CN103732746A - 通过将模拟双链断裂的dna分子与热疗相组合治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括模拟双链断裂的核酸分子的治疗与热疗的组合。

Description

通过将模拟双链断裂的DNA分子与热疗相组合治疗癌症
技术领域
本发明涉及肿瘤学领域。
背景技术
热疗是增强各种抗癌疗法的有效性的最早临床应用的药剂之一。热疗是其中将身体组织暴露于高温以损伤和杀死癌细胞或使癌细胞对辐射和某些抗癌药物（环磷酰胺、多柔比星、顺铂、依托泊苷、异环磷酰胺、吉西他滨、干扰素-α、长春新碱、卡铂、奥沙利铂……）的效应更加敏感的一种治疗。它一般不单独使用。其研究集中于许多癌症类型的治疗，包括肉瘤、黑色素瘤、头颈癌、脑癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、直肠癌、肝癌、宫颈癌和腹膜间皮癌。然而，热疗的准确作用方式仍然是难以捉摸的。
WO2010/082821和Krawczyk等（2011,Proc Natl Acad Sci）公开了温和热疗抑制同源重组（HR）并诱导BRCA2降解。同源重组是修复双链断裂（DSB）的途径之一。已知BRCA2参与双链断裂（DSB）的重组修复，并且PARP抑制剂能够有效杀死BRCA2缺陷的乳腺癌细胞。因此，作者推断，在通过热疗抑制BRCA2（以及随后的同源重组）的同时，诱导DSB的药剂可用于治疗癌症。他们还建议与该组合一起进一步使用PARP抑制剂。PARP参与单链DNA断裂（SSB）的检测并将单链DNA断裂的信号传导到参与SSB修复的酶学机制。这些作者最终发现，通过热疗提高对放射疗法的敏感性是同源重组特异性的，因为在同源重组缺陷的细胞（Rad54-/-）中没有观察到这种效应。
尽管使用热疗的癌症治疗正在取得进展，但对于使用热疗治疗癌症的改进的方法仍存在强烈需求。
发明内容
本发明人令人吃惊地发现，与Krawczyk等示出的内容以及关于DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）的已知信息相反，热疗效应不是DBS修复的同源重组途径特异性的。更具体来说，被称为Dbait分子的模拟双链断裂的核酸分子可用于与热疗相组合治疗癌症。Dbait分子通过参与DNA双链断裂（DSB）修复的非同源末端连接途径的DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）的过度活化起作用，而不在细胞中引起任何附加的DNA损伤（WO2005/040378；WO2008/034866；Quanz等，2009,Clinical Cancer Research15:1308；Quanz等，2009,PLoS ONE4:e6298；Dutreix等，2010,Mut.Res.704:182）。令人吃惊的是，通过DNA-PK抑制剂NU7026抑制DNA修复，不引起对热疗敏感并且防止Dbait敏化。因此，Dbait敏化需要DNA-PK激酶活化，并独立于DSB DNA修复抑制而起作用。他们也显示，令人吃惊地，即使在不存在任何诱导DSB的药剂的情况下，也可以观察到Dbait分子与热疗的组合的抗肿瘤效应。此外，所述组合的观察到的效应似乎是协同性且Dbait剂量依赖性的效应。
因此，本发明涉及一种用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其具有至少一个游离末端和与人类基因组中的任何基因具有小于60%序列同一性的24-200bp的DNA双链部分。
更优选地，所述核酸分子具有下式之一：
Figure BDA0000424099050000021
其中N是脱氧核苷酸，n是15至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L’是连接物，C是促进胞吞的分子，所述促进胞吞的分子优选选自亲脂性分子和靶向细胞受体使实现受体介导的胞吞的配体，L是连接物，m和p独立地是0或1的整数。
更具体来说，所述核酸分子具有下式之一：
Figure BDA0000424099050000031
和
其中带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；m是1，并且L是甲酰胺基低聚乙二醇，C选自单链脂肪酸或双链脂肪酸例如十八烷基和二油酰基、胆甾醇、生育酚、叶酸、糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖、肽例如RGD和铃蟾肽以及蛋白质例如整合素，优选为胆甾醇。
在优选实施方式中，所述核酸分子选自
Figure BDA0000424099050000043
和
Figure BDA0000424099050000044
在非常具体的实施方式中，所述核酸分子是
Figure BDA0000424099050000045
更优选地，所述促进胞吞的分子是胆甾醇。
优选地，所述热疗包括至少41℃、优选至少42℃的温度。任选地，所述热疗通过微波（RFA）、超声、红外线、纳米粒子或纳米管、感应加热、磁热疗、灌注或输注预加温的液体例如血液、腹膜内加热流、药物诱导的热疗或直接加热来进行。
优选地，所述癌症是是实体癌，优选地选自肉瘤、黑色素瘤、头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、肝癌、宫颈癌和子宫内膜癌和腹膜癌，更优选为肝癌和腹膜癌。
在特定实施方式中，p是1（即结合的Dbait分子），并且所述核酸分子与内涵体溶解剂、优选喹啉内涵体溶解剂、更优选氯喹或羟氯喹组合使用。还更优选地，所述核酸分子与氯喹组合使用。
任选地，所述核酸分子可以与放射疗法、放射性同位素疗法和/或抗肿瘤化学疗法组合使用。优选地，所述抗肿瘤化学疗法是通过DNA损伤性抗肿瘤剂直接或间接进行的治疗。更优选地，所述DNA损伤性抗肿瘤剂选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体抑制剂。
或者，所述核酸分子不与放射疗法、放射性同位素疗法和/或抗肿瘤化学疗法组合使用。优选地，所述核酸分子不与放射疗法、放射性同位素疗法和/或使用DNA损伤性抗肿瘤剂的抗肿瘤化学疗法组合使用。
附图说明
图1.Dbait32Hc当与热疗联合时诱导协同毒性。
MRC5转化的成纤维细胞和HT29结肠癌细胞是未处理的，或在存在或不存在DNA-PK抑制剂NU7026（50μM）的情况下用Dbait8H（1.25mg/L）或Dbait32Hc（1.25mg/L）进行转染。5小时后，使细胞在43℃下经历1小时的热疗。48小时后通过台盼蓝测定法测量细胞死亡率。示出了来自于5个独立实验的细胞死亡平均百分数±标准偏差。**，p<0.01；***，p<0.001，使用Student t检验。
图2.DT01增强射频消融抗肿瘤效应。
将107个肿瘤HT29细胞在右胁s.c.植入NMR1裸鼠组。将小鼠用RFA（在肿瘤周边，在42℃下2分钟）（n=13）、DT01（4次6mg的局部注射）（n=14）、或RFA和4次DT01注射两者（n=11）进行治疗。未治疗的携带肿瘤的小鼠（n=11）用作对照。图A示出了在治疗前（第0日）、然后是4和12日后（分别为第4日和第12日）肿瘤外观的代表性图像。比例条：1cm。图B示出了用组合治疗RFA+DT01治疗的小鼠的更高的肿瘤生长抑制。对小鼠进行跟踪直至当肿瘤达到2000mm3时处死。在所有实验中，每周用数字卡尺测量肿瘤3次。使用下列公式计算以立方毫米为单位的肿瘤体积：长度×宽度×宽度/2。图C示出了用组合治疗RFA+DT01治疗的小鼠的存活率的提高。时序检验：未治疗与RFA相比（p<0.001，RR0.30）；DT01+RFA与RFA相比（p<0.05，RR0.41）。
图3.治疗效果的组织学分析。
将107个肿瘤HT29细胞在右胁s.c.植入NMR1裸鼠组（每组7至8只小鼠）。将小鼠用RFA（在肿瘤周边，在42℃下2分钟）、DT01（2次6mg的局部注射）或RFA和Dbait两者进行治疗。未治疗的携带肿瘤的小鼠用作对照。在RFA治疗后72h，将小鼠安乐死，并切除肿瘤用于组织学分析。图A示出了4个实验组中增殖性、退行性和坏死细胞的细胞分布。图B示出了4个实验组中有丝分裂的定量（每个肿瘤在x40放大倍数下，在5个视野中的平均值）。误差条表示SEM（平均值的标准误差）。与单独RFA或单独DT01相比，用与DT01组合的RFA治疗的样本显示出显著更大的坏死和退行性细胞区域，更小的增殖性细胞的面积和更低的有丝分裂数量。Student t检验：*，p<0.05；***，p<0.001。
表1.存活和病理学研究的数据。
按照在材料和方法部分中所描述的进行存活和病理学研究。完全响应包括在RFA治疗后10天肿瘤全部消退。部分响应包括肿瘤的最长直径减小至少30%。对于病理学研究来说，结果表示为平均值±SD。
具体实施方式
本发明人令人吃惊地发现，与热疗组合使用Dbait分子来治疗癌症具有重大利益。事实上，从所提出的热疗对DBS修复的同源重组途径的特异性来说或从DNA-PK在热疗的情形中的已知信息来说，这些结果是出人意料的。
事实上，在文献中，研究了DNA-PK在放射敏化中的作用（ZengZC等，World J Gastroenterol2002;8:797-803；Woudstra EC等，RadiatRes.1999,152:214-218；Dynlacht JR等，J Cell Physiol.2003,196:557-64.）。作者得出结论，DNA-PKcs在通过热疗增强细胞放射敏感性中不发挥任何关键作用，并且不论细胞中Ku80或DNA-PKcs的状态如何，都可以通过热疗获得放射敏化。因此，他们得出结论，Ku80或DNA-PKcs以及因此非同源DSB末端连接，在通过热疗增强细胞放射敏感性中均不发挥任何关键作用。
本发明人还显示，令人吃惊地，即使在不存在诱导DSB的药剂的情况下，也能观察到Dbait分子与热疗的组合的抗肿瘤效应。更具体来说，本发明人在体外和体内两种情况下证实，Dbait分子与热疗的组合对于治疗癌症具有重大利益。事实上，通过将Dbait分子与热疗相组合，观察到了对癌细胞死亡的协同效应。经典的DNA-PK激酶活性抑制剂例如NU7026抑制非同源末端连接修复（Veuger等，2004,Oncogene,23,7322-7329），但是不诱导热疗敏化（图1）。参与热疗敏化的Dbait活性严格依赖于DNA-PK激酶活性，因为它被NU7026完全破坏。热疗和Dbait的组合治疗允许观察到对小鼠存活率的重大影响。事实上，尽管单独使用热疗或Dbait分子的治疗在治疗后50天具有低于30%的存活率，但通过所述组合治疗的合并组出现80%的存活率（图2C）。在组合治疗的情况下观察到肿瘤尺寸的稳定或甚至减小。通过在治疗后3天对切除的肿瘤的组织学进行分析，本发明人观察到，与单独使用热疗或Dbait分子治疗的肿瘤相比，通过所述组合治疗的肿瘤显示出最高的破坏阶段（退行性和坏死阶段）（图3）。
根据这些观察结果，本发明涉及
-一种药物组合物，其包含如下所述的Dbait分子或发夹核酸分子，任选的抗肿瘤剂、优选为DNA损伤剂，以及药学可接受的载体，用于与热疗相组合治疗癌症；
-一种药物组合物，其包含a）如下所述的结合的Dbait分子或发夹核酸分子，b）如下所述的内涵体溶解剂，任选的c）抗肿瘤剂，优选为DNA损伤剂，以及d）药学可接受的载体，用于与热疗相组合治疗癌症；
-一种药物组合物，其包含如下所述的Dbait分子或发夹核酸分子以及药学可接受的载体，用于与热疗相组合治疗癌症，但是不与任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法相组合；
