ES2742197T7 - Uso de una combinación de molécula Dbait e inhibidores de PARP para tratamiento del cáncer - Google Patents

Uso de una combinación de molécula Dbait e inhibidores de PARP para tratamiento del cáncer Download PDF

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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Description

DESCRIPCIÓN
Uso de una combinación de molécula Dbait e inhibidores de PARP para tratamiento del cáncer
Campo de la Invención
La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular de la oncología.
Antecedentes de la Invención
La poli(ADP-ribosa)polimerasa PARP1 (y PARP2) es una enzima que se ligada al deterioro del DNA y promueve la reparación del DNA por formación de polímeros de ADP-ribosa que atraen enzimas reparadoras. PARP es la enzima principal de las roturas monocatenarias por el camino de la Reparación de la Excisión de Bases. Si se dejan sin reparar, las roturas monocatenarias se convierten en roturas bicatenarias durante la replicación que son reparadas esencialmente por Recombinación Homóloga. Por esta razón, la inhibición de PARP es letal en las células deficientes para Recombinación Homóloga. Esta observación condujo al desarrollo de inhibidores de PARP para tratar los cánceres que tienen ya mutaciones que anulan su capacidad de Recombinación Homóloga.
Dos enzimas principales están orientadas por los inhibidores de PARP: PARP1 y PARP2. En condiciones normales, PARP1 y PARP2 se desprenden del DNA una vez que el proceso de reparación está en curso. Sin embargo, cuando aquéllas están ligadas a algunos inhibidores de PARP, PARP1 y PARP2 quedan atrapadas en el DNA. Los complejos PARP-DNA atrapados son más tóxicos para las células que las roturas de DNA monocatenarias sin reparar. Existen dos clases de inhibidores de PARP: (i) inhibidores catalíticos que actúan principalmente para inhibir la actividad de la enzima PARP y no atrapan las proteínas PARP en el DNA, y (ii) inhibidores ligados que bloquean la actividad de la enzima PARP e impiden su desprendimiento del sitio de deterioro. Aunque se han desarrollado muchos inhibidores de PARP, su clasificación en tipo (i) o (ii) no está clara. Se ha propuesto que Veliparib podría ser tipo (i) y Olaparib, Niraparib, BM673 podrían pertenecer al tipo (ii). Además, dado que PARP está implicada en muchos procesos celulares, el mecanismo de acción de los inhibidores de PARP en las células tumorales sigue sin estar dilucidado por completo. Actualmente están considerándose pacientes para pruebas de inhibidores de PARP únicamente si aquéllos tienen un tipo de tumor particular (p. ej., cáncer ovárico seroso de alto grado o cáncer cerebral triple negativo) o si su cáncer pudiera pertenecer a un subtipo molecular relevante (p. ej., cáncer de mama con la mutación BRCA1/2, de ovario, de páncreas, o de próstata). Aunque la monoterapia con inhibidores de PARP (PARPi) exhibió perfiles prometedores de eficacia y seguridad en la clínica, sus limitaciones principales son la necesidad de deficiencia en HR y la rápida aparición de resistencia. Muchos tumores que respondían inicialmente a los tratamientos con PARPi sufrieron recaída finalmente por mutaciones compensatorias que restablecían la actividad de HR o estimulaban la actividad de caminos de reparación alternativos.
Por consiguiente, el uso de inhibidores de PARP se limita a tipos de tumor particulares y no puede utilizarse para tratamiento de cualquier cáncer. -
Sumario de la Invención
La presente invención proporciona un tratamiento combinado que facilita utilizar inhibidores de PARP para tratar cualquier clase de cánceres, en particular sin verse limitado a los asociados con deficiencia de Recombinación Homóloga. Adicionalmente, la presente invención proporciona una combinación de inhibidor de PARP con moléculas de ácido nucleico como se definen en esta memoria, que conduce a un efecto sinérgico contra los tumores.
Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PARP y una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria, en particular para uso en el tratamiento del cáncer.
La presente invención se refiere también a un inhibidor de PARP para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria o a una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con un inhibidor de PARP.
La misma se refiere también a un kit que comprende un inhibidor de PARP y una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial, en particular en el tratamiento del cáncer.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico tiene al menos un extremo libre y una porción de DNA bicatenario de 6-200 pb con menos de 60% de identidad de secuencia respecto a cualquier gen en un genoma humano.
Más preferiblemente, la molécula de ácido nucleico tiene una de las fórmulas siguientes:
Figure imgf000003_0001
en donde N es un desoxinucleótido, n es un número entero de 1 a 195, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal de fosfodiéster modificada, L' es un enlazador, C es una molécula que facilita la endocitosis, seleccionada preferiblemente de una molécula lipófila y un ligando que está orientado a un receptor celular que facilita la endocitosis mediada por receptores, L es un enlazador, m y p, independientemente, son un número entero que es 0 ó 1.
Más específicamente, la molécula de ácido nucleico tiene una de las fórmulas siguientes:
Figure imgf000003_0002
Figure imgf000004_0003
. .
y - (Ule) SEQ ID No 20
en donde el nucleótido subrayado se refiere a un nucleótido que tiene una cadena principal fosforotioato o metilfosfonato, el L' enlazado se selecciona del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1 -hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano; m es 1 y L es un carboxamido-oligoetilenglicol, C se selecciona del grupo que consiste en ácidos grasos de cadena simple o doble tales como octadecílico y dioleoílico, colesterol, tocoferol, ácido fólico, azúcar tal como galactosa y manosa y su oligosacárido, péptido tal como RGD y bombesina, y proteína tal como integrina, preferiblemente colesterol o tocoferol.
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000004_0001
Más preferiblemente, la molécula que facilita la endocitosis es colesterol o tocoferol.
En una realización muy específica, la molécula de ácido nucleico tiene la fórmula siguiente
Figure imgf000004_0002
En otra realización muy específica, la molécula de ácido nucleico tiene la fórmula siguiente
Figure imgf000005_0001
en donde C es un colesterilo, Lm es un tetraetilenglicol, p es 1 y L' es 1,19-bis (fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxononadecano.
Preferiblemente, el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que consiste en rucaparib (AG014699, PF-01367338), olaparib (AZD2281), veliparib (ABT888), iniparib (BSI 201), niraparib (MK 4827), talazoparib (BMN673), AZD 2461, CEP 9722, E7016, INO-1001, LT-673, MP-124, NMS-P118, XAV939, análogos, derivados o una mezcla de los mismos. Más preferiblemente, el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que consiste en AZD2281 (Olaparib), ABT888 (Veliparib), BMN673, BSI-21 (Iniparib), AZD 2461, MK-4827 (Niraparib), y AG 014699 (Rucaparib).
En un aspecto particular, el inhibidor de PARP se utiliza en una cantidad sub-terapéutica.
Pueden tratarse todos los tipos de cáncer. Más preferiblemente, el cáncer se selecciona de leucemia, linfoma, sarcoma, melanoma, y cánceres de cabeza y cuello, riñón, ovario, páncreas, próstata, tiroides, pulmón, en particular cáncer de pulmón microcítico, y cáncer de pulmón no microcítico, esófago, mama, vejiga, tracto colorrectal, hígado, cérvix, y cánceres endometrial y peritoneal. En particular, el cáncer es un cáncer sólido. En un aspecto particular, el cáncer es un cáncer metastásico o cáncer de alto grado o avanzado. En una realización particular, el cáncer se selecciona de leucemia, linfoma, melanoma, sarcoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer colorrectal, y cáncer de cérvix.
Breve Descripción de los Dibujos
Figura 1: Ejemplos de supra-aditividad de la combinación de Olaparib y Veliparib con DT01
medidos por el porcentaje de células vivas para varias dosis de olaparib (OLA), veliparib (VELI) y DT01.
Figura 2: El efecto supra-aditivo de DT01 y Olaparib no depende de la línea de células y de las mutaciones DNA-PK o BRCA. Supervivencia de las células expuestas a 0,1 pM Olaparib (negro), 100 pg/ml DT01 (gris) o ambos tratamientos 0,1 pM Olaparib 100 pg/ml DT01 (rayado) monitorizada en diferentes células tumorales (cánceres de Cérvix, Glioblastoma, de Sangre, y de Cerebro) y dos células de mama no tumorales.
Figura 3: Sinergia in vivo de DT01 y Olaparib.
Figura 4: Efecto de los inhibidores de reparación del DNA AsiDNA u Olaparib sobre la muerte celular. Análisis de muerte celular en líneas de células BC. (MDAMB436, HCC1937, BC227, HCC38, BC173, MDAMB468, HCC1143, BT20, MDAMB231, HCC1187, y HCC70), líneas de células de adenocarcinoma de cérvix (HeLa CTL SX, HeLa BRCA1 SX y HeLa BRCA2 SX) y líneas de células mamarias no tumorales (184B5, MCF10 y MCF12A) tratadas con 4,8pM AsiDNA (A) o 0,1 pM Ola (B). La línea punteada indica las líneas de células sensibles para cada tratamiento (definidas por una diferencia media en el % de células muertas mayor que dos veces).
Figura 5: Efecto de los inhibidores de la reparación del DNA AsiDNA u Olaparib sobre la supervivencia celular. Análisis de la supervivencia celular en líneas de células BC (MDAMB436, HCC1937, BC227, h Cc 38, BC173, MDAMB468, HCC1143, BT20, MDAMB231, HCC1187, y HCC70), líneas de células de adenocarcinoma de cérvix (HeLa CTL SX, HeLa BRCA1 SX y HeLa BRCA2 SX) y líneas de células mamarias no tumorales (184B5, MCF10 y MCF12A) tratadas con 4,8pM AsiDNA o 0,1 pM Ola. Las supervivencias se expresan como % de células vivas no tratadas.
Figura 6: El tratamiento combinado exhibe una eficacia supra-aditiva. La eficacia de AsiDNA (4,8 pM), olaparib (0, 0,1 y 1 pM) o ambos se monitorizó 6 días después del tratamiento por recuento de las células después de marcación con azul tripán. (A) Porcentaje de células vivas con relación a la afección sin tratar (NT). (B) Porcentaje de células muertas. Los datos se expresan como la media aritmética Sc. D. de al menos dos experimentos independientes. Las líneas de puntos indican las células supervivientes calculadas en caso de aditividad entre AsiDNA y olaparib.
Figura 7: Efecto del tratamiento combinado AsiDNA y olaparib. Análisis de la supervivencia celular (panel superior) y muerte celular (panel inferior) en líneas de células tumorales (panel A) y no tumorales (panel B) en cultivos tratados con 0,1 pM Ola (negro) o no (gris). Las líneas discontinuas indican las células supervivientes calculadas en caso de aditividad entre AsiDNA y Ola (supervivencia a AsiDNA x supervivencia a Olaparib). La supervivencia y la muerte celular se monitorizaron por tinción con azul tripán y recuento manual (6 días después del tratamiento). La supervivencia se expresa como % de células vivas no tratadas y las células muertas como frecuencias de células muertas.
Figura 8: Olaparib inhibe el reclutamiento de XRCC1 a los sitios de deterioro con independencia de AsiDNA. (A) Imágenes representativas del reclutamiento de XRCC1-eYFP 40 segundos después del deterioro por láser y (B) cinética de reclutamiento de XRCC1-eYFP en células MDAMB231 después de 24 horas de tratamiento con Ola (1 pM) y/o AsiDNA (16pM). ns: no significativo; ****: p<0,0001. Estos experimentos se realizaron con un sistema confocal Leica SP5, unido a un soporte DMI6000 utilizando un objetivo 63/1,4 en un ambiente controlado (37°C, 5% CO2). Todos los registros se hicieron utilizando la frecuencia de muestreo apropiada (imágenes 512_512, valor medio de línea de cuatro y zoom ajustado a ocho) y una línea de láser de argón (514 nm para YFP) adaptada para la proteína fluorescente de interés. En el primer paso, se adquirieron dos imágenes dentro de un periodo de 2-3 seg a un ajuste de la energía láser suficientemente bajo para no inducir ningún deterioro fotodinámico. La línea láser de 405 nm (diodo) se ajustó luego a potencia máxima durante 100 ms y se enfocó sobre una mancha simple de tamaño constante (176 nm) dentro del núcleo para causar un punto de fotodeterioro con una cantidad reproducible de energía. El reclutamiento de la proteína de interés se monitorizó luego por fluorescencia utilizando el mismo ajuste que para la secuencia de pre-deterioro. El deterioro por láser se indujo 24 horas después del tratamiento con AsiDNA (16 pM), olaparib (1 pM) o ambos. Las imágenes se capturaron a intervalos de 2 segundos durante los 52 segundos siguientes.
Figura 9: Efecto del tratamiento combinado con AsiDNA y olaparib sobre la reparación del DNA. Imágenes representativas de focos y H2AX (rojo) y Rad51 o 53BP1 (verde) en células MDAMB231 (A) o MCF10 (C) tratadas 24 horas con Ola y/o AsiDNA. (B, D) Numeración de focos 53BP1 y Rad51 en 100 células MDAMB231 (B) o células MCF10A (D) 24 horas después de tratamiento con Ola y/o AsiDNA. Las barras rojas representan los valores medios.
(E, F) deterioro del DNA monitorizado por el ensayo de cometas alcalinas 24 horas después de tratamiento con Ola y/o AsiDNA en células MDAMB231 (E) o MCF10A (F). Ns: no significativo; *: p<0,05; ****: p<0,0001.
Figura 10: AsiDNA inhibe los focos 53BP1 inducidos por irradiación. Numeración de los focos 53BP1 en 100 células MDAMB231 2 horas después de irradiación con 10Gy, 22 horas después de tratamiento previo con AsiDNA y/u Ola. Las barras rojas representan los valores medios. *: p<0,05; **: p<0,01; ****: p<0,0001.
Figura 11: Sinergia del defecto de AsiDNA y PARP. (A) Citotoxicidad de AsiDNA hacia diversas líneas de células isogénicas DT40. (B) Comparación de la supervivencia celular a AsiDNA en células DT40 tipo salvaje (WT; negro) o PARPKO (rojo) solo (línea continua) o en combinación con veliparib 1 pM (línea discontinua azul). La supervivencia se monitorizó por el kit ATPlite de un solo paso (72 horas después del tratamiento) en diversas células DT40 mutantes como se describe en (36). La supervivencia se expresa como % de células no tratadas. Los resultados se representan como supervivencia media ± SEM para tres experimentos independientes.
Figura 12: La asociación de AsiDNA con veliparib exhibe una eficacia supra-aditiva. La eficacia de AsiDNA (4,8 pM), veliparib (0, 10 y 50 pM) o ambos se monitorizó 6 días después de tratamiento por tinción con azul tripán. (A) Porcentaje de células vivas con relación a la afección sin tratar (NT). (B) porcentaje de células muertas. Las líneas de puntos indican las células supervivientes calculadas en caso de aditividad entre AsiDNA y veliparib.
Figura 13: Efecto del tratamiento combinado con AsiDNA y diversos PARPi sobre MDAMB231. Análisis de supervivencia celular (A) y muerte celular (B) en la línea de células MDAMB231 en cultivos tratados con AsiDNA 4,8 pM (negro), AsiDNA 16 pM (gris oscuro) o no (gris claro). Las líneas discontinuas indican las células supervivientes calculadas en caso de aditividad entre AsiDNA y PARPi (supervivencia a AsiDNA x supervivencia a PARPi). Las células supervivientes y las muertas se monitorizaron 6 días después del tratamiento. Las supervivencias se expresan como % de células vivas sin tratar y la muerte celular como frecuencias de células muertas. Las dosis de PARPi se eligieron para dar 80% y 50% de supervivencia (tabla 2).
