CN108138171A

CN108138171A - 表达嵌合抗原受体的基因修饰t细胞的制备方法

Info

Publication number: CN108138171A
Application number: CN201680058705.6A
Authority: CN
Inventors: 西尾信博; 中沢洋三; 田中美幸; 盛田大介; 高桥义行
Original assignee: Nagoya University NUC; Nippo Valve Co Ltd
Current assignee: National University Corp Donghai National University
Priority date: 2015-10-08
Filing date: 2016-10-07
Publication date: 2018-06-08
Anticipated expiration: 2036-10-07
Also published as: JP6857360B2; EP3360961A4; JPWO2017061615A1; US20230040878A1; US11517590B2; EP3360961B1; EP4289944A2; EP4289944A3; US20180289742A1; EP3360961A1; WO2017061615A1; CN108138171B

Abstract

本发明实现利用转座子法的CAR疗法的基因导入效率的提高。本发明提供一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法，包括以下的步骤：(1)准备非增殖性细胞的步骤，所述非增殖性细胞是通过在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对含有T细胞的细胞群进行刺激后，进行使增殖能力丧失的处理而得到的；(2)通过转座子法得到导入有靶抗原特异性嵌合抗原受体基因的基因修饰T细胞的步骤；(3)将步骤(1)中准备的非增殖性细胞和步骤(2)中得到的基因修饰T细胞混合，在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体进行刺激的同时进行共培养的步骤；(4)回收培养后的细胞的步骤。另外，本发明提供一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法，包括以下的步骤：(i)准备保持有病毒肽抗原的非增殖性细胞的步骤，所述保持有病毒肽抗原的非增殖性细胞是通过在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对含有T细胞的细胞群进行刺激后，进行病毒肽抗原存在下的培养和使增殖能力丧失的处理而得到的；(ii)通过转座子法得到导入有靶抗原特异性嵌合抗原受体基因的基因修饰T细胞的步骤；(iii)将步骤(i)中准备的非增殖性细胞和步骤(ii)中得到的基因修饰T细胞混合，共培养的步骤；(iv)回收培养后的细胞的步骤。

Description

表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法

技术领域

本发明涉及一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法及其用途。本申请主张基于2015年10月8日提出申请的日本专利申请第2015－200458号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照援引入本说明书。

背景技术

使用嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor。以下也称为“CAR”)的基因修饰T细胞疗法(CAR疗法)正在被临床应用。CAR典型地具有如下结构：以抗体的单链可变区作为细胞外结构域，在该细胞外结构域连接有跨膜区、CD3ζ和传递共刺激信号的分子的细胞内结构域的结构。通过依照抗体的特异性与抗原结合，CAR-T细胞活化，损坏靶细胞(癌细胞等)。CAR疗法具有细胞的制备比较容易、显示高的细胞毒活性、可期待持续的效果等优点，特别是作为针对难治性、对以往的治疗法有抗性的病例的新的治疗手段备受期待。实际上在欧美进行了针对化学疗法抗性急性淋巴性白血病(acute lymphoblastic leukemia)患者，将针对在细胞表面表达的CD19抗原的CAR基因导入到从患者采取的末梢血T细胞，进行培养并输液的临床试验，并报告了缓解率为80～90％的良好的成绩(非专利文献1～3)。CAR疗法在美国作为针对难治性癌最有希望的治疗法之一备受瞩目。

以往，CAR疗法中使用的细胞(CAR-T细胞)使用病毒载体来制备。然而，通常所使用的逆转录病毒对原癌基因的插入突变的频率高(在使用造血干细胞的基因治疗中频繁发生白血病)，安全性成为问题。另外，在以往方法中将细胞株、胎牛血清用于培养，特别是在小儿患者中担心长期安全性。进而，由于在使用病毒载体时需要专用细胞培养设备，因此，也存在治疗费用变为非常高的经济性的问题(非专利文献4)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Grupp SA,Kalos M,Barrett D,Aplenc R,Porter DL,RheingoldSR,Teachey DT,Chew A,Hauck B,Wright JF,Milone MC,Levine BL,June CH.Chimericantigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.N Engl J Med,368(16):1509-18.2013

非专利文献2：Maude SL,Frey N,Shaw PA,Aplenc R,Barrett DM,Bunin NJ,ChewA,Gonzalez VE,Zheng Z,Lacey SF,Mahnke YD,Melenhorst JJ,Rheingold SR,Shen A,Teachey DT,Levine BL,June CH,Porter DL,Grupp SA.Chimeric antigen receptor Tcells for sustained remissions in leukemia.N Engl J Med,371(16):1507-17.2014

非专利文献3：Lee DW,Kochenderfer JN,Stetler-Stevenson M,Cui YK,Delbrook C,Feldman SA,Fry TJ,Orentas R,Sabatino M,Shah NN,Steinberg SM,Stroncek D,Tschernia N,Yuan C,Zhang H,Zhang L,Rosenberg SA,Wayne AS,MackallCL.T cells expressing CD19chimeric antigen receptors for acute lymphoblasticleukaemia in children and young adults:a phase 1dose-escalationtrial.Lancet.2014

非专利文献4：Morgan RA.Faster,cheaper,safer,T-cell engineering.JImmunother,36(1):1-2.2013。

发明内容

为了解决利用病毒载体的以往的CAR疗法的问题点，研究了使用非病毒载体的基因修饰技术之一即转座子法的利用。虽然转座子法与病毒载体法同样地能够进行持久的基因导入，但是存在如下问题：与病毒载体法相比，基因导入效率低，另外，细胞随着基因导入操作(电穿孔及其改良法等)而受到损坏，细胞存活率、细胞增殖率降低。本发明的课题在于消除这些问题点，有助于CAR疗法的临床应用和治疗成绩的提高。

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究。其结果明确，通过将基因导入操作后的T细胞(基因修饰T细胞)与另外准备的活化T细胞进行共培养，基因导入效率和存活率/增殖率提高，最终得到的CAR-T细胞的数量增大。另一方面，通过将基因导入操作后的T细胞(基因修饰T细胞)与保持有病毒肽的活化T细胞进行共培养这样的战略，成功地有效制备病毒特异性CAR-T细胞。以下的发明主要基于这些成果。

[1]一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法，包括以下的步骤(1)～(4)：

(1)准备非增殖性细胞的步骤，所述非增殖性细胞是通过在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对含有T细胞的细胞群进行刺激后，进行使增殖能力丧失的处理而得到的；

(2)通过转座子法得到导入有靶抗原特异性嵌合抗原受体基因的基因修饰T细胞的步骤；

(3)将步骤(1)中准备的非增殖性细胞和步骤(2)中得到的基因修饰T细胞混合，在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体进行刺激的同时进行共培养的步骤；

(4)回收培养后的细胞的步骤。

[2]根据[1]所述的制备方法，其中，在步骤(3)和步骤(4)之间进行在T细胞增殖因子的存在下培养共培养后的细胞的步骤。

[3]根据[1]或[2]所述的制备方法，其中，步骤(3)的共培养的期限为1天～14天。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，在T细胞增殖因子的存在下进行步骤(3)。

[5]根据[4]所述的制备方法，其中，T细胞增殖因子为IL-15。

[6]根据[4]所述的制备方法，其中，并用IL-15和IL-7作为T细胞增殖因子。

[7]一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法，包括以下的步骤(i)～(iv)：

(i)准备保持有病毒肽抗原的非增殖性细胞的步骤，所述保持有病毒肽抗原的非增殖性细胞是通过在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对含有T细胞的细胞群进行刺激后，进行在病毒肽抗原存在下的培养和使增殖能力丧失的处理而得到的；

(ii)通过转座子法得到导入有靶抗原特异性嵌合抗原受体基因的基因修饰T细胞的步骤；

(iii)将步骤(i)中准备的非增殖性细胞和步骤(ii)中得到的基因修饰T细胞混合，共培养的步骤；

(iv)回收培养后的细胞的步骤。

[8]根据[7]所述的制备方法，其中，在步骤(iii)和步骤(iv)之间进行在T细胞增殖因子的存在下培养共培养后的细胞的步骤。

[9]根据[7]或[8]所述的制备方法，其中，步骤(iii)的共培养的期限为1天～14天。

[10]根据[7]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，在T细胞增殖因子的存在下进行步骤(iii)。

[11]根据[10]所述的制备方法，其中，T细胞增殖因子为IL-15。

[12]根据[10]所述的制备方法，其中，并用IL-15和IL-7作为T细胞增殖因子。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，含有T细胞的细胞群为末梢血单核细胞(PBMCs)。

[14]根据[1]～[13]中任一项所述的制备方法，其中，使增殖能力丧失的处理为放射线照射。

[15]根据[1]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，转座子法为PiggyBac转座子法。

[16]根据[1]～[15]中任一项所述的制备方法，其中，靶抗原为CD19、GD2、GMCSF受体或IGF受体。

[17]根据[1]～[16]中任一项所述的制备方法，其中，非增殖性细胞和基因修饰T细胞来自同一个体。

[18]一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞，是通过[1]～[17]中任一项所述的制备方法而得到的。

