稀释剂和/或载体。赋形剂、稀释剂和/或载体的实例包括但不限于水、磷酸盐缓冲盐水、无氧磷酸盐缓冲盐水、碳酸氢钠、果汁、奶、酸奶、婴儿配方、乳制品、着色剂例如二氧化钛(E171)、二氧化铁(E172)和亮黑BN(E151)；调味剂；增稠剂，例如单硬脂酸甘油酯；甜味剂；包衣剂，例如精炼菜籽油、大豆油、花生油、大豆卵磷脂或鱼明胶；稀释剂例如乳糖、一水合乳糖或淀粉；粘合剂，例如聚维酮、预胶化淀粉、树胶、蔗糖、聚乙二醇(PEG)4000或PEG 6000；崩解剂，例如微晶纤维素或羧甲基淀粉钠，例如A型羧甲基淀粉钠；润滑剂，例如硬脂酸镁；流动剂，例如胶态无水二氧化硅等等…
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物呈营养组合物的形式，即包含液体或固体食物、饲料或饮用水。在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物是食品，例如乳制品、乳制饮品、酸奶、水果汁或蔬菜汁或其浓缩物、粉末、基于麦芽或大豆或谷物的饮品、早餐谷物(例如什锦谷物早餐片(muesli flake))、水果和蔬菜汁粉末、谷物和/或巧克力棒、糖果、涂抹酱(spreads)、面粉、奶、果昔(smoothie)、糖果、奶制品、奶粉、复原乳、酸牛乳(cultured milk)、酸奶、饮用酸奶、凝固型酸奶(set yoghurt)、饮品、乳制饮品、奶制饮品、巧克力、凝胶、冰淇淋、谷物、复原水果产品(reconstituted fruit products)、零食棒(snack bar)、食品棒、什锦谷物早餐棒、涂抹酱、调味汁(sauce)、、沙司(dips)、乳制品(包括酸奶和奶酪)、饮品(包括基于乳和非基于乳的饮品)、运动补剂(包括基于乳和非基于乳的运动补剂)。
在本发明的一个实施方案中，所述组合物、药物组合物、美容组合物或药物呈食品添加剂、饮品添加剂、膳食补充剂、营养产品、医疗食品或营养食品组合物(nutraceuticalcomposition)的形式。
已知肥胖症和相关病症与受试者的肠通透性增加和受损的粘液产生、上皮屏障、免疫系统和/或抗菌化合物产生有关；并且，申请人提出，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用可以恢复这些参数。因此，本发明还涉及用于降低肠通透性和/或恢复受损的粘液产生和/或用于恢复上皮屏障和/或用于恢复免疫系统和/或用于恢复抗菌化合物产生的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。本发明的另一个目的是用于在有需要的受试者中降低肠通透性和/或用于恢复受损的粘液产生和/或用于恢复上皮屏障和/或用于恢复免疫系统和/或用于恢复抗菌化合物产生的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
因此，本发明还涉及用于控制肠屏障功能的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段，以及涉及用于控制肠屏障功能的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。在一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段调节粘液层厚度(其可以在肥胖症或其它代谢病症中减小)。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用诱导产生结肠抗微生物肽，例如RegIIIgamma。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用诱导产生内源性大麻素家族的化合物，例如选自2-油酰甘油、2-棕榈酰甘油和2-花生四烯酰甘油的酰基甘油。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用调节粘液周转。
本发明的另一目的涉及用于治疗与代谢病症相关或由代谢病症引起的代谢功能障碍的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。因此，本发明的另一目的是治疗有需要的受试者中与代谢病症相关或由代谢病症引起的代谢功能障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
申请人还证明，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用控制脂肪储存和脂肪组织代谢。因此，本发明的另一个目的涉及用于控制脂肪储存和脂肪组织代谢的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。本发明的另一个目的还是用于控制脂肪储存和脂肪组织代谢的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。在一个实施方案中，所述控制不涉及食物摄入的任何改变。在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用消除代谢性内毒素血症。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用降低脂肪量。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用增加脂肪细胞分化和脂质氧化的标志物的mRNA表达，优选不影响脂肪生成。
本发明还涉及用于调节脂肪组织代谢和葡萄糖稳态的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段；并且涉及调节脂肪组织代谢和葡萄糖稳态的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。在本发明的一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用逆转饮食诱导的空腹高血糖症。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用诱导肝葡萄糖-6-磷酸酶表达的降低至少10％，优选至少30％，更优选至少40％。在另一个实施方案中，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段的施用诱导胰岛素抵抗指数的降低。在一个实施方案中，所述胰岛素抵抗指数的降低为至少5％，优选至少10％，更优选至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的降低。
申请人证明，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用减少高脂饮食饲喂小鼠中的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。因此，本发明还涉及用于降低葡萄糖耐受不良和/或胰岛素抵抗的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段；并且涉及用于降低葡萄糖耐受不良和/或胰岛素抵抗的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
本发明还涉及用于治疗与代谢病症有关或由代谢病症引起的炎症、优选低级炎症的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段；并且涉及用于治疗与代谢病症有关的炎症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