Descripción Detallada de la Invención
Por consiguiente, la presente invención se refiere a
- una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PARP y una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria, y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable, en particular para uso en el tratamiento del cáncer;
- un producto o kit que contiene un inhibidor de PARP y una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial, en particular en el tratamiento del cáncer;
- una preparación combinada que comprende un inhibidor de PARP y una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria para uso simultáneo, separado o secuencial, en particular en el tratamiento del cáncer;
- una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PARP para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con un tratamiento con una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria;
- una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con un tratamiento con un inhibidor de PARP;
- el uso de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PARP para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con un tratamiento con una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria;
- el uso de una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria para la fabricación de un medicamento para tratamiento del cáncer en combinación con un tratamiento con un inhibidor de PARP;
- el uso de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PARP y una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria, y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer;
- un método para tratamiento de un cáncer en un individuo que se encuentra en necesidad de ello, que comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende a) una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria, b) un inhibidor de PARP, y un portador farmacéuticamente aceptable;
- un método para tratamiento de un cáncer en un individuo que se encuentra en necesidad de ello, que comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PARP, y una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria
- un método para tratamiento de un cáncer en un individuo que se encuentra en necesidad de ello, que comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PARP y una molécula de ácido nucleico como se define en esta memoria.
Los términos "kit", "producto" o "preparación combinada", como se utilizan en esta memoria, definen especialmente un "kit de partes" en el sentido de que los participantes de la combinación como se definen anteriormente pueden dosificarse independientemente o por el uso de diferentes combinaciones ligadas con cantidades distintas de los participantes de la combinación, es decir simultáneamente o en momentos diferentes. Las partes del kit de partes pueden entonces, por ejemplo, administrarse simultáneamente o escalonadas en el tiempo, es decir en momentos diferentes y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. La ratio de las cantidades totales de los participantes de la combinación a administrar en la preparación combinada puede variar. Los participantes de la combinación pueden administrarse por la misma ruta o por rutas diferentes.
Dentro del contexto de la invención, el término tratamiento denota tratamiento curativo, sintomático, y preventivo. Las composiciones farmacéuticas, kits, productos y preparaciones combinadas de la invención pueden utilizarse en humanos con cáncer o tumor existente, incluyendo en las etapas iniciales o finales de progresión del cáncer. Las composiciones farmacéuticas, kits, productos y preparaciones combinadas de la invención no curarán necesariamente al paciente que padece el cáncer, pero retardarán o ralentizarán la progresión o prevendrán la progresión ulterior de la enfermedad, mejorando con ello el estado de los pacientes. En particular, las composiciones farmacéuticas, kits, productos y preparaciones combinadas de la invención reducen el desarrollo de tumores, reducen la carga tumoral, producen regresión del tumor en un hospedador mamífero y/o previenen la aparición de metástasis y la recaída del cáncer. En el tratamiento del cáncer, la composición farmacéutica de la invención se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Por "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende la cantidad de la composición farmacéutica de la invención que previene, elimina o reduce los efectos deletéreos del cáncer en los mamíferos, con inclusión de los humanos, sola o en combinación con los otros ingredientes activos de la composición farmacéutica, kit, producto o preparación combinada. Se entiende que la dosis administrada puede ser menor para cada compuesto en la composición a la "cantidad terapéuticamente eficaz" definida para cada compuesto utilizado sólo o en combinación con tratamientos distintos que la combinación aquí descrita. La "cantidad terapéuticamente eficaz" de la composición será adaptada por los expertos en la técnica conforme al paciente, la patología, el modo de administración, etc.
Siempre que en esta memoria descriptiva completa se menciona "tratamiento de un cáncer" o similar con referencia a la composición farmacéutica de la invención, se entiende: a) un método para tratamiento de un cáncer, comprendiendo dicho método la administración de una composición farmacéutica de la invención a un individuo que precisa dicho tratamiento; b) el uso de una composición farmacéutica de la invención para tratamiento de un cáncer; c) el uso de la composición farmacéutica de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer; y/o d) una composición farmacéutica de la invención para uso en el tratamiento de un cáncer.
Las composiciones farmacéuticas contempladas en esta memoria pueden incluir un portador farmacéuticamente aceptable además del o los ingredientes activos. Se entiende que la expresión "portador farmacéuticamente aceptable" abarca cualquier portador (por ejemplo, soporte, sustancia, disolvente, etc.) que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del o los ingredientes activos y que no es tóxico para el hospedador al que se administra. Por ejemplo, para administración parenteral, el o los compuestos activos pueden formularse en una forma de dosis unitaria para inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, seroalbúmina y solución de Ringer.
La composición farmacéutica puede formularse como soluciones en disolventes farmacéuticamente compatibles o como emulsiones, suspensiones o dispersiones en disolventes farmacéuticos adecuados o vehículo, o como píldoras, tabletas o cápsulas que contienen vehículos sólidos de una manera conocida en la técnica. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración oral pueden encontrarse en forma de unidades discretas como cápsulas, bolsitas, tabletas o pastillas, cada una de las cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o gránulos; en la forma de una solución o una suspensión en un líquido acuoso o líquido no acuoso; o en la forma de una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite. Formulaciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación estéril aceitosa o acuosa del ingrediente activo que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor. Cada una de tales formulaciones puede contener también otros agentes auxiliares farmacéuticamente aceptables y no tóxicos, tales como, por ejemplo, estabilizadores, antioxidantes, ligantes, tintes, emulsionantes o sustancias saborizantes. Las formulaciones de la presente invención comprenden un ingrediente activo en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable para ellas y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos. El portador tiene que ser "aceptable" el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de las formulaciones y no deletéreo para el receptor de las mismas. Las composiciones farmacéuticas se aplican ventajosamente por inyección o infusión intravenosa de soluciones estériles adecuadas o como dosis oral por el tracto digestivo. Métodos para la administración segura y eficaz de la mayoría de estos agentes quimioterapéuticos son conocidos por los expertos en la técnica. Adicionalmente, su administración se describe en la bibliografía estándar.
Inhibidor de PARP
El término "PARP", como se utiliza en esta memoria, se refiere a Poli(ADP-ribosa) polimerasa. PARP cataliza la conversión de p-nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD+) en nicotinamida y poli-ADP-ribosa (PAR). PARP es una molécula clave en la reparación de las roturas monocatenarias (SSBs) del DNA. Como se utiliza en esta memoria, el término "PARP" (EC 2. 4. 2. 30) es equivalente a "PARS" (para poli(ADP-ribosa) sintetasa), "ADPRT" (para NADrprotein(ADP-ribosil)transferasa (polimerizante)), o "pADPRT" (para poli(ADP-ribosa)transferasa).
Como se utiliza en esta memoria, la expresión "inhibidor de PARP" se refiere a cualquier compuesto que tiene la capacidad para disminuir la actividad de una poli(ADP-ribosa)polimerasa(PARP). La inhibición de PARP está basada principalmente en dos mecanismos diferentes: (i) inhibición catalítica que actúa principalmente por inhibición de la actividad de la enzima PARP y (ii) inhibición ligada que bloquea la actividad de la enzima PARP y previene su desprendimiento del sitio de deterioro. Los inhibidores ligados son más tóxicos para las células que los inhibidores catalíticos. Los inhibidores de PARP conforme a la invención son preferiblemente inhibidores catalíticos y/o ligados.
En una realización preferida, el inhibidor de PARP es un inhibidor de cualquier enzima de la familia PARP, preferentemente PARP1 y/o PARP2.
La actividad de PARP puede determinarse por la diversidad de técnicas bien conocidas por las personas expertas. Usualmente, estas técnicas comprenden medir la incorporación de una poli(ADP-ribosa) marcada en proteínas histona. Kits comerciales para tales técnicas están disponibles (véase, por ejemplo, los kits Tervigen con poli(ADP-ribosa) biotinilada). Pueden utilizarse también otros métodos tales como el desarrollado por Putt KS et al (Anal Biochem, 326(1):78-86, 2004) cuya descripción se incorpora a la presente por referencia en su totalidad.
Estos métodos son ideales para la determinación de los valores CI50 de los inhibidores de PARP conocidos o sospechados.
Se conocen muchos inhibidores de PARP y, así, pueden ser sintetizados por métodos conocidos a partir de materias primas que son conocidas, pueden estar disponibles comercialmente, o pueden prepararse por métodos utilizados para preparar compuestos correspondientes en la bibliografía.
Ejemplos de inhibidores de PARP adecuados conforme a la invención incluyen, pero no se limitan a, olaparib (AZD-2281, 4-[(3-[(4-ciclopropilcarbonil)piperazin-4-il]carbonil)-4-fluorofenil]metil(2H)-ftalazin-1-ona), veliparib (ABT-888, CAS 912444-00-9, 2-((fi)-2-metilpirrolidin-2-il)-1W-benzimidazol-4-carboxamida), CEP- 8 9 8 3 (11-metoxi-4,5,6,7-tetrahidro-1 H-ciclopenta[a]pirrolo[3,4-c]carbazol-1,3(2H)-diona) o un profármaco del mismo (por ejemplo CEP-9722), rucaparib (AG014699, PF-01367338, 8-fluoro-2-{4-[(metilamino)metil]fenil}-1,3,4,5-tetrahidro-6H-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona), E7016 (GPI-21016, 10-((4-hidroxipiperidin-1 -il)metil)cromeno-[4,3,2-de]ftalazin-3(2H)-ona), talazoparib (BMN-673, (8S, 9R)-5-fluoro-8-(4-fluorofenil)-9-(1 -metil-1 H-1,2,4-triazol-5-il)-8,9-dihidro-2H-pirido[4, 3, 2de]ftalazin-3(7H)-ona), INO-1001 (ácido 4-fenoxi-3-pirrolidin-1-il-5-sulfamoil-benzoico), KU0058684 (c As 623578­ 11-0), niraparib (MK 4827, Merck & Co Inc), iniparib (BSI 201), iniparib-met (metabolito C-nitroso de lniparib), CEP 9722 (Cephalon Inc), LT-673, MP-124, NMS-P118, XAV939, AZD 2461, nicotinamidas, 5-metil-nicotinamida, 4-amino-1,8-naftalimida, picolinamida, benzamidas, benzamidas 3-sustituidas, 3-metoxibenzamida, 3-hidroxibenzamida, 3-aminobenzamida, 3-chloroprocainamida, 3-nitrosobenzamida, 4-aminobenzamida, 2-aminobenzamida, metil-3,5-diiodo-4-(4'-metoxifenoxi)-benzoato, metil-3,5-diiodo-4-(4'-metoxi-3',5'-diyodo-fenoxi)benzoato, benzamidas cíclicas, 1,5-di[(3-carbamoilfenil)-amino-carboniloxi]-pentano, indoles, benzimidazoles, benzoxazol-4-carboxamidas, benzimidazol-4-carboxamidas, benzoxazol-4-carboxamidas 2-sustituidas, benzimidazol-4-carboxamidas 2-sustituidas, 2-aril-benzimidazol-4-carboxamidas, 2-cicloalquilbenzimidazol-4-carboxamidas, 2-(4-hidroxfenil) benzimidazol A-carboxamida, quinoxalinacarboxamidas, imidazopiridinacarboxamidas, 2-fenilindoles, benzoxazoles 2-sustituidos, 2-fenil-benzoxazol, 2-(3-metoxifenil)-benzoxazol, benzimidazoles 2-sustituidos, 2-fenil-benzimidazol, 2-(3-metoxifenil)-benzimidazol, 1,3,4,5-tetrahidro-azepino[5,4,3-cd]indol-6-ona, azepinoindoles, azepinoindolonas, 1,5dihidro-azepino[4, 5, 6-cd]indolin-6-ona, dihidrodiazapinoindolinona, dihidrodiazapinoindolinonas 3-sustituidas, 3-(4-trifluorometilfenil)-dihidrodiazapinoindolinona, tetrahidrodiazapinoindolinona, 5,6-dihidroimidazo[4,5,1-j,k][1,4]venzodiazopin-7(4H)-ona, 2-fenil-5,6-dihidro-imidazo[4,5,1-jk][1,4]benzodiazepin-7(4H)-ona, 2,3-dihidro-isoindol-1 -ona, benzimidazol-2-piperazina, derivados heterocíclicos de benzimidazol-2-piperazina, 4-yodo-3-nitrobenzamida, benzopironas, 1,2-benzopirona-6-nitrosobenzopirona, 6-nitroso-1,2-benzopirona, 5-yodo-6-aminobenzopirona, benzoilurea, quinolona, isoquinolona, isoquinolinonas, dihidroisoquinolinonas, 2H-isoquinolin-1-onas, 3H-quinazolin-4-onas, dihidroisoquinolinonas 5-sustituidas, 5-hidroxi-dihidroisoquinolinona, 5-metil-dihidroisoquinolinona, 5-hidroxiisoquinolinona, 5-amino-isoquinolin-1-ona, 5-dihidroxiisoquinolinona, 1,5-dihidroxiisoquinolina, 1,5-isoquinolinadiol, 4-hidroxiquinazolina, tiazolil-isoquinolinonas sustituidas, oxazoil-isoquinolinonas sustituidas, tetrahidro-2H-isoquinolin-1-ona, 3,4-dihidroisoquinolin-1 (2H)-onas, 3,4-dihidro-5-metoxi-isoquinolin-1 (2H)-ona, 3,4-dihidro-5-metil-1 (2H)-isoquinolinona, 3H-quinazolin-4-ona, isoquinolin-1(2H)-onas, 3,4-dihidroisoquinolin-1(2H)-ona, 4-carboxamidobenzimidazol, 2-quinolinonas sustituidas con 6-ciclohexilalquil sustituido, 2-quinoxalinonas sustituidas con 6-ciclohexilalquil sustituido, 2-quinolinonas sustituidas con 7-fenilalquilo, 2-quinoxalinonas sustituidas con 7-fenilalquilo, 2-quinolinonas-6-sustituidas, 2-quinoxalinonas-6-sustituidas, 1 -(arilmetil)quinazolina-2,4(1 H,3H)-diona, 4,5-dihidroimidazo[4,5,1-il]quinolin-6-onas, 1,6-naftiridina-5(6H)-onas, 1,8-naftalimidas, 4-amino-1,8-naftalimidas, 3,4-dihidro-5-[4-1 (1 -piperidinil)butoxi]-1 (2H)-isoquinolinona, 2,3-dihidrobenzo[de]isoquinolin-1 -ona, 1-1 1 b-dihidro-[2H]benzopirano[4,3,2-de]isoquinolin-3-ona, lactamas tetracíclicas, benzopiranoisoquinolinonas, benzopirano[4,3,2-de]-isoquinolinona, quinazolinas, quinazolinonas, quinazolinadionas, A-hidroxiquinazolina, quinazolinas 2-sustituidas, 8-hidroxi-2- metilquinazolin-4-(3H)ona, ftalazinas, ftalazinonas, ftalazin-1(2H)-onas, 5-metoxi-4-metil-1(2)-ftalazinonas, ftalazinonas 4-sustituidas, 4-(1-piperazinil)-1(2H)-ftalazinona, benzopirano tetracíclico-[4,3,2-de]ftalazinonas y tetracíclico-indeno-[1,2,3-de]ftalazinonas, ftalazinonas tricíclicas, 2-aminoftalhidrazida, ftalazinona-cetona, dihidropiridoftalazinona, 5-arilamino-1h-piridina-2-onas 6-sustituidas, piridazinonas, tetrahidropirido-piridazinona, tetraaza-fenalen-3-ona, tieno[2,3-c]isoquinolin-5-ona (TIQ-A), 2,5-diazabiciclo[2,2,1]heptano, pirimidoimidazol, isoindolinonas, fenantridinas, fenantridinonas, 5[H]fenantridin-6-ona, 5[H]-fenantridin-6-onas sustituidas, 5[H]fenantridin-6-onas 2,3-sustituidas, derivados sulfonamida/carbamida de 6(5H)fenantridinonas, tieno[2,3-c]isoquinolonas, 9-aminotieno[2,3-c]isoquinolona, 9-hidroxitieno[2,3-c]isoquinolona, 9-metoxitieno[2,3-c]isoquinolona, N-(6-oxo-5,6-dihidrofenantridin-2-il]-2-(N,N-dimetilamino}acetamida, 4,9-dihidrociclopenta[imn]-fenantridina-5-onas sustituidas, derivados de ácido hidroxímico insaturados, amidoxima O-(3-piperidino-2-hidroxi-1-propil)-nicotínica, amidoxima del ácido O-(2-hidroxi-3-piperidino-propil)-3-carboxílico, piridazinas, pirazinamida, BGB-290, PF-1367338 (Pfizer Inc), AG014699 (Pfizer, Inc.), KU-59436 (KuDOS/AstraZeneca PJ34, 4-amino-1,8-naftalimida (Trevigen), 6(5H)-fenantridinona-(Trevigen), NU1025, 4-HQN, BGP -15, A-966492, GPI21016, 6(5H)-fenantridinona (Phen), teobromina, teofilina, cafeína, metilxantinas, timidina, 3-aminoftalhidrazida, análogos, derivados o una mezcla de los mismos.