-一种药物组合物，其包含a）如下所述的结合的Dbait分子或发夹核酸分子，b）如下所述的内涵体溶解剂，以及c）药学可接受的载体，用于与热疗相组合治疗癌症，但是不与任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法相组合；
-一种产品或试剂盒，其含有a）如下所公开的Dbait分子或发夹核酸分子，以及任选的b）抗肿瘤剂、优选为DNA损伤剂，作为组合制剂，与热疗、并任选与放射疗法或放射性同位素疗法相组合，同时、分开或顺序地用于治疗癌症；
-一种产品或试剂盒，其含有a）如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子，b）如下所述的内涵体溶解剂，以及任选的c）抗肿瘤剂，优选为DNA损伤剂，作为组合制剂，与热疗、并任选与放射疗法或放射性同位素疗法相组合，同时、分开或顺序地用于治疗癌症；
-一种产品或试剂盒，其含有a）如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子，以及b）如下所述的内涵体溶解剂，作为组合制剂，与热疗相组合同时、分开或顺序地用于治疗癌症，但是不与任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法相组合；
-一种药物组合物，其包含如下所公开的Dbait分子或发夹核酸分子，用于与热疗并与放射疗法、放射性同位素疗法和/或使用抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂的疗法相组合治疗癌症；
-一种药物组合物，其包含a）如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子，以及b）如下所述的内涵体溶解剂，用于与热疗并与放射疗法、放射性同位素疗法和/或使用DNA损伤性抗肿瘤剂的疗法相组合治疗癌症；
-包含如下所公开的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物在制造以下药物中的应用：用于与热疗相组合治疗癌症的药物；或用于提高使用热疗治疗癌症的效率的药物，或用于增强肿瘤对热疗的敏感性的药物；
-包含如下所公开的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物在制造以下药物中的应用：用于与热疗并与放射疗法、放射性同位素疗法和/或使用抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂的疗法相组合治疗癌症的药物；或用于提高使用热疗并使用放射疗法、放射性同位素疗法和/或使用抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂的疗法治疗癌症的效率的药物；或用于增强肿瘤对热疗和放射疗法、放射性同位素疗法和/或抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂的敏感性的药物；
-包含如下所公开的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物在制造以下药物中的应用：用于与热疗相组合，但是不与任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法相组合治疗癌症的药物；或用于提高使用热疗而不使用任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法治疗癌症的效率的药物；或用于增强肿瘤对热疗而不是任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法的敏感性的药物；
-包含如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物在制造用于与热疗并与使用如下所公开的内涵体溶解剂的疗法相组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物在制造用于与热疗和放射疗法、放射性同位素疗法和/或与抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂，并与如下所公开的内涵体溶解剂相组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含如下所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子的药物组合物在制造用于与如下所公开的的内涵体溶解剂并与热疗相组合，但是不与任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法相组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b）如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物在制造用于与热疗相组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b）如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物在制造用于与热疗并与放射疗法、放射性同位素疗法和/或抗肿瘤化学疗法、优选使用DNA损伤性抗肿瘤剂的抗肿瘤化学疗法相组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b）如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物在制造用于与热疗相组合，但是不与任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法相组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b）如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物在制造以下药物中的应用：用于提高使用热疗治疗癌症的效率的药物或用于增强肿瘤对热疗的敏感性的药物；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b）如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物在制造以下药物中的应用：用于提高使用热疗和放射疗法、放射性同位素疗法和/或抗肿瘤化学疗法、优选使用DNA损伤性抗肿瘤剂的抗肿瘤化学疗法治疗癌症的效率的药物；或用于增强肿瘤对与放射疗法、放射性同位素疗法和/或抗肿瘤化学疗法、优选使用DNA损伤性抗肿瘤剂的抗肿瘤化学疗法相组合的热疗的敏感性的药物；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b）如下所述的内涵体溶解剂的药物组合物在制造以下药物中的应用：用于提高使用热疗而不使用任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DNS的药剂的抗肿瘤化学疗法治疗癌症的效率的药物；或用于增强肿瘤对热疗而不是任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DNS的药剂的抗肿瘤化学疗法的敏感性的药物；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b）如下所述的内涵体溶解剂、c）抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂和d）药学可接受的载体的药物组合物在制造用于与热疗相组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b）如下所述的内涵体溶解剂、c）抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂和d）药学可接受的载体的药物组合物在制造用于与热疗并与放射疗法、放射性同位素疗法和/或抗肿瘤化学疗法、优选使用DNA损伤性抗肿瘤剂的抗肿瘤化学疗法相组合治疗癌症的药物中的应用；
-包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b）如下所述的内涵体溶解剂、c）抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂和d）药学可接受的载体的药物组合物在制造用于与热疗相组合，但是不与任何放射疗法、任何放射性同位素疗法和任何抗肿瘤化学疗法、特别是任何使用诱导DBS的药剂的抗肿瘤化学疗法相组合治疗癌症的药物中的应用；
-一种用于在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括i）施用有效量的包含本文中所公开的Dbait分子或发夹核酸分子和药学可接受的载体的药物组合物，以及ii）在步骤i）之前、同时或之后使所述对象的癌细胞经受热疗；由此诱导癌细胞死亡；
-一种用于在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括i）施用治疗有效量的包含本文中所公开的Dbait分子或发夹核酸分子和药学可接受的载体的药物组合物，以及ii）在步骤i）之前、同时或之后使所述对象的癌细胞经受热疗；由此诱导癌细胞死亡；任选地，所述方法还包括向所述对象施用治疗有效量的抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂或放射性同位素药剂；或者或另外，所述方法还包括使所述对象的癌细胞经受放射疗法；或者，所述方法不包括施用任何抗肿瘤剂、特别是任何诱导DBS的药剂和放射性同位素药剂，并且不包括使所述对象的癌细胞经受放射疗法；
-一种用于在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括i）施用治疗有效量的包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b）如下所述的内涵体溶解剂和c）药学可接受的载体的药物组合物，以及ii）在步骤i）之前、同时或之后使所述对象的癌细胞经受热疗；由此诱导癌细胞死亡；任选地，所述方法还包括向所述对象施用治疗有效量的抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂或放射性同位素药剂；或者或另外，所述方法还包括使所述对象的癌细胞经受放射疗法；或者，所述方法不包括施用任何抗肿瘤剂、特别是任何诱导DBS的药剂和放射性同位素药剂，并且不包括使所述对象的癌细胞经受放射疗法；
-一种用于在需要的对象中提高使用热疗治疗癌症的效率或用于增强肿瘤对热疗的敏感性的方法，所述方法包括i）施用治疗有效量的包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子和b）药学可接受的载体的药物组合物；以及ii）在步骤i）之前、同时或之后使所述对象的癌细胞经受热疗；由此增加癌细胞死亡；任选地，所述方法还包括向所述对象施用治疗有效量的抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂或放射性同位素药剂；或者或另外，所述方法还包括使所述对象的癌细胞经受放射疗法；或者，所述方法不包括施用任何抗肿瘤剂、特别是任何诱导DBS的药剂和放射性同位素药剂，并且不包括使所述对象的癌细胞经受放射疗法；