[19]一种细胞制剂，含有治疗上有效量的[18]所述的基因修饰T细胞。

[20]一种癌的治疗法，包括对癌患者给药治疗上有效量的[18]所述的基因修饰T细胞的步骤。

附图说明

图1是基于以往的方法(培养法1)的CAR-T细胞的制作·培养。

图2是基于新方法(培养法2)的CAR-T细胞的制作·培养。

图3是基于新方法(培养法3)的CAR-T细胞的制作·培养。

图4是pIRII-CAR.CD19.28z载体(序列号1)的构成。具备CD19CAR基因被5’反向重复序列(5’IR)和3’反向重复序列(3’IR)夹持的结构。CD19CAR含有前导序列(序列号2)、轻链可变区(VL)(序列号3)、重链可变区(VH)(序列号4)、Fc区(CH2、CH3)(序列号5)、CD28的跨膜区和细胞内结构域(序列号6)以及CD3ζ(序列号7)。

图5是pCMV-pigBac载体(序列号8)的构成。在CMV即刻早期启动子(CMV immediateearly promoter)的控制下配置piggyBac转座酶基因。

图6是通过各培养法得到的CAR-T细胞的数量(平均±标准误差)。

图7是各培养法的基因导入率(平均±标准误差)。

图8是通过各培养法得到的CAR-T细胞的数量(平均±标准误差)。N＝9。在新方法(培养法2、3)与以往的方法(培养法1)之间确认到显著差异。另外，培养法3与培养法2相比，带来显著多的CAR-T细胞数。

图9是各培养法的基因导入率(平均±标准误差)。N＝9。在新方法(培养法2、3)与以往的方法(培养法1)之间确认到显著差异。另外，培养法3与培养法2相比，显示显著高的基因导入率。

图10是优化的CAR基因导入用载体即pIRII-CAR.CD19_优化的载体(序列号9)的构成。与pIRII-CAR.CD19.28z载体的结构相比，Fc区(CH2、CH3)被删除。

图11是使用pIRII-CAR.CD19_优化的载体时的基因导入率。表示流式细胞仪的结果(左)和CD3阳性T细胞中的CAR表达细胞的比例(右)。N＝9。

图12是细胞毒活性试验的结果。表示流式细胞仪的结果(上)和肿瘤细胞残留率(下)。将3种CD19阳性白血病细胞株(KOPN30bi、SK-9、TCC-Y/sr)和CAR-T细胞共培养，评价细胞毒活性。N＝6。

图13是抗肿瘤活性试验的结果。对荷瘤小鼠给药CAR-T细胞后，利用生物体内成像系统监测肿瘤细胞的增殖。

具体实施方式

本发明涉及表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞(CAR-T细胞)的制备方法。通过本发明的制备方法得到的CAR-T细胞可利用于CAR疗法。本发明大致提供2种制备方法，即，包括与活化T细胞的共培养的方法(为了便于说明，有时称为“第1制备方法”)和包括与保持有病毒肽的活化T细胞的共培养的方法(为了便于说明，有时称为“第2制备方法”)。应予说明，只要没有特别提及，本说明书的各种细胞(例如T细胞)为人细胞。

1.包括与活化T细胞的共培养的方法

在该制备方法(第1制备方法)中，进行以下的步骤(1)～(4)。

(1)准备非增殖性细胞的步骤，所述非增殖性细胞是通过在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对含有T细胞的细胞群进行刺激后，进行使增殖能力丧失的处理而得到的

(2)通过转座子法得到导入有靶抗原特异性嵌合抗原受体基因的基因修饰T细胞的步骤

(3)将步骤(1)中准备的非增殖性细胞和步骤(2)中得到的基因修饰T细胞混合，在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体进行刺激的同时进行共培养的步骤

(4)回收培养后的细胞的步骤

步骤(1)是得到用于基因导入操作后的T细胞(步骤(2)中使用的基因修饰T细胞)的保护的非增殖性细胞的步骤，首先，利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对含有T细胞的细胞群进行刺激。通过该处理，得到活化T细胞。作为“含有T细胞的细胞群”，优选使用从末梢血采取的PBMC(末梢血单核细胞)。也可以将纯化PBMC、提高了T细胞的含有率的PBMC、通过提取法从末梢血采取的单核细胞等作为这里的“含有T细胞的细胞群”使用。

例如，在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体包被了培养面的培养容器(例如培养皿)中培养3小时～3天、优选6小时～2天、进一步优选12小时～1天，由此能够对细胞群内的T细胞施加基于抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激。抗CD3抗体(例如可使用Miltenyi Biotec公司提供的商品名CD3pure抗体)和抗CD28抗体(例如可使用Miltenyi Biotec公司提供的商品名CD28pure抗体)也被市售，能够容易地获得。也可以利用包被有抗CD3抗体和抗CD28抗体的磁珠(例如，VERITAS公司提供的Dynabeads T-Activator CD3/CD28)进行步骤(1)的刺激。此外，作为抗CD3抗体，优选使用“OKT3”克隆。

进行了基于抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激的细胞被供于使增殖能力丧失的处理，但在其之前，可以在T细胞增殖因子的存在下进行培养。通过该培养，可提高刺激处理后的细胞的活性。这里的培养的期限例如为1天～10天，优选为2天～7天，进一步优选为3天～4天。如果培养期限过短，则无法期望充分的活化，如果培养期限过长，则存在共刺激分子减弱的顾虑。可以暂时将培养后的细胞冷冻保存。在该情况下，可以在使用时将细胞溶解，再次进行基于抗CD3抗体和CD28抗体的刺激(条件按照上述)后，供于“使增殖能力丧失的处理”。

通过经过“使增殖能力丧失的处理”，得到丧失了增殖能力的活化T细胞(非增殖性细胞)。使增殖能力丧失的处理典型地为放射线照射，但也可以使用药剂。示出放射线照射的条件的一个例子时，是使用伽马射线，以25Gy～50Gy的强度进行15～30分钟的处理。

在步骤(2)中，通过转座子法得到导入有靶抗原特异性嵌合抗原受体基因的基因修饰T细胞。即，在本发明中，利用转座子法将CAR基因导入到T细胞，得到CAR-T细胞。转座子法是非病毒基因导入法之一。转座子是在进化的过程中被保存的、引起基因转位的短的基因序列的总称。在一对基因酶(转座酶)和其特异识别序列中引起基因转位。作为转座子法，例如，可使用PiggyBac转座子法。PiggyBac转座子法为利用从昆虫分离的转座子的方法(Fraser MJ et al.,Insect Mol Biol.1996May；5(2):141-51.；Wilson MH et al.,MolTher.2007Jan；15(1):139-45.)，能够进行对哺乳类染色体的高效的整合。PiggyBac转座子法实际上被利用于CAR基因的导入(例如参照Nakazawa Y,et al.,J Immunother 32:826-836,2009；Nakazawa Y et al.,J Immunother 6:3-10,2013等)。能够应用于本发明的转座子法不限定于利用PiggyBac的方法，例如，也可以采用利用Sleeping Beauty(Ivics Z,Hackett PB,Plasterk RH,Izsvak Z(1997)Cell 91:501-510.)、Frog Prince(Miskey C,Izsvak Z,Plasterk RH,Ivics Z(2003)Nucleic Acids Res 31:6873-6881.)、Tol1(KogaA,Inagaki H,Bessho Y,Hori H.Mol Gen Genet.1995Dec 10；249(4):400-5.；Koga A,Shimada A,Kuroki T,Hori H,Kusumi J,Kyono-Hamaguchi Y,Hamaguchi S.J HumGenet.2007；52(7):628-35.Epub 2007Jun 7.)、Tol2(Koga A,Hori H,Sakaizumi M(2002)Mar Biotechnol 4:6-11.；Johnson Hamlet MR,Yergeau DA,Kuliyev E,Takeda M,TairaM,Kawakami K,Mead PE(2006)Genesis 44:438-445.；Choo BG,Kondrichin I,Parinov S,Emelyanov A,Go W,Toh WC,Korzh V(2006)BMC Dev Biol 6:5.)等转座子的方法。

基于转座子法的导入操作只要利用常规方法进行即可，过去的文献(例如关于PiggyBac转座子法上述的Nakazawa Y,et al.,J Immunother32:826-836,2009、NakazawaY et al.,J Immunother 6:3-10,2013，或者Saha S,Nakazawa Y,Huye LE,Doherty JE,Galvan DL,Rooney CM,Wilson MH.J Vis Exp.2012Nov 5；(69):e4235)成为参考。在本发明的优选的一个方式中，采用PiggyBac转座子法。典型地，在PiggyBac转座子法中，准备保持有编码PiggyBac转座酶的基因的载体(转座酶质粒)以及具备编码目标蛋白质的基因(CAR基因)被piggyBac反向重复序列夹持的结构的载体(转座子质粒)，将这两个载体导入(转染)到靶细胞。转染可利用电穿孔、核转染、脂转染、磷酸钙法等各种方法。