Inhibidores de PARP adicionales se describen por ejemplo en WO14201972, WO14201972, WO12141990, WO10091140, WO9524379, WO09155402, WO09046205, WO08146035, WO08015429, WO0191796, WO0042040, US2006004028, EP2604610, EP1802578, CN104140426, CN104003979, US060229351, US7041675, WO07041357, WO2003057699, US06444676, US20060229289, US20060063926, WO2006033006, WO2006033007, WO03051879, , WO2004108723, WO2006066172, WO2006078503, US20070032489, WO2005023246, WO2005097750, WO2005123687, WO2005097750, US7087637, US6903101, WO20070011962, US20070015814, WO2006135873, UA20070072912, WO2006065392, WO2005012305, WO2005012305, EP412848, EP453210, EP454831, EP879820, EP879820, WO030805, WO03007959, US6989388, US20060094746, EP1212328, WO2006078711, US06426415, US06514983, EP1212328, US20040254372, US20050148575, US20060003987, US06635642, WO200116137, WO2004105700, WO03057145A2, WO2006078711, WO2002044157, US20056924284, WO2005112935, US20046828319, WO2005054201, WO2005054209, WO2005054210, WO2005058843, WO2006003146, WO2006003147, WO2006003148, WO2006003150, WO2006003146, WO2006003147, UA20070072842, US05587384, US20060094743, WO2002094790, WO2004048339, EP1582520, US20060004028, WO2005108400, US6964960, WO20050080096, WO2006137510, UA20070072841, WO2004087713, WO2006046035, WO2006008119, WO06008118, WO2006042638, US20060229289, US20060229351, WO2005023800, WO1991007404, WO2000042025, WO2004096779, US06426415, WO02068407, US06476048, WO2001090077, WO2001085687, WO2001085686, WO2001079184, WO2001057038, WO2001023390, WO01021615A1, WO2001016136, WO2001012199, WO95024379, WO200236576, WO2004080976, WO2007149451, WO2006110816, WO2007113596, WO2007138351, WO2007144652, WO2007144639, WO2007138351, WO2007144637, Banasik et al. (J. Biol. Chem., 267:3, 1569-75, 1992), Banasik et al. (Molec. Cell. Biochem, 138:185-97, 1994), Cosi et al. (Expert Opin. Ther. Patents 12 (7), 2002), Southan y Szabo (Curr Med Chem, 10321-340, 2003), Underhill C. et al. (Annals de Oncology, doi:10. 1093/annonc/mdq322, pp 1-12, 2010), Murai J. et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther., 349:408-416, 2014), todas estas patentes y publicaciones se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.
En una realización preferida, el compuesto inhibidor de PARP se selecciona del grupo que consiste en rucaparib (AG014699, PF-01367338), olaparib (AZD2281), veliparib (ABT888), iniparib (BSI 201), niraparib (MK 4827), talazoparib (BMN673), AZD 2461, CEP 9722, E7016, INO-1001, LT-673, MP-124, NMS-P118, XAV939, análogos, derivados o una mezcla de los mismos.
En una realización aún más preferida, el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que consiste en rucaparib (AG014699, PF-01367338), olaparib (AZD2281), veliparib (ABT888), iniparib (BSI 201), niraparib (MK 4827), talazoparib (BMN673), AZD 2461, análogos, derivados o una mezcla de los mismos.
Moléculas de ácido nucleico
Las moléculas de ácido nucleico para uso en la presente invención, conjugadas o no, pueden describirse por las fórmulas siguientes:
Figure imgf000010_0001
en donde N es un nucleótido, n es un número entero de al menos 1, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal fosfodiéster modificada, L' es un enlazador, C es una molécula que facilita la endocitosis, L es un enlazador, m y p, independientemente, son un número entero que es 0 ó 1. En las fórmulas (II) y (III), C-Lm está enlazado respectivamente al extremo 5' o al extremo 3' del nucleótido. En la fórmula (I-III), C-Lm está enlazado preferiblemente a L' a través de un enlace disulfuro (S-S). Cuando la molécula está conjugada, p es 1. Preferiblemente, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene una cadena principal fosfodiéster modificada.
En realizaciones preferidas, la molécula de fórmula (I), (II) o (III) tiene una o varias de las características siguientes:
- N es un desoxinucleótido, seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en A (adenina), C (citosina), T (timina) y G (guanina) y seleccionado de tal manera que evita la existencia de un dinucleótido CpG y que tiene menos de 80% o 70%, incluso menos de 60% o 50% de identidad de secuencia a cualquier gen en un genoma humano; y/o,
- n es un número entero de 1 a 195, preferiblemente de 3 a 195, de 23 a 195, o de 25 a 195, opcionalmente de 1 a 95, de 2 a 95, de 3 a 95, de 5 a 95, de 15 a 195, de 19-95, de 21 a 95, de 23 a 95, de 25 a 95, de 27 a 95, de 1 a 45, de 2 a 35, de 3 a 35, de 5 a 35, de 15 a 45, de 19 a 45, de 21 a 45, o de 27 a 45. En una realización particularmente preferida, n es 27; y/o,
- la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal fosforotioato o metilfosfonato, más preferiblemente una cadena principal fosforotioato; preferiblemente, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene una cadena principal fosfodiéster modificada, y/o,
- la L' enlazada se selecciona del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis (fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis (fosfo)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano; y/o,
- m es 1 y L es un carboxamido-polietilenglicol, más preferiblemente carboxamido-trietilenglicol o carboxamidotetraetilenglicol; y/o,
- C se selecciona del grupo que consiste en un colesterol, ácidos grasos de cadena simple o doble tales como ácido octadecílico, oleico, dioleoílico o esteárico, o ligando (con inclusión de péptido, proteína, aptámero) que está orientado a receptores celulares tales como ácido fólico, tocoferol, azúcar tal como galactosa y manosa y su oligosacárido, péptido tal como RGD y bombesina, y proteína tal como transferrina e integrina, siendo preferiblemente un colesterol o un tocoferol, y todavía más preferiblemente un colesterol.
Preferiblemente, C-Lm es un radical enlazador trietilenglicol (10-O-[1-propil-3-N-carbamoilcolesteril]-trietilenglicol). Alternativamente, C-Lm es un radical enlazador tetraetilenglicol(10-O-[1-propil-3-N-carbamoilcolesteril]-tetraetilenglicol).
En una realización preferida, la molécula Dbait conjugada o molécula de ácido nucleico en horquilla tiene la fórmula siguiente:
c ----------- ----------------------- ,,
NNNN-(N)n-N — ( l r )
con la misma definición que las fórmulas (I), (II), (II') y (III) para N, N_n, L, L', C y m.
En una realización particular, las moléculas de ácido nucleico pueden ser moléculas Dbait tales como las descritas extensamente en las solicitudes de patente PCT WO2005/040378, WO2008/034866 y WO2008/084087, cuya descripción se incorpora a la presente por referencia.
Las moléculas Dbait pueden definirse por cierto número de características necesarias para su actividad terapéutica, tales como su longitud mínima, la presencia de al menos un extremo libre, y la presencia de una porción bicatenaria, preferiblemente una porción de DNA bicatenario. Como se expondrá más adelante, es importante indicar que la secuencia nucleotídica precisa de las moléculas Dbait no afecta a su actividad. Adicionalmente, las moléculas Dbait pueden contener una cadena principal modificada y/o no natural.
Preferiblemente, las moléculas Dbait son de origen no humano (es decir, su secuencia nucleotídica y/o conformación (por ejemplo, horquilla) no existe como tal en una célula humana), muy preferiblemente de origen sintético. Dado que la secuencia de las moléculas Dbait desempeña, en todo caso, un papel poco importante, las moléculas Dbait no tienen preferiblemente ningún grado significativo de homología o identidad de secuencia con genes, promotores, intensificadores, secuencias aguas arriba 5' o 3', exones, intrones, y análogos conocidos. Dicho de otro modo, las moléculas Dbait tienen menos de 80 % ó 70 %, incluso menos de 60% o 50% de identidad de secuencia a cualquier gen en un genoma humano. Los métodos de determinación de la identidad de secuencia son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, Blast. Las moléculas Dbait no se hibridan, en condiciones severas, con el DNA genómico humano. Condiciones severas típicas son tales que facilitan la discriminación de ácidos nucleicos totalmente complementarios con respecto a ácidos nucleicos parcialmente complementarios.
Adicionalmente, la secuencia de las moléculas Dbait esta preferiblemente desprovista de CpG a fin de evitar las bien conocidas reacciones inmunológicas mediadas por receptores tipo Toll.
La longitud de las moléculas Dbait puede ser variable, con tal que la misma sea suficiente para permitir la ligación apropiada del complejo proteínico Ku que comprende Ku y proteínas DNA-PKcs. Se ha demostrado que la longitud de las moléculas Dbait tiene que ser mayor que 20 pb, con preferencia aproximadamente 32 pb, para asegurar la ligación a un complejo Ku de este tipo y permitir la activación de DNA-PKcs. Preferiblemente, las moléculas Dbait comprenden entre 20 y 200 pb, más preferiblemente 24-100 pb, todavía más preferiblemente 26-100, y muy preferiblemente entre 24-200, 25-200, 26-200, 27-200, 28-200, 30-200, 32-200, 24-100, 25-100, 26-100, 27-100, 28­ 100, 30-100, 32-200 ó 32-100 pb. Por ejemplo, las moléculas Dbait comprenden entre 24-160, 26-150, 28-140, 28­ 200, 30-120, 32-200 ó 32-100 pb. Por "pb" se entiende que la molécula comprende una porción bicatenaria de la longitud indicada.
En una realización particular, las moléculas Dbait que tienen una porción bicatenaria de al menos 32 pb, o de aproximadamente 32 pb, comprenden la misma secuencia nucleotídica que Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ iD No 2), Dbait32Hb (SEQ iD No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SeQ ID No 5). Opcionalmente, las moléculas Dbait tienen la misma composición de nucleótidos que Dbait32, Dbait32Ha, Dbait32Hb, Dbait32Hc o Dbait32Hd, pero su secuencia nucleotídica es diferente. Así, las moléculas Dbait comprenden una cadena de la porción bicatenaria con 3 A, 6 C, 12 G y 11 T. Preferiblemente, la secuencia de las moléculas Dbait no contiene ningún dinucleótido CpG.
Alternativamente, la porción bicatenaria comprende al menos 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32 nucleótidos consecutivos de Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 2), Dbait32Hb (s Eq ID No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SEQ ID No 5). En una realización más particular, la porción bicatenaria consiste en 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32 nucleótidos consecutivos de Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 2), Dbait32Hb (SEQ iD No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SEQ ID No 5).
El ácido nucleico que se describe en esta memoria debe tener al menos un extremo libre, como un mimético de DSB. Dicho extremo libre puede ser un extremo libre romo o un extremo cohesivo 5'-/3'-. El "extremo libre" se refiere en esta memoria a una molécula de ácido nucleico, en particular una porción de ácido nucleico bicatenario, que tiene a la vez un extremo 5' y un extremo 3' o que tiene un extremo 3' o un extremo 5'. Opcionalmente, uno de los extremos 5' y 3' puede utilizarse para conjugar la molécula de ácido nucleico o puede enlazarse a un grupo bloqueador, por ejemplo, un enlace nucleotídico 3'-3'.
En una realización alternativa, las moléculas de ácido nucleico contienen dos extremos libres y pueden ser lineales. Por consiguiente, las moléculas Dbait pueden ser también una molécula bicatenaria con dos extremos libres y que tiene la secuencia de nucleótidos de Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 2), Dbait32Hb (SEQ ID No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SEQ ID No 5).
En otra realización particular, aquéllas contienen un solo extremo libre. Preferiblemente, las moléculas Dbait están constituidas por ácidos nucleicos en horquilla con un tallo de DNA bicatenario y un bucle. El bucle puede ser un ácido nucleico, u otros grupos químicos conocidos por una persona experta, o una mezcla de los mismos. Un enlazador nucleotídico puede incluir de 2 a 10 nucleótidos, preferiblemente, 3, 4 ó 5 nucleótidos. Enlazadores no nucleotídicos incluyen, no exhaustivamente, nucleótido abásico, poliéter, poliamina, poliamida, péptido, carbohidrato, lípido, polihidrocarburo, u otros compuestos polímeros (por ejemplo, oligoetilenglicoles tales como los que tienen entre 2 y 10 unidades etilenglicol, preferiblemente 4, 5, 6, 7 u 8 unidades etilenglicol). Un enlazador preferido se selecciona del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis (fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxononadecano y otros enlazadores tales como 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano. Por consiguiente, en una realización particular, las moléculas Dbait pueden ser una molécula en horquilla que tiene una porción bicatenaria o tallo que comprende al menos 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32 nucleótidos consecutivos de Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 2), Dbait32Hb (SEQ ID No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SEQ ID No 5) y un bucle que es un enlazador hexaetilenglicol, un enlazador tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano o 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano. En una realización más particular, dichas moléculas Dbait pueden tener una porción bicatenaria consistente en 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32 nucleótidos consecutivos de Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 2), Dbait32Hb (SeQ ID No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SEQ ID No 5).
Las moléculas Dbait comprenden preferiblemente una cadena principal de 2'-desoxinucleótido, y comprenden opcionalmente uno o varios (2, 3, 4, 5 ó 6) nucleótidos modificados y/o nucleobases distintas de adenina, citosina, guanina y timina. Por consiguiente, las moléculas Dbait son esencialmente una estructura de DNA. En particular, la porción bicatenaria o tallo de las moléculas Dbait está hecha de desoxirribonucleótidos.