-一种用于在需要的对象中提高使用热疗治疗癌症的效率或用于增强肿瘤对热疗的敏感性的方法，所述方法包括i）施用治疗有效量的包含a）本文中所公开的结合的Dbait分子或发夹核酸分子、b）如下所述的内涵体溶解剂和c）药学可接受的载体的药物组合物；以及ii）在步骤i）之前、同时或之后使所述对象的癌细胞经受热疗；由此增加癌细胞死亡；任选地，所述方法还包括向所述对象施用治疗有效量的抗肿瘤剂、优选为DNA损伤性抗肿瘤剂或放射性同位素药剂；或者或另外，所述方法还包括使所述对象的癌细胞经受放射疗法；或者，所述方法不包括施用任何抗肿瘤剂、特别是任何诱导DBS的药剂和放射性同位素药剂，并且不包括使所述对象的癌细胞经受放射疗法。
当在本文中使用时，术语“试剂盒”、“产品”或“组合制剂”，在可以独立地或通过使用具有显著量的如上所定义的组合伙伴的不同固定组合，即同时或在不同的时间点，对所述组合伙伴进行给药的意义上，特别定义了“组成部分的试剂盒”。然后，所述组成部分的试剂盒的组成部分可以同时或在时间上错开地被施用，后者是指对于所述组成部分的试剂盒的任何组成部分来说，在不同时间点并以相等或不同的时间间隔进行施用。在组合制剂中，待施用的组合伙伴的总量之比可以变化。组合伙伴可以通过相同途径或通过不同途径来施用。
在本发明的情形中，术语治疗是指治愈性、对症性和预防性治疗。本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂可用于已患有癌症或肿瘤、包括癌症进展的早期或晚期阶段的人类。本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂不必定治愈患有癌症的患者，但是将延迟或减缓疾病的进展或防止疾病的进一步进展，由此改善患者的状况。具体来说，本发明的药物组合物、试剂盒、产品和组合制剂在哺乳动物宿主中减少肿瘤的发展，降低肿瘤负荷，产生肿瘤消退，和/或防止转移发生和癌症复发。在治疗癌症中，以治疗有效量施用本发明的药物组合物。
“治疗有效量”是指本发明的药物组合物在包括人类在内的哺乳动物中单独地或与药物组合物、试剂盒、产品或组合制剂的其他活性成分相组合而防止、消除或降低癌症的有害效果时的量。应该理解，施用剂量可以由本领域技术人员根据患者、病理学和施用方式等进行调整。
在这整个说明书中，当结合本发明的药物组合物提到“治疗癌症”等时，意味着：a）治疗癌症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的对象施用本发明的药物组合物；b）本发明的药物组合物在治疗癌症中的应用；c）本发明的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的应用；和/或d）用于治疗癌症的本发明的药物组合物。
除了活性成分之外，本文中设想的药物组合物可以包括药学可接受的载体。术语“药学可接受的载体”意味着涵盖不干扰活性成分的生物活性的有效性，并且对被施用的宿主无毒性的任何载体（例如支持物、物质、溶剂等）。例如，对于肠胃外施用来说，可以将活性化合物在介质例如盐水、右旋糖溶液、血清白蛋白和林格溶液中配制成用于注射的单位剂型。
可以以本领域已知的方式将药物组合物在药物相容性溶剂中配制成溶液，或在适合的药用溶剂或介质中配制成乳液、悬液或分散体，或配制成含有固体介质的丸剂、片剂或胶囊。本发明的适用于口服施用的制剂可以是各自含有预定量活性成分的离散单位例如胶囊、袋剂、片剂或锭剂的形式；粉剂或颗粒剂的形式；在水性液体或非水性液体中的溶液或悬液的形式；或水包油乳液或油包水乳液的形式。适用于肠胃外施用的制剂方便地包含活性成分的无菌油性或水性制备物，其优选与接受者的血液等渗。每种这样的制剂还可以含有其他药物相容性且无毒性的辅助剂，例如稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、染料、乳化剂或调味物质。因此，本发明的制剂包含活性成分和药学可接受的载体，并任选地包含其他治疗性成分。在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是“可接受的”。有利地通过注射或静脉内输注适合的无菌溶液来应用药物组合物，或作为口服剂量，通过消化道来应用药物组合物。大多数这些化疗剂的安全有效的施用方法对于本领域技术人员来说是已知的。此外，它们的施用被描述在标准文献中。
当在本文中使用时，术语“抗肿瘤化学疗法”或“化学疗法”是指使用化学或生物化学物质，特别是使用一种或数种抗肿瘤剂的癌症治疗性疗法。具体来说，它还包括激素疗法和免疫疗法。术语“激素疗法”是指有目的性地阻断、添加或移除激素的癌症疗法。例如，在乳腺癌中，雌性激素雌激素和孕酮能够促进某些乳腺癌细胞的生长。因此，在这些患者中，给予激素疗法以阻断雌激素，常用药物的非穷举性名单包括：他莫昔芬、法乐通、瑞宁得、阿诺新、弗隆、诺雷德/ 醋酸亮丙瑞林、梅格施和氟甲睾酮制剂。术语“免疫疗法”是指使用免疫系统来排斥癌症的癌症治疗性疗法。所述治疗性疗法刺激患者的免疫系统来攻击恶性肿瘤细胞。
Dbait分子
Dbait分子已被广泛描述在PCT专利申请WO2005/040378、WO2008/034866和WO2008/084087中，所述申请的公开内容通过参考并入本文。
Dbait分子可以通过对于它们的治疗活性而言所必需的多种特性例如它们的最小长度、至少一个游离末端的存在和双链部分、优选为DNA双链部分的存在来定义。正如将在下面讨论的，重要的是要注意，Dbait分子的精确的核苷酸序列不影响它们的活性。此外，Dbait分子可以含有修饰的和/或非天然的骨架。
优选地，Dbait分子是非人类来源的（即，它们的核苷酸序列和/或构象（例如发夹）本身在人类细胞中不存在），最优选为合成来源的。由于Dbait分子的序列发挥的作用即使有，也是很少，因此Dbait分子优选与已知基因、启动子、增强子、5’-或3’-上游序列、外显子、内含子等不具有显著程度的序列同源性或同一性。换句话说，Dbait分子与人类基因组中的任何基因具有低于80%或70%、甚至低于60%或50%的序列同一性。确定序列同一性的方法在本领域中是公知的，并包括例如Blast。Dbait分子在严格条件下不与人类基因组DNA杂交。典型的严格条件是允许将完全互补的核酸与部分互补的核酸区分开这样的条件。
此外，Dbait分子的序列优选不含CpG，以避免公知的toll样受体介导的免疫反应。
Dbait分子的长度可以变化，只要它足以允许包含Ku和DNA-PKcs蛋白的Ku蛋白复合体的适当的结合即可。已显示，Dbait分子的长度必须大于20bp，优选为约32bp，以确保与这样的Ku复合体结合并允许DNA-PKcs活化。优选地，Dbait分子在20-200bp之间，更优选在24-100bp之间，还更优选在26-100bp之间，最优选在24-200、25-200、26-200、27-200、28-200、30-200、32-200、24-100、25-100、26-100、27-100、28-100、30-100、32-200或32-100bp之间。例如，Dbait分子在24-160、26-150、28-140、28-200、30-120、32-200或32-100bp之间。“bp”是指该分子包含所指示长度的双链部分。
在特定实施方式中，具有至少32pb或约32bp的双链部分的Dbait分子包含与Dbait32（SEQ ID No1）、Dbait32Ha（SEQ ID No2）、Dbait32Hb（SEQ ID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）相同的核苷酸序列。任选地，Dbait分子具有与Dbait32、Dbait32Ha、Dbait32Hb、Dbait32Hc或Dbait32Hd相同的核苷酸组成，但是它们的核苷酸序列不同。于是，Dbait分子包含具有3个A、6个C、12个G和11个T的双链部分的一条链。优选地，Dbait分子的序列不含任何CpG二核甘酸。
或者，双链部分包含Dbait32（SEQ ID No1）、Dbait32Ha（SEQ IDNo2）、Dbait32Hb（SEQ ID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸。在更具体的实施方式中，双链部分由Dbait32（SEQID No1）、Dbait32Ha（SEQ ID No2）、Dbait32Hb（SEQ ID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸构成。
Dbait必须具有至少一个游离末端作为DSB的模拟物。所述游离末端可以是游离的平末端或5’-/3’-突出末端。“游离末端”在本文中是指具有5’末端和3’末端两者或者具有3’末端或5’末端的核酸分子、特别是双链核酸部分。任选地，5’和3’末端中的一个可用于结合Dbait分子或者可以与阻断基团例如a或3’-3’核苷酸键连接。
在特定实施方式中，它们含有两个游离末端并且可以是线性的。因此，Dbait分子也可以是具有两个游离末端并具有Dbait32（SEQ ID No1）、Dbait32Ha（SEQ ID No2）、Dbait32Hb（SEQ ID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）的核苷酸序列的双链分子。
在另一种特定实施方式中，它们仅含有一个游离末端。优选地，Dbait分子由具有双链DNA茎和环的发夹核酸制成。环可以是核酸或技术人员已知的其他化学基团或其混合物。核苷酸连接物可以包括2至10个核苷酸，优选3、4或5个核苷酸。非核苷酸连接物非穷举地包括脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖类、脂类、聚烃或其他聚合化合物（例如低聚乙二醇，例如具有2至10个乙二醇单元、优选4、5、6、7或8个乙二醇单元的低聚乙二醇）。优选的连接物选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和其他连接物例如2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。因此，在特定实施方式中，Dbait分子可以是具有双链部分或茎和环的发夹分子，所述双链部分或茎包含Dbait32（SEQ ID No1）、Dbait32Ha（SEQ ID No2）、Dbait32Hb（SEQID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸，所述环为六乙二醇连接物、四脱氧胸苷酸连接物（T4）或2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。在更具体的实施方式中，那些Dbait分子可以具有由Dbait32（SEQ ID No1）、Dbait32Ha（SEQ ID No2）、Dbait32Hb（SEQ ID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸构成的双链部分。
Dbait分子优选地包含2’-脱氧核苷酸骨架，并任选地包含一个或数个（2、3、4、5或6个）修饰的核苷酸和/或除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶之外的核碱基。因此，Dbait分子基本上是DNA结构。具体来说，Dbait分子的双链部分或茎由脱氧核糖核苷酸构成。