申请人证明，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用降低治疗小鼠中的血浆甘油三酯水平。因此，本发明还涉及用于降低血浆甘油三酯水平的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段；并且涉及用于降低血浆甘油三酯水平的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
本发明还涉及用于降低血浆胆固醇的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段；并且涉及用于降低血浆胆固醇的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量或美容有效量的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段。
在本发明的一个实施方案中，向受试者施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段对所述受试者的食物摄入没有影响。
在本发明的一个实施方案中，向受试者施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段增加所述受试者的能量消耗，优选不影响所述受试者的食物摄入。
因此，本发明还涉及增加受试者能量消耗的方法，所述方法包括(优选以治疗或美容有效量)向受试者施用本发明的经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段或者组合物、药物组合物、美容组合物或药物。优选地，本发明的方法不包括或不进一步包括调节所述受试者的食物摄入。在本发明的一个实施方案中，本发明的方法增加能量消耗，从而诱导受试者持久的体重减轻，并且从而治疗所述受试者的代谢病症，例如肥胖症相关的代谢病症。
在一个实施方案中，向受试者施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌或其片段增加所述受试者的饱腹感。因此，根据该实施方案，本发明的方法增加受试者的饱腹感，从而诱导受试者持久的体重减轻，并且从而治疗所述受试者的代谢病症，例如肥胖症相关的代谢病症。
附图说明
图1是一组直方图，显示在粘液基培养基上或在非粘液基生长培养基上生长的嗜粘蛋白艾克曼菌抵消饲喂高脂饮食的小鼠体重增加和脂肪量增加的增加。此外，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌对体重增加和脂肪量增加的影响比活细菌更强。(a)饲喂对照饮食(CT ND)的小鼠、饲喂高脂饮食(CT HFD)并且每天接受经口管饲含有甘油的无菌无氧PBS的小鼠、或饲喂高脂饮食并且每天接受经口管饲生长在粘液基培养基(HFD Akk M)、非粘液基培养基(HFD Akk G)上的活嗜粘蛋白艾克曼菌或生长在粘液基培养基上并经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)的小鼠的总体重增加(g)，上述处理达4周(n＝8-10)。(2.108个细菌细胞悬浮于150μl无菌无氧PBS中)。(b)通过时域核磁共振测量的总脂肪量增加(g)(n＝8-10)。数据显示为平均值±SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图2是直方图，显示了用嗜粘蛋白艾克曼菌处理后高脂饮食饲喂小鼠的肥胖指数的标准化。肥胖指数(g)显示为附睾、皮下和肠系膜脂肪贮库的重量的加和(n＝8-10)。数据显示为平均值±SEM。*对应于当两个条件用非配对双尾斯氏t检验比较时，P值＜0.05。
图3是一组曲线图，显示高脂饮食饲喂的小鼠在施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌后葡萄糖耐受不良的降低程度高于在施用在粘液基或非粘液基培养基上生长的活嗜粘蛋白艾克曼菌后的降低程度。(a)在自由移动的小鼠中，在2g/kg葡萄糖口服攻击后的血浆葡萄糖分布(n＝8-10)。(b)在葡萄糖负荷后，在-30和120分钟之间测量的平均曲线下面积(AUC)(n＝8-10)。(c)胰岛素抵抗指数，通过将血浆葡萄糖的AUC(-30至120分钟)乘以血浆胰岛素的AUC(-30至15分钟)确定(n＝8-10)。数据显示为平均值土SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图4是直方图，显示了在施用非粘液基培养基上生长的活的或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌后，肠完整性的标志物表达的调节和HFD诱导的代谢性内毒素血症的矫正。(a)空肠中Ocln、Cldn3和Lyz1的mRNA表达(n＝7-10)，(b)回肠中Ocln、Cldn3和Lyz1的mRNA表达(n＝7-10)，(c)血浆脂多糖水平(EU/mL)(n＝5-9)。数据显示为平均值±SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图5是一组直方图，显示了施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌后的体重增加和脂肪量增加的降低程度高于施用生长在非粘液基培养基上的活的嗜粘蛋白艾克曼菌后的降低程度。(a)饲喂对照饮食(CT ND)的小鼠、饲喂高脂饮食(CT HFD)并且每天接受经口管饲含有甘油的无菌无氧PBS的小鼠、或饲喂高脂饮食并且每天接受经口管饲生长在非粘液基培养基(HFD Akk G)上的活嗜粘蛋白艾克曼菌或生长在粘液基培养基上并经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)的小鼠的总体重增加(g)，上述处理达5周(n＝16-19)。(2.108个细菌细胞悬浮于150μl无菌无氧PBS中)。(b)通过时域核磁共振测量的总脂肪量增加(g)(n＝16-19)。数据显示为平均值土SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图6是显示直方图，显示了施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌后肥胖指数的降低程度高于施用生长在非粘液基培养基上的活嗜粘蛋白艾克曼菌后的降低程度。肥胖指数(g)，显示为附睾、皮下和肠系膜脂肪贮库的合并重量(n＝16-19)。数据显示为平均值±SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图7是一组直方图，显示了经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用抵消饲喂高脂饮食的小鼠中的葡萄糖耐受不良的程度高于施用活嗜粘蛋白艾克曼菌后的程度。向小鼠饲喂对照饮食(CT ND)、高脂饮食(CT HFD)，并且每天通过经口管饲用含有甘油或者在非粘液基培养基上生长的活的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk G)或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)的无菌无氧PBS处理小鼠，达5周。(a)在自由移动的小鼠中，在2g/kg葡萄糖口服攻击后的血浆葡萄糖分布(n＝8-10)。根据双向ANOVA分析和随后的Bonferonni事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。