Moléculas Dbait preferidas comprenden uno o varios nucleótidos o grupos modificados químicamente al final de una o de cada cadena, en particular para protegerlas contra la degradación. En una realización preferida particular, el o los extremos libres de las moléculas Dbait está (están) protegidos por una, dos o tres cadenas principales fosfodiéster modificadas al final de una o de cada cadena. Grupos químicos preferidos, en particular la cadena principal fosfodiéster modificada, comprenden fosforotioatos. Alternativamente, Dbait preferidas tienen enlaces nucleotídicos 3'-3', o nucleótidos con cadena principal metilfosfonato. Otras cadenas principales modificadas son bien conocidas en la técnica y comprenden fosforamidatos, ácido morfolino-nucleico, ácido nucleico bloqueado puenteado con 2'-0,4'-C metileno/etileno, ácido nucleico peptídico (PNA), y enlaces inter- azúcar alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces intra-azúcar heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta de longitud variable, o cualesquiera nucleótidos modificados conocidos por las personas expertas. En una primera realización preferida, las moléculas Dbait tienen el o los extremos libres protegidos por una, dos o tres cadenas principales fosfodiéster modificadas en el extremo de una o de cada cadena, más preferiblemente por tres cadenas principales fosfodiéster modificadas (en particular fosforotioato o metilfosfonato) al menos en el extremo 3', pero todavía más preferiblemente en ambos extremos 5' y 3'.
En una realización muy preferida, la molécula Dbait es una molécula de ácido nucleico en horquilla que comprende una porción bicatenaria o tallo de DNA de 32 pb (por ejemplo, con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Núms. 1-5, en particular SEQ ID No. 4) y un bucle que enlaza las dos cadenas de la porción bicatenaria o tallo de DNA que comprende o consiste en un enlazador seleccionado del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano, teniendo los extremos libres de la porción bicatenaria o tallo de DNA (es decir en el extremo opuesto del bucle) tres cadenas principales fosfodiéster modificadas (en particular enlaces internucleotídicos fosforotioato).
Dichas moléculas de ácido nucleico se producen por síntesis química, semi-biosíntesis o biosíntesis, cualquier método de amplificación, seguido por cualesquiera métodos de extracción y preparación y cualquier modificación química. Los enlazadores se proporcionan de tal modo que pueden incorporarse por síntesis química estándar de ácidos nucleicos. Más preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico se fabrican por síntesis convergente diseñada especialmente: se preparan dos cadenas complementarias por síntesis química estándar de ácidos nucleicos con la incorporación de un precursor enlazador apropiado, y después de su purificación, aquéllas se acoplan covalentemente una a otra.
Opcionalmente, las moléculas de ácido nucleico pueden conjugarse a moléculas que facilitan la endocitosis o absorción celular.
En particular, las moléculas que facilitan la endocitosis o absorción celular pueden ser moléculas lipófilas tales como colesterol, ácidos grasos de cadena simple o doble, o ligandos que están orientados a receptores celulares que facilitan la endocitosis mediada por receptores, tales como ácido fólico y derivados folato o transferrina (Goldstein et al. Ann. Rev. Cell Biol. 1985 1:1 -39; Leamon & Lowe, Proc Natl Acad Sci USA. 1991,88: 5572-5576.). La molécula puede ser también tocoferol, azúcar tal como galactosa y manosa y su oligosacárido, péptido tal como RGD y bombesina y proteína tal como integrina. Los ácidos grasos pueden ser saturados o insaturados y estar comprendidos entre C4-C28, preferiblemente entre C14-C22, siendo todavía más preferiblemente C18, tales como ácido oleico o ácido esteárico. En particular, los ácidos grasos pueden ser octadecílico o dioleoílico. Los ácidos grasos pueden encontrarse como forma de doble cadena enlazada con un enlazador apropiado tal como glicerol, una fosfatidilcolina o etanolamina y análogos o enlazadas una a otra por los enlazadores utilizados para unirse en la molécula Dbait. Como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que el término "folato" se refiere a folato y derivados de folato, con inclusión de derivados de ácido pteroico y análogos. Los análogos y derivados de ácido fólico adecuados para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, antifolatos, didihidrofolatos, tetrahidrofolatos, ácido folínico, ácido pteropoliglutámico, 1-deaza, 3-deaza, 5-deaza, 8-deaza, 10-deaza, 1,5-deaza, 5,10-dideaza, 8,10-dideaza, y 5,8-dideazafolatos, antifolatos, y derivados de ácido pteroico. Análogos de folato adicionales se describen en US2004/242582. Por consiguiente, la molécula que facilita la endocitosis puede seleccionarse del grupo que consiste en ácidos grasos de cadena simple o doble, folatos y colesterol. Más preferiblemente, la molécula que facilita la endocitosis se selecciona del grupo que consiste en dioleoílo, octadecilo, ácido fólico, y colesterol. En una realización muy preferida, la molécula de ácido nucleico está conjugada a un colesterol. Las moléculas que facilitan la endocitosis están conjugadas a las moléculas Dbait, preferiblemente a través de un enlazador. Puede utilizarse cualquier enlazador conocido en la técnica para unir covalentemente la molécula que facilita la endocitosis a las moléculas Dbait. Por ejemplo, WO09/126933 proporciona una revisión extensa de enlazadores convenientes en las páginas 38-45. El enlazador puede ser, sin carácter exhaustivo, cadena alifática, poliéter, poliamina, poliamida, péptido, carbohidrato, lípido, polihidrocarburo, u otros compuestos polímeros (por ejemplo oligoetilenglicoles tales como los que tienen entre 2 y 10 unidades etilenglicol, preferiblemente 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades etilenglicol, todavía más preferiblemente 6 unidades etilenglicol), y que incorporan cualesquiera enlaces que puedan romperse por vía química o enzimática, tales como un enlace disulfuro, un enlace disulfuro protegido, un enlace lábil en medio ácido (p. ej. enlace hidrazona), un enlace éster, un enlace ortoéster, un enlace fosfonamida, un enlace peptídico bioescindible, un enlace azo o un enlace aldehído. Tales enlazadores escindibles se detallan en WO2007/040469 páginas 12-14, y en WO2008/022309 páginas 22-28.
En una realización particular, la molécula de ácido nucleico puede estar enlazada a una molécula que facilita la endocitosis. Alternativamente, varias moléculas que faciliten la endocitosis (p. ej. dos, tres o cuatro) pueden estar unidas a una molécula de ácido nucleico.
En una realización específica, el enlazador entre la molécula que facilita la endocitosis, en particular colesterol, y la molécula de ácido nucleico es CO-NH-(CH2-CH2-O)n, en donde n es un número entero de 1 a 10, seleccionándose preferiblemente n del grupo que consiste en 3, 4, 5 y 6. En una realización muy particular, el enlazador es CO-NH-(CH2-CH2-O)4 (carboxamido-tetraetilenglicol). En otra realización muy particular, el enlazador es CO-NH-(CH2-CH2-O)3 (carboxamido-trietilenglicol). El enlazador puede enlazarse a las moléculas de ácido nucleico en cualquier posición conveniente que no modifique la actividad de las moléculas de ácido nucleico. En particular, el enlazador puede estar enlazado en el extremo 5', en el extremo 3' o en el bucle cuando la molécula de ácido nucleico es una horquilla. Por tanto, en una realización preferida, la molécula Dbait conjugada contemplada es una molécula Dbait que tiene una estructura de horquilla y que está conjugada a la molécula que facilita la endocitosis, preferiblemente a través de un enlazador, en su extremo 5'.
En otra realización específica, el enlazador entre la molécula que facilita la endocitosis, en particular colesterol, y la molécula de ácido nucleico es dialquil-disulfuro {p. ej., (CH2)r-S-S-(CH2)s, siendo r y s números enteros de 1 a 10, preferiblemente de 3 a 8, por ejemplo 6}.
En una realización muy preferida, la molécula Dbait conjugada es una molécula de ácido nucleico en horquilla que comprende una porción bicatenaria de DNA o tallo de 32 pb (p. ej., con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Núms. 1-5, en particular SEQ ID Núm. 4) y un bucle que enlaza las dos cadenas de la porción bicatenaria de DNA o tallo que comprende o consiste en un enlazador seleccionado del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1 -hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano, teniendo los extremos libres de la porción bicatenaria de DNA o tallo (es decir en el lado opuesto del bucle) tres cadenas principales fosfodiéster modificadas (en particular enlaces internucleotídicos fosforotioato) y estando dicha molécula Dbait conjugada a un colesterol en su extremo 5', preferiblemente a través de un enlazador (p. ej. carboxamido-oligoetilenglicol, preferiblemente carboxamidotrietilenglicol o carboxamido-tetraetilenglicol).
En una realización preferida, NNNN-(N)n-N comprende al menos 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32 nucleótidos consecutivos de Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 2), Dbait32Hb (SEQ ID No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SEQ iD No 5) o consiste en 20, 22, 24, 26, 28, 30 ó 32 nucleótidos consecutivos de Dbait32 (SEQ ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 2), Dbait32Hb (SEQ ID No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SEQ ID No 5). En una realización particular, NNNN-(N)n-N comprende o consiste en Dbait32 (s Eq ID No 1), Dbait32Ha (SEQ ID No 2), Dbait32Hb (SEQ ID No 3), Dbait32Hc (SEQ ID No 4) o Dbait32Hd (SEQ ID No 5), más preferiblemente Dbait32Hc (SEQ ID No 4).
Por consiguiente, la molécula Dbait conjugada o molécula de ácido nucleico en horquilla puede seleccionarse del grupo que consiste en:
cuando NNNN-(N)n-N es SEQ ID Núm. 1
Figure imgf000014_0001
cuando NNNN-(N)n-N es SEQ ID No 5
G CTAG G TCTG TTTG G TG G CTT
Figure imgf000015_0001
CG ATCCAG ACAAACCACCG AA
(le) SEQ ID No 10
_ C-L„ _ _ GCTAGGTCTGTTTGGTGGCTTTGCAGTGGCAC
Figure imgf000015_0002
CGATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGTG.
(He) SEQ ID No 15
GCTAGGTCTGTTTGGTGGCTT TGCAGTGGCAC
Figure imgf000015_0003
. CGATCCAGACAAACCACCGAAACGTCACCGTG.
y ( i , (lile) SEQ ID No 20
con la misma definición que las fórmulas (I), (II) y (III) para L, L’, C, p y m.
En realizaciones preferidas, la molécula de fórmuIas (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (II Id), (Ie), (IIe) y (IIIe), preferiblemente de fórmulas (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) y (IIe), tiene una o varias de las características siguientes:
- el nucleótido subrayado se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal fosforotioato o metilfosfonato, más preferiblemente una cadena principal fosforotioato; preferiblemente, el nucleótido subrayado se refiere a un nucleótido que tiene una cadena principal fosforotioato o metilfosfonato, más preferiblemente una cadena principal fosforotioato y/o,
- el L' enlazado se selecciona del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1 -hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano; y/o, - m es 1 y L es un carboxamido-polietilenglicol, más preferiblemente carboxamido-trietilenglicol o carboxamidotetraetilenglicol; y/o,
- p es 1; y/o,
- C se selecciona del grupo que consiste en un colesterol, ácidos grasos de cadena simple o doble tales como ácido octadecílico, oleico, dioleoílico o esteárico, o ligando (con inclusión de péptido, proteína, aptámero) que está orientado a un receptor celular tal como ácido fólico, tocoferol, azúcar tal como galactosa y manosa y su oligosacárido, péptido tal como RGD y bombesina, y proteína tal como transferrina e integrina, siendo preferiblemente un colesterol.
Preferiblemente, C-Lm es un radical enlazador trietilenglicol (10-O-[1-propil-3-N-carbamoilcolesteril]-trietilenglicol. Alternativamente, C-Lm es un radical enlazador tetraetilenglicol (10-O-[1-propil-3-N-carbamoilcolesteril]-tetraetilenglicol.
En una realización específica de las moléculas Dbait o moléculas de ácido nucleico en horquilla de las fórmulas (I), (II), (II') , (III), (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) y (IIIe), preferiblemente de las fórmulas (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) y (IIe), L' se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano.
En una realización específica de las moléculas Dbait o moléculas de ácido nucleico en horquilla de fórmulas (I), (II), (II'), (III), (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) y (IIIe), preferiblemente de fórmulas (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) y (IIe), siendo C colesterol, C-Lm es el radical
Figure imgf000015_0004
En una realización preferida, la molécula Dbait conjugada o molécula de ácido nucleico en horquilla se selecciona del grupo que consiste en (II), (II'), (IIa), (Ilb), (IIc), (Ild), y (IIe), en donde C-Lm es el radical
Figure imgf000016_0001
y en donde L' si selecciona preferiblemente del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano, más preferiblemente 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano.
En una realización muy específica, la molécula Dbait o molécula de ácido nucleico en horquilla tiene la fórmula siguiente
Figure imgf000016_0002
en donde C-Lm es el radical
Figure imgf000016_0003
en donde L' es 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y en donde los nucleótidos subrayados tienen una cadena principal fosforotioato. Por consiguiente, la molécula tiene la estructura siguiente y se refiere a ella en la sección de Ejemplos como "coDbait".
Figure imgf000016_0004
En una realización específica de las moléculas Dbait o moléculas de ácido nucleico en horquilla de fórmulas (I), (II), (II'), (III), (Ia), (IIa), (IIIa), (Ib), (IIb), (IIIb), (Ic), (IIc), (IIIc), (Id), (IId), (IIId), (Ie), (IIe) y (IIIe), preferiblemente de fórmulas (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) y (IIe), siendo C colesterol, C-Lm es un radical enlazador tetraetilenglicol (10-O-[1 -propil-3-N-carbamoilcolesteril]-tetraetilenglicol.
En una realización preferida, la molécula Dbait conjugada o molécula de ácido nucleico en horquilla se selecciona del grupo que consiste en (II), (II'), (IIa), (IIb), (IIc), (IId), y (IIe), en donde C-Lm es el radical enlazador tetraetilenglicol (10-O-[1 -propil-3-N-carbamoilcolesteril]-tetraetilenglicol y en donde L' se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano, más preferiblemente 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano.
En una realización muy específica, la molécula Dbait o molécula de ácido nucleico en horquilla (AsiDNA o DT01) tiene la fórmula siguiente
Figure imgf000017_0001
en donde C-Lm es el radical enlazador tetraetilenglicol (10-O-[1-propil-3-N-carbamo¡lcolester¡l]-tetraet¡lengl¡col y L' es 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano.
Figure imgf000017_0002
En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico tiene una de las fórmulas siguientes
Figure imgf000017_0003
en donde N es un desoxinucleótido, n es un número entero de 1 a 15, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal fosfodiéster modificada, L' es un enlazador, C es un colesterol, L es un enlazador, m es un número entero que es 0 ó 1, y p es 1. Preferiblemente, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene una cadena principal fosfodiéster modificada. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico tiene la fórmula (II). Por consiguiente, la presente invención se refiere también al uso de una molécula Dbait o una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, una composición farmacéutica que comprende la misma y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable, para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con un inhibidor de PARP, y con o sin radioterapia y/o terapia con radioisótopos y/o una quimioterapia antitumoral, preferiblemente con un agente antitumoral que deteriora el DNA, como se detalla más adelante.
Combinaciones adicionales
Opcionalmente, el tratamiento con una molécula de ácido nucleico como se describe en esta memoria y un inhibidor de PARP puede utilizarse en combinación con una radioterapia, una terapia de radioisótopos y/u otra quimioterapia antitumoral, inmunoterapia, o terapia hormonal. Preferiblemente, la quimioterapia antitumoral es un tratamiento por un agente antitumoral que deteriora el DNA, sea directa o indirectamente.
