CN108138177A - Dbait分子与PARP抑制剂的组合用于治疗癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PARP抑制剂与Dbait分子的组合，其用于治疗癌症。

Description

Dbait分子与PARP抑制剂的组合用于治疗癌症的用途
技术领域
本发明涉及医学领域，特别是肿瘤学领域。
背景技术
聚(ADP核糖)聚合酶PARP1(和PARP2)是结合DNA损伤并通过形成吸引修复酶的ADP-核糖聚合物促进DNA修复的酶。PARP是通过碱基切除修复途径进行单链断裂的关键酶。如果保持未修复，则单链断裂在复制期间转化为双链断裂，其基本上通过同源重组修复。因此，抑制PARP对于缺乏同源重组的细胞是致命的。这个观察结果促成了开发PARP抑制剂以治疗已经发生突变而使同源重组能力丧失的癌症。
PARP抑制剂靶向两种主要的酶：PARP1和PARP2。在正常情况下，只要修复过程正在进行，就会从DNA释放PARP1和PARP2。然而，当其与一些PARP抑制剂结合时，PARP1和PARP2被捕获在DNA上。被捕获的PARP-DNA复合物比未修复的单链DNA断裂对细胞更具毒性。有两类PARP抑制剂：(i)主要用于抑制PARP酶活性并且不将PARP蛋白捕获在DNA上的催化抑制剂，和(ii)阻断PARP酶活性并且阻止其从损伤位点释放的结合抑制剂。虽然已经开发了许多PARP抑制剂，但其在类型(i)或(ii)中的分类尚不清楚。已经提出，维利帕尼(Veliparib)可以是类型(i)，并且奥拉帕尼(Olaparib)、尼拉帕尼(Niraparib)、BM673可以属于类型(ii)。此外，由于PARP参与多个细胞过程，所以PARP抑制剂在肿瘤细胞中的作用机制尚未完全阐明。当前，只有当患者患有特定的肿瘤类型(例如，高级浆液性卵巢癌或三阴性脑癌)或其癌症可以属于相关分子亚型(例如，BRCA1/2-突变的乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌或前列腺癌)时，所述患者才会被考虑进行PARP抑制剂试验。
虽然PARP抑制剂(PARPi)单一疗法在临床上显示有前景的疗效和安全概况，但其主要限制是需要缺乏HR和抗性的迅速出现。最初对PARPi治疗有反应的许多肿瘤最终通过补偿突变而复发，所述补偿突变恢复了HR活性或刺激替代性修复途径的活性。
因此，PARP抑制剂的使用限于特定的肿瘤类型，并且不能用于治疗任何癌症。
发明内容
本发明提供一种组合治疗，其可使用PARP抑制剂治疗任何类型的癌症，特别是但不限于与同源重组缺乏相关的癌症。另外，本发明提供PARP抑制剂与本文所定义的核酸分子的组合，从而产生对抗肿瘤的协同作用。
因此，本发明涉及包含PARP抑制剂和本文所定义的核酸分子的药物组合物，特别是用于治疗癌症。
本发明还涉及用于与本文所定义的核酸分子组合治疗癌症的PARP抑制剂，或用于与PARP抑制剂组合治疗癌症的本文所定义的核酸分子。
本发明还涉及一种试剂盒，其以组合制剂形式包含同时、分别或依序使用的PARP抑制剂和本文所定义作为组合制剂的核酸分子，特别是用于治疗癌症。
优选地，所述核酸分子具有至少一个游离端和6-200bp的DNA双链部分，该分子与人类基因组中的任何基因具有小于60％的序列同一性。
更优选地，所述核酸分子具有下式中的一者：
其中N为脱氧核苷酸，n为1至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L'为连接基团，C为促进胞吞的分子，所述促进胞吞的分子优选选自亲脂性分子和靶向细胞受体使得能够进行受体介导的胞吞的配体，L为连接基团，m和p独立地为整数0或1。
更具体地，所述核酸分子具有下式中的一者：
SEQ ID No 6
SEQ ID No 11
SEQ ID No 16
SEQ ID No 7
SEQ ID No 12
SEQ ID No 17
SEQ ID No 8
SEQ ID No 13
SEQ ID No 18
SEQ ID No 9
SEQ ID No 14
SEQ ID No 19
SEQ ID No 10
SEQ ID No 15
和SEQ ID No 20
其中带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；m为1，并且L为甲酰胺基寡聚乙二醇，C选自单链或双链脂肪酸如十八烷基和二油酰基、胆固醇、生育酚、叶酸、糖如半乳糖和甘露糖以及其寡糖、肽如RGD和蛙皮素以及蛋白质如整联蛋白，优选胆固醇或生育酚。
在一个优选实施方式中，所述核酸分子选自
和
更优选地，促进胞吞的分子为胆固醇或生育酚。
在一个非常特定的实施方式中，核酸分子具有下式
SEQ ID No 21。
在另一个非常特定的实施方式中，核酸分子具有下式
其中C为胆固醇基，Lm为四乙二醇，p为1并且L'为1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
优选地，所述PARP抑制剂选自：鲁卡帕尼(rucaparib)(AG014699、PF-01367338)、奥拉帕尼(AZD2281)、维利帕尼(ABT888)、英利帕尼(iniparib)(BSI 201)、尼拉帕尼(MK4827)、他唑帕尼(talazoparib)(BMN673)、AZD 2461、CEP 9722、E7016、INO-1001、LT-673、MP-124、NMS-P118、XAV939、其类似物、衍生物或混合物。更优选地，PARP抑制剂选自AZD2281(奥拉帕尼)、ABT888(维利帕尼)、BMN673、BSI-21(英利帕尼)、AZD 2461、MK-4827(尼拉帕尼)和AG 014699(鲁卡帕尼)。
在一个特定方面，所述PARP抑制剂以亚治疗量使用。
所有癌症类型都可以治疗。更优选地，所述癌症选自白血病、淋巴瘤、肉瘤、黑素瘤以及头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌，特别是小细胞肺癌和非小细胞肺癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肝癌、子宫颈癌以及子宫内膜癌和腹膜癌。具体地，所述癌症为实体癌症。在一个特定方面，所述癌症是转移性癌症或高级或晚期癌症。在一个特定实施方式中，所述癌症选自白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、头颈癌、乳腺癌、脑癌、结肠直肠癌和子宫颈癌。
附图说明
图1：奥拉帕尼和维利帕尼与DT01组合的超加和性的实例，其通过数种剂量的奥拉帕尼(OLA)、维利帕尼(VELI)和DT01下的活细胞百分比测量。
图2：DT01和奥拉帕尼的超加和作用不依赖于细胞系和DNA-PK或BRCA突变。在不同肿瘤细胞(来自子宫颈癌、胶质母细胞瘤、血癌、乳腺癌)和两个非肿瘤的乳腺细胞中监测暴露于0.1μM奥拉帕尼(黑色)、100μg/ml DT01(灰色)或两种处理0.1μM奥拉帕尼+100μg/mlDT01(影线)的细胞的存活率。
图3：DT01和奥拉帕尼的体内协同作用。
图4：DNA修复抑制剂AsiDNA或奥拉帕尼对细胞死亡的作用。用4.8μM AsiDNA(A)或0.1μM Ola(B)处理的BC细胞系(MDAMB436、HCC1937、BC227、HCC38、BC173、MDAMB468、HCC1143、BT20、MDAMB231、HCC1187和HCC70)、子宫颈腺癌细胞系(HeLa CTL SX、HeLaBRCA1SX和HeLa BRCA2SX)和非肿瘤乳腺细胞系(184B5、MCF10和MCF12A)中细胞死亡的分析。虚线指示各处理的敏感细胞系(由高于两倍的死细胞％平均差值定义)。
图5：DNA修复抑制剂AsiDNA或奥拉帕尼对细胞存活率的作用。用4.8μM AsiDNA或0.1μM Ola处理的BC细胞系(MDAMB436、HCC1937、BC227、HCC38、BC173、MDAMB468、HCC1143、BT20、MDAMB231、HCC1187、HCC70)、子宫颈腺癌细胞系(HeLa CTL SX、HeLa BRCA1SX和HeLaBRCA2SX)和非肿瘤乳腺细胞系(184B5、MCF10和MCF12A)中细胞存活率的分析。将存活率表示为未处理活细胞的百分比。
图6：组合处理显示超加和功效。处理后6天通过在锥虫蓝标记后进行细胞计数来监测AsiDNA(4.8μM)、奥拉帕尼(0、0.1和1μM)或两者的功效。(A)活细胞相对于未处理条件(NT)的百分比。(B)死细胞的百分比。将数据表示为至少2次独立实验的平均值±Sc.D.。虚线表示在AsiDNA与奥拉帕尼之间具有加和性时计算的细胞存活率。
图7：AsiDNA与奥拉帕尼组合处理的作用。用(黑色)或不用(灰色)0.1μM Ola处理的培养物中的肿瘤(图A)和非肿瘤细胞系(图B)中的细胞存活率(上图)和细胞死亡率(下图)的分析。不连续的线指示在AsiDNA与Ola之间具有加和性的情况下计算的细胞存活率(用AsiDNA产生的存活率×用奥拉帕尼产生的存活率)。通过锥虫蓝染色和手动计数(处理后6天)监测存活率和细胞死亡率。将存活率表示为未处理活细胞的百分比，并且将细胞死亡率表示为死细胞的出现率。
图8：奥拉帕尼抑制XRCC1募集到损伤位点而与AsiDNA无关。(A)激光损伤后40秒XRCC1-eYFP募集的代表性影像，和(B)用Ola(1μM)和/或AsiDNA(16μM)处理24h后MDAMB231细胞中XRCC1-eYFP募集的动力学。ns：不显著；****：p<0.0001。在受控的环境(37℃，5％CO2)下，用使用63/1.4物镜并连接到DMI6000支架上的Leica SP5共焦系统进行这些实验。使用适当取样频率(512_512个影像，线平均值为四并且放大率设置为八)和适合于所关注的荧光蛋白的氩激光线(对于YFP，为514nm)来进行所有记录。在第一步中，在2-3s的时间内在足够低以不会诱导任何光动力损伤的激光能量设定下获得两个影像。接着将405nm激光线(二极管)设置为最大输出100ms，并聚焦到核内恒定尺寸(176nm)的单个位置上，从而以可重现的量的能量引起光损伤点。接着使用与损伤前工序相同的设置通过荧光监测所关注蛋白质的募集。AsiDNA(16μM)、奥拉帕尼(1μM)或两者处理后24h诱导激光损伤。在后面的52s中，以2s的间隔拍摄影像。
图9：AsiDNA与奥拉帕尼组合处理对DNA修复的作用。用Ola和/或AsiDNA处理24h的MDAMB231(A)或MCF10(C)细胞中γH2AX(红色)和Rad51或53BP1(绿色)部位的代表性影像。(B、D)在Ola和/或AsiDNA处理后24h，100个MDAMB231细胞(B)或MCF10A细胞(D)中的53BP1和Rad51位点的数目。红色条代表平均值。(E、F)在Ola和/或AsiDNA处理后24h，通过碱性彗星分析在MDAMB231(E)或MCF10A(F)细胞中监测到的DNA损伤。ns：不显著；*：p<0.05；****：p<0.0001。
图10：AsiDNA抑制照射诱导的53BP1位点。在用AsiDNA和/或Ola事先处理22h后，在10Gy照射后2h，在100个MDAMB231细胞中53BP1部位的数目。红色条代表平均值。*：p<0.05；**：p<0.01；****：p<0.0001。
图11：AsiDNA与PARP缺陷的协同作用。(A)AsiDNA对各种等基因DT40细胞系的细胞毒性。(B)比较单独的(实线)或与1μM维利帕尼组合(蓝色不连续的线)的AsiDNA在野生型(WT；黑色)或PARP KO(红色)DT40细胞中产生的细胞存活率。如在(36)中所述，通过ATPlite1步试剂盒(处理后72小时)在各种突变DT40细胞中监测存活率。将存活率表示为未处理细胞的百分比。将结果表示为三次独立实验的平均存活率±SEM。
图12：AsiDNA与维利帕尼结合呈现超加和功效。处理后6天通过锥虫蓝染色监测AsiDNA(4.8μM)、维利帕尼(0、10和50μM)或两者的功效。(A)活细胞相对于未处理条件(NT)的百分比。(B)死细胞的百分比。虚线指示在AsiDNA与维利帕尼之间具有加和性时计算的细胞存活率。
图13：AsiDNA与各种的PARPi组合处理对MDAMB231的作用。在用4.8μM AsiDNA(黑色)、16μM AsiDNA(深灰色)处理或未处理(浅灰色)的培养物中的MDAMB231细胞系中的细胞存活率(A)和细胞死亡率(B)的分析。不连续的线指示在AsiDNA与PARPi之间具有加和性的情况下计算的细胞存活率(用AsiDNA产生的存活率×用PARPi产生的存活率)。处理后6天监测存活率和细胞死亡率。将存活率表示为未处理活细胞的百分比，并且将细胞死亡率表示为死细胞的出现率。选择产生80％和50％存活率的PARPi剂量(表2)。
具体实施方式
因此，本发明涉及
-一种包含PARP抑制剂和本文所定义的核酸分子和任选地药学上可接受的载体的药物组合物，特别是用于治疗癌症；
-一种以组合制剂形式含有用于同时、分别或依序使用的PARP抑制剂和本文所定义的核酸分子的产品或试剂盒，特别是用于治疗癌症；
-一种包含用于同时、分别或依序使用的PARP抑制剂和本文所定义的核酸分子的组合制剂，特别是用于治疗癌症；
-一种包含PARP抑制剂的药物组合物，其用于与使用本文所定义的核酸分子的治疗相组合治疗癌症；
-一种包含本文所定义的核酸分子的药物组合物，其用于与使用PARP抑制剂的治疗相组合治疗癌症；
-包含PARP抑制剂的药物组合物的用途，其用于制造用于与使用本文所定义的核酸分子的治疗相组合以治疗癌症的药剂；
-包含本文所定义的核酸分子的药物组合物的用途，其用于制造用于与使用PARP抑制剂的治疗相组合以治疗癌症的药剂；
-包含PARP抑制剂、本文所定义的核酸分子和任选地药学上可接受的载体的药物组合物的用途，其用于制造用于治疗癌症的药剂；
-一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含a)本文所定义的核酸分子、b)PARP抑制剂，和药学上可接受的载体；
-一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括给予有效量的包含PARP抑制剂的药物组合物，和有效量的包含本文所定义的核酸分子的药物组合物；