优选的Dbait分子在一条链或每条链的末端处包含一个或数个化学修饰的核苷酸或基团，特别是为了保护它们免于降解。在特别优选的实施方式中，在一条链或每条链的末端处，Dbait分子的游离末端被1、2或3个修饰的磷酸二酯骨架保护。优选的化学基团、特别是修饰的磷酸二酯骨架，包含硫代磷酸酯。或者，优选的Dbait具有3’-3’核苷酸键或具有甲基膦酸酯骨架的核苷酸。其他修饰的骨架在本领域中是公知的，并包含氨基磷酸酯、吗啉代核酸、2’-0,4’-C亚甲基/亚乙基桥接的锁核酸、肽核酸（PNA）和长度可变的短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖内键，或技术人员已知的任何修饰的核苷酸。在第一优选实施方式中，Dbait分子具有在一条链或每条链的末端处被1、2或3个修饰的磷酸二酯骨架保护的游离末端，更优选至少在3’末端处、但还更优选在5’和3’两个末端处被3个修饰的磷酸二酯骨架（特别是硫代磷酸酯或甲基膦酸酯）保护的游离末端。
在最优选实施方式中，Dbait分子是一种发夹核酸分子，其包含32bp的DNA双链部分或茎（例如具有选自SEQ ID No1-5、特别是SEQID No4的序列），以及连接DNA双链部分或茎的两条链的环，所述环包含选自以下的连接物或由所述连接物构成：六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，所述DNA双链部分或茎的游离末端（即在环的对面处）具有3个修饰的磷酸二酯骨架（特别是硫代磷酸酯核苷酸间连接）。
所述Dbait分子通过化学合成、半生物合成或生物合成，任何扩增方法，然后通过任何提取和制备方法以及任何化学修饰来制造。提供连接物以便可以通过标准的核酸化学合成掺入。
更优选地，Dbait分子通过特殊设计的汇集合成来制造：在掺入适合的连接物前体的情况下，通过标准的核酸化学合成来制备两条互补链，在将它们纯化后，将它们共价偶联在一起。
任选地，可以将Dbait分子结合到促进胞吞或细胞摄入的分子。
具体来说，促进胞吞或细胞摄入的分子可以是亲脂性分子例如胆甾醇、单链脂肪酸或双链脂肪酸或靶向细胞受体使实现受体介导的胞吞的配体，例如叶酸和叶酸衍生物或转铁蛋白（Goldstein等，Ann.Rev.Cell Biol.19851:1-39；Leamon&Lowe,Proc Natl Acad Sci USA.1991,88:5572–5576）。所述分子也可以是生育酚、糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖、肽例如RGD和铃蟾肽以及蛋白质例如整合素。脂肪酸可以是饱和或不饱和的，并且可以是C4-C28、优选C14-C22、还更优选C18例如油酸或硬脂酸。具体来说，脂肪酸可以是十八烷基或二油酰基。脂肪酸可以作为与适合的连接物例如甘油、磷脂酰胆碱或乙醇胺等连接的双链形式存在，或者可以与用于连接到Dbait分子上的连接物连接在一起。当在本文中使用时，术语“叶酸”的意思是指叶酸和叶酸衍生物，包括蝶酸衍生物和类似物。适用于本发明的叶酸类似物和衍生物包括但不限于抗叶酸剂、二氢叶酸、四氢叶酸、亚叶酸、蝶酰谷氨酸、1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮、10-脱氮、1,5-脱氮、5,10-双脱氮、8,10-双脱氮和5,8-双脱氮叶酸、抗叶酸剂和蝶酸衍生物。其他叶酸类似物被描述在US2004/242582中。因此，促进胞吞的分子可以选自单链脂肪酸或双链脂肪酸、叶酸和胆甾醇。更优选地，促进胞吞的分子选自二油酰基、十八烷基、叶酸和胆甾醇。在最优选实施方式中，Dbait分子结合于胆甾醇。
促进胞吞的分子优选通过连接物结合于Dbait分子。可以使用本领域中已知的任何连接物将促进胞吞的分子共价连接于Dbait分子。例如，WO09/126933在第38-45页提供了方便的连接物的广泛综述。非穷举地，连接物可以是脂族链、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖类、脂类、聚烃或其他聚合化合物（例如低聚乙二醇，例如具有2至10个乙二醇单元，优选3、4、5、6、7或8个乙二醇单元，还更优选6个乙二醇单元的低聚乙二醇），并且掺入有可以通过化学或酶学方式破坏的任何键，例如二硫键、受保护的二硫键、酸不稳定的键（例如腙键）、酯键、原酸酯键、膦酰胺键、可生物切开的肽键、偶氮键或醛键。这样的可切开的连接物被详细描述在WO2007/040469的第12-14页和WO2008/022309的第22-28页中。
在特定实施方式中，Dbait分子可以连接到一个促进胞吞的分子。或者，数个促进胞吞的分子（例如2、3或4个）可以连接到一个Dbait分子。
在特定实施方式中，在促进胞吞的分子、特别是胆甾醇与Dbait分子之间的连接物是CO-NH-(CH2-CH2-O)n，其中n是1至10的整数，优选地n选自3、4、5和6。在非常具体的实施方式中，连接物是CO-NH-(CH2-CH2-O)4（甲酰胺基三乙二醇）。连接物可以在不改变Dbait分子的活性的任何方便的位置处连接到Dbait分子。具体来说，连接物可以被连接在5’末端处、3’末端处或者当Dbait分子为发夹时被连接在环中。然而，在发夹Dbait分子的情形中，本发明人令人吃惊地发现，通过连接物在5’末端处连接到Dbait分子的胆甾醇比通过连接物在环处连接到Dbait分子的胆甾醇更加有效。因此，在优选实施方式中，所设想的结合的Dbait分子是具有发夹结构并且优选通过连接物在其5’末端处结合到促进胞吞的分子的Dbait分子。
在另一种特定实施方式中，在促进胞吞的分子、特别是胆甾醇与Dbait分子之间的连接物是二烷基二硫化物（例如(CH2)r-S-S-(CH2)s，其中r和s是1至10的整数，优选为3至8的整数，例如6）。
在最优选实施方式中，结合的Dbait分子是一种发夹核酸分子，其包含32bp的DNA双链部分或茎（例如具有选自SEQ ID No1-5、特别是SEQ ID No4的序列），以及连接DNA双链部分或茎的两条链的环，所述环包含选自以下的连接物或由所述连接物构成：六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，所述DNA双链部分或茎的游离末端（即在环的对面处）具有3个修饰的磷酸二酯骨架（特别是硫代磷酸酯核苷酸间连接），并且所述Dbait分子优选通过连接物（例如甲酰胺基低聚乙二醇，优选甲酰胺基三乙二醇）在其5’末端处结合到胆甾醇。
结合或未结合的Dbait分子或发夹核酸分子也可以通过下式来描述：
Figure BDA0000424099050000211
Figure BDA0000424099050000221
其中N是核苷酸，n是大于14的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L’是连接物，C是促进胞吞的分子，L是连接物，m和p独立地是0或1的整数。在式（II）和（III）中，C-Lm分别连接到核苷酸的5’末端或3’末端。在式（I-III）中，C-Lm优选通过二硫键（S-S）连接到L’。当该分子是结合的分子时，p为1。优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸。
在优选实施方式中，式（I）、（II）或（III）的分子具有一个或数个下列特征：
-N是脱氧核苷酸，优选地选自A（腺嘌呤）、C（胞嘧啶）、T（胸腺嘧啶）和G（鸟嘌呤），并且被选择成避免出现CpG二核苷酸，并且与人类基因组中的任何基因具有低于80%或70%、甚至低于60%或50%的序列同一性；和/或
-n是15至195、优选19-95、更优选21至95、还更优选27至95的整数。在特别优选的实施方式中，n为27；和/或
-带下划线的N是指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架、更优选为硫代磷酸酯骨架的核苷酸；优选地，带下划线的N是指具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸；和/或
-连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m为1，并且L是甲酰胺基聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇；和/或
-C选自胆甾醇、单链脂肪酸或双链脂肪酸例如十八烷基、油酸、二油酰基或硬脂酸，或靶向细胞受体的配体（包括肽、蛋白质、适体）例如叶酸、生育酚、糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖、肽例如RGD和铃蟾肽，以及蛋白质例如转铁蛋白和整合素，优选为胆甾醇；
优选地，C-Lm是三乙二醇连接物（10-O-[1-丙基-3-N-甲酰胺基胆甾醇基]-三乙二醇基团）。
在优选实施方式中，结合的Dbait分子或发夹核酸分子具有下式：
Figure BDA0000424099050000231
其中对于N、N、n、L、L’、C和m来说，式（I）、（II）、（II’）和（III）的定义相同。
在优选实施方式中，NNNN-(N)n-N包含Dbait32（SEQ ID No1）、Dbait32Ha（SEQ ID No2）、Dbait32Hb（SEQ ID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）的至少16、18、20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸，或由Dbait32（SEQ ID No1）、Dbait32Ha（SEQ ID No2）、Dbait32Hb（SEQ ID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）的20、22、24、26、28、30或32个连续核苷酸构成。在特定实施方式中，NNNN-(N)n-N包含Dbait32（SEQ ID No1）、Dbait32Ha（SEQ ID No2）、Dbait32Hb（SEQID No3）、Dbait32Hc（SEQ ID No4）或Dbait32Hd（SEQ ID No5）、更优选Dbait32Hc（SEQ ID No4），或由其构成。
因此，结合的Dbait分子或发夹核酸分子可以选自：
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No1的
Figure BDA0000424099050000232
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No2的
Figure BDA0000424099050000241
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No3的
Figure BDA0000424099050000242
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No4的
Figure BDA0000424099050000243
其中NNNN-(N)n-N为SEQ ID No5的
Figure BDA0000424099050000244
和
Figure BDA0000424099050000251