Como se utiliza en esta memoria, la expresión "quimioterapia antitumoral" o el término "quimioterapia" se refiere a un tratamiento terapéutico del cáncer que utiliza sustancias químicas o bioquímicas, utilizando en particular uno o varios agentes anti-neoplásicos. En particular, la expresión o el término citados incluye también terapia hormonal e inmunoterapia. La expresión "terapia hormonal" se refiere a un tratamiento de cáncer que tiene como propósito bloquear, añadir o eliminar hormonas. Por ejemplo, en el cáncer de mama, las hormonas femeninas estrógeno y progesterona pueden promover el crecimiento de algunas células de cáncer de mama. Así, en estas pacientes, se da terapia hormonal para bloquear el estrógeno y una lista no exhaustiva de fármacos utilizados comúnmente incluye: Tamoxifeno, Fareston, Arimidex, Aromasin, Femara, Zoladex/Lupron, Megace, y Halotestin. El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento terapéutico del cáncer que utiliza el sistema inmune para rechazar el cáncer. El tratamiento terapéutico estimula el sistema inmune del paciente para atacar las células tumorales malignas.
En un aspecto particular, la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria y el inhibidor de PARP se utilizan en combinación con un tratamiento que deteriora el DNA. El tratamiento deteriorante del DNA puede ser radioterapia, o quimioterapia como un agente antitumoral deteriorante del DNA, o una combinación de las mismas. El tratamiento deteriorante del DNA se refiere a un tratamiento que induce la rotura de cadenas del DNA, con preferencia de manera relativamente específica en las células de cáncer.
La rotura de cadenas del DNA puede lograrse por radiación ionizada (radioterapia). La radioterapia incluye, pero no se limita a, rayos y, rayos X, y/o el suministro directo de radioisótopos a las células tumorales. Otras radioterapias incluyen microondas e irradiación UV. Otras estrategias a la terapia de radiación se contemplan también en la presente invención.
La rotura de cadenas del DNA puede lograrse por terapia de radioisótopos, en particular por administración de un radioisótopo, preferiblemente un radioisótopo marcado. La orientación puede deberse a las propiedades químicas del isótopo tal como yodo radiactivo que es absorbido específicamente por la glándula tiroides mil veces mejor que por otros órganos. Alternativamente, la orientación puede lograrse uniendo al radioisótopo otra molécula que tenga propiedades de orientación tal como hapteno o anticuerpo. Puede utilizarse cualquiera de cierto número de isótopos radiactivos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, Indio-111, Lutecio-171, Bismuto-212, Bismuto-213, Astato-211, Cobre-62, Cobre-64, Cobre-67, Ytrio-90, Yodo-125, Yodo-131, Fósforo-32, Fósforo-33, Escandio-47, Plata-111, Galio-67, Praseodimio-142, Samario-153, Terbio-161, Disprosio-166, Holmio-166, Renio-186, Renio-188, Renio-189, Plomo-212, Radio-223, Actinio-225, Hierro-59, Selenio-75, Arsénico-77, Estroncio-89, Molibdeno-99, Rodio-105, Paladio-109, Praseodimio-143, Prometio-149, Erbio-169, Iridio-194, Oro-198, Oro-199, y Plomo-211.
El agente antitumoral deteriorante del DNA se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un inhibidor de las topoisomerasas I o II, un reticulador del DNA un agente alquilante del DNA, un agente anti-metabólico e inhibidores de los husos mitóticos.
Inhibidores de las topoisomerasas I y/o II incluyen, pero no se limitan a, etoposido, topotecán, camptotecina, irinotecán, amsacrina, intoplicina, antraciclinas tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, idanrrubicina y mitoxantrona. Inhibidores de la Topoisomerasa I y II incluyen, pero no se limitan a, intoplecina.
Reticuladores del DNA incluyen, pero no se limitan a, cisplatino, carboplatino y oxaliplatino.
Los agentes antimetabólicos bloquean las enzimas responsables de la síntesis de ácido nucleico o llegan a incorporarse en el DNA, lo cual produce un código genético incorrecto y conduce a apoptosis. Ejemplos no exhaustivos de los mismos incluyen, sin limitación, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores de la adenosina-desaminasa, y más particularmente Metotrexato, Floxuridina, Citarabina, 6-Mercaptopurina, 6-Tioguanina, Fludarabina fosfato, Pentostatina, 5-fluorouracilo, gemcitabina y capecitabina.
El agente antitumoral deteriorante del DNA puede ser agentes alquilantes que incluyen, sin limitación, mostazas nitrogenadas, derivados de etilen-imina, alquilsulfonatos, nitrosoureas, sales metálicas y triazenos. Ejemplos no exhaustivos de los mismos incluyen mostaza de Uracilo, Clormetina, Ciclofosfamida (CYTOXAN(R)), lfosfamida, Melfalán, Clorambucil, Pipobromano, Trietilenomelamina, Trietileno-tiofosforamina, Busulfán, Carmustina, Lomustina, Fotemustina, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, tiotepa, Estreptozocina, Dacarbazina, y Temozolomida.
Inhibidores de los husos mitóticos incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel, docetaxel, vinorelbina, larotaxel (llamado también XRP9881; Sanofi-Aventis), XRP6258 (Sanofi-Aventis), BMS-184476 (Bristol-Meyer-Squibb), BMS-188797 (Bristol-Meyer-Squibb), BMS-275183 (Bristol-Meyer-Squibb), ortataxel (llamado también IDN 5109, Ba Y 59-8862 o Sb -T-101131; Bristol-Meyer-Squibb), RPR 109881A (Bristol-Meyer-Squibb), RPR 116258 (Bristol-Meyer-Squibb), NBT-287 (TAPESTRY), PG-paclitaxel (llamado también CT-2103, PPX, paclitaxel poliglumex, paclitaxel poliglutamato o Xyotax™), ABRAXa Ne® (llamado también Nab-Paclitaxel ; a BrAXiS BIOSCIENCE), Tesetaxel (llamado también DJ-927), IDN 5390 (INDEnA), Taxoprexin (llamado también ácido docosahexanoico; PROTARGA), DHA-paclitaxel (llamado también Taxoprexin®), y MAC-321 (WYETH). Véase también la revisión de Hennenfent & Govindan (2006, Annals de Oncology, 17, 735-749).
Cánceres o tumores a tratar
Los términos "cáncer", "canceroso", o "maligno" se refieren a o describen la afección fisiológica en los mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen, por ejemplo, leucemia, linfoma, blastoma, carcinoma y sarcoma.
Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica aguda positiva al cromosoma Filadelfia (Ph+ ALL), carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de páncreas, glioblastoma multiforme, cáncer cervical, cáncer de estómago, cáncer de mama, hepatocarcinoma, cáncer de mama, carcinoma de colon, y cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, tumor de las células germinales, sarcoma pediátrico, mieloma múltiple, leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica crónica, mastocitosis y cualquier síntoma asociado con mastocitosis.
"Leucemia" se refiere a enfermedades malignas progresivas de los órganos formadores de sangre, y se caracteriza generalmente por una proliferación y desarrollo distorsionados de leucocitos y sus precursores en la sangre y la médula ósea. La leucemia se clasifica clínicamente en general sobre la base de (1) la duración y el carácter de la enfermedad -aguda o crónica; (2) el tipo de células implicado; mieloide (mielógena), linfoide (linfógena), o monocíclica; y (3) el aumento o la ausencia de aumento en el número de células anormales en la sangre -leucémica o aleucémica (subleucémica). La leucemia incluye, por ejemplo, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de las células T adultas, leucemia aleucémica, una leucemia leucocitémica, leucemia basófila, leucemia de células blásticas, leucemia de los bovinos, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrional, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de células vellosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células madre, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfógena, leucemia linfoide, leucemia con células de linfosarcoma, leucemia mastocítica, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia granulocítica mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmacítica, leucemia promielocítica, leucemia con células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células madre, leucemia subleucémica, y leucemia de células no diferenciadas. En ciertos aspectos, la presente invención proporciona tratamiento para leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, y/o leucemia linfoblástica aguda positiva al cromosoma Filadelfia (Ph+ ALL).
Diversos cánceres están abarcados también por el alcance de la invención, incluyendo, pero no se limitan a, los siguientes: carcinoma con inclusión del de vejiga (con inclusión de cáncer de vejiga acelerado y metastásico), mama, colon (con inclusión de cáncer colorrectal), riñón, hígado, pulmón (con inclusión de cáncer de pulmón microcítico y no microcítico y adenocarcinoma de pulmón), ovario, próstata, testículos, tracto genitourinario, sistema linfático, recto, laringe, páncreas (con inclusión de carcinoma pancreático exocrino), esófago, estómago, vesícula biliar, cérvix, tiroides, y piel (con inclusión de carcinoma de células escamosas); tumores hematopoyéticos de linaje linfoide con inclusión de leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de las células B, linfoma de las células T, linfoma de Hodgkins, linfoma no-Hodgkins, linfoma de células vellosas, linfoma histiocítico, y linfoma de Burketts; tumores hematopoyéticos de linaje mieloide con inclusión de leucemias mielógenas agudas y crónicas, síndrome mielodisplásico, leucemia mieloide, y leucemia promielocítica; tumores del sistema nervioso central y periférico que incluyen astrocitoma, neuroblastoma, glioma, y schwannomas; tumores de origen mesenquimático que incluyen fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, y osteosarcoma; otros tumores que incluyen melanoma, xenoderma pigmentosum, queratoactantoma, seminoma, cáncer folicular de tiroides, y teratocarcinoma; melanoma, melanoma maligno de fase III o IV irresecable, carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, glioma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de páncreas, glioblastoma multiforme, cáncer cervical, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatocarcinoma, cáncer de mama, carcinoma de colon, y cáncer de cabeza y cuello, retinoblastoma, cáncer gástrico, tumor de las células germinales, cáncer de huesos, tumores de huesos, histiocitoma fibroso maligno de los huesos adultos; histiocitoma fibroso maligno de huesos de la infancia; sarcoma, sarcoma pediátrico; síndromes mielodisplásicos, neuroblastoma; tumor de las células germinales de los testículos, melanoma intraocular, síndromes mielodisplásicos; enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, sarcoma sinovial.
En una realización preferida de la presente invención, el cáncer es un tumor sólido. Por ejemplo, el cáncer puede ser sarcoma y osteosarcoma tal como sarcoma de Kaposi, sarcoma de Kaposi relacionado con el SIDA, melanoma, en particular melanoma uveal, y cánceres de cabeza y cuello, riñón, ovario, páncreas, próstata, tiroides, pulmón, esófago, mama, vejiga, tracto colorrectal, hígado y tracto biliar, uterino, de apéndice, y de cérvix, cáncer testicular, cánceres gastrointestinales y cánceres endometriales y peritoneales. Preferiblemente, el cáncer puede ser sarcoma, melanoma, en particular melanoma uveal, y cánceres de cabeza y cuello, riñón, ovario, páncreas, próstata, tiroides, pulmón, esófago, mama, vejiga, tracto colorrectal, hígado, cérvix, y cánceres endometriales y peritoneales.
Las composiciones farmacéuticas y los productos, kits o preparaciones combinadas descritos en la invención pueden ser útiles para inhibir el crecimiento de tumores sólidos, disminuir el volumen de tumor, prevenir la propagación metastásica de tumores y el crecimiento o desarrollo de micrometástasis. Las composiciones farmacéuticas y los productos, kits o preparaciones combinadas descritas en la invención son adecuadas en particular para el tratamiento de pacientes con mala prognosis o de tumores radio-o quimio-resistentes.
En una realización particular, el cáncer es un cáncer de grado alto o avanzado o es un cáncer metastásico.
En otra realización particular, el cáncer no es deficiente o deteriorado para la reparación por Recombinación Homóloga (p. ej., no mutado en BRCA ni BRCAness).
Régimen, dosis y rutas de administración
La dosis eficaz de cada uno de los participantes de la combinación empleados en la preparación combinada de la invención puede variar dependiendo del compuesto o la composición farmacéutica particular empleado(a), el modo de administración, la afección de que se trate, y la gravedad de la afección de que se trate. Así, el régimen de dosis de la preparación combinada de la invención se selecciona conforme a una diversidad de factores que incluyen la ruta de administración y el estado del paciente. Un médico, clínico o veterinario con experiencia ordinaria puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de los ingredientes activos individuales requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección. La precisión óptima en el alcance de la concentración de los ingredientes activos dentro del intervalo que proporciona eficacia sin toxicidad requiere un régimen basado en la cinética de la disponibilidad de los ingredientes activos para los sitios diana.
La presente invención se refiere más particularmente a una composición farmacéutica, un kit, producto o preparación combinada en donde la cantidad o dosis del inhibidor de PARP puede reducirse en comparación con su cantidad o dosis cuando se utiliza solo. De hecho, la combinación de una molécula Dbait y un inhibidor de PARP conduce al menos a un efecto aditivo, pero más bien a un efecto claramente sinérgico de los dos ingredientes activos. Este efecto de potenciación facilita la disminución de la cantidad del inhibidor de PARP, que exhibe generalmente cierta toxicidad para las células normales y por tanto puede estar asociado con efectos adversos. Las moléculas Dbait exhiben ventajosamente una toxicidad mínima, e incluso ninguna toxicidad. Así pues, con el tratamiento combinado de la invención, es posible preservar la eficacia del tratamiento, o incluso aumentarla, en tanto que se reducen sus efectos adversos, en particular los efectos adversos del inhibidor de PARP.
Alternativamente, en lugar de disminuir la cantidad o dosis del inhibidor de PARP, puede reducirse la frecuencia de administración del inhibidor de PARP o su periodo de tratamiento.
Conforme a una realización, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un cáncer, a una composición farmacéutica, a un producto, kit o preparación combinada como se ha descrito anteriormente, en donde las cantidades de la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria y el inhibidor de PARP en la preparación combinada son tales que el efecto terapéutico combinado de los ingredientes activos es adicional o preferiblemente sinérgico.
Por el término efecto terapéutico "sinérgico" se entiende que el efecto terapéutico obtenido de la combinación es mayor que la suma del efecto terapéutico de cada participante aislado (es decir mayor que el efecto de la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria aislada más el efecto del inhibidor de PARP aislado). Por el término efecto terapéutico "adicional" se entiende que el efecto terapéutico obtenido de la combinación es la suma del efecto terapéutico de cada participante aislado (es decir igual al efecto de la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria aislada más el efecto del inhibidor de PARP aislado).
La presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un cáncer, a una composición farmacéutica, a un producto, kit o preparación combinada como se ha descrito anteriormente, en donde el inhibidor de PARP se utiliza a una dosis menor que la dosis convencional utilizada en quimioterapia para la misma indicación y la misma ruta de administración cuando aquélla se utiliza sola (es decir, la cantidad igual a o preferiblemente menor que la utilizada en quimioterapia convencional), llamada también en esta memoria una cantidad sub-terapéutica. Más particularmente, la cantidad puede ser por ejemplo 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ó 10 % de la dosis terapéutica convencional (en particular para la misma indicación y la misma ruta de administración). Las dosis terapéuticas convencionales son las reconocidas por las agencias de aprobación de fármacos (p. ej., FDA o EMEA). A este respecto, la presente invención se refiere a un método para tratamiento de un cáncer, a una composición farmacéutica, a un producto, kit o preparación combinada como se describe anteriormente, en donde la cantidad del inhibidor de PARP se utiliza a una dosis sub­ terapéutica y la cantidad de la molécula de ácido nucleico como se describe en esta memoria es tal que el efecto terapéutico combinado de los dos ingredientes activos es adicional o más preferiblemente sinérgico.
La presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un cáncer que comprende la administración de una cantidad eficaz terapéuticamente sinérgica de la preparación combinada de (a) una molécula de ácido nucleico como se describe en esta memoria y (b) un inhibidor de PARP.
La invención se refiere también a una combinación sinérgica que comprende (a) una molécula de ácido nucleico como se describe en esta memoria y (b) un inhibidor de PARP en una ratio sinérgica para uso simultáneo, separado o secuencial, en particular en el tratamiento de un cáncer.