作为导入CAR基因的细胞(靶细胞)，可举出CD4阳性CD8阴性T细胞、CD4阴性CD8阳性T细胞、由iPS细胞制备的T细胞、αβ-T细胞、γδ-T细胞。如果含有如上所述的T细胞或前体细胞，则可以使用各种细胞群。从末梢血采取的PBMC(末梢血单核细胞)是优选的靶细胞之一。即，在优选的一个方式中，对PBMC进行基因导入操作。PBMC只要利用常规方法进行制备即可。此外，关于PBMC的制备方法，例如，可参照Saha S,Nakazawa Y,Huye LE,Doherty JE,Galvan DL,Rooney CM,Wilson MH.J Vis Exp.2012Nov 5；(69):e4235。

经过基因导入操作的细胞被供于步骤(3)的共培养，但在步骤(3)之前，可以在T细胞增殖因子(例如IL-15、IL-7)的存在下培养基因导入操作后的细胞。

CAR基因编码识别特定的靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)。CAR是含有靶特异性细胞外结构域、跨膜结构域以及用于发挥免疫细胞的效应子功能的细胞内信号结构域的结构体。以下，对各结构域进行说明。

(a)细胞外结构域

细胞外结构域对靶显示特异性结合性。例如，细胞外结构域含有抗靶单克隆抗体的scFv片段。作为这里的单克隆抗体，例如可使用啮齿类(小鼠、大鼠、兔子等)的抗体、人抗体、人源化抗体等。人源化单克隆抗体是使其它动物种类(例如小鼠、大鼠)的单克隆抗体的结构与人的抗体的结构相似的抗体，包括仅将抗体的恒定区置换为人抗体的恒定区的人型嵌合抗体以及将存在于恒定区和可变区的CDR(互补决定区)以外的部分置换为人抗体的部分的人型CDR移植(CDR-grafted)抗体(P.T.Johons et al.,Nature 321,522(1986))。为了提高人型CDR移植抗体的抗原结合活性，也已经开发了选择与小鼠抗体同源性高的人抗体构架(FR)的方法、制作同源性高的人型化抗体的方法、向人抗体移植小鼠CDR后进一步置换FR区域的氨基酸的方法的改良技术(参照美国专利第5585089号、美国专利第5693761号、美国专利第5693762号、美国专利第6180370号、欧州专利第451216号、欧州专利第682040号、专利第2828340号等)，也可以利用于人源化抗体的制作。

scFv片段是介由连接子将免疫球蛋白的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)连接的结构体，保持与抗原的结合能力。作为连接子，例如可使用肽连接子。肽连接子是由氨基酸直链状地连接的肽构成的连接子。肽连接子的代表例为由甘氨酸和丝氨酸构成的连接子(GGS连接子、GS连接子)。对于作为构成GGS连接子和GS连接子的氨基酸的甘氨酸和丝氨酸，其自身的尺寸小，在连接子内不易形成高级结构。连接子的长度没有特别限定。例如，可使用氨基酸残基数为5～25个的连接子。连接子的长度优选为8～25，进一步优选为15～20。

靶典型地使用在肿瘤细胞确认到特异性表达的抗原。这里的“特异性表达”是指与肿瘤以外的细胞相比确认到明显或显著的表达，并未意图限定为在肿瘤以外的细胞中完全不表达。作为靶抗原的例子，可举出CD19抗原、CD20抗原、GD2抗原、CD22抗原、CD30抗原、CD33抗原、CD44变异体7/8抗原、CEA抗原、Her2/neu抗原、MUC1抗原、MUC4抗原、MUC6抗原、IL-13受体α2、免疫球蛋白轻链、PSMA抗原、VEGF受体2等。

也可以将在白血病性干细胞/前体细胞表达的GM-CSF(粒细胞单核细胞集落刺激因子)受体作为靶。在该情况下，构成CAR的细胞外结构域使用作为GM-CSF受体的配体的GM-CSF。而且，骨髓系肿瘤的白血病干细胞、白血病前体细胞、白血病细胞等成为CAR-T细胞的靶，制备能够应用于骨髓增殖性肿瘤、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤(CMML、JMML、CML、MDS/MPN-UC)、骨髓增生异常症候群、急性髓细胞源性白血病等的预防·治疗的细胞。

(b)跨膜结构域

跨膜结构域介于细胞外结构域与细胞内信号结构域之间。作为跨膜结构域，可使用CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4或4-1BB等跨膜结构域。也可以使用由人工构建的多肽构成的跨膜结构域。

(c)细胞内信号结构域

细胞内信号结构域传递免疫细胞的效应子功能发挥所需要的的信号。即，在细胞外结构域与靶的抗原结合时，使用能够传递免疫细胞的活化所需要的信号的细胞内信号结构域。细胞内信号结构域包括用于传递介由TCR复合物的信号的结构域(为了方便，称为“第1结构域”)以及用于传达共刺激信号的结构域(为了方便，称为“第2结构域”)。作为第1结构域，除CD3ζ以外，可使用FcεRIγ等细胞内结构域。优选使用CD3ζ。另外，作为第2结构域，使用共刺激分子的细胞内结构域。作为共刺激分子，可例示CD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD4、CD5、CD134、OX-40或ICOS。优选采用CD28或4-1BB的细胞内结构域。

第1结构域和第2结构域的连接方式没有特别限定，在过去的事例中已知将CD3ζ在远端连接时共刺激强烈地传播，因此，优选在跨膜结构域侧配置第2结构域。可以将相同或不同的多个细胞内结构域以串联的方式进行连接而构成第1结构域。对于第2结构域也同样。

对于第1结构域和第2结构域，可以将它们直接连接，也可以使连接子介于它们之间。作为连接子，例如可使用肽连接子。肽连接子是由氨基酸直链状地连接的肽构成的连接子。肽连接子的结构、特征等如上所述。但是，作为这里的连接子，也可以使用仅由甘氨酸构成的连接子。连接子的长度没有特别限定。例如，可使用氨基酸残基数为2～15个的连接子。

(d)其它要素

为了促进CAR的分泌，使用前导序列(信号肽)。例如，可使用GM-CSF受体的前导序列。另外，有时可以制成细胞外结构域和跨膜区介由间隔结构域连接的结构。间隔结构域被用于促进CAR与靶抗原的结合。例如，可使用人IgG(例如人IgG1、人IgG4)的Fc片段作为间隔结构域。此外，也可使用CD28的细胞外结构域的一部分、CD8α的细胞外结构域的一部分等作为间隔结构域。此外，在跨膜结构域与细胞内信号结构域之间也可以设置间隔结构域。

另外，迄今为止有几个利用CAR的实验、临床研究等报告(例如Rossig C,etal.Mol Ther 10:5-18,2004；Dotti G,et al.Hum Gene Ther 20:1229-1239,2009；NgoMC,et al.Hum Mol Genet 20(R1):R93-99,2011；Ahmed N,et al.Mol Ther 17:1779-1787,2009；Pule MA,et al.Nat Med 14:1264-1270,2008；Louis CU,et al.Blood 118:6050-6056,2011；Kochenderfer JN,et al.Blood116:4099-4102,2010；Kochenderfer JN,et al.Blood 119:2709-2720,2012；Porter DL,et al.N Engl J Med 365:725-733,2011；Kalos M,et al.Sci Transl Med 3:95ra73,2011；Brentjens RJ,et al.Blood 118:4817-4828,2011；Brentjens RJ,et al.Sci Transl Med 5:177ra38,2013)，可参考这些报告构建本发明的CAR。

在转座子质粒内，在CAR基因的下游配置多聚A附加信号序列。通过使用多聚A附加信号序列而结束转录。作为多聚A附加信号序列，可使用SV40的多聚A附加序列、来自牛的生长激素基因的多聚A附加序列等。

转座子质粒可以含有检测用基因(报告基因、细胞或组织特异性基因、选择标记物基因等)、增强子序列、WRPE序列等。检测用基因被利用于表达盒的导入的成败、效率的判定、CAR基因的表达的检测或表达效率的判定、CAR基因表达的细胞的选择、分取等。另一方面，通过使用增强子序列，实现了表达效率的提高。作为检测用基因，可使用赋予对新霉素的抗性的neo基因、赋予对卡那霉素等的抗性的npt基因(Herrera Estrella、EMBO J.2(1983)、987-995)、nptII基因(Messing&Vierra.Gene1 9:259-268(1982))、赋予对潮霉素的抗性的hph基因(Blochinger&Diggl mann，Mol Cell Bio 4:2929-2931)、赋予对甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因(Bourouis et al.，EMBO J.2(7))等(以上为标记物基因)、荧光素酶基因(Giacomin、P1.Sci.116(1996)、59～72；Scikantha、J.Bact.178(1996)、121)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因、GFP(Gerdes、FEBS Lett.389(1996)、44-47)或其变异体(EGFP、d2EGFP等)等荧光蛋白质的基因(以上为报告基因)、缺少细胞内结构域的表皮生长因子受体(EGFR)基因等基因。检测用基因例如介由双顺反子性控制序列(例如，核糖体内部识别序列(IRES))、编码自切割肽的序列与CAR基因连接。自切割肽的例子为来自明脉扁刺蛾病毒的2A肽(T2A)，但并不限定于此。作为自切割肽，已知来自口蹄疫病毒(FMDV)的2A肽(F2A)、来自马鼻炎A病毒(ERAV)的2A肽(E2A)、来自猪捷申病毒(PTV-1)的2A肽(P2A)等。

