WO2007015540A1 - 細胞傷害性ｔ細胞エピトープペプチド及びその用途 - Google Patents

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Yool-Ja Kim
Susumu Suzuki
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Definitions

  • the present invention relates to a cytotoxic T cell epitope peptide specific for adenovirus, a vaccine for treating or preventing adenovirus infection using the peptide, and a passive immunotherapeutic agent for adenovirus.
  • Adenoviruses cause respiratory infections such as pneumonia, ocular infections such as pool fever and epidemic keratoconjunctivitis, intestinal infections such as gastroenteritis, hemorrhagic cystitis and urethritis.
  • respiratory infections such as pneumonia
  • ocular infections such as pool fever and epidemic keratoconjunctivitis
  • intestinal infections such as gastroenteritis, hemorrhagic cystitis and urethritis.
  • genitourinary infections can cause serious symptoms in newborns. However, as long as appropriate treatment is given to adults, it rarely becomes severe, and it is used as a relatively safe viral vector for research in gene therapy and vaccine development.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 See Non-Patent Documents 1 to 3).
  • HCMV human cytomegalovirus
  • VZV varicella-zoster virus
  • BLPD herpes zoster and B-cell lymphoproliferati ve disorder
  • EBV Epstein-Barr virus
  • the issue of how to control such infectious diseases determines the success of transplantation, and countermeasures against infectious diseases are the most important issue at the site of transplantation.
  • the administration of antibiotics has helped HSV, HCMV, and VZV to be resolved to a large extent by administering effective antiviral drugs as a pretreatment.
  • antiviral drug resistant HCMV infection, B lymphocyte proliferative disease For many years, there has been no effective treatment for infections caused by virus.
  • Non-patent literature 1 Flomenberg P, outside d, “Characterization of human proliferative T cell responses to adenovirus.”, J Infect Dis., 1995, Vol.171, p.1090-1096
  • Non-patent literature 2 Hale GA, outside 6 people, “Adenovirus infection after pediatric bone marrow transplantation.”, Bone Marrow Transplant. ⁇ 1999, Vol.23, p.277—282
  • Non-patent literature 3 Howard DS, outside 7 authors, “Adenovirus infections in hematopoietic stem cell transplant recipients. '', Clin Infect Dis. ⁇ 1999, Vol.
  • Non-Patent Document 4 Einsele H, 13 others, ⁇ Infosion of cytomegalovirus (CMV) -specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy. '', Blood., 2002, Vol.99, p.3916-3922
  • Non-patent document 5 Heslop HE and Rooney CM., "Adoptive cellular immunotherapy f or EBV lymphoproliferative disease.”, Immunol Rev., 1997, Vol.157, p.217-222
  • Patent document 6 Walter EA, et al. 6 authors, ⁇ Reconstitution of cellular immunity against cyt omegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones fro m the donor.J, N Engl J Med., 1995, Vol.333, p.1038-1044
  • Non-Patent Document 7 Hromas R, 4 others, “Donor leukocyte infusion as therapy of life-threatening adenoviral infections after T—cell—depleted bone marrow transplantation.”, Blood., 1994, Vol.84, p.1689 -1690
  • Non-Patent Document 8 Chakrabarti S, 4 authors, “Adenovirus infections following haematopoi etic cell transplantation: is there a role for adoptive immunotherapy?”, Bone Marro w Transplant., 2000, Vol. 26, p.305-307
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to treat a cytotoxic T cell epitope peptide specific for adenovirus, and infection of adenovirus using the peptide.
  • the purpose is to provide a vaccine to prevent, a passive immunotherapy for adenovirus, and a method for quantifying adenovirus-specific CTL.