(b)在葡萄糖负荷后，在-30和120分钟之间测量的平均曲线下面积(AUC)(n＝10)。(c)胰岛素抵抗指数，通过将血浆葡萄糖的AUC(-30至120分钟)乘以血浆胰岛素的AUC(-30至15分钟)确定(n＝8-10)。数据显示为平均值±SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图8是一组曲线图，显示活的或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用抵消饲喂高脂饮食的小鼠中的葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗。(a)在自由移动的小鼠中，在2g/kg葡萄糖口服攻击后的血浆葡萄糖分布(n＝8-10)。数据显示为平均值±SEM。根据双向ANOVA分析和随后的Bonferonni事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。(b)在葡萄糖负荷后，在-30和120分钟之间测量的平均曲线下面积(AUC)(n＝8-10)。数据显示为平均值±SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。(c)通过密度测量法测量的在负载对照上的对照(-)和胰岛素刺激(+)的p-IRβ的比率。(d)通过密度测量法测量的在负载对照上的对照和胰岛素刺激的p-Aktthr308的比率。(e)通过密度测量法测量的在负载对照上的对照和胰岛素刺激的p-Aktser473的比率。(c-e)n＝3-5。根据双向ANOVA分析和随后的Bonferonni事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图9是照片(a)和直方图(b)，显示经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用抵消高脂饮食对平均脂肪细胞直径的影响。向小鼠饲喂对照饮食(CT ND)、高脂饮食(CT HFD)，并且每天通过经口管饲用含有甘油或者在非粘液基培养基上生长的活的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk G)或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)的无菌无氧PBS处理小鼠，达5周。(a)代表性苏木精和伊红染色的皮下脂肪组织贮库的照片。比例尺：100μm。(b)通过组织学分析确定的平均脂肪细胞直径(μm)(n＝16-19)。(c)在门静脉中测量的瘦蛋白血浆水平(pg/mL)(n＝8-10)。数据显示为平均值土SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图10是直方图，显示施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌后血浆甘油三酯的水平降低。向小鼠饲喂对照饮食(CT ND)、高脂饮食(CT HFD)，并且每天通过经口管饲用含有甘油或者在非粘液基培养基上生长的活的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk G)或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)的无菌无氧PBS处理小鼠，达5周(n＝16-19)。数据显示为平均值土SEM。当两个条件用非配对双尾斯氏t检验比较时，指示P值(*：P＜0.05)。
图11是直方图，显示活的或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用显著降低血清HDL-胆固醇并导致LDL-胆固醇的相似趋势。通过快速蛋白质液相色谱法(FPLC)测定血浆VLDL、LDL和HDL胆固醇水平。向小鼠饲喂对照饮食(CT ND)、高脂饮食(CT HFD)，并且每天通过经口管饲用含有甘油或者在非粘液基培养基上生长的活的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD AkkG)或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)的无菌无氧PBS处理小鼠，达5周(n＝8-10)。根据双向ANOVA分析和随后的Bonferonni事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图12是直方图，显示经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用增加排泄在粪便中的能量。通过间接弹式量热法测量粪便能量(kcal/g粪便)(n＝5)。向小鼠饲喂对照饮食(CTND)、高脂饮食(CT HFD)，并且每天通过经口管饲用含有甘油或者在非粘液基培养基上生长的活的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk G)或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)的无菌无氧PBS处理小鼠，达5周。数据显示为平均值土SEM。根据单向ANOVA分析和随后的Tukey事后检验，具有不同上标字母的数据显著不同(P＜0.05)。
图13的图显示，相比活的嗜粘蛋白艾克曼菌，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用诱导对HFD诱导的宿主尿代谢组学谱上的转变的更大矫正。(a)尿液代谢谱的正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)评分图(n＝5-7)。(b)所有处理对OPLS-DA分析的预测成分1的影响。向小鼠饲喂对照饮食(CT ND)、高脂饮食(CT HFD)，并且每天通过经口管饲用含有甘油或者在非粘液基培养基上生长的活的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk G)或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)的无菌无氧PBS处理小鼠，达5周。
图14是一组图，显示在超重/肥胖患者中经口施用后嗜粘蛋白艾克曼菌的安全性评估(n＝5)。(A-C)与炎症和血液学有关的标志物：(A)C-反应蛋白(mg/dl)，(B)总白细胞计数(103个细胞/μL)，(C)凝血酶原时间(秒)。(D-F)与肾功能有关的标志物：(D)尿素(mg/dl)，(E)肌酸酐(mg/dl)，(F)肾小球滤过率(mL/min*1,73m2)。(G-I)与肝功能有关的标志物：(G)丙氨酸转氨酶活性(IU/l)，(H)天冬氨酸转氨酶活性(IU/l)，(I)γ-谷氨酰转肽酶活性(IU/l)。(J-K)与肌肉功能相关的标志物：(J)肌酸酐激酶活性(IU/l)，(K)乳酸脱氢酶活性(IU/l)。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明。
我们之前证明了，向饲喂高脂饮食的小鼠每日施用嗜粘蛋白艾克曼菌可以阻止肥胖症的发展(WO 2014/076246)。
从将这些结果转移到临床环境的角度来看，我们决定评估当在适合人体试验的非粘液基培养基上培养时，嗜粘蛋白艾克曼菌是否会保持其效果。此外，我们以前的结果表明，高压灭菌嗜粘蛋白艾克曼菌失去了其对饮食诱导的肥胖症的影响。因此，我们设法研究另外的灭活方法(即巴氏灭菌法)对嗜粘蛋白艾克曼菌介导的效果的后果。
材料和方法
小鼠