En una realización particular, la molécula de ácido nucleico como se describe en esta memoria es DT01 como se define anteriormente y el inhibidor de PARP se selecciona del grupo constituido por AZD2281 (Olaparib), ABT888 (Veliparib), BMN673, BSI-21 (Iniparib), AZD 2461, MK-4827 (Niraparib), y AG 014699 (Rucaparib), siendo más preferiblemente AZD2281 (Olaparib) o ABT888 (Veliparib).
Por la expresión "cantidad eficaz terapéuticamente sinérgica" o "ratio sinérgica" se entiende que el efecto terapéutico de la combinación es mayor que la suma del efecto terapéutico de cada participante aislado (es decir mayor que el efecto terapéutico de la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria aislada más el efecto terapéutico del inhibidor de PARP aislado).
La invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende una cantidad que es conjuntamente terapéuticamente eficaz contra un cáncer de la combinación de la invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular de la invención, la combinación sinérgica es tal que el inhibidor de PARP se utiliza o administra en una cantidad sub-terapéutica. En particular, una cantidad sub-terapéutica del inhibidor de PARP es menor que la dosis convencional utilizada para tratar un cáncer como un solo fármaco (es decir, no combinado con otro fármaco). Más particularmente, la cantidad sub-terapéutica puede ser por ejemplo 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 ó 10% de la dosis terapéutica convencional para la misma indicación y la misma ruta de administración. Las dosis terapéuticas convencionales son las reconocidas por las agencias de aprobación de fármacos (p. ej., FDA o EMEA) y pueden encontrarse en referencias.
La determinación de una interacción adicional o sinérgica entre uno o más componentes, el intervalo óptimo para el efecto y los intervalos de dosis absolutos de cada componente para el efecto puede medirse definitivamente por administración de los componentes a lo largo de diferentes intervalos de ratio p/p y dosis a pacientes que se encuentran en necesidad de tratamiento. Para humanos, la complejidad y el coste de la realización de estudios clínicos en pacientes puede hacer prácticamente imposible el uso de esta forma de ensayo como modelo primario para sinergia. Sin embargo, la observación de sinergia en una especie puede ser predictiva del efecto en otras especies y existen modelos animales para medir un efecto sinérgico, pudiendo utilizarse también los resultados de tales estudios para predecir los intervalos de ratios de concentración en plasma y la dosis eficaz y las dosis y concentraciones en plasma absolutas requeridas en otras especies por la aplicación de métodos farmacocinéticos/farmacodinámicos. Las correlaciones entre modelos de cáncer y efectos observados en el hombre sugieren que la sinergia observada en modelos animales puede ser predictiva también de una sinergia en el hombre.
La actividad farmacológica de una combinación de la invención puede, por ejemplo, demostrarse en un estudio clínico o más preferiblemente en un procedimiento de test. Estudios clínicos adecuados son, por ejemplo, estudios abiertos de escalación de dosis no aleatorizados en pacientes con tumores avanzados. Tales estudios pueden probar la aditividad o sinergia de los ingredientes activos de la combinación de la invención. Los efectos beneficiosos en enfermedades proliferativas pueden determinarse directamente a partir de los resultados de estos estudios o por cambios en el diseño del estudio que son conocidos como tales para una persona experta en la técnica. Tales estudios son adecuados, en particular, para comparar los efectos de una monoterapia utilizando los ingredientes activos y una combinación de la invención. Preferiblemente, se administra el participante de la combinación (a) con una dosis ligada y se escala la dosis del participante de la combinación (b) hasta que se alcanza la dosis máxima tolerada. Alternativamente, se administra el participante de la combinación (b) con una dosis ligada y se escala la dosis del participante de la combinación (a) hasta que se alcanza la dosis máxima tolerada.
La ruta de administración para la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria puede ser oral, parenteral, intravenosa, intratumoral, subcutánea, intracraneal, intra-arterial, tópica, rectal, transdérmica, intradérmica, nasal, intramuscular, intraperitoneal, intraósea, y análogas. En una realización preferida, las moléculas Dbait deben administrarse o inyectarse cerca del sitio o sitios del tumor a tratar. En otra realización particular, cuando el cáncer a tratar es un melanoma, la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria puede suministrarse por inyección subcutánea e intravenosa. Otra ruta de administración preferida es una inyección intra-tumoral.
Cuando se utiliza un agente antitumoral deteriorante del DNA en combinación con la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria y un inhibidor de PARP, el agente antitumoral deteriorante del DNA, la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria y el inhibidor de PARP pueden administrarse por la misma ruta o por rutas distintas. La ruta de administración para el agente antitumoral deteriorante del DNA puede ser oral, parenteral, intravenosa, intratumoral, subcutánea, intracraneal, intraarterial, tópica, rectal, transdérmica, intradérmica, nasal, intramuscular, intraósea, y análogas.
La molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria debe administrarse antes y/o simultáneamente a y/o después de la irradiación y/o la administración del agente antitumoral deteriorante del DNA, más preferiblemente antes y/o simultáneamente a la irradiación y/o la administración del agente antitumoral deteriorante del DNA. La irradiación y/o la administración del agente antitumoral deteriorante del DNA se realiza de tal manera que la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria está presente en las células tumorales cuando se aplica la irradiación o cuando el agente antitumoral deteriorante del DNA alcanza las células tumorales. El médico, clínico o veterinario con experiencia ordinaria puede determinar el régimen basado en los ingredientes activos, sus cinéticas de disponibilidad para los sitios diana o sus perfiles farmacocinéticos en plasma. Resultados preliminares indican que las moléculas Dbait se mantienen activas durante un día.
Una vez que se ha iniciado el tratamiento por radioterapia o con el agente antitumoral deteriorante del DNA, el tratamiento con la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria puede continuar durante tanto tiempo como vaya a aplicarse o administrarse el tratamiento por radioterapia o con el agente antitumoral deteriorante del DNA. Alternativamente, el tratamiento con la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria puede finalizar también.
La dosis eficaz de la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria empleada en combinación con un inhibidor de PARP puede variar dependiendo del modo de administración, la afección que se esté tratando, y la gravedad de la afección que se esté tratando. Así, el régimen de dosis de la molécula de ácido nucleico que se describe en esta memoria se selecciona Por consiguiente una diversidad de factores que incluyen la ruta de administración y el estado del paciente. Un médico, clínico o veterinario con experiencia ordinaria puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la molécula de ácido nucleicos que se describe en esta memoria requerida para prevenir, contrarrestar o detener la progresión del cáncer.
Por ejemplo, para administración local (p. ej. cuando se utiliza administración intratumoral o sub-cutánea), la cantidad eficaz de las moléculas Dbait es al menos 0,01 mg por 1 cm3 de tumor, preferiblemente 0,1 - 40 mg por 1 cm3 de tumor, muy preferiblemente 1 - 20 mg por 1 cm3 de tumor. La cantidad eficaz puede administrarse en un protocolo de tratamiento diario (p. ej., 5 días por semana durante 3 a 6 semanas consecutivas o 3 veces por semana durante 3 a 6 semanas consecutivas). Alternativamente, puede administrarse una cantidad eficaz de al menos 0,1 mg por 1 cm3 de tumor, preferiblemente 0,1 - 40 mg por 1 cm3 de tumor, muy preferiblemente 1 - 20 mg por 1 cm3 de tumor, en un protocolo de tratamiento semanal durante 3-6 semanas consecutivas, por ejemplo. Cuando se utilizan otras rutas de administración, el experto en la técnica puede adaptar la cantidad a fin de obtener una cantidad eficaz de las moléculas Dbait en el tumor de al menos 0,01 mg por 1 cm3 de tumor, preferiblemente 0,1 - 40 mg por 1 cm3 de tumor, muy preferiblemente 1 - 20 mg por 1 cm3 de tumor, en particular en un protocolo de tratamiento diario o en un protocolo de tratamiento semanal. Por ejemplo, para una ruta sistémica, la cantidad eficaz o dosis unitaria de las moléculas Dbait puede ser de 0,1 a 100 mg, preferiblemente de 4 a 40 mg. Por consiguiente, para una ruta sistémica, la cantidad eficaz o dosis unitaria de las moléculas Dbait puede ser de 0,06 a 0,6 mg/kg de paciente. Por supuesto, la dosis y el régimen pueden ser adaptadas por el experto en la técnica teniendo en consideración el régimen de quimioterapia y/o radioterapia.
Para radioterapia, puede utilizarse cualquier régimen de radioterapia conocido en la técnica, en particular irradiación estereotáxica (p. ej., 15 Gy) o una irradiación fraccionada. El uso de una irradiación fraccionada puede ser particularmente eficaz; por ejemplo, la irradiación puede aplicarse cada día o cada 2-5 días, preferiblemente cada 3-4 días, en un periodo de una, dos, tres, cuatro, cinco, o seis semanas. La irradiación puede ser de 1 a 10 Gy, preferiblemente de 2 a 5 Gy, en particular 2, 3, 4 ó 5 Gy. Por ejemplo, puede contemplarse una irradiación fraccionada de 15x2Gy en seis semanas o de 4 a 6x5Gy en dos semanas. En una realización preferida, la radioterapia contemplada es un protocolo con 4 irradiaciones de 5 Gy en 2 semanas. Regímenes o condiciones diferentes de tratamientos combinados de cáncer con irradiación y moléculas Dbait han sido ensayados y han permitido demostrar que la radiosensibilización de los tumores por moléculas Dbait depende de las dosis de moléculas Dbait, pero no de las dosis de irradiación.
Para quimioterapia, la dosis eficaz del agente antitumoral deteriorante del DNA empleado en la preparación combinada, kit o producto de la invención o en combinación con la composición de la invención puede variar dependiendo del agente antitumoral deteriorante del DNA particular empleado, el modo de administración, la afección de que se trate, y la gravedad de la afección de que se trate. Así, el régimen de dosis del agente antitumoral deteriorante del d Na se selecciona Por consiguiente una diversidad de factores que incluyen la ruta de administración y el estado del paciente. Un médico, clínico o veterinario con experiencia ordinaria puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz del agente antitumoral deteriorante del DNA requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso del cáncer.
El tratamiento puede incluir uno o varios ciclos, por ejemplo 2 a 10 ciclos, en particular 2, 3, 4 ó 5 ciclos. Los ciclos pueden ser continuados o separados. Por ejemplo, cada ciclo está separado por un período de tiempo de 1 a 8 semanas, preferiblemente 3 a 4 semanas.
Aspectos y ventajas adicionales de la presente invención se describirán en los ejemplos que siguen, que deberían considerarse como ilustrativos y no limitantes.
Ejemplos
EJEMPLO 1
Ensayo in vivo sobre la supervivencia de las células
Los inventores ensayaron el efecto de la combinación de DT01 con olaparib o veliparib sobre la supervivencia de las células. Más particularmente, los resultados se muestran en la Figura 1.
Líneas de células de cáncer de mama MDAMB231 se trataron con 100 pg/ml (negro, cuadrados) o 333 pg/ml (gris, cruces) de DT01 o sin DT01 (negro, rombos) y se expusieron a 0, 0,1 y 1 pM de Olaparib (panel superior) ó 1, 10 y 50 pM Veliparib (panel inferior). La supervivencia se midió 6 días después del tratamiento utilizando azul tripán para detectar las células vivas. Los datos se presentan como % del control sin tratar. DT01 tenía un efecto independiente que daba como resultado 88% y 49% de supervivencia después de exposición a 100 y 333 pg/ml. La adición de inhibidores de PARP, a saber, Olaparib o Veliparib, aumentaba significativamente la muerte celular (líneas de trazo lleno). La supervivencia al tratamiento combinado era inferior al efecto añadido esperado de ambos tratamientos simples (líneas de puntos), revelando un efecto sinérgico a cada dosis ensayada de DT01 e inhibidores de PARP.
Así pues, la combinación de inhibidores de PARP y moléculas Dbait exhibe un efecto antitumoral mayor que la suma esperada de los efectos de los tratamientos individuales. Esta supra-aditividad se observa para todas las dosis de cada fármaco. La supra-aditividad se observa con la combinación de la familia Dbait con todos los inhibidores de PARP. De hecho, Olaparib pertenece al tipo de inhibidores de PARP (ii), mientras que Veliparib pertenece al tipo (ii). Así pues, el efecto sinérgico observado no depende del mecanismo de inhibición.
Los inventores ensayaron el efecto de la combinación sobre varias líneas de células diferentes. Los resultados se muestran en la Figura 2.
La supervivencia de las células expuestas a 0,1 pM Olaparib (negro), 100 pg/ml DT01 (gris) o ambos tratamientos 0,1 pM Olaparib 100 pg/ml DT01 (rayado) se monitorizó en diferentes células tumorales (de cánceres de Cérvix, Glioblastoma, Sangre, Mama) y dos células de mama no tumorales. Las mutaciones principales en la reparación del DNA se indican en el panel inferior de la Figura.
El efecto supra-aditivo de la combinación se observó en todas las líneas de células cualquiera que sea el defecto en la reparación (BRCA-/-, defecto de Recombinación Homóloga; DNA-PKcs-/-, defecto de Unión de Extremos No Homólogos). Unicamente las células deficientes en actividad de PARP (HelaPARP1KO) no respondían a la combinación dado que las mismas son insensibles a los inhibidores de PARP. Las líneas de células de cáncer que se sabe son resistentes a Olaparib tales como Hela, MO59K, MO59J, Hut7, IM9, MD231, y BC173 muestran el efecto supra-aditivo del tratamiento combinado. Las células no tumorales eran insensibles a ambos tratamientos, simple y combinado.
Materiales y Métodos
Las líneas de células humanas se cultivaron en RPMI completo (Gibco, Cergy Pontoise, Francia) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (ATGC, Orléans, Francia), 1% de piruvato de sodio, estreptomicina (100 mg. mL-1) y penicilina (100 mg. mL-1) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Las células se mantuvieron a 37°C en una atmósfera con 5% de CO2 , a 100% de humedad. Los tratamientos se realizaron por adición de nucleótidos (DT01 y otros) y/o inhibidores de PARP en el tiempo cero en medio sin suero. El medio se cambió con medio nuevo que contenía suero de bovino fetal 24 horas después del comienzo del tratamiento. Las células se dejaron crecer durante 4 días adicionales (5 días después del tratamiento), se trataron con tripsina y se sometieron a recuento del número total de células. Se añadió azul tripán (0,4%) para recuento de las células vivas (no coloreadas) en la población.
Ensayo in vivo sobre el crecimiento del tumor
Ratones atímicos con líneas de células de cáncer de mama humano MD227 xenoinjertado injertadas en la almohadilla grasa se trataron por administración intratumoral de DT01 (5 mg/día) y Olaparib (200 mg/kg/día). El crecimiento del tumor se monitorizó (tiempo cero: comienzo del tratamiento). Se trataron 8 a 10 animales por grupo (grupo 1: inyección de vehículo (línea gris); grupo 2: DT01 (línea de puntos negra); grupo 3: olaparib (línea de puntos gris); grupo 4; DT01 olaparib (línea negra)). El tratamiento se administró durante los 5 días siguientes. Los resultados se presentan en la Figura 3 y demuestran un tamaño reducido del tumor en comparación con animales tratados con olaparib solo o DT01 solo.