-一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含PARP抑制剂和本文所定义的核酸分子。
如本文所用，术语“试剂盒”、“产品”或“组合制剂”特别定义“部分试剂盒”，其意义在于如上文所定义的组合搭配物可以独立地给药或通过使用具有区别量的所述组合搭配物的不同固定组合给药，即同时或在不同时间点给药。然后可以例如同时或按时间顺序交错地施用所述部分试剂盒的部分，即对于所述部分试剂盒的任何部分在不同的时间点以及以相等或不同的时间间隔施用。在组合制剂中施用的组合搭配物的总量的比率可以变化。组合搭配物可以通过相同途径或通过不同途径施用。
在本发明的上下文中，术语治疗表示治愈性、对症性和预防性治疗。本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂可以用于患有癌症或肿瘤的人，包括处于癌症进展的早期或晚期。本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂不一定会治愈患有癌症的患者，但会延缓或减缓疾病的进展或阻止疾病进一步发展，从而改善患者的病状。具体地，本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂减少肿瘤发展，降低肿瘤负荷，在哺乳动物宿主中产生肿瘤消退和/或预防转移发生和癌症复发。在治疗癌症时，本发明的药物组合物以治疗有效量施用。
“治疗有效量”是指本发明药物组合物的如下量，其单独地或与药物组合物、试剂盒、产品或组合制剂的其它活性成分组合地预防、去除或降低癌症在包括人类的哺乳动物中的有害作用。应了解，组合物中各化合物的施用剂量可以低于对于单独使用或与除了本文所述的组合以外的其它治疗组合使用的各化合物所定义的“治疗有效量”。本领域技术人员将根据患者、病理学、施用模式等来调整组合物的“治疗有效量”。
在整个本说明书中，每当关于本发明的药物组合物而提及“治疗癌症”等时，是指：a)一种治疗癌症的方法，所述方法包含向需要这种治疗的受试者施用本发明的药物组合物；b)本发明的药物组合物用于治疗癌症的用途；c)本发明的药物组合物用于制造用于治疗癌症的药剂的用途；和/或d)一种本发明药物组合物，其用于治疗癌症。
除了活性成分以外，本文考虑的药物组合物还可以包括药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”意在涵盖不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对所施用的宿主无毒的任何载体(例如支撑体、物质、溶剂等)。例如，对于肠胃外施用，可以将活性化合物在载体如盐水、右旋糖溶液、血清白蛋白和林格氏溶液中配制成单位剂型来用于注射。
所述药物组合物可以以本领域中已知的方式配制成在药学上相容的溶剂中的溶液，或在适合的药物溶剂或载体中的乳液、悬浮液或分散液，或含有固体载体的丸剂、片剂或胶囊。适用于口服施用的本发明制剂可以为离散单元形式，如胶囊、袋装剂、片剂或糖锭，其各自含有预定量的活性成分；为粉末或颗粒的形式；为在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液的形式；或为水包油乳液或油包水乳液的形式。适用于肠胃外施用的制剂常规包含活性成分的无菌油性或水性制剂，其优选与接受者的血液等渗。每种这样的制剂还可以含有其它药学上相容和无毒的助剂，诸如稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、染料、乳化剂或调味物质。本发明的制剂包含活性成分以及其药学上可接受的载体和任选地其它治疗成分。载体必须在与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害的意义上是“可接受的”。所述药物组合物有利地通过注射或静脉内输注适合的无菌溶液或以口服剂量通过消化道施用。本领域技术人员已知安全并且有效地施用大多数这些化学治疗剂的方法。此外，其施用描述在标准文献中。
PARP抑制剂
如本文所用，术语“PARP”是指聚(ADP-核糖)聚合酶。PARP催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)转化成烟酰胺和聚-ADP-核糖(PAR)。PARP是修复DNA单链断裂(SSB)的关键分子。如本文所用，术语“PARP”(EC 2.4.2.30)等效于“PARS”(为聚(ADP-核糖)合成酶)、“ADPRT”(为NADr蛋白(ADP-核糖基)转移酶(聚合))或“pADPRT”(为聚(ADP-核糖)转移酶)。
如本文所用，术语“PARP抑制剂”是指能够降低聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的活性的任何化合物。PARP抑制主要依赖于两种不同的机制：(i)主要通过抑制PARP酶活性起作用的催化抑制和(ii)阻断PARP酶活性并阻止其从损伤位点释放的结合抑制。相较于催化抑制剂，结合抑制剂对细胞的毒性更大。根据本发明的PARP抑制剂优选为催化和/或结合抑制剂。
在一个优选实施方式中，PARP抑制剂为PARP家族的任何酶、优选PARP1和/或PARP2的抑制剂。
PARP活性可以通过本领域技术人员众所周知的各种技术来测定。通常，这些技术包含测量标记的聚(ADP-核糖)在组蛋白上的并入。可获得用于这些技术的市售试剂盒(参见例如，使用生物素化聚(ADP-核糖)的Tervigen试剂盒)。还可以使用其它方法，诸如由Putt KS等人开发的方法(Anal Biochem，326(1):78-86,2004)，其公开内容在此以全文引用的方式并入。这些方法对于测定已知或可疑的PARP抑制剂的IC50值是理想的。
多种PARP抑制剂是已知的，因此可以通过已知方法从已知起始材料合成，可以购得，或可以通过文献中用于制备相应化合物的方法制备。
根据本发明的适合PARP抑制剂的实例包括但不限于奥拉帕尼(AZD-2281，4-[(3-[(4-环丙基羰基)哌嗪-4-基]羰基)-4-氟苯基]甲基(2H)-酞嗪-1-酮)、维利帕尼(ABT-888，CAS 912444-00-9，2-((fi)-2-甲基吡咯烷-2-基)-1W-苯并咪唑-4-甲酰胺)、CEP-8983(11-甲氧基-4,5,6,7-四氢-1H-环戊二烯并[a]吡咯并[3,4-c]咔唑-1,3(2H)-二酮)或其前药(例如CEP-9722)、鲁卡帕尼(AG014699，PF-01367338，8-氟-2-{4-[(甲基氨基)甲基]苯基}-1,3,4,5-四氢-6H-氮杂并[5,4,3-cd]吲哚-6-酮)、E7016(GPI-21016，10-((4-羟基哌啶-1-基)甲基)色烯并-[4,3,2-de]酞嗪-3(2H)-酮)、他唑帕尼(BMN-673，(8S,9R)-5-氟-8-(4-氟苯基)-9-(1-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-8,9-二氢-2H-吡啶并[4,3,2de]酞嗪-3(7H)-酮)、INO-1001(4-苯氧基-3-吡咯烷-1-基-5-氨磺酰基-苯甲酸)、KU0058684(CAS623578-11-0)、尼拉帕尼(MK 4827，Merck&Co Inc)、英利帕尼(BSI201)、英利帕尼-met(英利帕尼的C-亚硝基代谢物)、CEP 9722(Cephalon Inc)、LT-673、MP-124、NMS-P118、XAV939、AZD2461、烟酰胺、5-甲基烟酰胺、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、吡啶酰胺、苯甲酰胺，3-取代的苯甲酰胺、3-甲氧基苯甲酰胺、3-羟基苯甲酰胺、3-氨基苯甲酰胺、3-氯普鲁卡因胺、3-亚硝基苯甲酰胺、4-氨基苯甲酰胺、2-氨基苯甲酰胺、3,5-二碘-4-(4'-甲氧基苯氧基)苯甲酸甲酯、3,5-二碘-4-(4'-甲氧基-3',5'-二碘-苯氧基)苯甲酸甲酯、环苯甲酰胺、1,5-二[(3-氨甲酰基苯基)氨基羰氧基]戊烷、吲哚、苯并咪唑、苯并恶唑-4-甲酰胺、苯并咪唑-4-甲酰胺、2-取代的苯并恶唑-4-甲酰胺、2-取代的苯并咪唑4-甲酰胺、2-芳基苯并咪唑4-甲酰胺、2-环烷基苯并咪唑-4-甲酰胺、2-(4-羟基苯基)苯并咪唑A-甲酰胺、喹喔啉甲酰胺、咪唑并吡啶甲酰胺、2-苯基吲哚、2-取代的苯并恶唑、2-苯基苯并恶唑、2-(3-甲氧基苯基)苯并恶唑、2-取代的苯并咪唑、2-苯基苯并咪唑、2-(3-甲氧基苯基)苯并恶唑、1,3,4,5-四氢-氮杂并[5,4,3-cd]吲哚-6-酮、氮杂并吲哚、氮杂并吲哚酮、1,5-二氢-氮杂并[4,5,6-cd]吲哚啉-6-酮、二氢二氮杂并吲哚啉酮、3-取代的二氢二氮杂并吲哚啉酮、3-(4-三氟甲基苯基)-二氢二氮杂并吲哚啉酮、四氢二氮杂并吲哚啉酮、5,6-二氢咪唑并[4,5,l-j,k][1,4]苯并二氮杂-7(4H)-酮、2-苯基-5,6-二氢-咪唑并[4,5,1-jk][1,4]苯并二氮杂-7(4H)-酮、2,3-二氢-异吲哚-1-酮、苯并咪唑-2-哌嗪、苯并咪唑-2-哌嗪杂环衍生物、4-碘-3-硝基苯甲酰胺、苯并吡喃酮、1,2-苯并吡喃酮、6-亚硝基苯并吡喃酮、6-亚硝基-1,2-苯并吡喃酮、5-碘-6-氨基苯并吡喃酮、苯甲酰脲、喹诺酮、异喹诺酮、异喹啉酮、二氢异喹啉酮、2H-异喹啉-1-酮、3H-喹唑啉-4-酮、5-取代的二氢异喹啉酮、5-羟基二氢异喹啉酮、5-甲基二氢异喹啉酮、5-羟基异喹啉酮、5-氨基异喹啉-1-酮、5-二羟基异喹啉酮、1,5-二羟基异喹啉、1,5-异喹啉二醇、4-羟基喹唑啉、取代的噻唑基-异喹啉酮、取代的恶唑基-异喹啉酮、四氢-2H-异喹啉-1-酮、3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮、3,4-二氢-5-甲氧基-异喹啉-1(2H)-酮、3,4-二氢-5-甲基-1(2H)异喹啉酮、3H-喹唑啉-4-酮、异喹啉-1(2H)-酮、3,4-二氢异喹啉-1(2H)-酮、4-甲酰胺基-苯并咪唑、取代的6-环己基烷基取代的2-喹啉酮、取代的6-环己基烷基取代的2-喹喔啉酮、7-苯基烷基取代的2-喹啉酮、7-苯基烷基取代的2-喹喔啉酮、6-取代的2-喹啉酮、6-取代的2-喹喔啉酮、1-(芳基甲基)喹唑啉-2,4(1H,3H)-二酮、4,5-二氢-咪唑并[4,5,l-ij]喹啉-6-酮、1,6-二氮杂萘-5(6H)-酮、1,8-萘酰亚胺、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、3,4-二氢-5-[4-1(1-哌啶基)丁氧基]-1(2H)-异喹啉酮、2,3-二氢苯并[de]异喹啉-1-酮、1-1lb-二氢-[2H]苯并吡喃并[4,3,2-de]异喹啉-3-酮、四环内酰胺、苯并吡喃并异喹啉酮、苯并吡喃并[4,3,2-de]异喹啉酮、喹唑啉、喹唑啉酮、喹唑啉二酮、A-羟基喹唑啉、2-取代的喹唑啉、8-羟基-2-甲基喹唑啉-4-(3H)酮、酞嗪、酞嗪酮、酞嗪-1(2H)-酮、5-甲氧基-4-甲基-1(2)酞嗪酮、4-取代的酞嗪酮、4-(1-哌嗪基)-1(2H)-酞嗪酮、四环苯并吡喃并[4,3,2-de]酞嗪酮和四环茚并[1,2,3-de]酞嗪酮、三环酞嗪酮、2-氨基邻苯二甲酰肼、酞嗪酮酮、二氢吡啶并酞嗪酮、6-取代的5-芳基氨基-1h-吡啶-2-酮、哒嗪酮、四氢吡啶并哒嗪酮、四氮杂非那烯-3-酮、噻吩并[2,3-c]异喹啉-5-酮(TIQ-A)、2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷、嘧啶并咪唑、异吲哚啉酮、菲啶、菲啶酮、5[H]菲啶-6-酮、取代的5[H]菲啶-6-酮、2,3-取代的5[H]菲啶-6-酮、6(5H)菲啶酮的磺酰胺/碳酰胺衍生物、噻吩并[2、3-c]异喹诺酮、9-氨基噻吩并[2,3-c]异喹诺酮、9-羟基噻吩并[2,3-c]异喹诺酮、9-甲氧基噻吩并[2,3-c]异喹诺酮、N-(6-氧代-5,6-二氢菲啶-2-基]-2-(N,N-二甲基氨基}乙酰胺、取代的4,9-二氢环戊二烯并[imn]菲啶-5-酮、不饱和的羟肟酸衍生物、O-(3-哌啶基-2-羟基-1-丙基)烟碱胺肟、O-(2-羟基-3-哌啶基-丙基)-3-甲酸胺肟、哒嗪、吡嗪酰胺、BGB-290、PF-1367338(PfizerInc)、AG014699(Pfizer,Inc.)、KU-59436(KuDOS/AstraZeneca PJ34，4-氨基-1,8-萘二甲酰亚胺(4-amino-l,8-naphfhalirnide)(Trevigen)、6(5H)-菲啶酮(Trevigen)、NU1025、4-HQN、BGP-15、A-966492、GPI21016、6(5H)-菲啶酮(Phen)、可可碱、茶碱、咖啡因、甲基黄嘌呤、胸苷、3-氨基邻苯二甲酰肼(3-aminophtalhydrazide)，其类似物、衍生物或混合物。