第一实验：将一组10周龄的C57BL/6J小鼠(50只小鼠，n＝10/组)(Charles River，L’Arbresle，法国)以每笼两只小鼠为一组圈养于受控环境中(12小时的日光周期，在6pm关灯)，其可自由获得食物和水。向小鼠饲喂对照饮食(ND)(AIN93Mi，Research diet，NewBrunswick，NJ，USA)或高脂饮食(HFD)(60％脂肪和20％碳水化合物(kcal/100g)D12492i，Research diet，New Brunswick，NJ，USA)。
通过经口管饲以2.108cfu/0.15mL(悬浮于无菌无氧磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)的剂量经口施用在基于粘蛋白的培养基(HFD Akk M)或非粘液基培养基(HFD Akk G)上生长的嗜粘蛋白艾克曼菌每日处理小鼠。另外，每天通过经口施用在非粘液基培养基上生长并通过巴氏灭菌灭活的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk P)处理一组小鼠。对照组用等体积无菌无氧PBS(CT ND和CT HFD)经口管饲处理，所述无菌无氧PBS含有相似终浓度的甘油(2.5％vol/vol)。处理持续4周。
对于HFD Akk M组，如先前所述(Derrien等人，2004.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54：1469-1476)，使嗜粘蛋白艾克曼菌MucT(ATTC BAA-835)在基于粘蛋白的基础培养基中厌氧生长。然后洗涤培养物并将其悬浮于包含25％(v/v)甘油的无氧PBS中至终浓度为1.1010cfu/mL。
对于HFD Akk G组，使嗜粘蛋白艾克曼菌MucT(ATTC BAA-835)在非粘液基培养基中厌氧生长。然后洗涤培养物并将其悬浮于包含25％(v/v)甘油的无氧PBS中至终浓度为1.1010cfu/mL。
对于HFD Akk P组，使嗜粘蛋白艾克曼菌MucT(ATTC BAA-835)在非粘液基培养基中厌氧生长。然后洗涤培养物并将其悬浮于包含25％(v/v)甘油的无氧PBS中至终浓度为1.1010cfu/mL。然后，通过在水浴中暴露于70℃的温度30分钟将小瓶巴氏灭菌。
每周记录一次体重、食物和水的摄入量。通过使用7.5MHz时域-核磁共振(TD-NMR)(LF50minispec，Bruker，Rheinstetten，德国)评估身体组成。
第二实验：将一组10周龄的C57BL/6J小鼠(40只小鼠，n＝10/组)(Charles River，L’Arbresle，法国)以每笼两只小鼠为一组圈养于受控环境中(12小时的日光周期，在6pm关灯)，其可自由获得食物和水。向小鼠饲喂对照饮食(ND)(AIN93Mi，Research diet，NewBrunswick，NJ，USA)或高脂饮食(HFD)(60％脂肪和20％碳水化合物(kcal/100g)，Researchdiet D12492i，New Brunswick，NJ，USA)。通过经口管饲以2.108cfu/0.15mL(悬浮于无菌无氧磷酸盐缓冲盐水中)的剂量，经口施用在非粘液基培养基上生长的活的嗜粘蛋白艾克曼菌或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk G和HFD Akk P)每日处理小鼠。对照组用等体积无菌无氧磷酸盐缓冲盐水(CT ND和CT HFD)经口管饲处理。处理持续5周。
对于HFD Akk G组，使嗜粘蛋白艾克曼菌MucT(ATTC BAA-835)在非粘液基培养基中厌氧生长。然后洗涤培养物并将其悬浮于包含25％(v/v)甘油的无氧PBS中至终浓度为1.1010cfu/mL。
对于HFD Akk P组，使嗜粘蛋白艾克曼菌MucT(ATTC BAA-835)在非粘液基培养基中厌氧生长。然后洗涤培养物并将其悬浮于包含25％(v/v)甘油的无氧PBS中至终浓度为1.1010cfu/mL。然后通过在水浴中暴露于70℃的温度30分钟将小瓶巴氏灭菌。
每周记录一次体重、食物和水的摄入量。通过使用7.5MHz时域-核磁共振(TD-NMR)(LF50minispec，Bruker，Rheinstetten，德国)评估身体组成。
在处理的最后一周期间收集新鲜的尿液样品，并在分析前直接储存在-80℃。通过使用弹式量热计(Mouse Clinical Institute，67404Illkirch，法国)，对在处理的最后一周期间的24h间隔后收获的粪便样品测量粪便能量含量。
第三实验：将一组10周龄的C57BL/6J小鼠(40只小鼠，n＝10/组)(Charles River，L’Arbresle，法国)以每笼两只小鼠为一组圈养于受控环境中(12小时的日光周期，在6pm关灯)，其可自由获得食物和水。向小鼠饲喂对照饮食(CT ND)(AIN93Mi，Research diet，NewBrunswick，NJ，USA)或高脂饮食(CT HFD)(60％脂肪和20％碳水化合物(kcal/100g)，Research diet D12492i，New Brunswick，NJ，USA)。通过经口管饲以2.108cfu/0.15mL(悬浮于无菌无氧磷酸盐缓冲盐水中)的剂量，经口施用在非粘液基培养基上生长的活的嗜粘蛋白艾克曼菌或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(HFD Akk G和HFD Akk P)每日处理小鼠。对照组用等体积无菌无氧磷酸盐缓冲盐水(CT ND和CT HFD)经口管饲处理。处理持续5周。
所有小鼠实验都经过当地伦理委员会(the local ethics committee)批准并根据其指南执行。圈养条件由2013年5月29日颁布的关于保护实验室动物的比利时法律(协议编号LA1230314)规定。
口服葡萄糖耐量试验
用经口管饲葡萄糖负荷(每kg体重2g葡萄糖)处理禁食6h的小鼠。在口服葡萄糖负荷前和在口服葡萄糖负荷后15、30、60、90和120分钟测量血糖水平。用血糖仪(Accu Check，Aviva，Roche)对从尾静脉末端采集的血样测定血液葡萄糖。
胰岛素抵抗指数
根据制造商的说明书，使用ELISA试剂盒(Mercodia)在5μL血浆中测定血浆胰岛素浓度。通过将口服葡萄糖耐量试验后获得的血液葡萄糖(-30至120分钟)和血浆胰岛素(-30和15分钟)的曲线下面积相乘来确定胰岛素抵抗指数。
蛋白质印迹
为了在第三实验中分析胰岛素信号传导途径，将小鼠分配在盐水注射亚组或胰岛素注射亚组中，使得两个亚组在体重和脂肪量方面匹配。然后它们在麻醉(异氟烷，Forene，Abbott，Queenborough，Kent，英格兰)下接受1mU/g胰岛素(Actrapid；Novo Nordisk A/S，丹麦)或等体积的盐水溶液进入门静脉。注射三分钟后，处死小鼠并迅速收获肝脏。
为了检测胰岛素途径的蛋白质，将组织在补充有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的ERK缓冲液(Triton X-100 0.1％，HEPES 50mM，NaCl 5M，甘油10％，MgCl2 1.5mM和DTT 1mM)中匀浆化。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质并转移到硝酸纤维素膜上。将膜在4℃与在含有1％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水Tween-20稀释的抗体温育过夜：p-IRb(1：1,000；sc-25103，Santa Cruz，CA，USA)、p-AktThr308(1：1.000；#2965L，Cell Signaling，Danvers，MA，USA)和p-AktSer473(1：1.000；#4060L，Cell Signaling)。磷蛋白质的定量在每组具有胰岛素注射的5只动物和具有盐水注射的5只动物上进行。上样对照是β-肌动蛋白(1：10000；ab6276)。