Materiales y métodos
Se obtuvieron tumores de xenoinjerto de cáncer de mama humano por inyección de 4. 106 células tumorales en la almohadilla grasa de ratones atímicos hembra adultos (Janvier, Le Genest Saint Isle, Francia). Los animales se alojaron en el laboratorio durante al menos 1 semana antes del comienzo de los experimentos. Había 6 animales por jaula en condiciones controladas de ciclos de luz y oscuridad (12 horas: 12 horas), humedad relativa (55%), y temperatura (21°C. Estaban disponibles comida y agua del grifo ad libitum. Cuando los tumores subcutáneos alcanzaron aproximadamente 125 mm3, se separaron los ratones en grupos homogéneos que recibieron protocolos de tratamiento diferentes: ningún tratamiento (NT), DT01 solo durante 1 semana (tratamiento intratumoral de 2,5 mg y subcutáneo de 2,5 mg cada día durante 5 días), Olaparib solo (200 mg/kg/día) durante 1 semana (5 sesiones diarias per os), y el tratamiento combinado DT01 Olaparib 1 semana (5 sesiones diarias). En todos los experimentos, los tumores se midieron con un calibre digital cada 2-3 días. No se apreció toxicidad local en la piel o toxicidad sistémica alguna. Los volúmenes de tumor se calcularon utilizando la fórmula siguiente: longitud x anchura x anchura/2. Los ratones se pesaron cada semana y se siguieron durante 280 días. Por razones éticas, los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron 1500 mmP. El Comité Local sobre Ética de Experimentación con Animales aprobó todos los experimentos.
EJEMPLO 2
Los inventores analizaron los efectos combinados de dos clases de inhibidores de la reparación del DNA y demuestran que su asociación mimetiza letalidad sintética en todas las células. Compararon la eficacia de un DBait (AsiDNA) y el inhibidor de PARP (olaparib) en 12 líneas de células de Cáncer de Mama. El análisis de datos ómicos multi-nivel de estas líneas de células, interpretado en el contexto de mapas de redes de señalización, puso de relieve diferentes perfiles moleculares de reparación del DNA asociados con la sensibilidad a DBait u olaparib, que racionalizan el tratamiento combinado. El efecto supra-aditivo del tratamiento combinado con DBait y olaparib se confirmó en 20 líneas de células tumorales sin toxicidad significativa alguna para las células no tumorales. El análisis molecular demuestra que olaparib y DBait previenen respectivamente el reclutamiento de las enzimas reparadoras XRCC1 y RAD51/53BP1 en sitios de deterioro y tienen efectos acumulativos cuando se combinan. Se observó también la sinergia del tratamiento cuando se combinó DBait con otros inhibidores de PARP. Los resultados presentes ponen de relieve el interés terapéutico de la combinación de DBait e inhibidores de PARP para recapitular la letalidad sintética en todos los tumores.
Los inventores analizaron primeramente la sensibilidad a olaparib (Ola) y DBait en un panel de líneas de células de cáncer de mama (BC). BC es la enfermedad maligna femenina más común, con más de 1,7 millones de casos nuevos diagnosticados en el mundo cada año. Se observan mutaciones desactivadoras de BRCA en el 8,8% de todos los tumores BC esporádicos con una prevalencia de 30% en el subgrupo tipo Basal/Triple negativo. Los inventores utilizaron un panel de líneas de células BC con diferentes estados de BRCAness, y analizaron en primer lugar su sensibilidad al PARPi, olaparib (Ola) y DBait independientemente. Las líneas de células BC se clasificaron Por consiguiente su sensibilidad a DBait u Ola. El análisis de datos ómicos multi-nivel de estas líneas de células en el contexto de mapas de redes de señalización exhaustivos identificó diferentes perfiles moleculares asociados a la sensibilidad de DBait u Ola, especialmente en los mecanismos de reparación del DNA, poniendo de relieve el interés de la combinación de estos dos fármacos. Los inventores observaron un efecto sinérgico de Ola y DBait en las líneas de células BC con indiferencia de su estado de BRCAness y demuestran que esta combinación es eficaz en muchos tipos de células de cáncer y con diferentes inhibidores de PARP.
Resultados
Las líneas de células BC exhiben diferentes sensibilidades a AsiDNA y olaparib
La eficacia de Ola y AsiDNA se evaluó por medida de la muerte y proliferación celular en 12 líneas de células BC que incluían 4 líneas de células con la mutación BRCA (Figura 4A y B y Figura 5). Adicionalmente, se utilizaron células HeLa silenciadas para los genes BRCA 1 o BRCA 2 como control del factor de mutación BRCA y tres líneas de células mamarias inmortalizadas (MCF10A, MCF12A y 184B5) como controles no tumorales. Las concentraciones de los fármacos (0,1 pM para Ola y 4,8 pM para AsiDNA) se eligieron basándose en el 75-80% de supervivencia en el mutante BC 227 BRCA 2-/-. En todas las líneas de células BC, la disminución en el número relativo de células estaba correlacionada con un aumento en la muerte celular (Figura 4A, Figura 5) indicando que el número de células vivas refleja un efecto citotóxico y no un efecto citostático. Los tratamientos con Ola y AsiDNA no tenían efecto alguno sobre las tres líneas de células de control no tumorales. En contraste, las líneas de células tumorales revelaban una supervivencia que variaba desde 100% a 5% para Ola y desde 100% a 60% para AsiDNA. Todas las líneas de células BRCA-/- eran sensibles a ambos tratamientos. Entre las líneas de células tumorales competentes en BRCA, MDAMB468 era sensible a ambos tratamientos, BC173 y HCC1143 eran sensibles solamente a AsiDNA, y HCC1187 era sensible únicamente a Ola. BT20, MDAMB231, MCF7 y HCC70 eran resistentes a ambos tratamientos a estas dosis (Figura 4A, 4B y Figura 5). El análisis de la correlación entre la respuesta a AsiDNA y la respuesta a Ola no revelaba correlación significativa alguna (coeficiente de Spearman r: 0,33 y valor P: 0,17). Estos resultados indican que la deficiencia en BRCA es suficiente pero no necesaria para la eficacia de AsiDNA u Ola, y sugieren que defectos de reparación diferentes determinan la sensibilidad a estos fármacos.
El tratamiento combinado con AsiDNA y olaparib demuestra eficacia supra-aditiva en las líneas de células BC
Los inventores monitorizaron la supervivencia celular al tratamiento combinado de tres líneas de células BC y dos líneas no tumorales con sensibilidades diferentes a Ola y AsiDNA solos (Figura 6; Tabla 1). La eficacia de los tratamientos simples con Ola y AsiDNA era dependiente de la dosis (Figura 7). Sin embargo, la combinación seguía siendo más eficaz o al menos igual al efecto aditivo esperado para todas las dosis ensayadas. Es interesante que la supervivencia al tratamiento combinado era supra-aditiva en los tres modelos de cáncer con indiferencia del grado de sensibilidad a los tratamientos simples. El aumento de la dosis de AsiDNA a 16 pM no tenía efecto significativo alguno sobre el tratamiento combinado, aunque aumentaba significativamente el efecto del tratamiento simple con AsiDNA. En contraste, las células normales eran insensibles tanto al tratamiento combinado como a los tratamientos simples con AsiDNA y Ola (Figura 6; Tabla 1).
Tabla 1. Eficacia de los tratamientos simple y combinado en diversos tipos de cáncer.
Las concentraciones utilizadas fueron 4,8 pM de AsiDNA y 0,1 pM de Ola. Aditividad calculada = supervivencia a AsiDNA x supervivencia a Ola.
Línea de Defectos Supervivencia (% /NT) células Tejido de
reparación Ola AsiDNA AsiDNA Aditividad del DNA Ola calculada H e L a C T L K D - 97.2 69.0 35.4 67.1 H e L a F A R F 1
K D P A R F 1 100.5 49.3 4 7.6 49.5 I le L a C T L S X Cérvix - 105.1 96.4 79.5 101.3 I le L a U R C A .
S X B R C A 1 71.4 64.6 27.9 46 .2 H e L a B R C A 2
S X B R C A 2 65.0 69.3 15.1 45.1
Cabeza y H ep 2 - 101 6 9.4 42.5 70 cuello
M 059 K - 117.3 75 .4 2 8.7 88.5 Cerebro D N A -M 059 J FK cs 87 .5 51.2 21.3 44.9 S K 28 L sh C T L - 80 .6 7 0.3 34.8 56.7 S K 28 L sh D N A - Piel D N A -F K cs FK cs 80 .9 50.8 33.6 41.1 H C T 116 - 82.9 80.0 36.6 66.3 Colon
I I C T 116 K U 70 * K U 70 88.6 77.3 42 .3 68 .5 H u t78 - 85.8 51.1 39.1 43.8 IM 9 Sangre - 84.6 20.3 4.6 17.1 J u r k a t - 68.4 45.2 28.5 31 .0 M D A M B 231 - 90.9 87 .2 33 .5 79.2 B C 173 - 94 .4 54.5 3 9.3 51.4 B C 227 Mam a B R C A 2 75.3 69.8 42.6 52 .6 H C C 38 B R C A 1 66.7 69.5 25.7 46 .3 H C C 1187 - 61.5 103.8 41.5 63.9 M D A M B 468 - 68.3 53 .7 2 8.0 36.6 M C F 10 A M am a - no 86.2 91.7 87.5 79.0 M C F 12 A tumorales - 88.5 97.2 90.1 86.1 Mecanismos moleculares que subyacen en la combinación de AsiDNA y olaparib
Para diseccionar esta sinergia citotóxica, los inventores examinaron el efecto de AsiDNA, Ola o ambos sobre las actividades de reparación del DNA. Comprobaron en primer lugar que cada molécula no afecta a la capacidad de la otra para inhibir el reclutamiento de sus enzimas de reparación orientadas. Como era de esperar, Ola retardaba significativamente el reclutamiento de los focos XRCC1, mientras que AsiDNA no lo hacía. El reclutamiento de XRCC1 se retardaba análogamente en las células tratadas con Ola en presencia y ausencia de AsiDNA (Figura 8). La activación de la actividad de la quinasa DNA-PK por AsiDNA puede revelarse fácilmente por la fosforilación pannuclear de la histona H2AX. Esta fosforilación se observó tanto en presencia como en ausencia de Ola (Figura 9 A, C). Se cree que la fosforilación pan-nuclear de H2AX está implicada en la inhibición de HR y el reclutamiento de la enzima reparadora NHEJ por AsiDNA. Después de irradiación, se observó una disminución de los focos 53 BP1 en las células tratadas con AsiDNA con y sin Ola (Figura 10). En ausencia de tratamiento de deterioro del DNA, Ola induce la acumulación de DSBs revelada por la formación de focos yH2AX que están co-localizados con focos 53BP1 y Rad51 (Figura 9A, B). La adición de AsiDNA reducía significativamente la formación de focos 53BP1 o Rad51 inducida por Ola (Figura 9 A, B). Para demostrar que la reducción de los focos Rad51 y 53 BP1 después de AsiDNA es inducida por la inhibición de su reclutamiento en los sitios de deterioro y no por una reducción del número de deterioros del DNA, los inventores utilizaron ensayos cometa alcalinos de células individuales para monitorizar el deterioro en las células tumorales MDAMB 231 después de los diferentes tratamientos. Como era sugerido por los focos y H2AX, el tratamiento con Ola inducía la acumulación de deterioro a lo largo de 24 horas, mientras que AsiDNA no lo hacía (Figura 9 E). La combinación de AsiDNA con Ola daba como resultado un aumento al doble del deterioro del DNA inducido por ola. Este aumento podría justificar la toxicidad eficaz de la combinación en las células MDAMB 231. En contraste, en las células MCF10A no tumorales, si bien se observaba un ligero aumento en el deterioro del DNA después de tratamiento con ola, la combinación de AsiDNA con Ola no aumentaba la acumulación de deterioro (Figura 9 C, D y F).
AsiDNA aumenta la eficacia de olaparib en otras líneas de células de cáncer
Para determinar si la eficacia de la combinación de AsiDNA con Ola no se limitaba a BC, los inventores analizaron la sensibilidad de diferentes líneas de células de cáncer que incluían glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer de la sangre y melanoma. Todos los modelos tumorales exhiben eficacia supra-aditiva de la combinación de fármacos (Tabla 1). Además, el análisis de pares isogénicos con mutantes de reparación del DNA para tratamientos simples y combinados indica que AsiDNA es fuertemente citotóxico para todos los mutantes con un solo defecto de reparación (PARP1, BRCA 1, BRCA 2, Ku70, DNA-PKcs), mientras que la sensibilidad a Ola se ve restringida esencialmente a los mutantes BRCA (Tabla 1). La sensibilidad de los mutantes PARP1, BRCA y Ku70 a AsiDNA se confirmó en un conjunto isogénico de mutantes de reparación del linfoma de pollo DT40 (Figura 11A). Los inventores comprobaron también el efecto del tratamiento combinado en otras tres líneas de células BC (MDAMB468, HCC1187 y HCC38) que tienen perfiles de respuesta distintos a los tratamientos individuales que MDAMB231, BC173 y b C227 (Tabla 1). Se observó también efecto sinérgico entre AsiDNA y Ola en estas tres líneas de células BC. Entre las líneas de células derivadas de tumores sólidos, únicamente las células silenciadas HeLa-PARP1 no se beneficiaban de la combinación, dado que no se observó aumento alguno de sensibilidad a AsiDNA después del tratamiento con ola. Sorprendentemente, las células T de los tumores de sangre Hut 78 y Jurkat exhibían una supervivencia al tratamiento combinado próxima al efecto aditivo calculado de ambos tratamientos individuales (Tabla 1). Dado que ambas líneas de células eran sensibles a los tratamientos individuales, la falta de aditividad no parecía estar correlacionada con defectos de reparación del DNA específicos. Considerados juntos, estos resultados indican que la eficiencia del tratamiento combinado AsiDNA/ola no se limita a BC, y que AsiDNA sensibiliza todas las líneas de células a Ola con independencia de su estado de BRCA.
AsiDNA conduce a una eficacia supra-aditiva con todos los inhibidores de PARP
Los inhibidores de PARP pertenecen al menos a dos clases: los inhibidores catalíticos que inhiben la actividad de la enzima PARP, y los inhibidores duales que bloquean a la vez la actividad de la enzima PARP y atrapan las proteínas PARP en los sitios de deterioro del DNA. Ola pertenece al segundo grupo, mientras que veliparib (Veli) es sólo un inhibidor catalítico. Por esta razón, los inventores repitieron el análisis de eficacia en un panel de líneas BC utilizando Veli en lugar de Ola (Figura 12). El efecto sinérgico del tratamiento combinado se observó con Veli en las tres líneas BC, pero este efecto estaba ausente en las células no tumorales. Esto indica que el atrapamiento de PARP en el DNA no es esencial para una combinación eficaz. Se observaron también resultados similares en células de linfoma DT40 (Figura 11B).
Los inventores monitorizaron la eficacia del tratamiento combinado en células MDAMB 231 con otros 5 PARPi (rucaparib, iniparib, niraparib, AZD2461 y BMN673) desarrollados para aplicaciones clínicas (Figura 13). Las dosis aplicadas de PARPi se eligieron para producir un efecto sub-letal y una dosis que diera como resultado 50% de supervivencia (Tabla 2). La eficacia supra-aditiva de la combinación de PARPi con AsiDNA se confirmó con todos los inhibidores (Figura 13) independientemente de su mecanismo de acción. Estos resultados demuestran que los efectos sinérgicos observados son generales y no están restringidos únicamente a olaparib.