在步骤(3)中，将步骤(1)中准备的非增殖性细胞和步骤(2)中得到的基因修饰T细胞混合，在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体进行刺激的同时进行共培养。由此，施加介由基于非增殖性细胞的共刺激分子的刺激和基于抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激，基因修饰T细胞活化，并且促进其存活·增殖。

共培养中使用的非增殖性细胞的数量与基因修饰T细胞的数量的比率(非增殖性细胞的数量/基因修饰T细胞的数量)没有特别限定，例如为0.025～0.5。

为了提高细胞的存活率/增殖率，在共培养时，可以使用添加有T细胞增殖因子的培养液。作为T细胞增殖因子，优选IL-15。优选使用除IL-15以外还添加有IL-7的培养液。IL-15的添加量例如为5ng/ml～10ng/ml。同样地IL-7的添加量例如为5ng/ml～10ng/ml。IL-15、IL-7等T细胞增殖因子可按照常规方法来制备。另外，也可利用市售品。并不排除使用人以外的动物种的T细胞增殖因子，但通常T细胞增殖因子使用来自人的T细胞增殖因子(也可以为重组体)。人IL-15、人IL-7等增殖因子可容易地获得(例如Miltenyi Biotec公司、R&D Systems公司等提供)。

可以使用添加有血清(人血清、胎牛血清等)的培养基，但是通过采用无血清培养基，能够制备具有临床应用时的安全性高且难以出现基于血清批次间的差异的培养效率的不同这样的优点的细胞。T细胞用的无血清培养基的具体例为TexMACS^TM(Miltenyi Biotec公司)、AIM V(注册商标)(Thermo Fisher Scientific公司)。在使用血清的情况下，可以使用自身血清，即，从作为步骤(2)中得到的基因修饰T细胞的来源的个体(典型地为接受通过本发明的制备方法得到的嵌合抗原受体基因修饰T细胞的给药的患者)采取的血清。基础培养基只要使用适于T细胞的培养的培养基即可，如果举出具体例，则为上述的TexMACS^TM、AIMV(注册商标)。其它培养条件只要为适于T细胞的存活、增殖的培养条件即可，只要采用一般的培养条件即可。例如，只要在设定为37℃的CO₂培养箱(CO₂浓度5％)内进行培养即可。此外，基于抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激与步骤(1)的情况同样，因此，省略该说明。

步骤(3)的共培养的期限例如为1天～10天、优选为1天～7天，进一步优选为2天～4天。如果培养期限过短，则无法期望充分的效果，如果培养期限过长，则存在细胞的活性(生命力)的降低等顾虑。

在接着步骤(3)的步骤(4)中，回收培养后的细胞。回收操作只要通过常规方法进行即可。例如通过移液、离心处理等来回收。

在优选的一个方式中，在步骤(3)和步骤(4)之间进行在T细胞增殖因子的存在下培养共培养后的细胞的步骤。根据该步骤，能够进行有效的扩大培养，另外，也具有提高细胞的存活率的优点。

作为T细胞增殖因子，可使用IL-15、IL-7等。优选与步骤(3)同样地利用添加有IL-15和IL-7的培养基进行培养。培养期限例如为1天～21天，优选为5天～18天，进一步优选为10天～14天。如果培养期限过短，则无法期望细胞数的充分的增加，如果培养期限过长，则存在细胞的活性(生命力)的降低、细胞的疲惫/疲劳等顾虑。在培养的中途可以传代。另外，培养中根据需要进行培养基更换。例如以3天1次的频率将培养液的1/3～2/3左右更换为新的培养基。

2.包括与保持有病毒肽的T细胞的共培养的方法

本发明的另一方式(第2制备方法)涉及制备病毒特异性嵌合抗原受体基因修饰T细胞(以下，称为“病毒特异性CAR-T细胞”)的方法。病毒特异性CAR-T细胞在临床应用上具有以下重要的优点，即，在利用于自体移植时，能够期望基于来自病毒T细胞受体的刺激的体内持久性的提高，在利用于同种移植时，能够进一步通过减轻同种免疫反应(GVHD)而制作来自移植供体的CAR-T，而且能够将来自第3方供体的CAR-T细胞制剂化等。实际上，报告了病毒特异性CAR-T细胞更长期地在体内持续(Pule MA,et al.Nat Med.2008Nov；14(11):1264-70.)。另外，通过来自第3方EBV特异性CTL临床研究的报告(Annual Review血液2015，2015年1月发行，中外医学公司)，证明了病毒特异性细胞毒性T细胞(CTL)的安全性高。

该方式的制备方法包括以下的步骤(i)～(iv)。此外，对于没有提及的事项(例如，含有T细胞的细胞群的制备方法、基于抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激的基本的操作、使增殖能力丧失的处理的方法、基于转座子法的基因导入的操作、共培养的基本的操作、细胞的回收方法等)，与上述的第1制备方法同样，因此，省略重复的说明，援引对应的说明。

(i)准备保持有病毒肽抗原的非增殖性细胞的步骤，所述保持有病毒肽抗原的非增殖性细胞是通过在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对含有T细胞的细胞群进行刺激后，进行在病毒肽抗原存在下的培养和使增殖能力丧失的处理而得到的

(ii)通过转座子法得到导入有靶抗原特异性嵌合抗原受体基因的基因修饰T细胞的步骤

(iii)将步骤(i)中准备的非增殖性细胞和步骤(ii)中得到的基因修饰T细胞混合，共培养的步骤

(iv)回收培养后的细胞的步骤

在步骤(i)中，首先，利用抗CD3抗体和抗CD28抗体对含有T细胞的细胞群进行刺激，得到活化T细胞。然后，进行在病毒肽抗原存在下的培养和使增殖能力丧失的处理。由此，得到非增殖性的“在细胞表面保持有病毒肽抗原的活化T细胞”(以下，称为“保持病毒肽的非增殖性细胞”)。在病毒肽抗原存在下的培养和使增殖能力丧失的处理的顺序没有特别限定。因此，可以在病毒肽抗原存在下进行培养后使增殖能力丧失，或者可以在使增殖能力丧失后在病毒肽抗原存在下进行培养。使增殖能力丧失前的一方可期待病毒肽抗原的摄入更良好，因此，优选采用前者的顺序。为了在病毒肽抗原存在下进行培养，例如只要使用添加有病毒肽抗原的培养基即可。或者，只要在培养中向培养基添加病毒肽抗原即可。病毒肽抗原的添加浓度例如为0.5μg/ml～1μg/ml。培养期限例如为10分钟～5小时，优选为20分钟～3小时。本说明书的“病毒肽抗原”是指可诱导对特定的病毒特异性的细胞毒性T细胞(CTL)的表位肽或包含表位的长肽。作为病毒肽抗原，并不限定于这些，例如可使用腺病毒(AdV)的抗原肽(例如，参照WO2007015540A1)、巨细胞病毒(CMV)的抗原肽(例如，参照日本特开2002-255997号公报、日本特开2004-242599号公报、日本特开2012-87126号公报)、依卜斯汀-巴尔病毒(EBV)的抗原肽(例如，参照WO2007049737A1、日本特愿2011-177487号公报、日本特开2006-188513号公报)等。病毒肽抗原可基于序列信息通过常规方法(例如液相合成法、固相合成法)来制备。另外，病毒肽抗原中也有市售的病毒肽抗原(例如株式会社医学生物学研究所、Takara Bio、Miltenyi Biotec等提供。)

也可以使用1种抗原肽，但通常使用2种以上的抗原肽(抗原肽混合物)。例如，使用AdV抗原肽混合物、CMV抗原肽混合物或EBV抗原肽混合物或者将这些抗原肽混合物中的二种以上组合而成的混合物(例如，将AdV抗原肽混合物、CMV抗原肽混合物和EBV抗原肽混合物混合而成的混合物)。通过并用2种以上的抗原肽，可得到靶(抗原肽)不同的多个活化T细胞，可期望本发明的制备方法得到的CAR-T细胞有效的治疗对象(患者)增多(覆盖率提高)。在决定使用哪一种来自病毒的抗原肽时，可以考虑通过本发明的制备方法得到的CAR-T细胞的用途，具体而言是作为治疗对象的疾病、患者的病态。例如，在将造血干细胞移植后的复发性白血病的治疗作为目的的情况下，可以单独使用EBV病毒的抗原肽混合物或与其它病毒的抗原肽混合物并用而使用。AdV抗原肽混合物、CMV抗原肽混合物、EBV抗原肽混合物也被市售(例如，Miltenyi Biotec公司提供的PepTivator(注册商标)AdV5Hexon、PepTivator(注册商标)CMV pp65、PepTivator(注册商标)EBV EBNA-1、PepTivator(注册商标)EBV BZLF1、JPT Peptide Technologies公司提供的PepMix^TM Collection HCMV、PepMix^TM EBV(EBNA1)等)，能够容易地获得。