其它PARP抑制剂描述于例如以下文献中：WO14201972；WO14201972；WO12141990；WO10091140；WO9524379；WO09155402；WO09046205；WO08146035；WO08015429；WO0191796；WO0042040；US2006004028；EP2604610；EP1802578；CN104140426；CN104003979；US060229351；US7041675；WO07041357；WO2003057699；US06444676；US20060229289；US20060063926；WO2006033006；WO2006033007；WO03051879；WO2004108723；WO2006066172；WO2006078503；US20070032489；WO2005023246；WO2005097750；WO2005123687；WO2005097750；US7087637；US6903101；WO20070011962；US20070015814；WO2006135873；UA20070072912；WO2006065392；WO2005012305；WO2005012305；EP412848；EP453210；EP454831；EP879820；EP879820；WO030805；WO03007959；US6989388；US20060094746；EP1212328；WO2006078711；US06426415；US06514983；EP1212328；US20040254372；US20050148575；US20060003987；US06635642；WO200116137；WO2004105700；WO03057145A2；WO2006078711；WO2002044157；US20056924284；WO2005112935；US20046828319；WO2005054201；WO2005054209；WO2005054210；WO2005058843；WO2006003146；WO2006003147；WO2006003148；WO2006003150；WO2006003146；WO2006003147；UA20070072842；US05587384；US20060094743；WO2002094790；WO2004048339；EP1582520；US20060004028；WO2005108400；US6964960；WO20050080096；WO2006137510；UA20070072841；WO2004087713；WO2006046035；WO2006008119；WO06008118；WO2006042638；US20060229289；US20060229351；WO2005023800；WO1991007404；WO2000042025；WO2004096779；US06426415；WO02068407；US06476048；WO2001090077；WO2001085687；WO2001085686；WO2001079184；WO2001057038；WO2001023390；WO01021615A1；WO2001016136；WO2001012199；WO95024379；WO200236576；WO2004080976；WO2007149451；WO2006110816；WO2007113596；WO2007138351；WO2007144652；WO2007144639；WO2007138351；WO2007144637；Banasik等人(J.Biol.Chem.,267:3,1569-75,1992)；Banasik等人(Molec.Cell.Biochem,138:185-97,1994)；Cosi等人(ExpertOpin.Ther.Patents 12(7),2002)；Southan和Szabo(Curr Med Chem,10 321-340,2003)；Underhill C.等人(Annals of Oncology,doi:10.1093/annonc/mdq322,第1-12页,2010)；Murai J.等人(J.Pharmacol.Exp.Ther.,349:408-416,2014)，所有这些专利和公开都在此以全文引用的方式并入。
在一个优选实施方式中，PARP抑制剂化合物选自：鲁卡帕尼(AG014699、PF-01367338)、奥拉帕尼(AZD2281)、维利帕尼(ABT888)、英利帕尼(BSI 201)、尼拉帕尼(MK4827)、他唑帕尼(BMN673)、AZD2461、CEP 9722、E7016、INO-1001、LT-673、MP-124、NMS-P118、XAV939，其类似物、衍生物或混合物。
在一个甚至更优选的实施方式中，PARP抑制剂选自鲁卡帕尼(AG014699、PF-01367338)、奥拉帕尼(AZD2281)、维利帕尼(ABT888)、英利帕尼(BSI 201)、尼拉帕尼(MK4827)、他唑帕尼(BMN673)、AZD2461，其类似物、衍生物或混合物。
核酸分子
用于本发明的结合或未结合的核酸分子可以由下式描述：
其中N为核苷酸，n为至少1的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L'为连接基团，C为促进胞吞的分子，L为连接基团，m和p独立地为整数0或1。在式(II)和(III)中，C-Lm分别与核苷酸的5'端或3'端连接。在式(I-III)中，C-Lm优选通过二硫键(S-S)与L'连接。当结合该分子时，p为1。优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸。
在优选实施方式中，式(I)、(II)或(III)的分子具有以下特征中的一个或数个：
-N为脱氧核苷酸，其优选地选自A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)和G(鸟嘌呤)，并且N被选择成避免出现CpG二核苷酸并与人类基因组中的任何基因具有小于80％或70％，甚至小于60％或50％的序列同一性；和/或，
-n为整数1至195，优选3至195、23至195或25至195，任选地1至95、2至95、3至95、5至95、15至195、19-95、21至95、23至95、25至95、27至95、1至45、2至35、3至35、5至35、15至45、19至45、21至45或27至45。在一个特别优选的实施方式中，n为27；和/或，
-带下划线的N是指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架、更优选硫代磷酸酯骨架的核苷酸；优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸；和/或，
-连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m为1，并且L为甲酰胺基聚乙二醇，更优选甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇；和/或
-C选自胆固醇；单链或双链脂肪酸，诸如十八烷基、油酸、二油酰基或硬脂酸；或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、适体)，诸如叶酸；生育酚；糖，诸如半乳糖和甘露糖以及其寡糖；肽，诸如RGD和蛙皮素；以及蛋白质，诸如转铁蛋白和整联蛋白，优选为胆固醇或生育酚，更优选为胆固醇；
优选地，C-Lm是三乙二醇连接基团(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-三乙二醇基)。或者，C-Lm是四乙二醇连接基团(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-四乙二醇基)。
在一个优选实施方式中，结合的Dbait分子或发夹核酸分子具有下式：
其中N、N、n、L、L'、C和m的定义对于式(I)、(II)、(II')和(III)相同。
在一个特定实施方式中，核酸分子可以是Dbait分子，诸如在PCT专利申请WO2005/040378、WO2008/034866和WO2008/084087中广泛描述的Dbait分子，所述专利申请的公开内容以引用的方式并入本文中。
Dbait分子可以由其治疗活性所必需的许多特征来定义，诸如其最小长度，存在至少一个游离端并且存在双链部分，优选DNA双链部分。如下所述，重要的是要注意，Dbait分子的精确核苷酸序列不影响其活性。此外，Dbait分子可以含有修饰和/或非天然的骨架。
优选地，Dbait分子是非人类来源的(即，因此其核苷酸序列和/或构型(例如发夹)不存在于人类细胞中)，最优选合成来源。因为Dbait分子的序列几乎不起作用，所以Dbait分子优选与已知基因、启动子、增强子、5'-或3'-上游序列、外显子、内含子等没有显著程度的序列同源性或同一性。换句话说，Dbait分子与人类基因组中的任何基因具有小于80％或70％，甚至小于60％或50％的序列同一性。测定序列同一性的方法在本领域中是众所周知的，并且包括例如Blast。Dbait分子在严格条件下不与人类基因组DNA杂交。典型的严格条件是其允许区分完全互补的核酸与部分互补的核酸。
此外，Dbait分子的序列优选不含CpG，以避免众所周知的Toll样受体介导的免疫反应。
Dbait分子的长度可以是可变的，只要其足以使得可适当地结合包含Ku和DNA-PKcs蛋白的Ku蛋白复合物即可。已经显示，Dbait分子的长度必须大于20bp，优选约32bp，以确保与这种Ku复合物结合并使得DNA-PKcs活化。优选地，Dbait分子包含20-200bp，更优选24-100bp，更加优选26-100，并且最优选24-200、25-200、26-200、27-200、28-200、30-200、32-200、24-100、25-100、26-100、27-100、28-100、30-100、32-200或32-100bp。例如，Dbait分子包含24-160、26-150、28-140、28-200、30-120、32-200或32-100bp。“bp”是指该分子包含指定长度的双链部分。
在一个特定实施方式中，具有至少32bp或约32bp的双链部分的Dbait分子包含与Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)相同的核苷酸序列。任选地，Dbait分子与Dbait32、Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc或Dbait32Hd具有相同核苷酸组成，但其核苷酸序列不同。此外，Dbait分子包含具有3A、6C、12G和11T的双链部分的一条链。优选地，Dbait分子的序列不含任何CpG二核苷酸。
或者，双链部分包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸。在一个更特定实施方式中，双链部分由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸组成。
如本文所公开的核酸必须具有至少一个游离端作为DSB的模拟物。所述游离端可以是游离平端或5'-/3'-突出端。本文中的“游离端”是指具有5'端和3'端两者或具有3'端或5'端的核酸分子，特别是双链核酸部分。任选地，5'和3'端之一可以用于结合核酸分子或可以与阻断基团例如a或3'-3'核苷酸键连接。
在一个替代性实施方式中，核酸分子含有两个游离端并且可以为直链。因此，Dbait分子也可以为具有两个游离端的双链分子，并且具有Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的核苷酸序列。
在另一个特定实施方式中，其仅含有一个游离端。优选地，Dbait分子由具有双链DNA茎和环的发夹核酸组成。所述环可以为核酸，或技术人员已知的其它化学基团或其混合物。核苷酸连接基团可以包括2至10个核苷酸，优选3、4或5个核苷酸。非核苷酸连接基团非穷尽性地包括无碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其它聚合化合物(例如寡聚乙二醇，诸如具有2至10个乙二醇单元、优选4、5、6、7或8个乙二醇单元的寡聚乙二醇)。优选的连接基团选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和其他连接基团如2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。因此，在一个特定实施方式中，Dbait分子可以为具有双链部分或茎和环的发夹分子，所述双链部分或茎包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No5)的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸，所述环为六乙二醇连接基团、四脱氧胸苷酸连接基团(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷或2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。在一个更特定实施方式中，这些Dbait分子能够具有由Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸组成的双链部分。
Dbait分子优选包含2'-脱氧核苷酸骨架，并且任选地包含除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶之外的一个或数个(2、3、4、5或6个)修饰的核苷酸和/或核碱基。因此，Dbait分子基本上为DNA结构。具体地，Dbait分子的双链部分或茎由脱氧核糖核苷酸组成。
优选的Dbait分子在一条链或每条链的末端包含一个或数个化学修饰的核苷酸或基团，特别是以此保护它们免于降解。在一个特定的优选实施方式中，Dbait分子的游离端在一条链或每条链的末端被一个、两个或三个修饰的磷酸二酯骨架保护。优选的化学基团，特别是修饰的磷酸二酯骨架，包含硫代磷酸酯。或者，优选的Dbait具有3'-3'核苷酸键，或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸。其它修饰的骨架在本领域中是众所周知的，并且包含氨基磷酸酯、吗啉代核酸、2'-O,4'-C亚甲基/亚乙基桥接的锁定核酸、肽核酸(PNA)和短链烷基或环烷基糖间键或可变长度的短链杂原子或杂环糖内键，或技术人员已知的任何修饰的核苷酸。在第一优选实施方式中，Dbait分子的游离端在一条或两条链的末端被一个、两个或三个修饰的磷酸二酯骨架、更优选三个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯)保护，至少在3'端，但更优选在5'端和3'端两者。
在一个最优选实施方式中，Dbait分子是一种发夹核酸分子，其包含32bp的DNA双链部分或茎(例如，具有选自SEQ ID No 1-5，特别是SEQ ID No 4的序列)和连接DNA双链部分或茎的两条链的环，所述环包含选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷的连接基团或由所述连接基团组成，DNA双链部分或茎的游离端(即在环的相对侧)具有三个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯核苷酸间连接)。