组织采样
用异氟烷(
Figure BDA0001653550700000392
Abbott，Queenborough，Kent，英格兰)麻醉动物并从门静脉和腔静脉采血。然后，在进行组织采样之前，通过颈椎脱位处死小鼠。精确解剖和称重脂肪贮库(附睾、皮下和肠系膜)；所有三种脂肪组织贮库的重量的加和对应于肥胖指数。将肠区段(回肠、盲肠和结肠)、盲肠内容物和脂肪组织贮库浸入液氮中，并在-80℃储存以供进一步分析。
组织学分析
在室温，将脂肪组织在4％多聚甲醛中固定24小时。然后，将样品浸入100％乙醇中24小时，之后进行加工用于石蜡包埋。组织样品，5μm石蜡切片用苏木精和伊红染色。使用SCN400载玻片扫描仪(Leica Biosystems，Wetzlar，德国)获得图像。随机为每只小鼠选择5个高放大倍数视场(field)，并使用ImageJ(版本1.50a，National Institutes of Health，Bethesda，Maryland，USA)确定脂肪细胞直径。
RNA制备和实时qPCR分析
使用TriPure试剂(Roche)从组织制备总RNA。通过在Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent RNA 6000Nano Kit，Agilent)上运行1μL的每种样品来进行总RNA的定量和完整性分析。使用Reverse Transcription System试剂盒(Promega，Leiden，荷兰)，通过逆转录1μg总RNA来制备cDNA。根据制造商的说明书，使用Mesa Fast qPCR(Eurogentec，Seraing，比利时)用Biorad CFX实时PCR系统和软件(Biorad，Hercules，美国)进行实时PCR，以进行检测。选择RPL19作为持家基因。所有样品在单个96孔反应板中以两个重复运行，并且根据2ΔΔCT方法分析数据。通过在扩增结束时进行的对解链曲线的分析来检查扩增产物的身份和纯度。下表1中给出了靶小鼠基因的引物序列。
表1：靶小鼠基因的引物序列。
Figure BDA0001653550700000391
Figure BDA0001653550700000401
血浆甘油三酯的测量
使用商业试剂盒(DiaSys，Condom，法国)，通过测量由甘油三酯水解产生的甘油来分析血浆样品的甘油三酯。
血浆瘦蛋白的测量
通过使用多重免疫测定试剂盒(Merck Millipore，Brussels，比利时)分析血浆样品的瘦蛋白，并使用Luminex技术(Bioplex，Bio-Rad，比利时)按照生产商的说明书测量血浆样品的瘦蛋白。
血浆胆固醇的测量(快速蛋白质液相色谱法，FLPC)
使用快速蛋白质液相色谱法(FPLC，AKTA purifier 10，GE Healthcare，Chicago，IL，USA)进行血浆脂蛋白的定量。注入50μl单独的血浆，并在SuperoseTM 6 10/300GL柱(GEHealthcare，Chicago，IL，USA)上用NaCl 0.15M(pH 7.4)作为流动相以1mL/min流速分离脂蛋白。将流出物收集成0.3mL的流分，然后如上所述测定每个流分中的胆固醇和TG含量。通过测量峰面积百分比和将每个百分比乘以胆固醇总量来进行按脂蛋白类别(VLDL、LDL和HDL)计的胆固醇的定量。用商业试剂盒(CHOD-PAP；BIOLABO SA，Maizy，法国)测量血浆总胆固醇。
粪便能量的测量
通过使用弹式量热计(Mouse Clinical Institute，Illkirch，法国)，对在处理的最后一周期间的24h间隔后收集的粪便样品，测量粪便能量含量。
尿代谢组学分析
根据先前公布的方案(Dona AC，2014)，制备小鼠尿液样品，并在以600.22MHz 1H频率操作的光谱仪(Bruker)上测量；然后，如先前所述(Dumas等人，2006.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.103(33)：12511-6)处理和分析1H NMR谱。
血浆脂多糖的定量
使用基于鲎变形细胞溶解产物(LAL)动力学显色法的Endosafe-Multi-CartridgeSystem(Charles River Laboratories)测量门静脉血LPS浓度，所述动力学显色法测量与样品中内毒素浓度直接相关的颜色强度。用无内毒素的缓冲液将血浆1/10稀释以使反应中的干扰(抑制或增强)最小化，并在70℃加热15分钟。将每个样品用无内毒素的LAL试剂水(Charles River Laboratories)稀释1/100、1/150、1/200或1/400，并以两个重复处理每个样品，并且每个样品的两个峰(spike)都包括在测定中。已经验证了所有样品的回收率和系数变化。检测下限为0.005EU/mL。
巴氏灭菌温度和时间范围的确定
将含有活细菌的小瓶浸入设定为50、60、70、80或90℃的水浴中15秒(0.25分钟)、2分钟、5分钟、15分钟和30分钟。通过在补充有5％粘液的脑心浸液(Brain-Heart Infusion，BHI)-琼脂培养基上涂敷50μL未稀释的小瓶内容物并在厌氧容器中在37℃温育7天后寻找菌落形成单位(cfu)的存在来评估嗜粘蛋白艾克曼菌的灭活。使用高压灭菌小瓶的内容物作为阴性对照，使用未浸入水浴的小瓶的内容物作为阳性对照。这个实验在两个不同的时间进行。
粘液基培养基
如先前所述(Everard等人，2013.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.110：9066-9071)，使嗜粘蛋白艾克曼菌在粘液基培养基中生长，将其洗涤和浓缩。除了未经处理的细胞批次外，一部分通过在70℃温育30分钟而进行温和热处理。
非粘液基培养基
如先前所述(Derrien等人，2004.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54：1469-1476)，使嗜粘蛋白艾克曼菌在由基础厌氧培养基组成的非粘液基培养基中生长，所述培养基含有16g/L基于大豆的蛋白胨、25mM葡萄糖和25mM N-乙酰基-葡萄糖胺和4g/L L-苏氨酸。如先前所述(Everard等人，2013.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.110：9066-9071)，洗涤和浓缩细胞。除了未经处理的细胞批次外，一部分通过在70℃温育30分钟而进行温和热处理。
在超重或肥胖志愿者中经口施用活的和经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的安全性评估