步骤(ii)与上述本发明的第1制备方法的步骤(2)同样。通过该步骤，得到基因修饰T细胞(CAR-T细胞)。

在步骤(iii)中，将步骤(i)中准备的非增殖性细胞(保持病毒肽的非增殖性细胞)和步骤(ii)中得到的基因修饰T细胞混合，共培养。由此，施加介由基于非增殖性细胞的共刺激分子和病毒抗原肽的刺激，病毒抗原特异性基因修饰T细胞活化，并且促进其存活·增殖。

该步骤从为了使病毒特异性CAR-T细胞选择性增殖、为了避免强烈的刺激而防止T细胞的疲惫/疲劳等理由考虑，原则上不施加基于抗CD3抗体和抗CD28抗体的刺激。另一方面，为了提高细胞的存活率/增殖率，在共培养时，可以使用添加有T细胞增殖因子的培养液。作为T细胞增殖因子，优选IL-15。优选使用除IL-15还添加有IL-7的培养液。IL-15的添加量例如为5ng/ml～10ng/ml。同样地IL-7的添加量例如为5ng/ml～10ng/ml。此外，未提及的条件(血清的利用的可能性、基础培养基、培养温度等)与上述本发明的第1制备方法的步骤(3)的情况同样。

在步骤(iii)的中途可以追加保持病毒肽的非增殖性细胞。或者，可以回收共培养后的细胞，与保持病毒肽的非增殖性细胞混合后，再次进行共培养。可以将这些操作重复2次以上。如此，如果进行多次利用保持病毒肽的非增殖性细胞的刺激或活化，则能够期望病毒特异性CAR-T细胞的诱导率的提高、病毒特异性CAR-T细胞数的增加。此外，可以使用重新准备的细胞或预先保存步骤(i)中准备的细胞的一部分的细胞作为这里的保持病毒肽的非增殖性细胞。

步骤(iii)的共培养的期限例如为1天～21天，优选为5天～18天，进一步优选为10天～14天。如果培养期限过短，则无法期望充分的效果，如果培养期限过长，则存在细胞的活性(生命力)的降低、细胞的疲惫/疲劳等顾虑。

在与保持病毒肽的非增殖性细胞的共培养之前，可以将步骤(ii)中得到的基因修饰T细胞与保持病毒肽的非增殖性PBMC(末梢血单核细胞)进行共培养。在该方式的情况下，将共培养步骤(ii)中得到的基因修饰T细胞和保持病毒肽的非增殖性PBMC而得到的细胞与步骤(i)中准备的保持病毒肽的非增殖性细胞混合，进行共培养。这里的保持病毒肽的非增殖性PBMC可通过将PBMC供于在病毒肽抗原存在下的培养和使增殖能力丧失的处理而制备。具体而言，例如，对从末梢血分离的PBMC进行放射线处理后，在病毒肽抗原存在下培养，得到保持病毒肽的非增殖性PBMC。另外，如果使用从通过1次采血得到的末梢血分离的PBMC的一部分制备保持病毒肽的非增殖性PBMC并且由另一部分制备基因修饰T细胞，则能够减少伴随本发明的实施的采血次数，在临床应用上成为极大的优点。特别是如果使用剩余的PBMC进行步骤(i)，制备保持病毒肽的非增殖性细胞(第2阶段的共培养中使用的细胞)，则能够通过1次采血准备需要的3种细胞，即，基因修饰T细胞、与该细胞的共培养中使用的保持病毒肽的非增殖性PBMC、第2阶段的共培养中使用的保持病毒肽的非增殖性细胞，因此，能够大幅减轻使用本发明中得到的CAR-T细胞的治疗中的患者的负担。

在接着步骤(iii)的步骤(iv)中，回收培养后的细胞。与上述本发明的第1制备方法同样地，可以在步骤(iii)和步骤(iv)之间进行在T细胞增殖因子的存在下培养共培养后的细胞的步骤(扩大培养)。可以在该扩大培养时追加保持病毒肽的非增殖性细胞，或者在扩大培养的中途追加保持病毒肽的非增殖性细胞。

3.表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞及其用途

本发明的进一步的方面涉及通过本发明的制备方法得到的表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞(以下，称为“本发明的CAR-T细胞”)及其用途。本发明的CAR-T细胞可被利用于认为CAR疗法有效的各种疾病(以下，称为“靶疾病”)的治疗、预防或改善。靶疾病的代表为癌，但并不限定于此。如果举出靶疾病的例子，则为各种B细胞淋巴瘤(滤泡性恶性淋巴瘤、弥漫性恶性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、血管内B细胞性淋巴瘤、CD20阳性霍奇金淋巴瘤等)、骨髓增殖性肿瘤、骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤(CMML,JMML,CML,MDS/MPN-UC)、骨髓增生异常症候群、急性髓细胞源性白血病、神经母细胞瘤、脑肿瘤、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、肺小细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、肾癌、胰腺癌、恶性间皮瘤、前列腺癌等。“治疗”包括缓和对靶疾病特征性的症状或伴发症状(轻症化)、阻止或延迟症状的恶化等。“预防”是指防止或延迟疾病(障碍)或其症状的发病/出现，或者降低发病/出现的危险性。另一方面，“改善”是指疾病(障碍)或其症状缓和(轻症化)、好转、缓解、或治愈(包括部分的治愈)。

也能够以细胞制剂的形式提供本发明的CAR-T细胞。本发明的细胞制剂含有治疗上有效量的本发明的CAR-T细胞。例如作为1次给药用，含有10⁴个～10¹⁰个细胞。出于细胞保护的目的，可以在细胞制剂含有二甲基亚砜(DMSO)、血清白蛋白等，出于阻止细菌的混入的目的，可以在细胞制剂含有抗生素等，出于细胞的活化、增殖或分化诱导等目的，可以在细胞制剂含有各种成分(维生素类、细胞因子、生长因子、类固醇等)等成分。

本发明的CAR-T细胞或细胞制剂的给药途径没有特别限定。例如通过静脉内注射、动脉内注射、门静脉内注射、皮内注射、皮下注射、肌肉内注射或腹腔内注射而给药。不依赖于全身给药，也可以为局部给药。作为局部给药，可例示向目标组织·脏器·器官的直接注入。给药方案只要考虑对象(患者)的性别、年龄、体重、病态等制定即可。除单次给药以外，可以连续或定期地进行多次给药。

实施例

＜CAR-T细胞的制备效率和基因导入效率的研究＞

利用转座子法的CAR疗法与利用病毒载体的情况相比，特别是在安全性方面有利。另一方面，基因导入效率低、在基因导入时的操作(例如电穿孔)中细胞容易受到损伤、得到的细胞数少等成为问题。为了克服这些问题点，进行了以下的研究。

1.材料

(1)抗体

抗CD3抗体(Miltenyi Biotec公司)

抗CD28抗体(Miltenyi Biotec公司)

(2)培养基

TexMACS(Miltenyi Biotec公司)

(3)细胞因子

重组人IL-7(Miltenyi Biotec公司)

重组人IL-15(Miltenyi Biotec公司)

(4)病毒肽混合物

PepTivator(注册商标)CMV pp65-premium grade,人(Miltenyi Biotec公司)

PepTivator(注册商标)AdV5Hexon-premium grade,人(Miltenyi Biotec公司)

PepTivator(注册商标)EBV EBNA-1-premium grade,人(Miltenyi Biotec公司)

PepTivator(注册商标)EBV BZLF1-premium grade,人(Miltenyi Biotec公司)

(5)质粒

pIRII-CD19CAR载体(表达CAR)

pCMV-piggyBac载体(表达piggyBac转座酶)

(6)细胞培养容器

24孔未包被的组织培养板(Falcon)

24孔组织培养板(Falcon)

G-Rex10(Wilson Wolf)

2.方法

(1)活化T细胞的准备

(1－1)抗CD3抗体/抗CD28抗体包被(致敏)的板的制作

利用PBS以成为1mg/ml的方式稀释抗CD3抗体和抗CD28抗体，以成为0.5ml/孔的方式添加到24孔未包被的板。板在37℃的培养箱中静置2～4小时。抽吸抗体稀释PBS，每1个孔利用1ml的PBS清洗1次。

(1－2)在抗CD3抗体/抗CD28抗体包被的板中的培养

第0天：利用以成为5ng/ml的方式添加了IL-15的TexMACS将从末梢血分离的PBMC以成为5×10⁵/ml的方式进行稀释，以每1个孔各2ml的方式向抗CD3抗体/抗CD28抗体包被的板分注。

第1天：将细胞移至24孔组织培养板。培养液更换一半，以成为5ng/ml的方式添加IL-15。

第4天：以成为5ng/ml的方式添加IL-15。

第7天：回收细胞，分注并进行冷冻保存。

(1－3)活化T细胞的再刺激

第0天：将冷冻保存的细胞解冻，清洗2次后，利用添加IL15 5ng/ml的TexMACS^TM以成为1×10⁶个/ml的方式进行稀释，以每1孔2ml分配至抗CD3抗体/抗CD28抗体涂布板。

第3天：回收细胞，用于CAR-T培养。

(2)基于以往方法的CAR-T的制作和培养(参照培养法1、图1)