所述核酸分子通过化学合成、半生物合成或生物合成、任何扩增方法，接着任何提取和制备方法以及任何化学修饰来制备。提供连接基团以使所述连接基团通过标准的核酸化学合成是可结合的。更优选地，核酸分子通过特别设计的汇集合成来制造：通过标准核酸化学合成来制备两条互补链，其中并入适当的连接基团前体，在将所述链纯化后，其共价偶联在一起。
任选地，核酸分子可以与促进胞吞或细胞摄取的分子结合。
具体地，促进胞吞或细胞摄取的分子可以是亲脂性分子，诸如胆固醇、单链或双链脂肪酸，或靶向细胞受体使得能够进行受体介导介导的胞吞的配体，诸如叶酸和叶酸衍生物或转铁蛋白(Goldstein等人,Ann.Rev.Cell Biol.1985 1:1-39；Leamon&Lowe,ProcNatl AcadSci USA.1991,88:5572–5576.)。该分子也可以是生育酚；糖，诸如半乳糖和甘露糖以及其寡糖；肽，诸如RGD和蛙皮素；以及蛋白质，诸如整联蛋白。脂肪酸可以是饱和或不饱和的，并且为C4-C28，优选C14-C22，更优选C18如油酸或硬脂酸。具体地，脂肪酸可以为十八烷基或二油酰基。脂肪酸可以以双链形式存在，所述双链形式用适当的连接基团如甘油、磷脂酰胆碱或乙醇胺等连接，或通过用于连接在Dbait分子上的连接基团连接在一起。如本文所用，术语“叶酸”是指叶酸和叶酸衍生物，包括蝶酸衍生物和类似物。适用于本发明的叶酸的类似物和衍生物包括但不限于：抗叶酸剂、二氢叶酸盐、四氢叶酸盐、亚叶酸、蝶酰聚谷氨酸、1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮、10-脱氮、1,5-脱氮、5,10-二脱氮、8,10-二脱氮以及5,8-二脱氮叶酸、抗叶酸剂和蝶酸衍生物。其它叶酸类似物描述在US2004/242582中。因此，促进胞吞的分子可以选自单链或双链脂肪酸、叶酸和胆固醇。更优选地，促进胞吞的分子选自二油酰基、十八烷基、叶酸和胆固醇。在一个最优选实施方式中，核酸分子与胆固醇结合。
促进胞吞的分子与Dbait分子结合，优选通过连接基团。本领域中已知的任何连接基团可以用于将促进胞吞的分子共价连接到Dbait分子。例如，WO09/126933第38-45页提供了对便利连接基团的广泛评述。连接基团非穷尽地可以为脂族链、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质、聚烃或其它聚合物(例如寡聚乙二醇，诸如具有2至10个乙二醇单元、优选3、4、5、6、7或8个乙二醇单元、更优选6个乙二醇单元的寡聚乙二醇)，以及并入可以通过化学或酶促方式分解的任何键，诸如二硫键、保护的二硫键、酸不稳定性键(例如腙键)、酯键、原酸酯键，膦酰胺键、生物可裂解的肽键、偶氮键或醛键。这些可裂解连接基团在WO2007/040469第12-14页、WO2008/022309第22-28页中详述。
在一个特定实施方式中，核酸分子可以与一个促进胞吞的分子连接。或者，促进胞吞的数个分子(例如两个、三个或四个)可以与一个核酸分子连接。
在一个特定的实施方式中，促进胞吞的分子特别是胆固醇与核酸分子之间的连接基团是CO-NH-(CH2-CH2-O)n，其中n是1至10的整数，优选地n选自3、4、5和6。在一个非常特定的实施方式中，连接基团为CO-NH-(CH2-CH2-O)4(甲酰胺基四乙二醇)。在另一个非常特定的实施方式中，连接基团为CO-NH-(CH2-CH2-O)3(甲酰胺基三乙二醇)。连接基团可以在不改变核酸分子活性的任何便利位置与核酸分子连接。具体地，当核酸分子为发夹时，连接基团可以在5'端、在3'端或在环中连接。因此，在一个优选实施方式中，所考虑的结合的Dbait分子为如下Dbait分子，其具有发夹结构并且优选通过连接基团在其5'端与促进胞吞的分子结合。
在另一个特定的实施方式中，促进胞吞的分子特别是胆固醇与核酸分子之间的连接基团为二烷基-二硫键{例如(CH2)r-S-S-(CH2)s，其中r和s为1至10的整数，优选3至8，例如6}。
在一个最优选实施方式中，结合的Dbait分子是发夹核酸分子，其包含32bp的DNA双链部分或茎(例如，具有选自SEQ ID No 1-5，特别是SEQ ID No 4的序列)和连接DNA双链部分或茎的两条链的环，所述环包含选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷的连接基团或由所述连接基团组成，DNA双链部分或茎的游离端(即在环的相对侧)具有三个修饰的磷酸二酯骨架(特别是硫代磷酸酯核苷酸间连接)，并且所述Dbait分子优选通过连接基团(例如甲酰胺基寡聚乙二醇，优选甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇)在其5'端与胆固醇结合。
在一个优选实施方式中，NNNN-(N)n-N包含Dbait32(SEQ ID No1)、Dbait32Ha(SEQID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No5)的至少6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸，或由Dbait32(SEQID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸组成。在一个特定实施方式中，NNNN-(N)n-N包含Dbait32(SEQ ID No 1)、Dbait32Ha(SEQ ID No 2)、Dbait32Hb(SEQ ID No 3)、Dbait32Hc(SEQ ID No 4)或Dbait32Hd(SEQ ID No 5)或由其组成，更优选为Dbait32Hc(SEQ ID No 4)。
相应地，结合的Dbait分子或发夹核酸分子可以选自：
SEQ ID No 6
SEQ ID No 11
SEQ ID No 16
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 1，
SEQ ID No 7
SEQ ID No 12
SEQ ID No 17
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 2，
SEQ ID No 8
SEQ ID No 13
SEQ ID No 18
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 3，
SEQ ID No 9
SEQ ID No 14
SEQ ID No 19
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 4，
SEQ ID No 10
SEQ ID No 15
和SEQ ID No 20
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No 5，
其中L、L'、C、p和m的定义对于式(I)、(II)和(III)相同。
在优选实施方式中，式(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(Ic)、(IIc)、(IIIc)、(Id)、(IId)、(IIId)、(Ie)、(IIe)和(IIIe)、优选式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)的分子具有以下特征中的一个或数个：
-带下划线的核苷酸是指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架、更优选硫代磷酸酯骨架的核苷酸；优选地，带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架、更优选硫代磷酸酯骨架的核苷酸，和/或，
-连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m为1，并且L为甲酰胺基聚乙二醇，更优选甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇；和/或
-p为1；和/或，
-C选自胆固醇；单链或双链脂肪酸，诸如十八烷基、油酸、二油酰基或硬脂酸；或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、适体)，诸如叶酸；生育酚；糖，诸如半乳糖和甘露糖以及其寡糖；肽，诸如RGD和蛙皮素；以及蛋白质，诸如转铁蛋白和整联蛋白，优选为胆固醇。
优选地，C-Lm是三乙二醇连接基团(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-三乙二醇基团)。或者，C-Lm是四乙二醇连接基团(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-四乙二醇基)。
在式(I)、(II)、(II')、(III)、(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(Ic)、(IIc)、(IIIc)、(Id)、(IId)、(IIId)、(Ie)、(IIe)和(IIIe)、优选式(II)、(II')、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)的Dbait分子或发夹核酸分子的一个特定实施方式中，L'优选选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在式(I)、(II)、(II')、(III)、(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(Ic)、(IIc)、(IIIc)、(Id)、(IId)、(IIId)、(Ie)、(IIe)和(IIIe)、优选式(II)、(II')、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)的Dbait分子或发夹核酸分子的一个特定实施方式中，C为胆固醇，C-Lm为基团
在一个优选实施方式中，结合的Dbait分子或发夹核酸分子选自(II)、(II')、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)，其中C-Lm为基团
并且其中L'优选选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，更优选2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在一个非常特定的实施方式中，Dbait分子或发夹核酸分子具有下式：
其中C-Lm为基团
其中L'为2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，并且其中带下划线的核苷酸具有硫代磷酸酯骨架。因此，该分子具有以下结构，并且在实施例部分中将其称为“coDbait”。
SEQ ID No 21
在式(I)、(II)、(II')、(III)、(Ia)、(IIa)、(IIIa)、(Ib)、(IIb)、(IIIb)、(Ic)、(IIc)、(IIIc)、(Id)、(IId)、(IIId)、(Ie)、(IIe)和(IIIe)、优选式(II)、(II')、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)的Dbait分子或发夹核酸分子的一个特定实施方式中，C为胆固醇，C-Lm为四乙二醇连接基团(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-四乙二醇基)。
在一个优选实施方式中，结合的Dbait分子或发夹核酸分子选自(II)、(II')、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe)，其中C-Lm为四乙二醇连接基团(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-四乙二醇基)，其中L'优选选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，更优选1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在一个非常特定的实施方式中，Dbait分子或发夹核酸分子(AsiDNA或DT01)具有下式：
其中C-Lm为四乙二醇连接基团(10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基)，并且L'为1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在另一个优选实施方式中，核酸分子具有下式中的一个
其中N为脱氧核苷酸，n为1至15的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L'为连接基团，C为胆固醇，L为连接基团，m为整数0或1，并且p为1。优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸。在一个优选实施方式中，核酸分子具有式(II)。
因此，本发明还涉及如上文所公开的Dbait分子或核酸分子、包含所述分子和任选地药学上可接受的载体的药物组合物的用途，如下文详述，其用于与PARP抑制剂组合，并且与或不与放射性疗法和/或放射性同位素疗法和/或抗肿瘤化学疗法组合，优选与DNA损伤性抗肿瘤剂组合治疗癌症。
其它组合
任选地，使用如本文中所公开的核酸分子和PARP抑制剂的治疗可以与放射性疗法、放射性同位素疗法和/或另一种抗肿瘤化学疗法、免疫疗法或激素疗法组合使用。优选地，抗肿瘤化学疗法为直接或间接通过DNA损伤性抗肿瘤剂进行的治疗。