Tabla 2
CI20 (|iM) CI50 (|iM)
Olaparib 1 3,7
Rucaparib 0,4 1,8
Iniparib 46 49,5
Niraparib 0,1 0,7
AZD2461 0,1 0,5
BMN673 0,00013 0,0154
Materiales y métodos
Cultivo de células, productos químicos y moléculas AsiDNA
Se realizaron cultivos de células con 4 líneas de células BC deficientes en BRCA 1 (BC 227 Institut Curie, HCC1937, HCC38 y MDAMB436 de ATCC), 8 líneas de células BC competentes en BRCA1 (BC173 del Institut Curie, BT20, HCC1143, HCC1187, HCC70, Mc F7, MDAMB231 y MDAMB468 de ATCC), tres líneas de células mamarias no tumorales (184B5, MCF10A y MCF12A de ATCC), 5 líneas de células HeLa de cáncer cervical humano silenciadas para BRCA1 (HelaBRCA1SX, Tebu-Bio referenciada como 00301-00041), para BRCA2 (HelaBRCA2SX, Tebu-Bio referenciada como 00301 -00028), para PARP1 (HeLaPARP1 KD, obsequio amable de Vincent Pennanaech, Institut Curie, Francia) y controles (HeLaCTLSX, Tebu-Bio01-00001, y HeLaCTLKD, obsequio amable de Vincent Pennanaech, Institut Curie, Francia), líneas de células de glioblastoma humano MO59K y MO59J (deficiente en DNA-PKcs), líneas de células de melanoma humano SK28LshCTL y SK28 LshDNA-PKcs, líneas de células de cáncer colorrectal humano HCT116 WT y HCT116 KU70+/-(heterocigótica para el gen KU70), la línea de células de cáncer humano de cabeza y cuello Hep2, células de tumores sanguíneos Hut78, IM9 y Jurkat. Las células se cultivaron conforme a las instrucciones de los suministradores. Las líneas de células se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
Las células DT40 del linfoma de Burkitt son células de pollo que se han silenciado para diferentes genes como ha sido descrito previamente en Murai et al (2012, Cancer Res, 72, 5588-99). Para este estudio, los inventores utilizaron células DT40 tipo salvaje como control (DT40WT), y 4 líneas de células silenciadas respectivamente para los genes BRCA1, KU70, TDP1 y PARP1 (DT40BRCA1KO, DT40KU70KO, DT40TDP1KO y DT40PARP1KO). Las células DT40 se cultivaron a 37°C con 5% de CO2 en el medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) suplementado con 1% de suero de pollo (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 10-5 M p-mercaptoetanol, penicilina, estreptomicina y 10% suero de bovino fetal (FBS). Los reactivos para el cultivo de las células se obtuvieron de Gibco Invitrogen.
Todos los inhibidores PARP, AZD-2281 (olaparib), AZD-2461, ABT888 (veliparib), MK-4827 (niraparib), BSI-201 (iniparib), BMN673 (talazoparib) y AG-014699 (rucaparib) se adquirieron de Medchem Express (Princeton, USA) y se diluyeron en DMSO hasta una concentración stock de 10 mM.
La molécula DBait (AsiDNA) son oligonucleótidos bicatenarios cortos de 32 pares de bases producidos por métodos de síntesis automática de oligonucleótidos en fase sólida (Agilent, USA). La secuencia es:
5'XGCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-L'-
TCTAGGCTTGTTTGCTGGGTTGTGGGCACAGC-3', donde L' es 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxononadecano y las letras subrayadas son nucleósidos fosforodiamidato. En el extremo 5' está enlazado un colesteriltetraetilenglicol (X).
Medida de la sensibilidad celular a los fármacos
La citotoxicidad de AsiDNA o PARPi se midió por cuantificación de la supervivencia y muerte relativas de las células. Se sembraron células adherentes en placas de cultivo de 24 pocillos a densidades apropiadas y se incubaron durante 24 horas a 37°C antes de la adición de AsiDNA y/o PARPi. Las células se cosecharon 6 días después del tratamiento, se tiñeron con azul tripán al 0,4% (Sigma Aldrich, Saint Louis, USA) y se contaron con una cámara Burker. La supervivencia celular se calculó como la ratio de células vivas tratadas a células vivas con tratamiento falso. La muerte celular se calculó como el número de células muertas referido al número total de células contadas. La aditividad de la toxicidad se calculó por el producto de supervivencia celular a AsiDNA y supervivencia celular a PARPi.
Para medir la citotoxicidad en los mutantes de reparación del linfoma de pollo DT40 (Murai et al, 2012, Cáncer Res, 72, 5588-99), se sembraron 750 células en placas blancas de 96 pocillos (volumen final 150 pl/pocillo de Perkin Elmer Life Sciences (Waltham, MA, USA) en medios con o sin las concentraciones indicadas de los fármacos (AsiDNA y/o veliparib) a 372C. Después de 72 horas, las células se ensayaron por triplicado con el kit ATPlite de un solo paso (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Resumidamente, se añadió solución ATPlite a cada pocillo (150 pl para las células DT40). Después de 5 minutos de tratamiento, se midió la intensidad de luminiscencia con el lector Envision 2104 Multilabel de Perkin Elmer Life Sciences (Waltham, MA, USA). Las intensidades de señal de las células sin tratar se ajustaron como 100%.
Anticuerpos y estudios inmunológicos
Para la inmunotinción, se siembran células MDAMB231 en cubreobjetos (Menzel, Braunschweig, Alemania) a una concentración de 5x105 células y se incuban a 37°C durante 1 día. Las células se tratan luego con AsiDNA 16 pM /- olaparib 1 pM. 24 horas después del tratamiento, las células se ligan durante 20 minutos en 4% de paraformaldehído/Solución Salina Tamponada con Fosfato (PBS 1x), se permeabilizan en 0,5% Triton X-100 durante 10 min, se bloquean con seroalbúmina bovina al 2%/PBS 1x y se incuban con anticuerpo primario durante 1 hora a 4°C. Todos los anticuerpos secundarios se utilizaron a una dilución de 1/200 durante 45 minutos a la temperatura ambiente (RT), y el DNA se tiñó con 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Se utilizaron los anticuerpos siguientes: antifosfo-H2AX primario monoclonal de ratón (Millipore, Guyancourt, Francia), anticuerpo de conejo anti-53BP1 (Cell signaling technology, Danvers, USA), anticuerpo de conejo anti-Rad51 (Merk Millipore, Darmstadt, Alemania), IgG secundaria anti-ratón de cabra conjugada con Alexa-633 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) e IgG secundaria anti-conejo de cabra conjugada con Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).
Electroforesis alcalina de células simples, "Ensayo COMET”
Células tratadas con AsiDNA (16 pM), olaparib (1 pM) o ambos se suspendieron en agarosa de punto de fusión bajo al 0,5% en DMEM y se transfirieron a un portaobjetos congelado de vidrio de microscopio, recubierto previamente con una capa de agarosa de punto de fusión normal al 0,5%. Los portaobjetos se sumergieron en solución de lisis [2,5 mol/L NaCl, 100 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris, 1% laurilsarcosinato de sodio, 10% DMSO, 1% Triton X-100 (pH 10)] a 4jC durante 1 hora, se pusieron en un tanque de electroforesis que contenía 0,3 mol/L de NaOH (pH 13) y 1 mmol/L EDTA durante 40 min, se sometieron a electroforesis durante 25 min a 25 V (300 mA), se lavaron con tampón neutro [400 mmol/L de Tris-HCl (pH 7, 5)], y se tiñeron con 20 Ag/mL de bromuro de etidio. Las variables de las "cometas" se cuantificaron con el uso del software Comet Assay 2 (Perceptive Instrument). Se procesaron portaobjetos triplicados para cada punto experimental. El momento de cola se define como el producto del porcentaje de DNA en la cola y el desplazamiento entre la cabeza y la cola de la cometa.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con un test t de Student de dos colas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. - Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico DBait y un inhibidor de PARP, en donde la molécula de ácido nucleico DBait es un ácido nucleico en horquilla con un tallo de DNA bicatenario y un bucle y tiene una de las fórmulas siguientes:
Figure imgf000040_0002
III)
en donde N es un desoxinucleótido, n es un número entero de 23 a 195, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal fosfodiéster modificada, L' es un enlazador, C es la molécula que facilita la endocitosis, seleccionada preferiblemente de una molécula lipófila o un ligando que está orientado a un receptor celular que facilita la endocitosis mediada por receptores, L es un enlazador, m y p, independientemente, son un número entero que es 0 ó 1, y en donde la molécula de ácido nucleico DBait tiene menos de 70% de identidad de secuencia a cualquier gen en un genoma humano.
2. - Una composición farmacéutica conforme a la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de un cáncer.
3. - Un kit que comprende un inhibidor de PARP y una molécula de ácido nucleico DBait como una preparación combinada para uso simultáneo, separado o secuencial, en particular para uso en el tratamiento del cáncer, en donde la molécula de ácido nucleico DBait es un ácido nucleico en horquilla con un tallo de DNA bicatenario y un bucle y tiene una de las fórmulas siguientes:
Figure imgf000040_0001
en donde N es un desoxinucleótido, n es un número entero de 23 a 195, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal fosfodiéster modificada, L' es un enlazador, C es la molécula que facilita la endocitosis, seleccionada preferiblemente de una molécula lipófila o un ligando que está orientado a un receptor celular que facilita la endocitosis mediada por receptores, L es un enlazador, m y p, independientemente, son un número entero que es 0 ó 1, y en donde la molécula de ácido nucleico DBait tiene menos de 70 % de identidad de secuencia a cualquier gen en un genoma humano.
4. - La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 1, la composición farmacéutica para uso conforme a la reivindicación 2 o el kit conforme a la reivindicación 3, en donde la molécula de fórmula (I), (II) o (III) tiene una o varias de las características siguientes:
- n es un número entero de 23 a 195 o de 27 a 95, y/o
- N es un desoxinucleótido seleccionado del grupo que consiste en A (adenina), C (citosina), T (timina) y G (guanina) y se selecciona de modo que evita la formación de un dinucleótido CpG y que tiene menos de 70% de identidad de secuencia a cualquier gen en un genoma humano; y/o,
- el enlazador L' se selecciona del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1 -hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano; y/o,
- m es 1 y L es un carboxamido-polietilenglicol, más preferiblemente carboxamido-trietilenglicol o carboxamidotetraetilenglicol; y/o,
- C se selecciona del grupo que consiste en un colesterol, ácidos grasos de cadena simple o doble tales como ácido octadecílico, oleico, dioleoílico o esteárico, o ligando (con inclusión de péptido, proteína, aptámero) que está orientado a un receptor celular tal como ácido fólico, tocoferol, azúcar tal como galactosa y manosa y su oligosacárido, péptido tal como RGD y bombesina, y proteína tal como transferrina e integrina, siendo preferiblemente un colesterol o un tocoferol, todavía más preferiblemente un colesterol.
5. - La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 1, la composición farmacéutica para uso conforme a la reivindicación 2, o el kit conforme a la reivindicación 3, en donde la molécula de ácido nucleico DBait tiene una de las fórmulas siguientes:
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
en donde el nucleótido subrayado se refiere a un nucleótido que tiene una cadena principal fosforotioato o metilfosfonato, el enlazador L' se selecciona del grupo que consiste en hexaetilenglicol, tetradesoxitimidilato (T4), 1,19-bis(fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano y 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1 -hidroxi-4-oxa-9-oxo-nonadecano, m es 1 y L es un carboxamido-oligoetilenglicol, C se selecciona del grupo que consiste en ácidos grasos de cadena simple o doble tales como octadecílico y dioleoílico, colesterol, tocoferol, ácido fólico, azúcar tal como galactosa y manosa y su oligosacárido, péptido tal como RGD y bombesina, y proteína tal como integrina, preferiblemente colesterol.
6.- La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 1, la composición farmacéutica para uso conforme a la reivindicación 2 o el kit conforme a la reivindicación 3, en donde la molécula de ácido nucleico DBait es
Figure imgf000043_0001
siendo s una cadena principal fosforotioato.
7. - La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 1, la composición farmacéutica para uso conforme a la reivindicación 2, o el kit conforme a la reivindicación 3, en donde la molécula de ácido nucleico DBait es
Figure imgf000043_0002
8. - La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 1, la composición farmacéutica para uso conforme a la reivindicación 2, o el kit conforme a la reivindicación 3, en donde la molécula de ácido nucleico es
(C-L.Jp GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA.
Figure imgf000043_0003
CGACACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT (lid),
en donde C es un colesterilo, Lm es un tetraetilenglicol, p es 1 y L' es 1,19-bis (fosfo)-8-hidraza-2-hidroxi-4-oxa-9-oxononadecano.
9. - La composición farmacéutica conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-8, la composición farmacéutica para uso conforme a las reivindicaciones 2 y 4-8 o el kit conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en donde el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que consiste en rucaparib (AG014699, PF-01367338), olaparib (AZD2281), veliparib (ABT888), iniparib (BSI 201), niraparib (MK 4827), talazoparib (BMN673), AZD 2461, CEP9722, E7016, INO-1001, LT-673, MP-124, NMS-P118, XAV939, análogos, derivados o una mezcla de los mismos.
10. - La composición farmacéutica conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4-8, la composición farmacéutica para uso conforme a las reivindicaciones 2 y 4-8 o el kit conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 3-8, en donde el inhibidor de PARP se selecciona del grupo que consiste en AZD2281 (Olaparib), ABT888 (Veliparib), BMN673, BSI-21 (Iniparib), AZD 2461, MK-4827 (Niraparib), y AG 014699 (Rucaparib).
11. - La composición farmacéutica o kit para uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en donde el cáncer se selecciona de leucemia, linfoma, sarcoma, melanoma, y cánceres de cabeza y cuello, riñón, ovario, páncreas, próstata, tiroides, pulmón, esófago, mama, vejiga, cerebro, tracto colorrectal, hígado, y cérvix.
12. - La composición farmacéutica o kit para uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en donde el inhibidor de PARP se utiliza en una cantidad sub-terapéutica.
13. - La composición farmacéutica o kit para uso conforme a una cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en donde el inhibidor de PARP y la molécula de ácido nucleico DBait se utilizan en combinación con una radioterapia y/o una quimioterapia antitumoral con un agente deteriorante del DNA.
14. - Una molécula de ácido nucleico DBait para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con un inhibidor de PARP, en donde la molécula de ácido nucleico DBait es un ácido nucleico en horquilla con un tallo de DNA bicatenario y un bucle y tiene una de las fórmulas siguientes:
Figure imgf000044_0001
en donde N es un desoxinucleótido, n es un número entero de 23 a 195, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal fosfodiéster modificada, L' es un enlazador, C es la molécula que facilita la endocitosis seleccionada de una molécula lipófila o un ligando que está orientado a un receptor celular que facilita la endocitosis mediada por receptores, L es un enlazador, m y p, independientemente, son un número entero que es 0 ó 1, y en donde la molécula de ácido nucleico DBait tiene menos de 70% de identidad de secuencia a cualquier gen en un genoma humano.
15. - Un inhibidor de PARP para uso en el tratamiento del cáncer en combinación con una molécula de ácido nucleico DBait, en donde la molécula de ácido nucleico DBait es un ácido nucleico en horquilla con tallo de DNA bicatenario y un bucle y tiene una de las fórmulas siguientes:
Figure imgf000044_0002
en donde N es un desoxinucleótido, n es un número entero de 23 a 195, la N subrayada se refiere a un nucleótido que tiene o no una cadena principal fosfodiéster modificada, L' es un enlazador, C es la molécula que facilita la endocitosis seleccionada de una molécula lipófila o un ligando que está orientado a un receptor celular que facilita la endocitosis mediada por receptores, L es un enlazador, m y p, independientemente, son un número entero que es 0 ó 1, y en donde la molécula de ácido nucleico DBait tiene menos de 70% de identidad de secuencia a cualquier gen en un genoma humano.
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