第0天：从末梢血分离单核细胞并计数。相对于1×10⁷个单核细胞，各添加5μg的pIRII-CAR.CD19.28z载体(图4)和pCMV-pigBac载体(图5)，使用4D nucleofector(Lonza)并通过电穿孔(核转染)进行基因导入。然后，浮于添加了IL-7 10ng/ml和IL15 5ng/ml的TexMACS^TM，利用24孔板在37℃的培养箱中开始培养。

第1天：利用抗CD3抗体/抗CD28抗体包被的板刺激。

第4天：将细胞移至G-Rex10，利用添加了IL-7 10ng/ml和IL15 5ng/ml的TexMACS^TM进行培养。

第7天：利用添加了IL-7 10ng/ml和IL15 5ng/ml的TexMACS^TM将培养液更换一半。

第10天：利用添加了IL-7 10ng/ml和IL15 5ng/ml的TexMACS^TM将培养液更换一半。

第14天：结束培养。

(3)基于活化T细胞添加法的CAR-T的制作和培养(参照培养法2、图2)

第0天：从末梢血分离单核细胞，相对于1×10⁷个单核细胞，各添加5μg的pIRII-CAR.CD19.28z载体(图4)和pCMV-pigBac载体(图5)并通过电穿孔(核转染)进行基因导入。将基因导入的细胞和放射线照射的5×10⁵个活化T细胞混合，浮于添加了IL-7 10ng/ml和IL15 5ng/ml的TexMACS^TM，利用24孔板在37℃的培养箱中开始培养。

第1天：利用抗CD3抗体/抗CD28抗体包被的板进行刺激。

第4天：将细胞移至G-Rex10，利用添加了IL-7 10ng/ml和IL155ng/ml的TexMACS^TM进行培养。

第14天：结束培养。

(4)基于添加病毒肽的活化T细胞添加法的CAR-T的制作和培养(参照培养法3、图3)

第0天：向放射线照射的活化T细胞5×10⁵个添加病毒肽(PepTivator CMV pp65、PepTivator AdV5Hexon、PepTivator EBV EBNA-1和PepTivator EBV BZLF1各50ng)，在37℃培养30分钟。相对于1×10⁷个末梢血单核细胞，各添加5μg的pIRII-CAR.CD19.28z载体(图4)和pCMV-pigBac载体(图5)并通过电穿孔(核转染)进行基因导入。将基因导入的细胞和放射线照射的添加病毒肽的活化T细胞混合，浮于添加了IL-7 10ng/ml和IL15 5ng/ml的TexMACS^TM，利用24孔板在37℃的培养箱中开始培养。

第2天～第5天：根据需要利用添加了IL-7 10ng/ml和IL15 5ng/ml的TexMACS^TM将培养液更换一半。

第7天：回收细胞并计数。使通过与上述同样的方法制备的添加病毒肽的活化T细胞2×10⁶个和回收的细胞漂浮于添加了IL-15(5ng/ml)和IL-7(10ng/ml)的培养液30ml中，利用G-Rex10开始培养。

第14天：结束培养。

3.结果

培养结束后(第14天)，每个培养法求出增殖细胞数、CAR-T细胞数和基因导入效率(CAR-T细胞/总活细胞)，在培养法1～3之间进行比较。另外，增殖细胞数的测量使用血球计数板，CAR-T细胞数和基因导入效率由流式细胞仪解析的结果算出。

对于CAR-T细胞数，培养法1为1.18×10⁶(±0.509×10⁶)，培养法2为7.13×10⁶(±3.25×10⁶)，培养法3为1.09×10⁷(±2.98×10⁶)(图6)。另外，对于基因导入效率，培养法1为3.22％(±1.42)，培养法2为10.3％(±4.21)，培养法3为26.9％(±2.79)(图7)。应予说明，括号内为标准误差。

增加CAR-T细胞的制备中使用的末梢血的供体数(N＝9)进一步进行了研究。其结果，对于CAR-T细胞数，培养法1为2.5×10⁶(±0.72×10⁶)，培养法2为7.6×10⁶(±2.6×10⁶)，培养法3为17.2×10⁶(±5.8×10⁶)(图8)。另外，对于基因导入效率，培养法1为4.6％(±1.1)，培养法2为10.7％(±2.7)，培养法3为33.0％(±3.4)(图9)。应予说明，括号内为标准误差。

另一方面，通过质粒的优化(图10)，在培养法3中实现了平均约50％的基因导入效率(图11)。

如上所示，新培养法(培养法2、3)与以往方法(培养法1)相比，CAR-T细胞数增加，基因导入效率也上升。在培养法2的情况下，认为通过基于共刺激分子的表达的细胞刺激(电穿孔时受到损伤的基因导入细胞的保护作用)、基于培养微环境的细胞因子刺激等，带来CAR-T细胞数的增加和基因导入效率的上升。在培养法3中，认为通过基于共刺激分子的表达的细胞刺激、基于培养微环境的细胞因子刺激、来自病毒特异性T细胞受体的相对缓和的细胞刺激等，带来CAR-T细胞数的增加和基因导入效率的上升。

明确了新的两个培养法，即，使用活化T细胞的新培养法(培养法2)和使用添加病毒肽的活化T细胞的新培养法(培养法3)能够克服利用转座子法的CAR疗法的问题点。通过利用这些培养法，可期待进一步促进·扩大CAR疗法的临床应用。对于培养法3，存在同种反应性降低(病毒特异性CTL可期待的效果)、由该同种反应性降低带来的能够利用来自第三方的CAR-T细胞的可能性、由通过体内病毒刺激病毒抗原受体所带来的体内持久性(persistency)上升的可能性等，可以期待安全性的进一步提高、治疗效果的增大等。

＜培养法3的改良＞

1.方法

第0天：从末梢血分离单核细胞(PBMC)。对一部分(PBMC 1×10⁶个)进行放射线照射后，添加病毒肽(PepTivator CMV pp65、PepTivator AdV5Hexon、PepTivator EBV EBNA-1和PepTivator EBV BZLF1各50ng)，在37℃培养30分钟。另一方面，相对于1×10⁷个PBMC，各添加5μg的pIRII-CAR.CD19_优化的载体(图10)和pCMV-pigBac载体(图5)并通过电穿孔(核转染)进行基因导入。将基因导入的细胞和放射线照射的添加病毒肽的PBMC混合，浮于添加了IL-7 10ng/ml和IL15 5ng/ml的TexMACS^TM，利用24孔板在37℃的培养箱中开始培养。此外，按照上述(1)的方法，预先由剩余的PBMC制备活化T细胞。

第7天：回收细胞并计数。另一方面，对通过上述方法制备的活化T细胞2×10⁶个进行放射线照射后，添加病毒肽(PepTivator CMV pp65、PepTivator AdV5Hexon、PepTivatorEBV EBNA-1和PepTivator EBV BZLF1各50ng)，在37℃培养30分钟。使如此得到的添加病毒肽的活化T细胞2×10⁶个和回收的细胞漂浮于添加了IL-15(5ng/ml)和IL-7(10ng/ml)的培养液30ml中，利用G-Rex10开始培养。

第14天：结束培养。

2.结果

培养结束后(第14天)，求出CAR-T细胞数和基因导入效率(CAR-T细胞/总活细胞)。对于CAR-T细胞数和基因导入效率，第1次实验为2.81×10⁷个和55.1％，第2次实验为1.03×10⁷个和52.0％，第3次实验为9.22×10⁶个和42.3％。如此实现了高的基因导入效率。此外，该培养法能够通过1次采血而得到CAT-T细胞，具有减轻对患者的负担这样的优点。

＜CAR-T细胞的活性评价＞

通过以下的方法对利用新培养法制备的CAR-T细胞的细胞毒活性和抗肿瘤活性。

1.与CD19阳性白血病细胞株的共培养实验

使用培养法3由6人的健康人末梢血制作CAR-T细胞。将CAR-T细胞(1×10⁵个)和CD19阳性白血病细胞株(5×10⁵个)在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基下共培养7天(效应子细胞：靶细胞＝1:5)。将使用未导入基因的活化T细胞(从培养法3省略基因导入操作而制备的T细胞)代替CAR-T细胞的情况作为对照。在7天的共培养后回收细胞，利用抗CD19抗体和抗CD3抗体染色后，利用计数微珠(counting beads)和流式细胞仪对细胞数进行计数。利用以下的计算式算出残留肿瘤细胞数，评价CAR-T细胞的细胞毒活性。此外，使用3种CD19阳性白血病细胞株(KOPN30bi、SK-9、TCC-Y/sr)进行以上的实验。

标准化肿瘤细胞残留率(％)＝100×(与T细胞共培养的孔的残留肿瘤细胞数－未与T细胞共培养的孔的肿瘤细胞数)/未与T细胞共培养的孔的肿瘤细胞数

将结果示于图12。在与CAR-T细胞共培养的情况下，KOPN30bi的残留率为0.2％(对照为89％)，SK-9的残留率为0.03％(对照为87％)，TCC-Y/sr为0.03％(对照为86％)，CAR-T细胞显示强力的细胞毒活性。