如本文所用，术语“抗肿瘤化学疗法”或“化学疗法”是指使用化学或生物化学物质，特别是使用一种或数种抗肿瘤剂进行的癌症治疗性处理。具体地，其还包括激素疗法和免疫疗法。术语“激素疗法”是指出于阻断、增加或去除激素的目的进行的癌症治疗。例如，在乳腺癌中，雌性激素雌激素和黄体酮可以促进一些乳腺癌细胞的生长。所以在这些患者中，给予激素疗法来阻断雌激素，并且常用药物的非穷尽性列表包括：他莫昔芬(Tamoxifen)、托瑞米芬(Fareston)、阿那曲唑(Arimidex)、依西美坦(Aromasin)、来曲唑(Femara)、戈舍瑞林(Zoladex)/亮丙瑞林(Lupron)、醋酸甲地孕酮(Megace)和氟甲睾酮(Halotestin)。术语“免疫疗法”是指使用免疫系统排斥癌症的癌症治疗性处理。所述治疗性处理刺激患者的免疫系统攻击恶性肿瘤细胞。
在一个特定方面，将如本文中所公开的核酸分子和PARP抑制剂与DNA损伤性治疗组合使用。DNA损伤性治疗可以为放射性疗法，或使用DNA损伤性抗肿瘤剂的化学疗法或其组合。DNA损伤性治疗是指诱导DNA链断裂的治疗，优选相对特异性地在癌细胞中进行。
DNA链断裂可以通过电离辐射(放射性疗法)来实现。放射性疗法包括但不限于γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向传递。其它放射性疗法包括微波和UV照射。本发明还考虑其它放射疗法。
DNA链断裂可以通过放射性同位素疗法来实现，特别是通过施用放射性同位素，优选靶向放射性同位素来实现。靶向可能是由于同位素的化学特性，诸如放射性碘，其被甲状腺以高于其它器官的一千倍特异性吸收。或者，靶向可以通过将放射性同位素与具有靶向特性的另一种分子如半抗原或抗体连接来实现。可以使用多种适合的放射性同位素中的任一种，包括但不限于铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨143、钷-149、铒-169、铱-194、金198、金-199和铅-211。
DNA损伤性抗肿瘤剂优选选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体的抑制剂。
拓扑异构酶I和/或II的抑制剂包括但不限于依托泊苷(etoposide)、拓扑替康(topotecan)、喜树碱、伊立替康(irinotecan)、安吖啶(amsacrine)、茚托利辛(intoplicine)、蒽环如阿霉素、表柔比星、柔红霉素、伊达比星(idanrubicine)和米托蒽醌。拓扑异构酶I和II的抑制剂包括但不限于茚托利辛(intoplecin)。
DNA交联剂但不限于顺铂、卡铂和奥沙利铂。
抗代谢剂阻断负责核酸合成的酶或者并入DNA中，从而产生不正确的遗传密码并造成细胞凋亡。其非穷尽性实例包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，并且更具体是甲氨蝶呤、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁(Pentostatine)、5-氟尿嘧啶、吉西他滨和卡培他滨。
DNA损伤性抗肿瘤剂可以为烷化剂，其包括但不限于氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、金属盐和三氮烯。其非穷尽性实例包括尿嘧啶氮芥、氮芥、环磷酰胺(CYTOXAN(R))、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基蜜胺、三亚乙基硫代磷酸胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、福莫司汀、顺铂、卡铂、奥沙利铂、噻替派、链脲霉素、氮烯咪胺和替莫唑胺。
有丝分裂纺锤体抑制剂包括但不限于紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、拉洛他赛(larotaxel)(也被称为XRP9881；Sanofi-Aventis)、XRP6258(Sanofi-Aventis)、BMS-184476(Bristol-Meyer-Squibb)、BMS-188797(Bristol-Meyer-Squibb)、BMS-275183(Bristol-Meyer-Squibb)、奥塔他赛(ortataxel)(也被称为IDN5109、BAY 59-8862或SB-T-101131；Bristol-Meyer-Squibb)、RPR 109881A(Bristol-Meyer-Squibb)、RPR116258(Bristol-Meyer-Squibb)、NBT-287(TAPESTRY)、PG-紫杉醇(也被称为CT-2103、PPX、聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex/paclitaxel polyglutamate)或XyotaxTM)、(也称为Nab-紫杉醇；ABRAXIS BIOSCIENCE)、替司他赛(Tesetaxel)(也被称为DJ-927)、IDN5390(INDENA)、他索瑞新(Taxoprexin)(也被称为二十二碳六烯酸-紫杉醇；PROTARGA)、DHA-紫杉醇(也被称为)和MAC-321(WYETH)。也参见Hennenfent&Govindan(2006,Annals of Oncology,17,735-749)的评述。
待治疗的癌症或肿瘤
术语“癌症”、“癌性”或“恶性”是指或描述哺乳动物的生理病状，其典型特征为不受调节的细胞生长。癌症的实例包括例如白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、癌和肉瘤。
这些癌症的更具体的实例包括慢性髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病(Ph+ALL)、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子宫颈癌、胃癌(stomach cancer)、膀胱癌、肝癌(hepatocarcinoma)、乳腺癌、结肠癌和头颈癌、胃癌(gastric cancer)生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病、肥大细胞增多症和任何与肥大细胞增多症相关的症状。
“白血病”是指血液形成器官的进行性恶性疾病，并且通常特征为血液和骨髓中白细胞和其前体的异常增殖和产生。白血病一般根据以下特征进行临床分类：(1)疾病的持续时间和特征-急性或慢性；(2)涉及的细胞类型：髓细胞(骨髓性)、淋巴细胞(淋巴性)或单核细胞；和(3)血液中异常细胞数量的增加或不增加-白血性或非白血性(亚白血病)。白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性前髓细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病(aleukemicleukemia)、白细胞不增多性白血病(aleukocythemic leukemia)、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎型白血病、嗜酸细胞性白血病、格罗斯氏白血病(Gross'leukemia)、毛细胞白血病、血母细胞性白血病(hemoblasticleukemia)、成血细胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴细胞性白血病(lymphaticleukemia)、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemia)、淋巴原性白血病、淋巴样性白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小骨髓母细胞性白血病、单核细胞性白血病、骨髓母细胞性白血病、髓细胞性白血症、髓细胞粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病(Naegeli leukemia)、浆细胞白血病(plasma cell leukemia)、浆细胞性白血病(plasmacytic leukemia)、早幼粒细胞性白血病、里德尔细胞白血病(Rieder cell leukemia)、席林氏白血病(Schilling's leukemia)、干细胞白血病、亚白血病性白血病和未分化细胞白血病。在某些方面，本发明提供慢性髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病和/或费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病(Ph+ALL)的治疗。
本发明范畴还涵盖各种癌症，包括但不限于以下癌症：癌，包括膀胱癌(包括快速和转移性膀胱癌)、乳腺癌、结肠癌(包括结直肠癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括小和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、直肠癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、食道癌、胃癌、胆囊癌、子宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴系的造血肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、毛细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤(Burketts lymphoma)；髓细胞系的造血肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤(schwannomas)；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其它肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮病(xenodermapigmentosum)、角化棘皮瘤(keratoactanthoma)、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌；黑素瘤、不可切除的III或IV期恶性黑素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(renal cancer)、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(kidney cancer)、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌(hepatocarcinoma)、乳腺癌、结肠癌和头颈癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、生殖细胞肿瘤、骨癌、骨肿瘤、成人恶性纤维状骨组织细胞瘤；儿童恶性纤维状骨组织细胞瘤、肉瘤、小儿肉瘤；骨髓增生异常综合征；神经母细胞瘤；睾丸生殖细胞肿瘤、眼内黑素瘤、骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、滑膜肉瘤。
在本发明的一个优选实施方式中，所述癌症为实体肿瘤。例如，所述癌症可以是肉瘤和骨肉瘤，诸如卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcome)、AIDS相关的卡波西氏肉瘤、黑素瘤，特别是葡萄膜黑素瘤(ulveal melanoma)；以及头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、肝胆道癌、子宫癌、阑尾癌和子宫颈癌、睾丸癌、胃肠癌以及子宫内膜癌和腹膜癌。优选地，所述癌症可以为肉瘤、黑素瘤，特别是葡萄膜黑素瘤(ulveal melanoma)，以及头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠直肠癌、肝癌、子宫颈癌以及子宫内膜癌和腹膜癌。
本发明描述的药物组合物和产品、试剂盒或组合制剂可以适用于抑制实体肿瘤的生长，减小肿瘤体积，防止肿瘤的转移扩散和微转移的生长或发展。本发明描述的药物组合物和产品、试剂盒或组合制剂特别适用于治疗不良预后患者或具有放射性或化疗抗性肿瘤的患者。
在一个特定实施方式中，所述癌症为高级或晚期癌症或为转移性癌症。
在另一个特定实施方式中，所述癌症不缺乏同源重组修复或同源重组修复未受损(例如，不是BRCA突变，也不是BRCAness)。
方案、剂量和施用途径
用于本发明组合制剂中的每种组合搭配物的有效剂量可以依据所用的特定化合物或药物组合物、施用模式、所治疗的病状、所治疗病状的严重性而变化。因此，本发明组合制剂的给药方案根据多种因素来选择，所述因素包括施用途径和患者状态。普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开出预防、对抗或延缓病状发展所需的有效量的单一活性成分。最精确地使活性成分的浓度在产生功效而没有毒性的范围内需要基于活性成分对目标位点的可达性的动力学的方案。
本发明更具体地涉及一种药物组合物、试剂盒、产品或组合制剂，其中PARP抑制剂的量或剂量可以低于其单独使用时的量或剂量。实际上，与其说Dbait分子与PARP抑制剂的组合至少产生加和作用，还不如说产生了两种活性成分的明显的协同作用。这种增强作用使得可减少PARP抑制剂的量，PARP抑制剂通常对正常细胞表现出毒性，因此可以与副作用相关。Dbait分子有利地展现最小的毒性，甚至没有毒性。然后，使用本发明的组合治疗，有可能保持治疗功效，或甚至改善治疗功效，同时降低其副作用，特别是PARP抑制剂的副作用。
或者，不是降低PARP抑制剂的量或剂量，而是可以降低PARP抑制剂的施用频率或其治疗时间。
根据一个实施方式，本发明涉及如上文所公开的治疗癌症的方法、药物组合物、产品、试剂盒或组合制剂，其中组合制剂中如本文中所公开的核酸分子和PARP抑制剂的量使得两种活性成分的组合治疗作用是加和性或优选地协同性的。