其中对于L、L’、C、p和m来说，与式（I）、（II）和（III）的定义相同。
在优选实施方式中，式（Ia）、（IIa）、（IIIa）、（Ib）、（IIb）、（IIIb）、（Ic）、（IIc）、（IIIc）、（Id）、（IId）、（IIId）、（Ie）、（IIe）和（IIIe）的分子，优选式（II）、（IIa）、（IIb）、（IIc）、（IId）和（IIe）的分子，具有一个或数个下列特征：
-带下划线的核苷酸是指具有或不具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架，更优选为硫代磷酸酯骨架的核苷酸；优选地，带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架，更优选为硫代磷酸酯骨架的核苷酸，和/或
-连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；和/或
-m为1，并且L是甲酰胺基聚乙二醇，更优选为甲酰胺基三乙二醇；和/或
-p为1；和/或
-C选自胆甾醇、单链脂肪酸或双链脂肪酸例如十八烷基、油酸、二油酰基或硬脂酸，或靶向细胞受体的配体（包括肽、蛋白质、适体）例如叶酸、生育酚、糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖、肽例如RGD和铃蟾肽，以及蛋白质例如转铁蛋白和整合素，优选为胆甾醇。
优选地，C-Lm是三乙二醇连接物（10-O-[1-丙基-3-N-甲酰胺基胆甾醇基]-三乙二醇基团）。
在式（I）、（II）、（II’）、（III）、（Ia）、（IIa）、（IIIa）、（Ib）、（IIb）、（IIIb）、（Ic）、（IIc）、（IIIc）、（Id）、（IId）、（IIId）、（Ie）、（IIe）和（IIIe），优选式（II）、（II’）、（IIa）、（IIb）、（IIc）、（IId）和（IIe）的Dbait分子或发夹核酸分子的特定实施方式中，L’优选地选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在式（I）、（II）、（II’）、（III）、（Ia）、（IIa）、（IIIa）、（Ib）、（IIb）、（IIIb）、（Ic）、（IIc）、（IIIc）、（Id）、（IId）、（IIId）、（Ie）、（IIe）和（IIIe），优选式（II）、（II’）、（IIa）、（IIb）、（IIc）、（IId）和（IIe）的Dbait分子或发夹核酸分子的特定实施方式中，当C是胆甾醇时，C-Lm是下述基团
Figure BDA0000424099050000261
在优选实施方式中，结合的Dbait分子或发夹核酸分子选自（II）、（II’）、（IIa）、（IIb）、（IIc）、（IId）和（IIe），其中C-Lm是下述基团
Figure BDA0000424099050000262
并且其中L’优选地选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，更优选为2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷。
在非常具体的实施方式中，Dbait分子或发夹核酸分子具有下式
Figure BDA0000424099050000263
其中C-Lm是下述基团
Figure BDA0000424099050000271
其中L’是2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷，并且其中带下划线的核苷酸具有硫代磷酸酯骨架。因此，所述分子具有下面的结构，并且它在实施例部分中被称为“coDbait”或“DT01”。
Figure BDA0000424099050000272
因此，本发明还涉及如上公开的Dbait分子、包含所述Dbait分子并任选地包含药学可接受的载体的药物组合物在与热疗相组合并且与或不与放射疗法和/或放射性同位素疗法和/或抗肿瘤化学疗法、优选使用DNA损伤性抗肿瘤剂的抗肿瘤化学疗法相组合治疗癌症中的应用，正如下面详细描述的。
热疗
热疗是其中将身体组织暴露于高温以损伤和杀死癌细胞或使癌细胞对辐射和某些抗癌药物的效应更加敏感的一种医学治疗。存在许多本领域技术人员公知的可以递送热量的技术。
热疗可以是施加于肿瘤的局部热疗，施加于组织、器官或其部分的区域热疗，或全身热疗。热疗可以是“急性”或“温和”的。
“急性热疗”意在指施加到瘤内的50至100℃、优选60至100℃的高温，以诱导对细胞的线粒体酶和胞浆酶的不可逆损伤，以便引起肿瘤的热消融。
“温和热疗”意在指等于天然高烧的温度。温和热疗是至少40℃、优选40至42℃、更优选约41℃的身体温度以及因此癌细胞温度。“中温热疗”意在指将癌细胞在至少41℃、优选在41-47℃范围内、更优选42-45℃的温度下加热的方法。“高温热疗”意在指将癌细胞在至少50℃的温度下加热的方法。高温热疗仅仅被用作局部热疗。
热疗可以由本领域公知的不同方法产生。例如，热疗可以通过微波（RFA）、超声（例如聚焦超声（FUS或HIFU））、红外线、纳米粒子或纳米管、感应加热、磁热疗、灌注或输注预加温的液体例如血液、腹膜内加热流、药物诱导的热疗或直接加热来进行。
局部热疗由对非常小的区域、优选为肿瘤进行加热所构成。在这种情形中，目的是杀死肿瘤而不造成其他损伤。热量可以通过微波、射频、超声能量或通过使用磁热疗来施加。在这种情形中，热疗是中温至高温热疗。取决于肿瘤的位置，热量可以被施加在身体表面（即浅表热疗）、施加在天然体腔中或通过使用针或探针施加在组织更深处（即间质热疗）。在优选实施方式中，热疗是肿瘤的射频消融。
区域热疗由对身体的一部分例如器官、其部分、四肢等进行加热所构成。在这种情形中，热疗是中温热疗，以便保护器官或四肢并弱化肿瘤细胞。区域热疗可以通过与局部热疗相同的方法，以降低的强度或时间来进行。或者，可以利用灌注或输注预加温的液体例如血液或腹膜内加热流。任选地，当热疗与抗肿瘤化学疗法相组合时，可以向预加温的液体添加抗肿瘤剂。例如，为了治疗腹膜癌，可以使用连续的高温腹腔灌注（CHPP）。
为了治疗转移癌症，宁可进行全身热疗。可以通过让患者坐在热室中或将他包裹在热毯中，进行直接加热。药物诱导的热疗是指其中将药物施用于对象以便帮助患者产生发热的方法。例如，药物可以干扰向外周散热、提高代谢速率、唤起细胞应答或体液免疫应答、模拟内源性致热原或损伤组织。此外，全身热疗可以通过红外热疗圆顶技术来进行。
内涵体溶解剂
在这里，结合的Dbait分子或发夹核酸分子优选与内涵体溶解剂（例如氯喹、膜融合脂质（fusogenic lipids）或肽等）组合使用。事实上，通过内涵体溶解剂的治疗促进结合的Dbait分子从内涵体释放。具体来说，内涵体溶解剂能够对pH变化做出响应而实现内涵体的裂解，并囊封或包裹能够包裹待递送至细胞或亚细胞组分的治疗剂的组分。内涵体溶解物质包括但不限于喹啉化合物，特别是4-氨基喹啉和2-苯基喹啉化合物及其氨基、硫基、苯基、烷基、乙烯基和卤素衍生物、膜融合脂质、肽或蛋白质。
在优选实施方式中，内涵体溶解剂是小分子。基本的内涵体溶解剂可以选自奎宁、氯喹、羟氯喹、阿莫地喹（氨酚喹胍）、阿莫吡喹、伯氨喹、甲氟喹、尼瓦奎宁（nivaquines）、卤泛群、醌亚胺及其组合。优选的内涵体溶解剂是喹啉内涵体溶解剂，包括但不限于下面使用其化学名列出的化合物：7-氯-4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉（氯喹）；7-氯-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉（羟氯喹）；7-氟-4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉（去甲氯喹）；7-氟-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉)；4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-二乙基氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基-)喹啉；7-羟基-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；羟氯喹磷酸盐；7-氯-4-(4-乙基-(2-羟基乙基-l)-氨基-1-丁基氨基)喹啉(去甲羟氯喹)；7-氟-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-丁基氨基)喹啉；7-氯-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-氟-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；7-羟基-4-(1-羧基-4-乙基-(2-羟基乙基)-氨基-1-甲基丁基氨基)喹啉；8-[(4-氨基戊基)氨基-6-甲氧基喹啉二盐酸盐；1-乙酰基-1,2,3,4-四氢喹啉；8-[(4-氨基戊基)氨基]-6-甲氧基喹啉二盐酸盐；1-丁酰基-1,2,3,4-四氢喹啉；3-氯-4-(4-羟基-α,α’-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲代苯氨基喹啉；4-[(4-二乙基氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；3-氟-4-(4-羟基-α,α’-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲代苯氨基喹啉；4-[(4-二乙基氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；4-(4-羟基-α,α’-双(2-甲基-1-吡咯烷基)-2,5-二甲代苯氨基喹啉；4-[(4-二乙基氨基)-1-甲基丁基-氨基]-6-甲氧基喹啉；3,4-二氢-1-(2H)-喹啉甲醛；1,1’-五亚甲基二喹啉
Figure BDA0000424099050000301
二碘化物；8-羟基喹啉硫酸酯，及其氨基、醛、羧基、羟基、卤素、酮、巯基和乙烯基衍生物或类似物。其他药剂被公开在Naisbitt等（1997,JPharmacol Exp Therapy280:884-893）和US5,736,557中。在更优选实施方式中，内涵体溶解剂可以选自氯喹、羟氯喹、去甲氯喹、羟氯喹磷酸盐和去甲羟氯喹，优选为氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹。
在另一种实施方式中，内涵体溶解剂是膜融合脂质、肽或蛋白质。事实上，大量膜融合脂质、肽或蛋白质在本领域中是已知的。例如，膜融合脂质、肽或蛋白质被公开在下列专利申请中：WO10057160，US2007/0293449，US2006/0051405，WO10053489，WO09126933。具体来说，WO09/126933在第23-29页公开了膜融合脂质、肽和蛋白质。
DNA损伤性治疗
除了Dbait分子和热疗以及当Dbait分子为结合的Dbait分子时的内涵体溶解剂之外，治疗还可以进一步包含抗肿瘤治疗，优选为通过DNA损伤剂或放射疗法进行的治疗。
DNA损伤性治疗可以是放射疗法或使用DNA损伤性抗肿瘤剂的化学疗法或其组合。DNA损伤性治疗是指优选相对特异性地在癌细胞中诱导DNA链断裂的治疗。