2.基于荷瘤小鼠的评价

对于在3天前(D-3)从尾静脉注射了CD19阳性细胞株(导入了荧光素酶基因的Daudi，1×10⁶个)的NSG小鼠(各试验区5只)，从尾静脉注射通过培养法3制作的CAR-T细胞(1×10⁷个)(D0)。在对照(NT)中，注射未导入基因的活化T细胞(从培养法3省略基因导入操作而制备的T细胞)。适当腹腔内给药荧光素，使用生物体内成像系统对小鼠进行拍摄。

如图13所示，在利用未导入基因的活化T细胞(对照(NT))治疗的小鼠中，肿瘤细胞增殖，与此相对，在利用增殖CAR-T细胞治疗的小鼠中，未确认到肿瘤细胞的增殖。即，CAT细胞在荷瘤小鼠中强力地抑制肿瘤增殖。

3.结论

如上所述，在体外和体内的实验中确认了通过新培养法制作的CAR-T细胞显示优异的活性。即，表示新培养法作为有效地制作治疗效果高的CAR-T细胞的方法是极其有效的。

产业上的可利用性

根据本发明，能够提高利用转座子法制备CAR-T细胞时的CAR基因导入效率和细胞增殖率。即，本发明提高利用转座子法的安全性高的CAR-T细胞的制备方法的实用性，由此促进CAR疗法的临床应用，另外，有助于CAR疗法的治疗效果的增大。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限定。在不脱离专利请求书的范围的记载、本领域技术人员能够容易想到的范围内进行的各种变形方式也包含在本发明中。本说明书中明示的论文、公开专利公报以及专利公报等内容通过援引其全部的内容而引用。

序列表

<110> 国立大学法人名古屋大学

国立大学法人信州大学

<120> 表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法

<130> NU15010P

<150> JP P2015-200458

<151> 2015-10-08

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6438

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pIRII-CAR.CD19.28z

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(86)

<223> 前导

<220>

<221> misc_feature

<222> (87)..(416)

<223> VL

<220>

<221> misc_feature

<222> (486)..(833)

<223> VH

<220>

<221> misc_feature

<222> (867)..(1562)

<223> CH2CH3

<220>

<221> misc_feature

<222> (1575)..(1778)

<223> CD28

<220>

<221> misc_feature

<222> (1779)..(2117)

<223> CD3 zeta

<220>

<221> misc_feature

<222> (2850)..(3085)

<223> 3' IR

<220>

<221> misc_feature

<222> (5031)..(5341)

<223> 5' IR

<400> 1

tcgagctcaa gcttcgaatt cgaatggcca tggagtttgg gctgagctgg ctttttcttg 60

tggctatttt aaaaggtgtc cagtgctcta gagacatcca gatgacacag actacatcct 120

ccctgtctgc ctctctggga gacagagtca ccatcagttg cagggcaagt caggacatta 180

gtaaatattt aaattggtat cagcaaaaac cagatggaac tgttaaactc ctgatctacc 240

atacatcaag attacactca ggagtcccat caaggttcag tggcagtggg tctggaacag 300

attattctct caccattagc aacctggagc aagaagatat tgccacttac ttttgccaac 360

agggtaatac gcttccgtac acgttcggag gggggaccaa gctggagctg aaacgtggtg 420

gtggtggttc tggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt ggatccgagg 480

tgcagctgca gcagtctgga cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat 540

gcactgtctc aggggtctca ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac 600

gaaagggtct ggagtggctg ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag 660

ctctcaaatc cagactgacc atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa 720

tgaacagtct gcaaactgat gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg 780

gtggtagcta tgctatggac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc tcctcgtacg 840

tcaccgtctc ttcacaggat cccgccgagc ccaaatctcc tgacaaaact cacacatgcc 900

caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 960

ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 1020

gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 1080

ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1140

ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1200

ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 1260

aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 1320

gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcaac 1380

cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 1440

acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 1500

tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 1560

aaaaagatcc caaattttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct 1620

tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc 1680

acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc 1740

cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc agcaggagcg 1800

cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac 1860

gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa 1920

agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg 1980

cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg 2040

gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg 2100

ccctgcctcc tcgctaagca tgctagctat agttctagag gtaccggttg ttaacgttag 2160

ccggctacgt atactccgga atattaatag gcctaggatg catatggcgg ccgcttccct 2220

ttagtgaggg ttaatgcttc gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 2280

cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 2340

atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 2400

gtttcaggtt cagggggaga tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg 2460

tggtaaaatc cgataaggat cgatccgggc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 2520

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga cgcgccctgt agcggcgcat 2580

taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 2640

cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgcccga tagcgataag 2700

gatccgcgta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc 2760

ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc 2820

ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggat tttgttactt tatagaagaa attttgagtt 2880

tttgtttttt tttaataaat aaataaacat aaataaattg tttgttgaat ttattattag 2940

tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat atctattcaa attaataaat aaacctcgat 3000

atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac 3060

aatatgatta tctttctagg gttaatccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 3120

atcaccgaaa cgcgcgagac gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt 3180

catgataata atggtttctt agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac 3240

ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 3300

ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt 3360

cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct 3420

ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga 3480

tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag 3540

cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca 3600

actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga 3660

aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag 3720

tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc 3780

ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa 3840

tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt 3900

gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg 3960

gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt 4020

tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg 4080

gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat 4140

ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact 4200

gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa 4260

aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 4320

ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 4380

ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 4440

tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 4500

gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 4560

agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 4620

taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 4680

gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 4740

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 4800

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 4860

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 4920

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 4980

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatggct cgacagatct ttaaccctag 5040

aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc tctttctaaa 5100

tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga gctcccgtga 5160

ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc gcgtgagtca 5220

aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg ataattatat 5280

tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct tgttatagat 5340

aagatcttca atattggcca ttagccatat tattcattgg ttatatagca taaatcaata 5400

ttggctattg gccattgcat acgttgtatc tatatcataa tatgtacatt tatattggct 5460

catgtccaat atgaccgcca tgttggcatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa 5520

ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 5580

atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 5640

ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 5700

aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtccgccc cctattgacg 5760

tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta cgggactttc 5820

ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 5880

agtacaccaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 5940

ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta 6000

acaactgcga tcgcccgccc cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac ggtgggaggt 6060

ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcact agaagcttta ttgcggtagt 6120

ttatcacagt taaattgcta acgcagtcag tgcttctgac acaacagtct cgaacttaag 6180

ctgcagtgac tctcttaagg tagccttgca gaagttggtc gtgaggcact gggcaggtaa 6240

gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa actgggcttg tcgagacaga 6300

gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc 6360

tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta aggctagagt acttaatacg 6420

actcactata ggctagcc 6438

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 前导

<400> 2

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 3

Ser Arg Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser

1 5 10 15

Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser

20 25 30

Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu

65 70 75 80

Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu

85 90 95

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110

<210> 4

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 4

Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

1 5 10 15

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

20 25 30

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

35 40 45

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

50 55 60

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

85 90 95

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser

115

<210> 5

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH2CH3

<400> 5

Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 6

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD28

<400> 6

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD3zeta

<400> 7

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 8

<211> 5413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCMV-pigBac

<220>

<221> misc_feature

<222> (826)..(2610)

<223> piggyBac

<400> 8

gaattcgagc ttgcatgcct gcaggtcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 60

tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 120

ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 180

gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 240

tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 300

atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 360

cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 420

agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 480

ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta 540

gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac 600

cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gatccggtac tcgaggaact gaaaaaccag 660

aaagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc aggtcccgga tccggtggtg 720

gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt acttctaggc ctgtacggaa 780