术语“协同”治疗作用是指所获得的组合的治疗作用大于各搭配物单独治疗作用的加和(即，大于单独的如本文中所公开的核酸分子的作用加上单独的PARP抑制剂的作用)。
术语“加和”治疗作用是指所获得的组合的治疗作用为各搭配物单独治疗作用的加和(即，等于单独的如本文中所公开的核酸分子的作用加上单独的PARP抑制剂的作用)。
本发明涉及如上文所公开的治疗癌症的方法、药物组合物、产品、试剂盒或组合制剂，其中PARP抑制剂的使用剂量低于其单独使用时对于相同适应症和相同施用途径的化学疗法中所用的常规剂量(即等于或优选低于常规化学疗法中所用量的量)，在本文中也被称为亚治疗量。更具体地，所述量可以为常规治疗剂量(特别是对于相同适应症和相同施用途径)的例如90、80、70、60、50、40、30、20或10％。常规治疗剂量是药物批准机构(例如FDA或EMEA)承认的剂量。在这方面，本发明涉及如上文所公开的治疗癌症的方法、药物组合物、产品、试剂盒或组合制剂，其中PARP抑制剂的量以亚治疗剂量使用，并且如本文中所公开的核酸分子的量使得两种活性成分的组合治疗作用是加和性或更优选地协同性的。
本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包含施用协同治疗有效量的(a)如本文中所公开的核酸分子与(b)PARP抑制剂的组合制剂。
本发明还涉及一种协同组合，其包含同时、分别或依序使用的协同性比率的(a)如本文中所公开的核酸分子和(b)PARP抑制剂，特别是用于治疗癌症。
在一个特定实施方式中，如本文中所公开的核酸分子是如上文所定义的DT01，并且PARP抑制剂选自AZD2281(奥拉帕尼)、ABT888(维利帕尼)、BMN673、BSI-21(英利帕尼)、AZD 2461、MK-4827(尼拉帕尼)和AG 014699(鲁卡帕尼)，更优选AZD2281(奥拉帕尼)或ABT888(维利帕尼)。
术语“协同治疗有效量”或“协同性比率”是指组合的治疗作用大于各搭配物单独治疗作用的加和(即，大于单独的如本文中所公开的核酸分子的治疗作用加上单独的PARP抑制剂的治疗作用)。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含联合治疗有效对抗癌症的量的本发明的组合和至少一种药学上可接受的载体。
在本发明的一个特定实施方式中，协同组合使得PARP抑制剂以亚治疗量使用或施用。具体地，PARP抑制剂的亚治疗量小于以单一药物形式(即，不与另一种药物组合)用于治疗癌症的常规剂量。更具体地，亚治疗量可以为对于相同适应症和相同施用途径的常规治疗剂量的例如90、80、70、60、50、40、30、20或10％。常规治疗剂量是药物批准机构(例如FDA或EMEA)承认的剂量并且可以在参考文献中找到。
确定一种或多种组分之间的加和或协同相互作用、最适作用范围和各组分获得该作用的绝对剂量范围可以通过向需要治疗的患者施用不同w/w比率范围和剂量的组分来确定地测量。对于人类来说，对患者进行临床研究的复杂性和成本可能使得使用这种形式的测试作为协同作用的主要模式不切实际。然而，对一个物种中协同作用的观察可以预测在其它物种中的作用，并且存在用于测量协同作用的动物模型，并且这些研究的结果也能够用于通过使用药代动力学/药效动力学方法预测其它物种中所需的有效剂量和血浆浓度比率范围以及绝对剂量和血浆浓度。癌症模型与在人体中观察到的作用之间的相关性表明观察到的对动物模型的协同作用也可以预测对人的协同作用。
例如，可以在临床研究中或更优选地在测试程序中展示本发明组合的药理学活性。适合的临床研究例如为晚期肿瘤患者的开放标签非随机化剂量递增研究。这些研究可以证明本发明组合的活性成分的加和或协同作用。对增殖性疾病的有益作用可以直接通过这些研究的结果或通过本领域技术人员已知的对研究设计进行变化来确定。这些研究特别适合于比较使用活性成分的单一疗法与本发明组合的作用。优选地，组合搭配物(a)以固定剂量施用，并且逐步增加组合搭配物(b)的剂量直到达到最大耐受剂量。或者，组合搭配物(b)以固定剂量施用，并且逐步增加组合搭配物(a)的剂量直到达到最大耐受剂量。
如本文中所公开的核酸分子的施用途径可以为口服、肠胃外(parental)、静脉内、肿瘤内、皮下、颅内、动脉内、局部、直肠、经皮、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、骨内等。在一个优选实施方式中，在待治疗的肿瘤位点附近施用或注射Dbait分子。在另一个特定实施方式中，当待治疗的癌症是黑素瘤时，可以通过皮下和静脉内注射来传递如本文中所公开的核酸分子。另一种优选施用途径为肿瘤内注射。
当DNA损伤性抗肿瘤剂与如本文中所公开的核酸分子和PARP抑制剂组合使用时，DNA损伤性抗肿瘤剂、如本文中所公开的核酸分子和PARP抑制剂可以通过相同途径或通过不同途径施用。DNA损伤性抗肿瘤剂的施用途径可以为口服、肠胃外、静脉内、肿瘤内、皮下、颅内、动脉内、局部、直肠、经皮、皮内、鼻内、肌肉内、骨内等。
如本文中所公开的核酸分子在照射和/或施用DNA损伤性抗肿瘤剂之前和/或同时和/或之后施用，更优选在照射和/或施用DNA损伤性抗肿瘤剂之前和/或同时施用。进行照射和/或DNA损伤性抗肿瘤剂的施用以使得如本文中所公开的核酸分子在施加照射时或当DNA损伤性抗肿瘤剂到达肿瘤细胞时存在于肿瘤细胞中。普通技术的医师、临床医生或兽医可以根据活性成分、其对目标位点的可达性或其在血浆中的药代动力学概况来确定方案。初步结果指示Dbait分子在一天内保持活性。
通过放射性疗法或用DNA损伤性抗肿瘤剂开始治疗后，可以继续用如本文中所公开的核酸分子治疗，只要将施加或施用通过放射性疗法或用DNA损伤性抗肿瘤剂进行的治疗即可。或者，用如本文中所公开的核酸分子进行的治疗也可以结束。
与PARP抑制剂组合使用的如本文中所公开的核酸分子的有效剂量可以依据施用模式、正在治疗的病状、正在治疗的病状的严重性而变化。因此，如本文中所公开的核酸分子的给药方案根据各种因素来选择，所述因素包括施用途径和患者状态。普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开出预防、对抗或延缓癌症发展所需的有效量的如本文中所公开的核酸分子。
例如，对于局部施用(例如当使用肿瘤内或皮下施用时)，Dbait分子的有效量为每1cm3肿瘤至少0.01mg，优选每1cm3肿瘤0.1-40mg，最优选每1cm3肿瘤1-20mg。可以在每日治疗方案(例如，每周5天连续3至6周，或每周3次连续3至6周)中施用有效量。或者，在例如连续3-6周的每周治疗方案中可以施用每1cm3肿瘤至少0.1mg、优选每1cm3肿瘤0.1-40mg、最优选每1cm3肿瘤1-20mg的有效量。当使用其它施用途径时，本领域技术人员可以调整量以便获得肿瘤中Dbait分子的有效量：每1cm3肿瘤至少0.01mg，优选每1cm3 0.1-40mg，最优选每1cm3肿瘤1-20mg，特别是在每日治疗方案或每周治疗方案中。例如，对于全身性途径，Dbait分子的有效量或单位剂量可以为0.1至100mg，优选4至40mg。因此，对于全身性途径，Dbait分子的有效量或单位剂量可以为患者的每千克0.06至0.6mg。当然，本领域技术人员可以考虑化学疗法和/或放射性疗法方案而调整剂量和方案。
对于放射性疗法，可以使用本领域中已知的任何放射性疗法方案，特别是立体定向照射(例如15Gy)或分次照射。使用分次照射可能特别有效，例如可以在一、二、三、四、五或六周的时间内每天或每2-5天、优选每3-4天施加照射。照射可以为1至10Gy，优选2至5Gy，特别是2、3、4或5Gy。例如，可以考虑在六周内分次照射15×2Gy，或在两周内分次照射4至6×5Gy。在一个优选实施方式中，考虑的放射性疗法是在两周内进行4次5Gy照射的方案。已经测试了用照射和Dbait分子组合治疗癌症的不同方案或条件，并且可以显示Dbait分子对肿瘤的放射敏化取决于Dbait分子的剂量而不是照射剂量。
对于化学疗法，用于本发明的组合制剂、试剂盒或产品或与本发明组合物组合使用的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效剂量可以依据所用的特定DNA损伤性抗肿瘤剂、施用模式、正在治疗的病状、正在治疗的病状的严重性而变化。因此，DNA损伤性抗肿瘤剂的给药方案根据各种因素来选择，包括施用途径和患者状态。普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开出预防、对抗或延缓癌症发展所需的有效量的DNA损伤性抗肿瘤剂。
治疗可以包括一个或数个循环，例如二至十个循环，特别是二、三、四或五个循环。循环可以为持续或分隔的。例如，各循环之间相隔一至八周的时间，优选三至四周。
在以下实施例中将描述本发明的其它方面和优势，这些实施例应被认为是说明性的而非限制性的。
实施例
实施例1
对细胞存活率的体内测试
发明者测试了DT01与奥拉帕尼或维利帕尼的组合对细胞存活率的作用。更具体地，结果如图1所示。
将乳腺癌细胞系MDAMB231用100μg/ml(黑色正方形)或333μg/ml(灰色叉)DT01或不用DT01(黑色菱形)处理，并暴露于0、0.1和1μM的奥拉帕尼(上图)或1、10和50μM维利帕尼(下图)。处理后6天使用锥虫蓝检测活细胞来测量存活率。数据以未处理对照的％表示。DT01的独立作用使得在暴露于100和333μg/ml后产生88％和49％的存活率。添加PARP抑制剂(奥拉帕尼或维利帕尼)显著提高了细胞死亡率(实线)。用组合处理产生的存活率低于两种单一处理的预期加和作用(虚线)，揭示在每个测试剂量的DT01和PARP抑制剂的情况下存在协同作用。
因此，PARP抑制剂与Dbait分子的组合显示高于单一处理作用预期加和的抗肿瘤作用。在每个剂量的各药物的情况下都观察到这种超加和性。在Dbait家族与所有PARP抑制剂的组合的情况下都观察到该超加和性。实际上，奥拉帕尼属于PARP抑制剂(ii)型，而维利帕尼属于(ii)型。因此所观察到的协同作用不取决于抑制机制。
发明者测试了组合对数种不同细胞系的作用。结果如图2所示。
在不同肿瘤细胞(来自子宫颈癌、胶质母细胞瘤、血癌、乳腺癌)和两个非肿瘤的乳腺细胞中监测暴露于0.1μM奥拉帕尼(黑色)、100μg/ml DT01(灰色)或两种处理0.1μM奥拉帕尼+100μg/ml DT01(影线)的细胞的存活率。该图的下图中指示DNA修复的主要突变。
在所有细胞系中，无论有何种修复缺陷(BRCA-/-，同源重组缺陷；DNA-PKcs-/-，非同源末端接合缺陷)，均观察到组合的超加和作用。只有缺乏PARP活性的细胞(HelaPARP1KO)对组合没有反应，因为其对PARP抑制剂不敏感。已知对奥拉帕尼具有抗性的癌细胞系诸如Hela、MO59K、MO59J、Hut7、IM9、MD231和BC173，显示组合处理的超加和作用。非肿瘤细胞对单一和组合处理都不敏感。
材料和方法
使人类细胞系在补充有10％胎牛血清(ATGC,Orléans,France)、1％丙酮酸钠、链霉素(100mg.mL-1)和青霉素(100mg.mL-1)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)的完全RPMI(Gibco,CergyPontoise,France)中生长。将细胞维持在37℃、5％CO2氛围、100％湿度下。通过在时间零点在不含血清的培养基中添加核苷酸(DT01等)或/和PARP抑制剂进行处理。处理开始后24小时用含有胎牛血清的新鲜培养基更换培养基。使细胞再生长4天(处理后5天)，用胰蛋白酶处理并计数总细胞数。添加锥虫蓝(0.4％)来计数群体中的活细胞(未着色)。
对肿瘤生长的体内测试
通过肿瘤内施用DT01(5mg/天)和奥拉帕尼(200mg/kg/天)处理脂肪垫中移植有异种移植的MD227人类乳腺癌细胞系的裸鼠。监测肿瘤生长(时间零点：处理开始时)。每组处理八至十只动物(组1：载体注射(灰色线)；组2：DT01(黑色虚线)；组3：奥拉帕尼(灰色虚线)；组4：DT01+奥拉帕尼(黑色线))。在后面的5天进行处理。结果如图3所示，并且展示与单独用奥拉帕尼或单独用DT01处理的动物相比，肿瘤尺寸减小。
材料和方法
通过将4.106个肿瘤细胞注射到成年雌性裸鼠(Janvier,Le Genest Saint Isle,France)的脂肪垫中获得人类乳腺癌异种移植肿瘤。在开始实验之前，将动物饲养在实验室中至少1周。在亮和暗循环(12小时:12小时)、相对湿度(55％)和温度(21℃)的控制条件下，每笼有6只动物。食物和自来水可随意获得。当皮下肿瘤达到约125mm3时，将小鼠均分到各组来接受不同的处理方案：未处理(NT)，单独用DT01处理1周(每天2.5mg肿瘤内和2.5mg皮下处理，持续5天)，单独用奥拉帕尼(200mg/kg/天)处理1周(每天口服5次)和组合处理DT01+奥拉帕尼1周(每天5次)。在所有实验中，每隔2-3天用数字卡尺测量肿瘤。未发现局部皮肤毒性或全身毒性。使用下式计算肿瘤体积：长度×宽度×宽度/2。每周称重小鼠，并且追踪280天。出于伦理原因，当肿瘤达到1500mm3时将动物牺牲。地方动物实验伦理委员会批准了所有实验。
实施例2
发明者分析了两类DNA修复抑制剂的组合作用，并展示处其结合在所有细胞中模拟了合成致死。他们比较了DBait(AsiDNA)和PARP抑制剂(奥拉帕尼)在12种乳腺癌细胞系中的功效。在信号网络图的情况下解释的对来自这些细胞系的多级组学数据的分析突出了与对DBait或奥拉帕尼的敏感性相关的不同DNA修复分子概况，从而合理化组合处理。在20种肿瘤细胞系中证实了DBait和奥拉帕尼组合处理的超加和作用，其中对非肿瘤细胞没有显著细胞毒性。分子分析展示奥拉帕尼和DBait分别防止在损伤位点募集XRCC1和RAD51/53BP1修复酶，并且在组合时具有累积作用。在组合DBait与其它PARP抑制剂时也观察到处理协同作用。本发明的结果突出了组合DBait与PARP抑制剂在所有肿瘤中重现合成致死的治疗益处。