所呈现的结果是来自20位超重和肥胖患者(体重指数＞25kg/m2)的临时安全性报告，根据NCEP ATP III定义(5个下列标准中的任意三个：空腹血糖＞110mg/dL，血压≥130/85mm Hg或抗高血压治疗，空腹甘油三酯血(triglyceridemia)≥150mg/dL，HDL胆固醇＜40mg/dL(对于雄性)、50mg/dL(对于雌性)，和/或腰围＞102em(对于雄性)、88em(对于雌性))，所述患者呈现代谢综合征。在2015年12月与2016年5月之间，从比利时布鲁塞尔圣吕克大学医院(Cliniques Universitaires Saint Luc)志愿招募患者。按照随机区组设计，将受试者分配到任何处理组。排除标准为：急性或慢性进行性或慢性不稳定疾病的存在、饮酒(＞2杯/天)、既往减肥手术、研究前3个月或未来6个月计划的任何手术、怀孕或计划在未来6个月内怀孕、定期体育活动(＞30分钟的运动，每周3次)、在研究前的月中食用膳食补充剂(Ω-3脂肪酸，益生菌，益生元，植物甾烷醇/固醇类)、炎性肠病或肠道易激综合征、糖尿病性胃肠道自主神经病(如胃轻瘫或胃肠蠕动减弱)、每天消耗超过30g膳食纤维、食用素食或异常饮食、乳糖不耐症或牛奶蛋白过敏、麸质不耐症、目前接受影响感兴趣参数的药物(降糖药如二甲双胍、DPP-4抑制剂、GLP-1受体激动剂、阿卡波糖、磺酰脲类药物(sulfonylueras)、格列奈类药物(glinides)、噻唑烷二酮类、SGLT2抑制剂、胰岛素、乳果糖、在研究前2个月内使用抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、他汀类药物(stains)、贝特类(fibrates)、奥利司他(orlistat)、考来烯胺(cholestyramine)或依泽替米贝(依泽替米贝))的治疗、和基线糖化血红蛋白(HbA1c)＞7.5％。来自鲁汶大学(Universitécatholique de Louvain)(比利时布鲁塞尔)的生物医学伦理医院委员会(ommission d’Ethique Biomédicale Hospitalo-facultaire)提供了该研究的伦理批准，并获得了每位参与者的书面知情同意。该试验在clinicaltrials.gov上注册为NCT02637115。
分配受试者以接受每日剂量的安慰剂(等体积的含有甘油的无菌PBS)、1010CFU活嗜粘蛋白艾克曼菌(Akk S-1010)、109CFU活嗜粘蛋白艾克曼菌(Akk S-109)或1010CFU经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(Akk P-1010)(安慰剂和细菌根据良好操作规范在食品级水平生产)，达3个月。在处理开始时收集血样，并将一部分直接送到医院实验室以测量相关的临床参数。基于临床参数使用不同的管：用于白细胞计数的EDTA包被管、用于空腹血糖的氟化钠包被管、用于凝血测定的柠檬酸包被管和用于尿素和酶活性的锂-肝素包被管。处理2周后，患者回到医院进行安全性访视，其中收集血样以允许将临床参数与基线值比较。
患者和医生对处理不知情(blinded)。对于图14和表3-5，每组受试者的数目是：安慰剂：5，Akk S-1010：5，Akk S-109：5，Akk P-1010：5。
统计学分析
数据表示为平均值±SEM。两组之间的差异使用非配对双尾斯氏t检验进行评估。涉及多于两个组的数据集通过ANOVA和随后Tukey事后检验进行评估。根据事后ANOVA统计分析，具有不同上标字母的数据显著不同，P＜0.05。使用用于windows的GraphPad Prism版本5.00(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)分析数据。当P＜0.05时，结果被认为是统计学显著的。
对于OGTT期间的糖血演变、对于在特定脂蛋白中的再分配胆固醇以及对于蛋白质印迹分析，进行了双向ANOVA分析，其中对重复测量结果进行Bonferonni后验。
人数据表示为平均值±SD。使用Kruskal-Wallis检验评估组间差异。使用Wilcoxon配对符号秩检验评估在基线和安全性访视时观察到的值之间的差异。使用用于Windows的GraphPad Prism版本7.00(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)分析数据。当p＜0.05时，结果被认为是统计学显著的。
结果
体外实验
为了优化巴氏灭菌方案，我们首先将含有嗜粘蛋白艾克曼菌的小瓶在设定为一定温度范围的水浴中温育不同时间。当在加富培养基(rich medium)上涂敷处理过的小瓶内容物后没有观察到细菌时，巴氏灭菌被认为是有效的(表2)。
表2：针对巴氏灭菌测试的温度和暴露时间的组合。“活的”对应于大量获得cfu的板。“边界”对应于观察到1和3cfu之间的板。“灭活的”对应于不能观察到cfu的板。
温度(℃)
Figure BDA0001653550700000441
为了进一步的实验，我们选择了在70℃进行30分钟的巴氏灭菌。除存活率外，还测试了巴氏灭菌对两种嗜粘蛋白艾克曼菌岩藻糖苷酶和2种硫酸酯酶(由基因Amuc_0010、Amuch_0146以及Amuc_0121和Amuc_1074编码；van Passel等人，2011.PLoS One.6(3)：e16876)的活性的影响。这些酶与粘蛋白的降解有关。为此目的，如对C端His标签所述(Tailford等人，2015.Nat.Commun.6：7624)，在大肠杆菌(Escherichia coli)中过表达它们的基因，将纯化的蛋白质用于分析。在70℃ 30分钟之前和之后测定酶活性，该处理完全导致超过20倍的酶活性灭活。
体内实验
在第一组实验中，饲喂高脂饮食的小鼠每天通过在粘液基或非粘液基培养基上生长的活嗜粘蛋白艾克曼菌的经口管饲进行处理。另一组小鼠通过在非粘液基培养基上生长并通过巴氏灭菌灭活(70℃，30分钟)的嗜粘蛋白艾克曼菌的经口管饲进行处理。饲喂标准食物的小鼠用作对照组。处理进行4周。
我们观察到，无论使用何种生长培养基，活的嗜粘蛋白艾克曼菌处理均可降低高脂饮食诱导的体重和脂肪量增加(图1a-b)。令人惊讶的是，经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌比活细菌具有更强的作用，因为用经巴氏灭菌的细胞处理的小鼠显示出与饲喂对照饮食的小鼠相似的体重增加和脂肪量增加(图1a-b)。显示为皮下、内脏和附睾脂肪组织贮库的总和的肥胖指数，在饲喂高脂饮食的小鼠中显著增加(图2)。无论生长培养基还是巴氏灭菌，嗜粘蛋白艾克曼菌的施用均以相似的程度抵消了这种增加。
我们接下来证实了我们之前的关于葡萄糖耐量的结果。事实上，高脂饮食导致在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)后糖血升高，从而引起在葡萄糖施用前30分钟至施用后120分钟之间测量的曲线下面积(AUC)显著更高(图3a-b)。嗜粘蛋白艾克曼菌的施用减轻了这种增加，导致中间AUC值，再次不依赖于生长培养基和巴氏灭菌。
当考虑到小鼠的胰岛素血症时，饲喂高脂饮食的小鼠的胰岛素抵抗指数显著高于对照小鼠(图3c)。用在粘液基培养基上生长的嗜粘蛋白艾克曼菌处理导致对照和未处理的高脂饮食饲喂的小鼠之间的中间胰岛素抵抗(IR)指数值。然而，尽管用在非粘液基培养基上生长的嗜粘蛋白艾克曼菌处理的小鼠的IR指数比饲喂高脂饮食的未处理小鼠低15％，但其仍然显著高于对照小鼠，而经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌使饲喂高脂饮食的小鼠的IR指数完全正常化(图3c)，从而证明巴氏灭菌增加嗜粘蛋白艾克曼菌对葡萄糖耐量和胰岛素抵抗的作用。
我们以前发现，使用嗜粘蛋白艾克曼菌处理可以通过调节抗微生物肽产生和调节粘液层厚度来影响肠屏障功能。为了进一步增加我们对嗜粘蛋白艾克曼菌与肠屏障之间相互关系的理解，我们测量了两种肠紧密连接蛋白标志物即Ocln和Cldn3(编码蛋白闭合蛋白和密蛋白3)以及编码抗微生物肽溶菌酶1的Lyz1的表达。在空肠中，用活的或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理HFD饲喂的小鼠增加了Ocln的表达，而经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌特异性增加了Lyz1表达(图4a)。在回肠中，用活的和经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理增加了Cldn3和Lyz1的表达(图4b)。这些对肠完整性标志物的影响导致经处理小鼠中血浆LPS完全正常化(图4c)，表明嗜粘蛋白艾克曼菌的活的和经巴氏灭菌的形式均可加强肠屏障并降低代谢性内毒素血症。