DNA链断裂可以通过电离辐射（放射疗法）来实现。放射疗法包括但不限于γ-射线、X-射线和/或向肿瘤细胞定向递送放射性同位素。其他放射疗法包括微波和UV辐照。在本发明中还设想了进行放射疗法的其他方法。
DNA链断裂可以通过放射性同位素疗法，特别是通过施用放射性同位素、优选为靶向放射性同位素来实现。靶向可以由同位素的化学性质造成，例如放射性碘，其被甲状腺特异性吸收，比其他器官的吸收好一千倍。或者，靶向可以通过将具有靶向性质的另一种分子例如半抗原或抗体连接于放射性同位素来实现。可以使用大量适合的放射活性同位素中的任一种，包括但不限铟-111、镥-171、铋-212、铋-213、砹-211、铜-62、铜-64、铜-67、钇-90、碘-125、碘-131、磷-32、磷-33、钪-47、银-111、镓-67、镨-142、钐-153、铽-161、镝-166、钬-166、铼-186、铼-188、铼-189、铅-212、镭-223、锕-225、铁-59、硒-75、砷-77、锶-89、钼-99、铑-105、钯-109、镨-143、钷-149、铒-169、铱-194、金-198、金-199和铅-211。
DNA损伤性抗肿瘤剂优选地选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体抑制剂。
拓扑异构酶I和/或II的抑制剂包括但不限于依托泊苷、拓扑替康、喜树碱、伊立替康、安吖啶、茚托利辛、蒽环类抗生素例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、伊达比星和米托蒽醌。拓扑异构酶I和II的抑制剂包括但不限于intoplecin。
DNA交联剂包括但不限于顺铂、卡铂和奥沙利铂。
抗代谢剂阻断负责核酸合成的酶，或变成掺入到DNA中，这产生不正确的遗传密码并导致凋亡。其非穷举性实例包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，更具体地为甲氨喋呤、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨，喷司他丁、5-氟尿嘧啶、吉西他滨和卡培他滨。
DNA损伤性抗肿瘤剂可以是烷化剂，包括但不限于氮芥、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲、金属盐和三氮烯。其非穷举性实例包括尿嘧啶氮芥、甲川氯、环磷酰胺（CYTOXAN(R)）、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三乙撑密胺、三乙撑硫代磷酰胺（Triethylenethiophosphoramine）、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、福莫司汀、顺铂、卡铂、奥沙利铂、塞替派、链脲霉素、达卡巴嗪和替莫唑胺。
有丝分裂纺锤体抑制剂包括但不限于紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨，larotaxel（也称为XRP9881；Sanofi-Aventis）、XRP6258（Sanofi-Aventis）、BMS-184476（Bristol-Meyer-Squibb）、BMS-188797（Bristol-Meyer-Squibb）、BMS-275183（Bristol-Meyer-Squibb）、沃塔紫杉醇（也称为IDN5109、BAY59-8862或SB-T-101131；Bristol-Meyer-Squibb）、RPR109881A（Bristol-Meyer-Squibb）、RPR116258（Bristol-Meyer-Squibb）、NBT-287（TAPESTRY）、PG-紫杉醇（也称为CT-2103、PPX、聚谷氨酸紫杉醇、多聚谷氨酸紫杉醇或XyotaxTM）、（也称为Nab-Paclitaxel；ABRAXISBIOSCIENCE）、Tesetaxel（也称为DJ-927）、IDN5390（INDENA）、Taxoprexin（也称为二十二碳六酸紫杉醇；PROTARGA）、DHA-紫杉醇（也称为
Figure BDA0000424099050000331
）和MAC-321（WYETH）。也可参见Hennenfent&Govindan的综述（2006,Annals of Oncology,17,735-749）。
待治疗的癌症或肿瘤
术语“癌症”、“癌性”或“恶性”指的是或描述了哺乳动物中通常以不受控的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括例如白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、癌和肉瘤。这样的癌症的更具体的实例包括慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病（Ph+ALL)、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、以及头颈癌、胃癌、胚细胞瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、多发性骨髓瘤、急性髓性白血病（AML)、慢性淋巴细胞性白血病、肥大细胞增多症以及与肥大细胞增多症相关的任何症状。
“白血病”是指造血器官的进展性恶性疾病，并且一般以血液和骨髓中的白细胞及其前体的不正常的增殖和发育为特征。白血病在临床上通常根据下面几点进行分类：（1）疾病的持续时间和特性——急性或慢性；（2）所涉及的细胞类型：髓性（骨髓性）、淋巴性（成淋巴的）、或单核细胞性；以及（3）血液中异常细胞的数量增加或不增加——白血性或非白血性（亚白血性）。白血病包括例如急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人T细胞白血病、非白血性白血病、白血球血症性白血病（leucocythemic leukemia）、嗜碱性白血病、干细胞白血病（blast cell leukemia）、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸性白血病、格罗斯白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病（hemoblastic leukemia）、成血细胞性白血病（hemocytoblastic leukemia）、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞性白血病、白细胞减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴母细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、成淋巴性白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞性白血病、单核细胞性白血病、成髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、髓性粒细胞性白血病、粒单核细胞白血病、Naegeli白血病、浆细胞白血病、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、里德尔细胞性白血病、希林白血病、干细胞白血病、亚白血性白血病和未分化细胞性白血病。在某些情况下，本发明提供了用于慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病和/或费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病（Ph+ALL）的治疗。
本发明的范围还涵盖各种癌症，包括但不限于下面的这些：癌，包括膀胱癌（包括加速和转移性膀胱癌）、乳腺癌、结肠癌（包括结直肠癌）、肾癌、肝癌、肺癌（包括小细胞和非小细胞肺癌以及肺腺癌）、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、直肠癌、喉癌、胰腺癌（包括胰腺外分泌癌）、食管癌、胃癌、胆囊癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌（包括鳞状细胞癌）；淋巴系造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓系造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征、髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎瘤；黑色素瘤、不能手术切除的III期或IV期恶性黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、以及头颈癌、视网膜母细胞瘤、胃癌、胚细胞瘤、骨癌、骨肿瘤、成人骨恶性纤维组织细胞瘤；儿童骨恶性纤维组织细胞瘤、肉瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、赘生物、浆细胞肿瘤；骨髓增生异常综合征；神经母细胞瘤；睾丸生殖细胞肿瘤、眼内黑色素瘤、骨髓增生异常综合征；骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病、滑膜肉瘤。另外，障碍包括色素性荨麻疹，肥大细胞增多症例如弥散性皮肤肥大细胞增多症，人类中的孤立性肥大细胞瘤，以及犬的肥大细胞瘤和一些罕见的亚型如大疱性、红皮病型和毛细血管扩张性（teleangiectatic）肥大细胞增多症，伴有血液障碍例如骨髓增生性或骨髓增生异常综合征或急性白血病的肥大细胞增多症，与肥大细胞增多症相关的骨髓增生性障碍、肥大细胞白血病和其他癌症。其他癌症也被包括在障碍的范围内，包括但不限于下面的这些：癌，包括膀胱癌、尿路上皮癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌、尤其是睾丸精原细胞瘤、和皮肤癌；包括鳞状细胞癌、胃肠道间质瘤（“GIST”）；淋巴系造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和Burketts淋巴瘤；髓系造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤和胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤和神经鞘瘤；间充质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌、畸胎癌、化学疗法难治性非精原细胞瘤性生殖细胞肿瘤和卡波西氏肉瘤，及其任何转移。
在本发明的优选实施方式中，癌症是实体肿瘤。癌症也可以是血液癌症。例如癌症可以是肉瘤和骨肉瘤例如卡波西氏肉瘤、AIDS相关的卡波西氏肉瘤、黑色素瘤尤其是葡萄膜黑色素瘤，以及头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、肝癌和胆管癌、子宫癌、阑尾癌和宫颈癌、睾丸癌、胃肠癌以及子宫内膜癌和腹膜癌。优选地，所述癌症可以是肉瘤、黑色素瘤尤其是葡萄膜黑色素瘤，以及头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、肝癌、宫颈癌以及子宫内膜癌和腹膜癌。在非常具体的实施方式中，癌症可以是腹膜癌和肝癌。在特定实施方式中，癌症可以是大肝细胞癌和肝转移，特别是与射频消融（RFA）组合。在另一种特定实施方式中，癌症可以是腹膜癌转移，特别是与腹腔热疗（HIPEC）组合。