发明者首先在一组乳腺癌(BC)细胞系中分析了对奥拉帕尼(Ola)和DBait的敏感性。BC是最常见的女性恶性肿瘤，每年全世界诊断的新病例超过170万。在所有散发性BC肿瘤中有8.8％观察到BRCA失活突变，其中在基底样/三阴性亚群中发病率为30％。他们使用了一组具有不同BRCAness状态的BC细胞系，并且首先独立分析了其对PARPi奥拉帕尼(Ola)和DBait的敏感性。将BC细胞系根据其对DBait或Ola的敏感性分类。在综合信号网络图的情况下对来自这些细胞系的多级组学数据的分析鉴别了与DBait或Ola的敏感性相关的不同分子概况，特别是在DNA修复机制中，从而突出了组合这两种药物的益处。不管BRCAness状态如何，发明者都在BC细胞系中观察到Ola和DBait的协同作用，并展示这种组合在多种癌细胞类型中并在与不同PARP抑制剂组合的情况下都是有效的。
结果
BC细胞系显示对AsiDNA和奥拉帕尼具有不同敏感性
通过测量包括4BRCA突变细胞系的12种BC细胞系中的细胞死亡率和增殖来评估Ola和AsiDNA的功效(图4A和图B和图5)。此外，将BRCA1或BRCA2基因沉默的HeLa细胞用作BRCA突变因子的对照，并将3种永生化乳腺细胞系(MCF10A、MCF12A和184B5)用作非肿瘤对照。基于BC227BRCA2-/-突变体中75-80％的存活率选择药物浓度(对于Ola为0.1μM，并且对于AsiDNA为4.8μM)。在所有BC细胞系中，细胞相对数目的减少与细胞死亡率增加相关(图4A、图5)，指示活细胞的数目反映了细胞毒性而不是细胞抑制作用。Ola和AsiDNA处理对三种对照非肿瘤细胞系没有作用。相比之下，肿瘤细胞系揭示对于Ola，存活率为100％至5％，对于AsiDNA，存活率为100％至60％。所有BRCA-/-细胞系都对两种处理敏感。在BRCA正常的肿瘤细胞系中，MDAMB468对两种处理都敏感，BC173和HCC1143仅对AsiDNA敏感，并且HCC1187仅对Ola敏感。在这些剂量下，BT20、MDAMB231、MCF7和HCC70对两种处理都具有抗性(图4A、图4B和图5)。对AsiDNA的反应与对Ola的反应之间的相关分析揭示不显著相关(斯珀曼系数(Spearman coefficient)r＝0.33，并且P值：0.17)。这些结果指示BRCA缺乏是充分的，但不是AsiDNA或Ola功效所必要的，并且表明不同的修复缺陷决定了对这些药物的敏感性。
用AsiDNA和奥拉帕尼组合处理在BC细胞系中展示超加和功效
发明者监测组合处理对单独的Ola和AsiDNA具有不同敏感性的3种BC和2种非肿瘤细胞系产生的细胞存活率(图6；表1)。Ola和AsiDNA单一处理的功效具有剂量依赖性(图7)。然而，在所有测试剂量下，组合仍然更有效或至少等于预期的加和作用。有趣的是，不管对单一处理的敏感度如何，在三种癌症模型中，用组合处理产生的存活率都是超加和的。将AsiDNA的剂量增加到16μM对组合处理没有显著影响，但其显著增加了AsiDNA单一处理的作用。相比之下，正常细胞对使用AsiDNA和Ola的组合和单一处理两者都不敏感(图6；表1)。
表1单一和组合处理在各种癌症类型中的功效。
所用浓度为4.8μM AsiDNA和0.1μM Ola。计算的加和＝用AsiDNA产生的存活率×用Ola产生的存活率。
AsiDNA与奥拉帕尼的组合的分子机制
为了解析这种细胞毒性协同作用，发明者检查了AsiDNA、Ola或两者对DNA修复活性的作用。他们首先检查了各分子不影响其它分子抑制其靶向修复酶募集的能力。正如所料，Ola显著延缓了XRCC1位点募集，而AsiDNA没有。在AsiDNA存在和不存在的情况下，用Ola处理的细胞中XRCC1的募集都被类似地延缓(图8)。通过组蛋白H2AX的泛核磷酸化可以容易地揭示AsiDNA对DNA-PK激酶活性的活化。在存在或不存在Ola的情况下都观察到了这种磷酸化(图9A、图9C)。认为H2AX的泛核磷酸化参与AsiDNA对HR和NHEJ修复酶募集的抑制。照射后，我们观察到在有和没有Ola的情况下，AsiDNA处理的细胞中53BP1位点都减少(图10)。在不存在DNA损伤性处理的情况下，Ola诱导DSB累积，这通过形成与53BP1和Rad51位点共局部化的γH2AX位点揭示(图9A、图9B)。添加AsiDNA显著减少了由Ola诱导的53BP1或Rad51位点的形成(图9A、图9B)。为了展示AsiDNA之后Rad51和53BP1位点的减少是通过抑制其在损伤位点募集而不是通过减少DNA损伤的数量来诱导的，发明者使用单细胞碱性彗星分析来监测进行不同处理后MDAMB231肿瘤中的损伤。如γH2AX位点所表明，Ola处理经过24小时诱导损伤累积，而AsiDNA没有(图9E)。将AsiDNA与Ola组合使得Ola诱导的DNA损伤增加两倍。这种增加可以解释所述组合在MDAMB231细胞中的有效毒性。相比之下，在MCF10A非肿瘤细胞中，即使Ola处理后观察到DNA损伤略有增加，将AsiDNA与Ola组合也不会增加损伤累积(图9C、图9D和图9F)。
AsiDNA增加了奥拉帕尼在其它癌细胞系中的疗效
为了判定AsiDNA与Ola的组合的功效是否不限于BC，发明者分析了不同癌细胞系的敏感性，包括胶质母细胞瘤、子宫颈癌、结肠癌、血癌和黑素瘤。所有肿瘤模型都显示药物组合的超加和功效(表1)。此外，针对单一和组合处理对DNA修复突变体的等基因对进行分析指示AsiDNA对于具有一个修复缺陷(PARP1、BRCA1、BRCA2、Ku70、DNA-PKcs)的所有突变体都具有高细胞毒性，而Ola敏感性基本上限于BRCA突变体(表1)。在DT40鸡淋巴瘤修复突变体的等基因组中证实了PARP1、BRCA和Ku70突变体对AsiDNA的敏感性(图11A)。发明者还检查了所述组合处理在与MDAMB231、BC173和BC227相比对单一处理具有不同反应概况的三种其它BC细胞系(MDAMB468、HCC1187和HCC38)中的作用(表1)。在这三种BC细胞系中也观察到AsiDNA与Ola之间的协同作用。在来源于实体肿瘤的细胞系中，只有Hela-PARP1沉默细胞没有从所述组合中获益，因为在Ola处理后没有观察到对AsiDNA的敏感性增加。令人惊讶的是，Hut78和Jurkat血液肿瘤T细胞对组合处理的存活率接近两种单一处理的计算的加和作用(表1)。由于两种细胞系都对单一处理敏感，所以缺乏加和性似乎与特定的DNA修复缺陷无关。综上所述，这些结果指示组合处理AsiDNA/Ola的效率不限于BC，并且AsiDNA使所有细胞系对Ola敏感而与其BRCA状态无关。
AsiDNA与所有PARP抑制剂都能产生超加和功效
PARP抑制剂属于至少两类：抑制PARP酶活性的催化抑制剂，以及阻断PARP酶活性并将PARP蛋白捕获在DNA损伤位点上的双重抑制剂。Ola属于第二组，而维利帕尼(Veli)仅为催化抑制剂。因此，发明者使用Veli代替Ola重复了在一系列BC系中的功效分析(图12)。在三种BC细胞系中使用Veli观察到了组合处理的协同作用，但是这种作用在非肿瘤细胞中不存在。这指示将PARP捕获在DNA上对于有效组合不是必需的。在DT40淋巴瘤细胞中也观察到类似结果(图11B)。
发明者使用开发用于临床应用的5种其它PARPi(鲁卡帕尼、英利帕尼、尼拉帕尼、AZD2461和BMN673)监测了组合处理在MDAMB231细胞中的功效(图13)。选择产生亚致死作用的PARPi施用剂量和产生50％存活率的剂量(表2)。证实了对于所有抑制剂，PARPi与AsiDNA组合都具有超加和功效，而与抑制剂的作用机制无关(图13)。这些结果展示出观察到的协同作用是普遍的，而不仅限于奥拉帕尼。
表2
材料和方法
细胞培养、化学品和AsiDNA分子
用如下细胞进行细胞培养：4种缺乏BRCA1的BC细胞系(来自Institut Curie的BC227，来自ATCC的HCC1937、HCC38和MDAMB436)；8种BRCA1正常的BC细胞系(来自InstitutCurie的BC173，来自ATCC的BT20、HCC1143、HCC1187、HCC70、MCF7、MDAMB231和MDAMB468)；3种非肿瘤乳腺细胞系(来自ATCC的184B5、MCF10A和MCF12A)；5种人类子宫颈癌海拉(HeLa)细胞系：BRCA1沉默的人类子宫颈癌海拉细胞系(HelaBRCA1SX，Tebu-Bio称为00301-00041)、BRCA2沉默的人类子宫颈癌海拉细胞系(HelaBRCA2SX，Tebu-Bio参考为00301-00028)、PARP1沉默的人类子宫颈癌海拉细胞系(HeLaPARP1KD，Vincent Pennanaech,Institut Curie,France的慷慨馈赠)和对照(HeLaCTLSX，Tebu-Bio01-00001，和HeLaCTLKD，Vincent Pennanaech,Institut Curie,France的慷慨馈赠)；人类胶质母细胞瘤细胞系MO59K和MO59J(缺乏DNA-PKcs)；人类黑素瘤细胞系SK28LshCTL和SK28LshDNA-PKcs；人类结肠直肠癌细胞系HCT116WT和HCT116KU70+/-(KU70基因的杂合子)；人类头颈癌细胞系Hep2；肿瘤血细胞Hut78、IM9和Jurkat。根据供应者的说明书使细胞生长。将细胞系维持在37℃下5％CO2的潮湿氛围中。
DT40伯基特淋巴瘤细胞是如之前在Murai等人(2012,Cancer Res,72,5588-99)中所述的敲除不同基因的鸡细胞。对于本研究，发明者使用DT40野生型细胞作为对照(DT40WT)以及分别敲除BRCA1、KU70、TDP1和PARP1基因的4种细胞系(DT40BRCA1KO、DT40KU70KO、DT40TDP1KO和DT40PARP1KO)。在37℃下，在5％CO2存在下，将DT40细胞在补充有1％鸡血清(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)、10-5Mβ-巯基乙醇、青霉素、链霉素和10％胎牛血清(FBS)的Roswell Park Memorial Institute(RPMI-1640)培养基中培养。用于细胞培养的试剂从Gibco Invitrogen获得。
所有PARP抑制剂AZD-2281(奥拉帕尼)、AZD-2461、ABT888(维利帕尼)、MK-4827(尼拉帕尼)、BSI-201(英利帕尼)、BMN673(他唑帕尼)和AG-014699(鲁卡帕尼)购自Medchemexpress(Princeton,USA)，并用DMSO稀释至10mM的储备浓度。
DBait分子(AsiDNA)为通过自动固相寡核苷酸合成方法(Agilent,USA)制备的短双链32碱基对寡核苷酸。序列为：5'XGCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-L'-TCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTGGGCACAGC-3'，其中L'为1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，并且带下划线的字母为磷二酰胺核苷。胆固醇基四乙二醇(X)连接在5'端。
测量细胞对药物的敏感性
通过相对存活率和细胞死亡率定量来测量AsiDNA或PARPi细胞毒性。将粘附细胞以适当的密度接种在24孔培养板中，并在37℃下培育24小时，接着添加AsiDNA和/或PARPi。处理后第6天收获细胞，用0.4％锥虫蓝(Sigma Aldrich,Saint-Louis,USA)染色并用Burker室计数。细胞存活率以活处理细胞与活假处理细胞的比率的形式计算。细胞死亡率以计数的细胞总数中的死细胞数的形式计算。毒性的加和通对AsiDNA的细胞存活率和对PARPi的细胞存活率的乘积来计算。
为了测量DT40鸡淋巴瘤修复突变体中的细胞毒性(Murai等人,2012,Cancer Res,72,5588-99)，将750个细胞在37℃下接种在来自Perkin Elmer Life Sciences(Waltham,MA,USA)的96孔白板中(最终体积150微升/孔)的培养基中，所述培养基含有或不含指示浓度的药物(AsiDNA和/或维利帕尼)。72h后，用ATPlite 1步试剂盒(PerkinElmer,Waltham,MA,USA)一式三份地分析细胞。简言之，将ATPlite溶液添加到各孔(对于DT40细胞为150μl)中。处理5分钟后，通过来自Perkin Elmer Life Sciences(Waltham,MA,USA)的Envision2104Multilabel Reader测量发光强度。将未处理细胞的信号强度设定为100％。
抗体和免疫学研究
为了进行免疫染色，将MDAMB231细胞以5×105个细胞的浓度接种在盖玻片(Menzel,Braunschweig,Germany)上并在37℃下培育1天。接着用16μM AsiDNA+/-1μM奥拉帕尼处理细胞。处理后24h，将细胞在4％多聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水(PBS 1×)中固定20min，在0.5％Triton X-100中透化10min，用2％牛血清白蛋白/PBS 1×阻断并在4℃下与初级抗体一起培育1h。在室温(RT)下，以1/200稀释率使用所有次级抗体45min，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)将DNA染色。使用以下抗体：初级单克隆小鼠抗磷酸-H2AX(Millipore,Guyancourt,France)、抗53BP1兔抗体(Cell signaling technology,Danvers,USA)、抗Rad51兔抗体(Merk Millipore,Darmstadt,Allemagne)、与Alexa-633结合的次级山羊抗小鼠IgG(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)和与Alexa-488结合的次级山羊抗兔IgG(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)。
碱性单细胞电泳“彗星分析(COMET Assay)”