  • CTLs cytotoxic T cells
  • Adenoviruses have been reported with 51 serotypes, and are classified into 6 subgroups (AF). The pathogenicity is high in the subgroups A, B, and C, which are categorized into fcO (Flomenberg P, Piaskowski V, Truitt RL, Casper JT., And haracteriza tion of human proliferative T cell responses to adenovirus., J Infect Dis., 1995; 171: 1 090-109b, Carrigan DR., Adenovirus infections in immunocompromised patients., AmJ Med., 1997; 102: 71-74) 0
  • the present inventors show specificity for adenovirus-specific epitopes belonging to subgroup B and adenovirus in general.
  • the present invention was completed by successfully identifying an epitope peptide.
  • the epitope peptide identified by the present inventors has a function of efficiently inducing adenovirus-specific CTL, and the peptide and the nucleic acid encoding the peptide prevent the infection of adenovirus. It is useful as a vaccine (active immunotherapy agent) for treatment or prevention.
  • CTLs induced by these epitope peptides of the present invention have a function of specifically destroying adenovirus-infected cells and are very useful as components of passive immunotherapeutic agents.
  • CTL specific for adenovirus can be quantified by using the epitope peptide. Knowing whether or not adenovirus-specific CTLs are present in the peripheral blood of patients with or without risk, including the appropriate use of antiviral and immunosuppressive agents, can help control these infections. This is important information.
  • the present inventors have provided a method for quantifying CTL using an epitope peptide.
  • various forms of molecules that retain adenovirus-specific CTL inducing ability can be prepared based on the peptide structure specifically disclosed by the present application. Furthermore, by appropriately modifying the peptide, it is possible to produce a molecule that has a stronger ability to induce CTLs or can induce CTLs with higher specificity for adenovirus-infected cells.
  • the present invention relates to an adenovirus-specific cytotoxic T cell epitope peptide, a vaccine for treating or preventing adenovirus infection using the peptide, a passive immunotherapeutic agent for adenovirus, and adenovirus.
  • cytotoxic T cell epitope peptide specific for adenovirus [2] The peptide according to [1], wherein the cytotoxic T cell epitope peptide specific for adenovirus comprises at least one amino acid sequence selected from the group force consisting of SEQ ID NOs: 1 to 6,
  • a cell having a T cell receptor capable of specifically recognizing a cell presenting a complex with a 702 molecule on the cell surface has a function capable of inducing a cytotoxic T cell, [1]-[ 3] !, the peptide according to any of the above,
  • a vaccine for treating or preventing adenovirus infection comprising the peptide according to any one of [1] to [4] as an active ingredient,
  • a vaccine for treating or preventing adenovirus infection comprising the nucleic acid according to [5] as an active ingredient,
  • a vaccine for treating or preventing adenovirus infection comprising, as an active ingredient, an antigen-presenting cell presenting the peptide of any one of [1] to [4] on HLA, [9] [9] 1)-[4] or an adenovirus-specific cytotoxic T cell obtained by stimulating peripheral blood lymphocytes with antigen-presenting cells presenting the peptide on HLA as an active ingredient
  • a passive immunotherapeutic agent against adenovirus [10] a major histocompatibility antigen complex prepared from any of the peptides according to [1] to [4], and Z or a major histocompatibility antigen complex-tetramer; It reacts with peripheral blood lymphocytes to form a conjugate in which cytotoxic T cells are bound to the major histocompatibility complex and / or major histocompatibility complex-tetramer.
  • a method for quantifying adenovirus-specific cytotoxic T cells characterized by measuring Z or chemokines and Z or cell surface molecules;
  • a major histocompatibility antigen complex-tetramer is prepared from the peptide according to any one of [1] to [4], and the major histocompatibility antigen complex-tetramer is reacted with peripheral blood.
  • a method for quantifying cytotoxic T cells specific to adenovirus in the peripheral blood is described in detail below.
  • a method for inducing cytotoxic T cells which comprises inducing cytotoxic T cells using the peptide according to any one of [1] to [4],
  • Peripheral blood lymphocytes are stimulated with an antigen-presenting cell obtained by presenting the peptide according to any one of [1] to [4] or the peptide on HLA to obtain adenovirus-specific cytotoxic T cells.