本发明中所描述的药物组合物以及产品、试剂盒或组合制剂可用于抑制实例瘤的生长，缩小肿瘤体积，防止肿瘤的转移播散以及微转移灶的生长或发展。本发明中所描述的药物组合物以及产品、试剂盒或组合制剂特别适用于治疗预后不良的患者或者放射疗法或化学疗法耐受性的肿瘤。
方案、剂量和施用途径
本发明的组合制剂中采用的每个组合伙伴的有效剂量可根据所采用的具体化合物或药物组合物、使用方式、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度而有所不同。因此，本发明的组合制剂的给药方案根据包括施用途径和患者状态在内的多种因素来进行选择。具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开处用于防止、对抗或抑制病症进展所需要的单个活性成分的有效量。在获得在产生疗效而无毒性的范围内的活性成分浓度方面的最佳精确度，需要基于活性成分在靶部位的利用度动力学的方案。
可以在施用Dbait分子之前、同时或之后应用热疗。更优选地，在施用Dbait分子后，优选5分钟至24小时、更优选1至6小时应用热疗。
Dbait分子的施用途径可以是口服、胃肠外、静脉内、瘤内、皮下、颅内、动脉内、表面、直肠、透皮、皮内、经鼻、肌内、腹膜内、骨内等。在优选实施方式中，Dbait分子被施用或注射到待治疗的肿瘤位点附近。在特定实施方式中，当待治疗的癌症是腹膜癌转移时，可以使用capnoperitoneum来递送Dbait分子。在另一种特定实施方式中，当待治疗的癌症是肝细胞瘤时，Dbait分子可以通过静脉内、口服或动脉内注射和栓塞术来递送。在其他特定实施方式中，当待治疗的癌症是黑色素瘤时，Dbait分子可以通过皮下和静脉内注射来递送。另一种优选的施用途径是瘤内注射。
当Dbait分子是结合的Dbait分子时，内涵体溶解剂和结合的Dbait分子可以通过相同途径或通过两种不同途径来施用。内涵体溶解剂、优选为氯喹或羟氯喹、更优选为氯喹的施用途径，可以是口服、肠胃外、静脉内、瘤内、皮下、颅内、动脉内、表面、直肠、透皮、皮内、经鼻、肌内、腹膜内、骨内等。在特定实施方式中，内涵体溶解剂、优选为氯喹或羟氯喹、更优选为氯喹，通过口服途径或通过腹膜内途径，优选通过口服途径来施用。共同注射或局部注射的优点在于不需要匹配血浆中的药物动力学曲线。
在使用结合的Dbait分子的第一优选实施方式中，治疗方案包括下面的步骤：在开始用结合的Dbait分子或发夹核酸分子治疗之前，用内涵体溶解剂、优选为氯喹对患者进行预治疗。例如，当在待治疗的肿瘤位点附近施用（例如局部施用）内涵体溶解剂时，可以与结合的Dbait分子或发夹核酸分子一起施用内涵体溶解剂，或者在施用结合的Dbait分子或发夹核酸分子之前至少或约1、2、3、4或5小时，优选约1至3小时，更优选约2小时施用内涵体溶解剂。或者，当通过全身性施用来施用内涵体溶解剂时，可以在施用结合的Dbait分子或发夹核酸分子之前更长时间并通过更长的治疗，优选在施用结合的Dbait分子或发夹核酸分子之前约1至3周的时间段内，更优选为约2周左右的时间段内，施用内涵体溶解剂。一旦施用或已施用结合的Dbait分子或发夹核酸分子后，可以继续用内涵体溶解剂治疗，只要仍将施用胆甾醇结合的Dbait分子或发夹核酸分子即可。或者，也可以终止使用内涵体溶解剂治疗。
当DNA损伤性抗肿瘤剂与Dbait分子组合使用时，DNA损伤性抗肿瘤剂和Dbait分子可以通过相同的途径或通过不同的途径来施用。DNA损伤性抗肿瘤剂的施用途径可以是口服、胃肠外、静脉内、瘤内、皮下、颅内、动脉内、表面、直肠、透皮、皮内，经鼻、肌内、骨内等。
在特定实施方式中，DNA损伤性抗肿瘤剂通过口服途径施用，并且Dbait分子可以通过瘤内注射、通过皮下注射、通过腹膜内注射、通过静脉内注射，或通过口服途径，优选通过瘤内、皮下或腹膜内注射或者通过口服途径，还更优选通过瘤内或皮下来施用。
在辐射和/或施用DNA损伤性抗肿瘤剂之前和/或同时和/或之后，更优选在辐射和/或施用DNA损伤性抗肿瘤剂之前和/或同时，施用Dbait分子或发夹核酸分子。进行辐射和/或DNA损伤性抗肿瘤剂的施用，以便当施加辐射或者当DNA损伤性抗肿瘤剂到达肿瘤细胞时，Dbait分子存在于肿瘤细胞中。具有普通技术的医师、临床医生或兽医，可以根据活性成分、它们在靶位点的利用度动力学或者它们在血浆中的药物动力学曲线来确定方案。初步结果表明，Dbait分子在一天的时间内保持活性。
在使用结合的Dbait分子的特定优选实施方式中，治疗方案包括下面的步骤：在开始用结合的Dbait分子或发夹核酸分子治疗之前，用内涵体溶解剂、优选为氯喹或羟氯喹、更优选为氯喹对患者进行预治疗。然后，在开始用结合的Dbait分子或发夹核酸分子治疗时或者在用结合的Dbait分子或发夹核酸分子治疗之后，施加辐射或者施用DNA损伤性抗肿瘤剂。例如，在开始用结合的Dbait分子治疗后3-24h，施加辐射或者施用DNA损伤性抗肿瘤剂。也可以同时施用DNA损伤性抗肿瘤剂和结合的Dbait分子。
一旦已经开始用放射疗法或用DNA损伤性抗肿瘤剂进行治疗后，可以继续用Dbait分子治疗，只要仍将施加或施用通过放射疗法或使用DNA损伤性抗肿瘤剂的治疗即可。或者，也可以终止使用Dbait分子治疗。
与热疗相组合使用的Dbait分子的有效剂量可根据施用方式、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度而有所不同。因此，Dbait分子的给药方案根据包括施用途径和患者状态在内的多种因素来进行选择。具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开处用于防止、对抗或抑制癌症进展所需的Dbait分子的有效量。
例如，对于局部施用（例如，当使用瘤内或皮下施用时）来说，Dbait分子的有效量为至少0.01mg/1cm3肿瘤，优选为0.1–40mg/1cm3肿瘤，最优选为1–20mg/1cm3肿瘤。可以以每日治疗方案（例如，每周5天，持续3至6个连续周，或者一周3次，持续3至6个连续周）来施用所述有效量。或者，例如可以以持续3-6个连续周的每周治疗方案来施用至少0.01mg/1cm3肿瘤，优选0.1–40mg/1cm3肿瘤，最优选1–20mg/1cm3肿瘤的有效量。当使用其他施用途径时，本领域技术人员可以调整所述量，从而获得Dbait分子在肿瘤中的有效量为至少0.01mg/1cm3肿瘤，优选0.1–40mg/1cm3肿瘤，最优选1–20mg/1cm3肿瘤，特别是在每日治疗方案或每周治疗方案中。例如，对于全身性途径来说，Dbait分子的有效量或单位剂量可以为0.1至100mg，优选为4至40mg。因此，对于全身性途径来说，Dbait分子的有效量或单位剂量可以为0.06至0.6mg/kg患者。当然，考虑到化学疗法和/或放射疗法的方案，本领域技术人员可以调整剂量和方案。
对于内涵体溶解剂，特别是氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹来说，本发明的组合制剂、试剂盒或产品中所采用的内涵体溶解剂的有效剂量可能根据施用方式、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度而有所不同。因此，内涵体溶解剂的给药方案根据包括施用途径和患者状态在内的多种因素来进行选择。具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开处用于防止、对抗或抑制癌症进展所需要的，特别是与结合的Dbait分子和所选择的DNA损伤性治疗相组合的内涵体溶解剂的有效量。在特定实施方式中，当使用口服途径并且如果已知所选择的内涵体溶解剂可用于治疗或预防疟疾时，以用于治疗或预防疟疾的相同剂量和方案使用内涵体溶解剂，特别是氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹。例如，如果所选择的内涵体溶解剂是氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹，则可以以100-600mg/天、优选200-400mg/天、更优选约300mg/天的剂量，每周一次、两次、三次或四次来施用氯喹或羟氯喹。在特定实施方式中，氯喹或羟氯喹可以在1或2周期间以约100mg/天的剂量施用，或者在1或2周期间每周两次以约300mg的剂量施用。在另一种特定实施方式中，当设想了局部途径例如皮下或瘤内途径时，可以以100-300mg来使用内涵体溶解剂，特别是氯喹或羟氯喹，更优选为氯喹。
对于放射疗法来说，可以使用本领域已知的任何放射疗法方案，特别是立体定向辐射（例如15Gy）或分次辐射（fractionated radiation）。使用分次辐射可能是特别有效的，例如，可以在1、2、3、4、5或6周的时间内，每天或每2-5天、优选每3-4天施加辐射。辐射可以为1至10Gy，优选为2至5Gy，特别是2、3、4或5Gy。例如，可以设想到在6周内进行15x2Gy的分次辐射，或者在2周内进行4至6x5Gy的分次辐射。在优选实施方式中，所设想的放射疗法是在2周内4次5Gy辐射的方案。已测试了用辐射和Dbait分子组合治疗癌症的不同方案或条件，并证明了Dbait分子对肿瘤的放射增敏取决于Dbait分子的剂量，而不是辐射剂量。
对于化学疗法来说，本发明的组合制剂、试剂盒或产品中所采用的或者与本发明的组合物相组合的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效剂量，可能根据所采用的具体DNA损伤性抗肿瘤剂、施用方式、所治疗的病症、所治疗的病症的严重程度而有所不同。因此，DNA损伤性抗肿瘤剂的给药方案根据包括施用途径和患者状态在内的多种因素来进行选择。具有普通技术的医师、临床医生或兽医可以容易地确定和开处用于防止、对抗或抑制癌症进展所需的DNA损伤性抗肿瘤剂的有效量。
所述治疗可以包括一个或数个循环，例如2至10个循环，特别是2、3、4或5个循环。所述循环可以是持续的或分开的。例如，每个循环被1至8周、优选3至4周的时间段分隔开。
将在下面的实施例中描述本发明的其他方面和优点，所述实施例应该被认为是说明性而不是限制性的。
实施例
结果
当在体外与热疗联合时，Dbait32Hc显示出协同增效的细胞毒性
首先，本发明人测试了用Dbait32Hc或对DNA-PK无活性的转染对照Dbait8H进行处理的MRC5和HT29细胞，然后在43℃下进行1h的热疗，并在1h后固定。为了评估添加的Dbait32Hc与RFA的相关性，本发明人进行了台盼蓝测定，以测定处理诱导的细胞死亡。在Dbait32Hc处理后，在41或43℃下对MRC5和HT29培养物进行1h的热疗，并在48h后评估细胞死亡（图1）。该测定显示，当通过温和的温度变化处理细胞时，其本身不诱导细胞死亡。添加Dbait8H这种无活性的Dbait分子不改变细胞存活率，然而在温度改变前添加Dbait32Hc则引发30%至50%的死亡率。这种效果严格依赖于DNA-PK，因为添加NU7026废除了这种温度致敏。
肿瘤坏死和有丝分裂的组织病理学分析
使用HT29胁部异种移植小鼠模型来进行RFA、DT01和组合治疗。在本研究中，在RFA治疗之前24和5小时进行DT01的瘤内和皮下注射。为了评估急性治疗功效，在治疗后72h进行大的治疗后肿瘤的组织学切片。进行苏木精伊红染色来分析组织结构、血管化、坏死面积和有丝分裂指数（图3和表1）。