将用AsiDNA(16μM)、奥拉帕尼(1μM)或两者处理的细胞悬浮在0.5％低熔点琼脂糖的DMEM中，并转移到预涂有0.5％正常熔点琼脂糖层的磨砂玻璃显微镜载玻片上。将载玻片在4℃下在裂解溶液[2.5mol/L NaCl、100mmol/L EDTA、10mmol/L Tris、1％月桂基肌氨酸钠、10％DMSO、1％Triton X-100(pH10)]中浸渍1h，置于含有0.3mol/L NaOH(pH 13)和1mmol/L EDTA的电泳槽中40min，在25V(300mA)下电泳25min，用中性缓冲液[400mmol/LTris-HCl(pH 7.5)]洗涤，并用20Ag/mL溴化乙锭染色。使用软件彗星分析2(PerceptiveInstrument)来定量“彗星”的变量。对于每个实验点处理三个载玻片。将尾力矩定义为尾部DNA的百分比与彗星头部与尾部之间的位移的乘积。
统计分析
所有统计分析均采用双尾学生t检验(Student's t-test)进行。
序列表
<110> 法国居里学院等
<120> Dbait分子与PARP抑制剂的组合用于治疗癌症的用途
<130> B2068EP
<160> 21
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Dbait32
<400> 1
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<223> 环L' =六乙二醇、四脱氧胸苷酸或2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷
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<223> 注意=“在互补链的3'端，最后三个核苷酸具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架”
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<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> mod_base= 硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架
<220>
<221> stem_loop
<222> (1)..(32)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> 环L' =六乙二醇、四脱氧胸苷酸或2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷
<400> 17
cgtaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子IIIc
<220>
<221> misc_feature
<223> 注意=“在互补链的3'端，最后三个核苷酸具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架”
<220>
<221> misc_feature
<223> 注意=“互补链3'端的最后一个核苷酸连接于Lm =甲酰胺基寡聚乙二醇+ C =单链或双链脂肪酸、胆固醇、糖、肽或蛋白质”
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> mod_base= 硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架
<220>
<221> stem_loop
<222> (1)..(32)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> 环L' =六乙二醇、四脱氧胸苷酸或2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷
<400> 18
gctaggcttg tttgctgggt tgtaggcaca gc 32
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子IIId
<220>
<221> misc_feature
<223> 注意=“在互补链的3'端，最后三个核苷酸具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架”
<220>
<221> misc_feature
<223> 注意=“互补链3'端的最后一个核苷酸连接于Lm =甲酰胺基寡聚乙二醇+ C =单链或双链脂肪酸、胆固醇、糖、肽或蛋白质”
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> mod_base= 硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架
<220>
<221> stem_loop
<222> (1)..(32)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> 环L' =六乙二醇、四脱氧胸苷酸或2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷
<400> 19
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子IIIe
<220>
<221> misc_feature
<223> 注意=“在互补链的3'端，最后三个核苷酸具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架”
<220>
<221> misc_feature
<223> 注意=“互补链3'端的最后一个核苷酸连接于Lm = 甲酰胺基寡聚乙二醇 + C =单链或双链脂肪酸、胆固醇、糖、肽或蛋白质”
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> mod_base= 硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架
<220>
<221> stem_loop
<222> (1)..(32)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> 环L' =六乙二醇、四脱氧胸苷酸或2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷
<400> 20
gctaggtctg tttggtggct ttgcagtggc ac 32
<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸分子DT01
<220>
<221> misc_feature
<223> 注意=“在互补链的3'端，最后三个核苷酸具有硫代磷酸酯骨架”
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 在5'端，10-O-[1-丙基-3-N-氨甲酰基胆固醇基]-三乙二醇基
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> mod_base= 硫代磷酸酯骨架
<220>
<221> stem_loop
<222> (1)..(32)
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> 环L' = 2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷
<400> 21
gctgtgccca caacccagca aacaagccta ga 32

Claims (14)

1.一种药物组合物，其包含核酸分子和PARP抑制剂，其中所述核酸分子具有下式中的一者：
其中N为脱氧核苷酸，n为1至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L'为连接基团，C为促进胞吞的分子，所述促进胞吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使得能够进行受体介导的胞吞的配体，L为连接基团，m和p独立地为整数0或1。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
3.一种试剂盒，其以组合制剂形式包含同时、分开或依序使用的PARP抑制剂和核酸分子，特别是用于治疗癌症，其中所述核酸分子具有下式中的一者：
其中N为脱氧核苷酸，n为1至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L'为连接基团，C为促进胞吞的分子，所述促进胞吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使得能够进行受体介导的胞吞的配体，L为连接基团，m和p独立地为整数0或1。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，根据权利要求2所述的供使用的药物组合物或根据权利要求3所述的试剂盒，其中式(I)、(II)或(III)的分子具有以下特征中的一个或数个：
-n为23至195或27至95的整数，和/或
-N为选自A(腺嘌呤)、C(胞嘧啶)、T(胸腺嘧啶)和G(鸟嘌呤)的脱氧核苷酸，并且N被选择成避免出现CpG二核苷酸并与人类基因组中的任何基因具有小于80％的序列同一性；和/或
-连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m为1，并且L为甲酰胺基聚乙二醇，更优选甲酰胺基三乙二醇或甲酰胺基四乙二醇；和/或
-C选自胆固醇；单链或双链脂肪酸，诸如十八烷基、油酸、二油酰基或硬脂酸；或靶向细胞受体的配体(包括肽、蛋白质、适体)，诸如叶酸；生育酚；糖，诸如半乳糖和甘露糖以及其寡糖；肽，诸如RGD和蛙皮素；以及蛋白质，诸如转铁蛋白和整联蛋白，优选为胆固醇或生育酚，更优选为胆固醇。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，根据权利要求2所述的供使用的药物组合物或根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述核酸分子具有下式中的一者：
其中带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，连接的L'选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸(T4)、1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷和2,19-双(磷酸)-8-hydraza-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；m为1，并且L为甲酰胺基寡聚乙二醇，C选自单链或双链脂肪酸如十八烷基和二油酰基、胆固醇、生育酚、叶酸、糖如半乳糖和甘露糖以及其寡糖、肽如RGD和蛙皮素以及蛋白质如整联蛋白，优选胆固醇。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，根据权利要求2所述的供使用的药物组合物或根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述核酸分子选自
7.根据权利要求1所述的药物组合物，根据权利要求2所述的供使用的药物组合物或根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述核酸分子为
8.根据权利要求1所述的药物组合物，根据权利要求2所述的供使用的药物组合物或根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述核酸分子为
其中C为胆固醇基，Lm为四乙二醇，p为1并且L'为1,19-双(磷酸)-8-hydraza-2-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
9.根据权利要求1和4至8任一项所述的药物组合物，根据权利要求2和4至8所述的供使用的药物组合物或根据权利要求3至8任一项所述的试剂盒，其中所述PARP抑制剂选自鲁卡帕尼(AG014699、PF-01367338)、奥拉帕尼(AZD2281)、维利帕尼(ABT888)、英利帕尼(BSI201)、尼拉帕尼(MK 4827)、他唑帕尼(BMN673)、AZD 2461、CEP 9722、E7016、INO-1001、LT-673、MP-124、NMS-P118、XAV939、其类似物、衍生物或混合物。
10.根据权利要求1和4至8任一项所述的药物组合物，根据权利要求2和4至8所述的供使用的药物组合物或根据权利要求3至8任一项所述的试剂盒，其中所述PARP抑制剂选自AZD2281(奥拉帕尼)、ABT888(维利帕尼)、BMN673、BSI-21(英利帕尼)、AZD 2461、MK-4827(尼拉帕尼)和AG 014699(鲁卡帕尼)。
11.根据权利要求2至10任一项所述的供使用的药物组合物或试剂盒，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、肉瘤、黑素瘤以及头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠直肠癌、肝癌和子宫颈癌。
12.根据权利要求11所述的供使用的药物组合物或试剂盒，其中所述癌症选自白血病、淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、头颈癌、乳腺癌、脑癌、结肠直肠癌和子宫颈癌。
13.根据权利要求2至12任一项所述的供使用的药物组合物或试剂盒，其中所述PARP抑制剂以亚治疗量使用。
14.根据权利要求2至12任一项所述的供使用的药物组合物或试剂盒，其中将所述PARP抑制剂和所述核酸分子与放射性疗法和/或用DNA损伤剂进行的抗肿瘤化学疗法组合使用。
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