  • a process for producing a passive immunotherapeutic agent against adenovirus comprising: a major histocompatibility antigen complex and Z or major histocompatibility prepared from the peptide according to any one of [16] [1] to [4]
  • the antigen complex-tetramer is reacted with peripheral blood lymphocytes to form a major histocompatibility complex and / or a conjugate of cytotoxic T cells bound to the major histocompatibility complex-tetramer.
  • a method for producing a passive immunotherapeutic agent against adenovirus comprising a step of obtaining cytotoxic T cells obtained by isolation from the conjugate.
  • the present invention provides peripheral blood lymph by using the peptide according to the present invention, a nucleic acid encoding the peptide, an antigen-presenting cell presenting the peptide on HLA, and an antigen-presenting cell presenting the peptide or the peptide on HLA.
  • Adenovirus-specific cytotoxic T cells obtained by stimulating spheres, or major histocompatibility complex and Z or major histocompatibility complex-tetramer and peripheral blood lymphocytes prepared from the peptide To the major histocompatibility complex and Z or major histocompatibility complex-tetramer.
  • a method for treating or preventing adenovirus infection comprising the step of forming a conjugate to which cystic T cells are bound, and administering any one of cytotoxic ⁇ cells obtained by isolation from the conjugate.
  • the present invention provides peripheral blood using the peptide according to the present invention, a nucleic acid encoding the peptide, an antigen-presenting cell presenting the peptide on HLA, or the antigen-presenting cell presenting the peptide or HLA.
  • Adenovirus-specific cytotoxicity obtained by stimulating lymphocytes Spider cells, or major histocompatibility antigen complex prepared from the peptide and / or major histocompatibility antigen complex-tetramer and peripheral blood lymphocytes Obtained by forming a conjugate in which a cytotoxic ⁇ cell is bound to the major histocompatibility complex and sputum or the major histocompatibility complex-tetramer, and then isolated from the conjugate.
  • passive immunotherapeutic agents for adenovirus to treat or prevent adenovirus infection, which is one of the toxic cells Related to use.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of the result of determining an HLA type using an anti-HLA antibody.
  • the left force also shows the results of the HL-type determination, the histogram development of the results of staining with the anti-HLA-A * 24 antibody, and the histogram development of the results of staining with the anti-HLA-A * 2 antibody. It was.
  • the analyzed cell region (R1) is shown as a dot plot developed with FSC (forward scattered light) on the X axis and SSC (side scattered light) on the Y axis.
  • FSC forward scattered light
  • SSC side scattered light
  • the black solid is the result of staining with specific antibody
  • the white is the result of staining with isotype control IgG.
  • HLA type A * 24 + / A * 2— shows the determination result when the anti-HLA-A * 24 antibody shows reactivity and the anti-HLA-A * 2 antibody shows no reactivity. Show. Note that the scales and titles for the X-axis and Y-axis of the histogram expansion charts in the left two columns are shown on the lower left side of the figure, and the X-axis and Y-axis scales and titles for each dot plot in the right column It is shown separately on the lower right side of the figure.
  • FIG. 2 is a diagram showing an examination of a method for quantifying intracellular IFN y-producing cells using a control peptide.
  • Donor ID * 24-2 PBMC were stimulated with EBV BRLFl (a, b) or CMV pp65 (c, d) HLA-A * 2402-restricted epitope peptide for 13 days, followed by negative control (HIV) peptide (a , c) and each peptide (b, d) used for stimulation, positive for tetramer (Tetramer)
  • FIG. 4 shows that cells respond to specific peptides and produce IFN y.
  • the scales and titles for the X and Y axes in the dot plots for each column are shown separately at the bottom of the figure.
  • FIG. 3a-d shows confirmation of specific CTL induction (Donor ID * 24-8) by intracellular IFN y-producing cell quantification.