在第二组和第三组实验中，我们用在非粘液基培养基上生长的活的或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理高脂饮食小鼠，以证实上述获得的影响。将饲喂标准食物的小鼠用作对照组，并且处理进行五周。用在非粘液基培养基上生长的嗜粘蛋白艾克曼菌处理导致饲喂高脂饮食的小鼠的体重增加、脂肪量增加和肥胖指数均下降10-15％，尽管没有达到统计学显著性(图5和图6)。经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的施用使这些参数完全正常化，再次显示在巴氏灭菌后更强的作用。
我们在葡萄糖耐量和胰岛素敏感性方面也获得了类似的结果。事实上，虽然在OGTT过程中饲喂高脂饮食的未处理小鼠表现出较高的AUC(图7a-b)，但用活的或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理使这一参数正常化。用在非粘液基培养基上生长的嗜粘蛋白艾克曼菌处理的小鼠的IR指数比未处理的高脂饮食饲喂小鼠低20％，但仍显著高于对照小鼠。然而，用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理使IR指数完全正常化，其中与未处理的高脂饮食饲喂组相比降低至1/2(图7c)。
在第三组实验中，虽然在OGTT过程中饲喂高脂饮食的未处理小鼠表现出较高的AUC，但用活的或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理显著降低AUC，显示出葡萄糖耐量的改善(图8a-b)。为了进一步研究嗜粘蛋白艾克曼菌对胰岛素敏感性的作用，除OGTT外，我们还分析了在胰岛素或盐水溶液注射到门静脉后，胰岛素诱导的对胰岛素受体(IR)及其下游介体Akt在肝中在苏氨酸(Aktthr)和丝氨酸(Aktser)位点处的磷酸化(图8c-e)。如前所述，与CT ND小鼠相比，未处理的高脂饮食饲喂的小鼠显示所有评估的蛋白质的磷酸化降低，对于Aktthr达到显著性(图8d)。用嗜粘蛋白艾克曼菌处理倾向于抵消这些效应，其中与未经处理的HFD饲喂的小鼠相比，在用活细菌处理的小鼠中p-Aktser的水平显著更高(图8e)。
然后，我们测量了皮下脂肪贮库中的平均脂肪细胞直径，因为已知其在肥胖症中增加并且促进炎症和胰岛素抵抗的发展(Rosen和Spiegelman，2014.Cell.156：20-44)。根据该文献，我们观察到高脂饮食导致直径增加。用在非粘液基培养基上生长的活嗜粘蛋白艾克曼菌处理并不影响高脂饮食诱导的直径增加。然而，施用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌使直径恢复至与对照小鼠相似的水平(图9a-b)。用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理也使瘦蛋白浓度正常化至与对照小鼠中观察到的水平相似的水平(图9c)。
下一个分析参数涉及高脂饮食饲喂引起的血脂异常。我们评估了嗜粘蛋白艾克曼菌对高甘油三酯血症和高胆固醇血症的影响，高甘油三酯血症和高胆固醇血症与动脉粥样硬化和心血管疾病有关。尽管在对照组和未处理的高脂饮食饲喂的小鼠之间没有观察到差异，但我们观察到用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理导致血浆甘油三酯水平显著降低(在15-20％之间)(图10)。关于血浆胆固醇，用活的或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理矫正HFD诱导的高胆固醇血症，其中血浆HDL-胆固醇显著降低，LDL胆固醇也有类似趋势(图11)。
为了进一步解释活的和经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌如何减少体重和脂肪量增加而不影响对高脂饮食的食物摄入，我们测量了粪便的含热量，发现在用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理的小鼠中粪便的含热量显著增加，但用活的嗜粘蛋白艾克曼菌处理的小鼠中未显著增加(图12)。这些结果表明，在经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌施用后能量吸收减少，因而导致在粪便中的能量排泄，这可至少部分地解释了通过经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌所观察到的更大的作用。
我们接下来评估了用嗜粘蛋白艾克曼菌处理是否可以减少HFD诱导的宿主尿代谢组的转变(图13)。高脂饮食是在第一O-PLS-DA评分(Tpred1)上影响基于1H NMR的非靶向代谢谱的主要因素，而用经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理就第二评分(Tpred2，图13)而言与所有其它组独立聚类。这导致37％(用经巴氏灭菌的细菌)和17％(用活细菌)的HFD诱导的转变的正常化(图13)。
总之，这些数据表明，无论使用何种生长培养基，嗜粘蛋白艾克曼菌对宿主代谢的影响大都相似。更令人惊讶的是，它们还证明，巴氏灭菌加强了嗜粘蛋白艾克曼菌的作用。这是最令人感兴趣的，因为巴氏灭菌可以减少与使用活细菌相关的生物安全问题，同时增加嗜粘蛋白艾克曼菌在治疗肥胖症和相关病症中的功效。
在超重或肥胖志愿者中经口施用活的和经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌的安全性评估
我们评估了在使用不同剂量的活嗜粘蛋白艾克曼菌(Akk S-1010和Akk S-109)或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌(Akk P-1010)处理的超重和肥胖志愿者中嗜粘蛋白艾克曼菌经口施用的安全性和耐受性，作为正在进行的临床研究的一部分，该临床研究测试该细菌对代谢综合征的功效。干预开始时患者的拟人化(anthropomorphic)特征报告于表3。
表3：包括在临床研究中的所有受试者在处理开始时的描述性特征(n＝5)
安慰剂 Akk S-10<sup>10</sup> Akk S-10<sup>9</sup> Akk P-10<sup>10</sup>
性别(M/W) 1/4 3/2 2/3 2/3
年龄(年) 53.00±10.98 50.40±4.72 50.60±6.69 52.40±7.99
体重(Kg) 102.60±13.53 111.10±19.52 103.80±17.03 122.50±12.67
体重指数(Kg/m<sup>2</sup>) 35.84±5.98 38.48±5.37 36.30±3.12 40.71±5.71
腰围(cm) 116.60±13.03 119.50±12.35 115.60±7.20 124.90±8.10
空腹血糖(mg/dl) 100.50±10.52 96.13±2.24 108.30±12.91 106.30±11.80