gtgttacttc tgctctaaaa gctgcggaat tgtacccgcg gataaaatgg gtagttcttt 840

agacgatgag catatcctct ctgctcttct gcaaagcgat gacgagcttg ttggtgagga 900

ttctgacagt gaaatatcag atcacgtaag tgaagatgac gtccagagcg atacagaaga 960

agcgtttata gatgaggtac atgaagtgca gccaacgtca agcggtagtg aaatattaga 1020

cgaacaaaat gttattgaac aaccaggttc ttcattggct tctaacagaa tcttgacctt 1080

gccacagagg actattagag gtaagaataa acattgttgg tcaacttcaa agtccacgag 1140

gcgtagccga gtctctgcac tgaacattgt cagatctcaa agaggtccga cgcgtatgtg 1200

ccgcaatata tatgacccac ttttatgctt caaactattt tttactgatg agataatttc 1260

ggaaattgta aaatggacaa atgctgagat atcattgaaa cgtcgggaat ctatgacagg 1320

tgctacattt cgtgacacga atgaagatga aatctatgct ttctttggta ttctggtaat 1380

gacagcagtg agaaaagata accacatgtc cacagatgac ctctttgatc gatctttgtc 1440

aatggtgtac gtctctgtaa tgagtcgtga tcgttttgat tttttgatac gatgtcttag 1500

aatggatgac aaaagtatac ggcccacact tcgagaaaac gatgtattta ctcctgttag 1560

aaaaatatgg gatctcttta tccatcagtg catacaaaat tacactccag gggctcattt 1620

gaccatagat gaacagttac ttggttttag aggacggtgt ccgtttagga tgtatatccc 1680

aaacaagcca agtaagtatg gaataaaaat cctcatgatg tgtgacagtg gtacgaagta 1740

tatgataaat ggaatgcctt atttgggaag aggaacacag accaacggag taccactcgg 1800

tgaatactac gtgaaggagt tatcaaagcc tgtgcacggt agttgtcgta atattacgtg 1860

tgacaattgg ttcacctcaa tccctttggc aaaaaactta ctacaagaac cgtataagtt 1920

aaccattgtg ggaaccgtgc gatcaaacaa acgcgagata ccggaagtac tgaaaaacag 1980

tcgctccagg ccagtgggaa catcgatgtt ttgttttgac ggacccctta ctctcgtctc 2040

atataaaccg aagccagcta agatggtata cttattatca tcttgtgatg aggatgcttc 2100

tatcaacgaa agtaccggta aaccgcaaat ggttatgtat tataatcaaa ctaaaggcgg 2160

agtggacacg ctagaccaaa tgtgttctgt gatgacctgc agtaggaaga cgaataggtg 2220

gcctatggca ttattgtacg gaatgataaa cattgcctgc ataaattctt ttattatata 2280

cagccataat gtcagtagca agggagaaaa ggttcaaagt cgcaaaaaat ttatgagaaa 2340

cctttacatg agcctgacgt catcgtttat gcgtaagcgt ttagaagctc ctactttgaa 2400

gagatatttg cgcgataata tctctaatat tttgccaaat gaagtgcctg gtacatcaga 2460

tgacagtact gaagagccag taatgaaaaa acgtacttac tgtacttact gcccctctaa 2520

aataaggcga aaggcaaatg catcgtgcaa aaaatgcaaa aaagttattt gtcgagagca 2580

taatattgat atgtgccaaa gttgtttctg actgactaat aagtataatt tgtttctatt 2640

atgtataagt taagctaatt aggatctaag ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg 2700

cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag gttttttcgg atcctctaga 2760

gtcgacctgc aggcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 2820

ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 2880

gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 2940

gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 3000

tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 3060

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 3120

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 3180

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 3240

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 3300

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 3360

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 3420

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 3480

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 3540

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 3600

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 3660

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 3720

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 3780

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 3840

acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 3900

ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 3960

ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 4020

tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 4080

tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 4140

gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 4200

tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 4260

tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 4320

ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 4380

tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 4440

ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 4500

gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 4560

ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 4620

cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 4680

ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 4740

ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 4800

gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 4860

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 4920

gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 4980

aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 5040

tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 5100

cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct 5160

taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc 5220

gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa 5280

ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg 5340

atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa 5400

aacgacggcc agt 5413

<210> 9

<211> 5793

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pIRII-CAR.CD19_optimized

<400> 9

tcgagctcaa gcttcgaatt caccatgctt ctcctggtga caagccttct gctctgtgag 60

ttaccacacc cagcattcct cctgatccca gacatccaga tgacacagac tacatcctcc 120

ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt 180

aaatatttaa attggtatca gcaaaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctaccat 240

acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat 300

tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag 360

ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg gggactaagt tggaaataac aggctccacc 420

tctggatccg gcaagcccgg atctggcgag ggatccacca agggcgaggt gaaactgcag 480

gagtcaggac ctggcctggt ggcgccctca cagagcctgt ccgtcacatg cactgtctca 540

ggggtctcat tacccgacta tggtgtaagc tggattcgcc agcctccacg aaagggtctg 600

gagtggctgg gagtaatatg gggtagtgaa accacatact ataattcagc tctcaaatcc 660

agactgacca tcatcaagga caactccaag agccaagttt tcttaaaaat gaacagtctg 720

caaactgatg acacagccat ttactactgt gccaaacatt attactacgg tggtagctat 780

gctatggact actggggcca agggacctca gtcaccgtct cctcagcggc cgcaattgaa 840

gttatgtatc ctcctcctta cctagacaat gagaagagca atggaaccat tatccatgtg 900

aaagggaaac acctttgtcc aagtccccta tttcccggac cttctaagcc cttttgggtg 960

ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt 1020

attttctggg tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 1080

ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 1140

gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1200

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1260

gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1320

gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1380

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1440

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaaggtacc 1500

ggttgttaac gttagccggc tacgtatact ccggaatatt aataggccta ggatgcatat 1560

ggcggccgct tccctttagt gagggttaat gcttcgagca gacatgataa gatacattga 1620

tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg 1680

tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa 1740

ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta 1800

aaacctctac aaatgtggta aaatccgata aggatcgatc cgggctggcg taatagcgaa 1860

gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggacgcgc 1920

cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac 1980

ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg 2040

cccgatagcg ataaggatcc gcgtatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 2100

atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2160

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggattttgt tactttatag 2220

aagaaatttt gagtttttgt ttttttttaa taaataaata aacataaata aattgtttgt 2280

tgaatttatt attagtatgt aagtgtaaat ataataaaac ttaatatcta ttcaaattaa 2340

taaataaacc tcgatataca gaccgataaa acacatgcgt caattttacg catgattatc 2400

tttaacgtac gtcacaatat gattatcttt ctagggttaa tccgggagct gcatgtgtca 2460

gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 2520

tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 2580

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 2640

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 2700

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 2760

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 2820

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 2880

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 2940

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 3000

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 3060

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 3120

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 3180

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 3240

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 3300

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 3360

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 3420

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 3480

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 3540

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 3600

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 3660

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 3720

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 3780

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 3840

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca 3900

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 3960

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 4020

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 4080

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 4140

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 4200

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 4260

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 4320

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tggctcgaca 4380

gatctttaac cctagaaaga tagtctgcgt aaaattgacg catgcattct tgaaatattg 4440

ctctctcttt ctaaatagcg cgaatccgtc gctgtgcatt taggacatct cagtcgccgc 4500

ttggagctcc cgtgaggcgt gcttgtcaat gcggtaagtg tcactgattt tgaactataa 4560

cgaccgcgtg agtcaaaatg acgcatgatt atcttttacg tgacttttaa gatttaactc 4620

atacgataat tatattgtta tttcatgttc tacttacgtg ataacttatt atatatatat 4680

tttcttgtta tagataagat cttcaatatt ggccattagc catattattc attggttata 4740

tagcataaat caatattggc tattggccat tgcatacgtt gtatctatat cataatatgt 4800

acatttatat tggctcatgt ccaatatgac cgccatgttg gcattgatta ttgactagtt 4860

attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 4920

cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 4980

caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 5040

tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagtc 5100

cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 5160

ccttacggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 5220

tgatgcggtt ttggcagtac accaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 5280

caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 5340

ttccaaaatg tcgtaacaac tgcgatcgcc cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg 5400

tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag 5460

ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac 5520

agtctcgaac ttaagctgca gtgactctct taaggtagcc ttgcagaagt tggtcgtgag 5580

gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg 5640

gcttgtcgag acagagaaga ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca 5700

tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccagtt caattacagc tcttaaggct 5760

agagtactta atacgactca ctataggcta gcc 5793

Claims

1.一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法，包括以下的步骤(1)～(4)：

(4)回收培养后的细胞的步骤。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(3)和步骤(4)之间进行在T细胞增殖因子的存在下培养共培养后的细胞的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，步骤(3)的共培养的期限为1天～14天。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，在T细胞增殖因子的存在下进行步骤(3)。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，T细胞增殖因子为IL-15。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，并用IL-15和IL-7作为T细胞增殖因子。

7.一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞的制备方法，包括以下的步骤(i)～(iv)：

(iv)回收培养后的细胞的步骤。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，在步骤(iii)和步骤(iv)之间进行在T细胞增殖因子的存在下培养共培养后的细胞的步骤。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其中，步骤(iii)的共培养的期限为1天～14天。

10.根据权利要求7～9中任一项所述的制备方法，其中，在T细胞增殖因子的存在下进行步骤(iii)。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，T细胞增殖因子为IL-15。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其中，并用IL-15和IL-7作为T细胞增殖因子。

13.根据权利要求1～12中任一项所述的制备方法，其中，含有T细胞的细胞群为末梢血单核细胞即PBMCs。

14.根据权利要求1～13中任一项所述的制备方法，其中，使增殖能力丧失的处理为放射线照射。

15.根据权利要求1～14中任一项所述的制备方法，其中，转座子法为PiggyBac转座子法。

16.根据权利要求1～15中任一项所述的制备方法，其中，靶抗原为CD19、CD19、GD2、GMCSF受体或IGF受体。

17.根据权利要求1～16中任一项所述的制备方法，其中，非增殖性细胞和基因修饰T细胞来自同一个体。

18.一种表达嵌合抗原受体的基因修饰T细胞，是通过权利要求1～17中任一项所述的制备方法而得到的。

19.一种细胞制剂，含有治疗上有效量的权利要求18所述的基因修饰T细胞。

20.一种癌的治疗法，包括对癌患者给药治疗上有效量的权利要求18所述的基因修饰T细胞的步骤。