  • a dot plot development showing the fluorescence intensity for CD8 on the X-axis and IFN y on the Y-axis in log scale, a and c are the results of restimulation with the same peptide used for induction, b and d are The results of restimulation with the negative control HIV peptide are shown, and the ratio (%) of the number of CD8 positive IFN y positive cells to PBMC in UR is shown as a numerical value.
  • the scales and titles for the X and Y axes in the dot plots for a and b are shown separately below b.
  • the scales and titles for the X and Y axes in the dot plots for c and d are shown separately below d.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example in which specific CTLs are detected by an Elispot accessory.
  • ⁇ 5 This is a figure showing the result of staining with the prepared MHC-tetramer reagent. The scales and titles of the X and ⁇ axes in the dot plot are shown separately at the bottom of the figure.
  • FIG. 6 Donor ID * 24-14 PBMC were stimulated with LYA for 24 days and then stained with LYA-Tet and CD4, CD3 and CD8. Moreover, it is the figure which compared the reactivity with the Negative tetramer reagent as negative control.
  • FIG. 7 shows the effectiveness of AdV-specific CTL induction by short-term culture. It is the figure which dye
  • FIG. 4 shows that specific CTLs were induced using each tetramer reagent after culturing by adding a peptide. The X-axis and Y-axis scales and titles in each dot plot are shown separately below.
  • FIG. 8 is a diagram showing functional evaluation of adenovirus-specific CTL.
  • ab shows the functional evaluation of TYF-specific CTL induced with Donor ID * 24-8 PBMC
  • cd shows the functional evaluation of VYS-specific CTL induced with Donor ID * 24-2 PBMC
  • FIG. The X-axis title of each dot plot is described separately in the lower part of d for the force X-axis scale and Y-axis scale and title described in each dot plot.
  • FIG. 10 shows that TYF-specific CTL induced with Donor ID * 24-8 PBMC does not cross-react with subgroup C epitope peptides.
  • the X-axis and Y-axis scales and titles for each dot plot on the left are below the left-side dot plot, and the X- and Y-axis scales and titles for each center dot plot are for the center dot plot.
  • the X-axis and Y-axis scales and titles for each dot plot on the right are listed separately below the dot plot on the right.
  • FIG. 11-1 A diagram showing reactivity by amino acid homologous sequence analysis. Shows homology between subgroups of SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 11-2 A diagram showing reactivity by amino acid homologous sequence analysis. Shows homology between subgroups of SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 11-3 A diagram showing reactivity by amino acid homologous sequence analysis. Shows homology between subgroups of SEQ ID NO: 3.
  • FIG. 11-4 A diagram showing reactivity by amino acid homologous sequence analysis. Shows homology between subgroups of SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 11-5 This is a diagram showing reactivity by amino acid homologous sequence analysis. Shows homology between subgroups of SEQ ID NO: 5.
  • FIG. 11-6 A diagram showing reactivity by amino acid homologous sequence analysis. Shows homology between subgroups of SEQ ID NO: 6.
  • the present invention relates to a T cell epitope peptide having a function capable of inducing cytotoxic T cells specifically to adenovirus. Accordingly, the present invention provides a cytotoxic T cell epitope peptide specific for adenovirus.
  • the epitope peptide is sometimes referred to herein as “epitope peptide” or simply “peptide of the present invention”.
  • the peptide of the present invention means a molecular chain of linear amino acids having physiological activity and bound to each other by a peptide bond between the adjacent amino acid residues (X-amino group and carboxyl group).
  • Peptides may have various lengths, not to mean a specific length, and thus the peptides of the present invention include so-called “oligopeptides” and “polypeptides”.
  • it may be in an uncharged or salt form, and may be modified by glycosylation, amidation, phosphorylation, carboxylation, phosphorylation, or the like.
  • the adenovirus-specific CTL epitope peptide of the present invention is an epitope peptide consisting of 8 to 10 amino acids having each binding motif of the target HLA molecule with respect to the amino acid sequence of the adenovirus protein.