*RECIST判据
每个肿瘤样品在x40放大倍数下5个代表性视野的平均值。
表1
用RFA（与或不与DT01组合）治疗的样本在治疗区中显示出凝固性坏死的区域，包括具有浓染的不规则核、嗜酸性细胞质和低有丝分裂率的非典型的退行性小细胞（图3）。与活跃的增殖性组分相比，这些营养不良细胞的形态表明了坏死的机制。用与DT01（2次局部注射，每次6mg）组合的RFA治疗的样本，与单独的RFA（p=0.03）或单独的DT01（p=0.0008）相比，显示出显著更大的坏死和退行性营养不良细胞区域，而未治疗的样本显示出很少的自发性坏死区域，特别是对于较大肿瘤来说。此外，对于用与DT01组合的RFA治疗的样本来说，观察更小的肿瘤区域显示出存活，主要在外周处（p<0.05），并具有更小的有丝分裂指数（p<0.05）。在72h时，3/8的样本甚至显示出没有存活的肿瘤。
总而言之，如图3中所示，与单独的RFA或单独的DT01相比，用与DT01组合的RFA治疗的样本显示出显著更大的坏死和退行性细胞区域，更小的增殖性细胞区域和更低数量的有丝分裂。
DT01增强RFA的抗肿瘤效应和总体存活率
如图2中所示，与未治疗相比，用RFA或DT01单独治疗产生中度抗肿瘤效应。与使用单独的RFA或单独的DT01的治疗相比，使用RFA和DT01的组合疗法产生协同增效的肿瘤生长减少。
使用RFA和DT01时，与未治疗动物、单独的RFA和单独的DT01相比，组合疗法组具有显著提高的存活率（图2C和表1）。与单独的RFA相比，通过DT01-RFA组合治疗的小鼠具有显著更长的存活（存活中位数：57比40天，p<0.001），而与对照相比，单独的RFA提高存活（存活中位数：40比28天，p<0.001）。
为了评估治疗功效，在尺寸均匀的（大）异种移植肿瘤上进行治疗。在连续4天中，每天一次进行6mg DT01分子的局部注射（相应地总计24mg）。在第三次注射DT01后5小时，进行RFA治疗。在模拟治疗或RFA治疗后第1和4天，获取标准化的肿瘤照片（图2A）。在这里，证实了与模拟治疗相比，单独的DT01诱导肿瘤坏死。单独的RFA治疗引发凝固性坏死，如黑色坏死区域所示。然而，当单独应用RFA时，RFA诱导的损伤的面积是有限的，并且未扩展到整个肿瘤体积。另一方面，向RFA治疗添加DT01，允许凝固性坏死扩展到整个肿瘤体积。
总而言之，如图2中所示，当动物在RFA之前接受DT01时，小鼠存活增加。
材料和方法
细胞培养
将MRC5（转化的人类成纤维细胞，ATCC（Manassas,VA））和HT29（人类结肠腺癌，ATCC（Manassas,VA））细胞系用于培养细胞的研究。HT29细胞系被生长在增补有10%胎牛血清（ATGC）、链霉素（100mg.mL–1，Invitrogen）和青霉素（100mg.mL–1，Invitrogen）的完全DMEM（Gibco）中。将细胞维持在5%CO2气氛、100%湿度和37℃下。
Dbait分子
所有Dbait分子均通过自动化固相寡核苷酸合成方法来合成（Eurogentec）。注意，对于体外研究来说，使用与PEI复合的Dbait32Hc，然而在临床前研究中，由于PEI对生物体的高毒性，因此使用胆甾醇连接形式的DT01。
体外热休克治疗和台盼蓝测定法
通过将细胞与2.5μg与11kDa PEI（Poly+）复合的Dbait在800μL培养基中（在6孔板中）温育5h，对细胞进行转染。1纳摩尔的Dbait32Hc（分子量20,153）重量为～20μg。在Dbait转染结束时，取出转染培养基，并将其用事先在37℃下加热的完全DMEM替换。随后立即在FisherScientific Isotemp中，在43℃下进行1小时的热休克。然后将细胞在正常条件下温育48小时。将细胞上清液和胰蛋白酶处理后的沉淀物混合，以计数死亡的漂浮细胞。然后将悬液与台盼蓝混合，以获得0.4%的台盼蓝溶液。在Malassez室片上计数染色的细胞和细胞总数。所计算到的未染色细胞的百分率表示活细胞的百分率。
动物模型和（肿瘤制备）处理
6周龄雌性NMRI裸鼠从Janvier（Le Genest St Isle,France）获得。在开始实验之前，将动物在实验室饲养至少1周。每个笼子有6只动物，处于受控的光和暗循环（12h：12h）、相对湿度（55%）和温度（21℃）条件下。食物和自来水随意取用。通过对80只小鼠在右胁部皮下注射107个肿瘤细胞，来诱导人类HT29结肠腺癌肿瘤。
临床前实验设计
将HT29结肠腺癌肿瘤异种移植在75只雌性成年裸鼠上。当肿瘤体积达到200至700mm3（平均体积：483±146mm3）时，将小鼠分到治疗组或对照组之一。将小鼠用单独的RFA、通过局部注射用单独的Dbait、通过DT01和RFA的组合进行治疗，或者不治疗。在第3天处死31只小鼠用于组织学分析，对49只其余小鼠进行追踪，直至在肿瘤达到2000mm3时将它们处死。在所有实验中，每3天使用数字卡尺测量肿瘤。使用下面的公式进行计算以立方厘米为单位的肿瘤体积：长度×宽度×宽度/2。当地动物实验伦理委员会批准了所有实验。
射频肿瘤消融
使用Radionics Cool-tip RF（系统射频（system radiofrequency））发生器，在异氟醚麻醉下进行RFA。将由15号Cosman RF套管电极（Cosman Medical,inc,Burlington,USA）构成的RFA探针插入到肿瘤中。手动控制功率（单位为瓦），直至达到目标温度。通过放置在肿瘤外周的皮下热电偶监测消融温度。将外周温度维持在42和44℃之间2分钟（不完全消融方案）。当与Dbait组合时，在治疗的第三天进行RFA。
DT01治疗
通过一次瘤内注射（2mg/动物）和在距离肿瘤边缘5mm远的相对位点处进行的两次皮下注射（每次2mg/动物），来进行每日DT01治疗。
使用两种方案计划进行连续的每日DT01治疗：用于组织病理学分析的2日治疗和用于存活研究的4日治疗（总剂量分别为12和24mg）。当与RFA组合时，对于2日和4日治疗来说，分别在DT01治疗的第二天或第三天，在消融之前5小时施用DT01。
组织学分析
在RFA治疗后3天，将动物处死并切下肿瘤。将肿瘤在中性缓冲的福尔马林中固定，包埋在石蜡中。切下7μm切片并用苏木精、伊红、番红花（HES）染色。坏死（由细胞尺寸增加、细胞边界模糊、嗜酸性细胞质、核丧失或固缩或相关炎症所指示）程度被表示成所分析的组织切片的表面积中坏死的比例（%）。从在高倍率下分析的～1,000个细胞的代表性非坏死视野来估算有丝分裂细胞和凋亡细胞的数量。
统计分析
使用StatEL软件（ad Science）进行统计分析。从Kaplan-Meier估算值绘制总存活曲线并比较。由于数据不符合正态分布，因此使用非参数时序检验进行这些比较。使用Student t-检验比较培养细胞的死亡。
Figure IDA0000424099140000011
Figure IDA0000424099140000021

Claims (15)

1.用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，所述核酸分子具有至少一个游离末端和与人类基因组中的任何基因具有小于60%序列同一性的24-200bp的DNA双链部分。
2.权利要求1的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述核酸分子具有下式之一：
Figure FDA0000424099040000011
其中N是脱氧核苷酸，n是15至195的整数，带下划线的N是指具有或不具有修饰的磷酸二酯骨架的核苷酸，L’是连接物，C是促进胞吞的分子，所述促进胞吞的分子选自亲脂性分子或靶向细胞受体使实现受体介导的胞吞的配体，L是连接物，m和p独立地是0或1的整数。
3.权利要求1或2的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述核酸分子具有下式之一：
Figure FDA0000424099040000012
和
Figure FDA0000424099040000022
其中带下划线的核苷酸是指具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯骨架的核苷酸，连接的L’选自六乙二醇、四脱氧胸苷酸（T4）和2,19-双(磷)-8-肼-1-羟基-4-氧杂-9-氧代-十九烷；m是1，并且L是甲酰胺基低聚乙二醇，C选自单链脂肪酸或双链脂肪酸例如十八烷基和二油酰基、胆甾醇、生育酚、叶酸、糖例如半乳糖和甘露糖以及它们的寡糖、肽例如RGD和铃蟾肽以及蛋白质例如整合素，优选为胆甾醇。
4.权利要求1-3任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述促进胞吞的分子是胆甾醇。
5.权利要求1-4任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述核酸分子选自：
Figure FDA0000424099040000031
和
Figure FDA0000424099040000032
6.权利要求1-5任一项的核酸分子，其中所述核酸分子是
7.权利要求1-6任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述热疗包括至少41℃、优选至少42℃的温度。
8.权利要求1-7任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述热疗通过微波（RFA）、超声、红外线、纳米粒子或纳米管、感应加热、磁热疗、灌注或输注预加温的液体例如血液、腹膜内加热流或直接加热来进行。
9.权利要求1-8任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述癌症是实体癌，优选地选自肉瘤、黑色素瘤、头颈癌、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、肝癌、宫颈癌和子宫内膜癌和腹膜癌，更优选为肝癌和腹膜癌。
10.权利要求1-9任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中p是1，并且所述核酸分子与内涵体溶解剂、优选喹啉内涵体溶解剂、更优选氯喹或羟氯喹组合使用。
11.权利要求1-10任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述核酸分子与放射疗法和/或抗肿瘤化学疗法组合使用。
12.权利要求11的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述抗肿瘤化学疗法是通过DNA损伤性抗肿瘤剂直接或间接进行的治疗。
13.权利要求12的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述DNA损伤性抗肿瘤剂选自拓扑异构酶I或II的抑制剂、DNA交联剂、DNA烷化剂、抗代谢剂和有丝分裂纺锤体抑制剂。
14.权利要求1-10任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述核酸分子不与放射疗法和/或抗肿瘤化学疗法组合使用。
15.权利要求1-10任一项的用于与热疗相组合治疗癌症的核酸分子，其中所述核酸分子不与放射疗法和/或使用DNA损伤性抗肿瘤剂的抗肿瘤化学疗法组合使用。
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