在开始处理之前和开始处理之后两周，我们分析了在益生菌安全性评估中研究的几个临床参数(Jones等人，2012.Food.Chem.Toxicol.50：2216-2223；Burton等人，2011.Food Chem.Toxicol.49(9)：2356-64；Wind等人，2010.Br.J.Nutr.104(12)：1806-16)。用任何嗜粘蛋白艾克曼菌制剂均未观察到与炎症和血液学、肾、肝和肌肉功能有关的标志物的显著变化(图14A-K和表4)。
表4：包括在临床研究中的所有受试者在处理开始时的描述性特征(n＝5)
Figure BDA0001653550700000491
Figure BDA0001653550700000501
此外，记录的副作用频率在所有组中都相似(表5)。
表5：经历自我报告副作用的患者比例(n＝5)
安慰剂 Akk s-10<sup>10</sup> Akk s-10<sup>9</sup> Akk P-10<sup>9</sup>
恶心 1/5 0 2/5 1/5
胃肠气胀 0 1/5 3/5 1/5
胃气胀 1/5 1/5 0 0
抽筋 1/5 1/5 0 1/5
腹鸣 0 3/5 3/5 0
胃回流 1/5 0 1/5 0
一些用活嗜粘蛋白艾克曼菌处理的患者报道了腹鸣，但与其它组的差异不显著。
虽然受试者的数量有限，但这些第一人类数据表明，活的和经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌二者在肥胖/超重志愿者中耐受性良好，并且对于经口施用似乎是安全的。
此外，在用高剂量的活的和/或经巴氏灭菌的嗜粘蛋白艾克曼菌处理的患者的处理期结束时，观察到脂肪量、糖血和炎症标志物的有希望的趋势。
序 列 表
<110> 卢万天主教大学
瓦赫宁根大学
P·卡尼
<120> 经巴氏灭菌的艾克曼菌用于治疗代谢病症的用途
<130> CV - 542/PCT
<160> 8
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物RPL-19，正向
<400> 1
gaaggtcaaa gggaatgtgt tca 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物RPL-19，反向
<400> 2
ccttgtctgc cttcagcttg t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ocln，正向
<400> 3
atgtccggcc gatgctctc 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Ocln，反向
<400> 4
tttggctgct cttgggtctg tat 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Cldn3，正向
<400> 5
tcatcggcag cagcatcatc ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Cldn3，反向
<400> 6
acgatggtga tcttggcctt gg 22
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Lyz1，正向
<400> 7
gccaaggtct acaatcgttg tgagttg 27
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Lyz1，反向
<400> 8
cagtcagcca gcttgacacc acg 23

Claims (23)

1.嗜粘蛋白艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）在制备用于治疗有需要的受试者的代谢病症的组合物中的用途，
所述代谢病症选自包括以下各项的组：肥胖症、代谢综合征、胰岛素缺乏或胰岛素抵抗、糖尿病、葡萄糖耐受不良、脂质代谢异常、高血糖、血脂异常、炎性肠病以及高胆固醇，
其中嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌，并且其中所述组合物是药物组合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述糖尿病是2型糖尿病。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述血脂异常是致动脉粥样硬化性血脂异常。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述炎性炎性肠病是克罗恩病、溃疡性结肠炎或肠道易激综合征。
5.嗜粘蛋白艾克曼菌在制备用于增加受试者的能量消耗的组合物中的用途，其中嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述增加受试者的能量消耗是在不影响所述受试者的食物摄入的情况下增加受试者的能量消耗。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物被制备为经口施用。
8. 根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物被制备为将嗜粘蛋白艾克曼菌以1 x 104至1 x 1012个细胞的量施用至所述受试者。
9. 根据权利要求8所述的用途，其中所述组合物被制备为将嗜粘蛋白艾克曼菌以1x105至1 x 1011个细胞的量施用至所述受试者。
10. 根据权利要求8所述的用途，其中组合物被制备为将所述嗜粘蛋白艾克曼菌以1 x106至1 x 1010个细胞的量施用至所述受试者。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物被制备为将嗜粘蛋白艾克曼菌每周施用至少三次。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物被制备为将嗜粘蛋白艾克曼菌与另外的益生菌菌株和/或与一种或多种益生元共同施用。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物被制备为将嗜粘蛋白艾克曼菌与具有有益作用的另外的细菌和/或与一种或多种益生元共同共同施用。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物被制备为将嗜粘蛋白艾克曼菌与具有有益作用的微生物和/或与一种或多种益生元共同共同施用。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物还包含赋形剂。
16.根据权利要求5或6所述的用途，其中所述组合物是营养组合物。
17.根据权利要求15所述的用途，其中所述组合物被制备为经口施用。
18.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物是药物组合物，其还包含药学可接受的载体。
19.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述组合物是药物。
20.嗜粘蛋白艾克曼菌在制备用于促进有需要的受试者的体重减轻的组合物中的用途，其中嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述组合物是美容组合物。
22.嗜粘蛋白艾克曼菌作为食品添加剂、饮品添加剂或营养产品的用途，其中所述嗜粘蛋白艾克曼菌经巴氏灭菌。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述营养产品是膳食补充剂。
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