  • Searchable, published on the Internet TV, o 3 ⁇ 4 software 'Noe ⁇ (Pingping Guan, ⁇ A. Doytchinova, and hnstianna Zygo uri, and Spotify R. Flower, MHCPred: a server for quantitative prediction of peptide- MHC binding, Nucleic Acids Res., 2003; 31: 3621-3624) can be used to select candidate peptides for CTL epitopes.
  • HLA class I molecules mainly include HLA-A, HLA-B, and HLA-C, and the epitope peptide presented by binding to these consists of 8 to 10 amino acids.
  • the second, ninth or tenth amino acid from the N-terminal side of the epitope peptide is the most important amino acid for binding to the HLA molecule and is called the anchor motif.
  • This anchor motif has been reported to vary with the type of each HLA molecule.
  • the world's most frequent peptide that binds to the HLA-A2 molecule is a peptide in which Leu is located at the second position from the N-terminus and Leu or Val is located at the 9th or 10th position.
  • a peptide library consisting of about 20 amino acids covering the entire adenovirus protein is synthesized.
  • a library is prepared so that about 10 amino acids out of about 20 amino acids overlap the peptide sequence before and after. As a result, the entire protein can be searched comprehensively, and once the library is prepared, the HLA restriction can be comprehensively examined.
  • the epitope peptide selected by the above-mentioned method does not necessarily become a CTL epitope, but can only become an adenovirus-specific CTL epitope after the following examination. Below, the examination method of an epitope peptide is described.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells isolated from people with a history of adenovirus infection or T cells isolated from PBMC are suspended in an appropriate medium at a cell concentration of 0.1 to 2 X 10 VmL. Add 1 x 10 5 / mL of adenovirus-infected cells that have been separated and cultured in advance by the same human power, and keep them in a 5% carbon dioxide (CO) constant temperature bath at 37 ° C for 7 days.
  • CO carbon dioxide
  • adenovirus-infected cells and interleukin 2 are added, and then CTL are induced by repeated weekly stimulation with adenovirus-infected cells and IL-2.
  • Guide. Whether the CTL induced in this way is specific for the epitope candidate peptide is determined by MHC-tetramer method, Elispot Atsey, Chromium Release Atsay, intracellular site force-in staining method, etc. (Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, 6.19 ELISPOT Assay to Detect Cytokine— Secreting Murine and Hum an Cells, 6.24 Detection of Intracellular Cytokines by Flow Cytometry, published by
  • PBMCs isolated from a person with a history of adenovirus infection are suspended in a suitable medium at a cell concentration of 0.1-2 X loVmL, and any one of the epitope peptides can be encapsulated at a concentration of 0.01-100 ⁇ gZmL. . Incubate at 37 ° C in a 5% CO oven, and add IL-2 after 2 days.
  • CTL is induced by repeating stimulation with the peptide and IL-2 once a week or once every two weeks. Whether the CTL induced in this way is specific to the epitope candidate peptide is determined by MHC-tetramer method, elicitor atsey, chrome release assay, intracellular site force-in staining method, and the like.
  • PBMCs isolated from a person with a history of adenovirus infection were suspended in an appropriate medium at a cell concentration of 0.1 to 2 X loVmL, and a peptide library synthesized in this suspension was pooled to an appropriate number (for example, 10 types each). I can see you. Cultivate at 37 ° C in a 5% CO oven, and after 2 days IL-2
  • CTL is induced by repeating stimulation with pooled peptide and IL-2 once a week or once every two weeks. Whether the CTL induced in this way is specific for the epitope peptide is determined by Elispot Atsey, Chromium Release Assay, intracellular site force-in staining method, and the like. For pooled peptides that have shown good results, it is possible to select peptides with CTL inducing ability by adding one peptide at a time and repeating the above experiment. The reacted peptides are shortened sequentially to obtain a basic peptide, which is the epitope peptide of the present invention. In general, epitopic peptides can ultimately be shortened to 8-10 amino acids.
  • the peptide of the present invention includes a nucleotide sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a peptide consisting of a sequence can be exemplified.
  • the peptide of the present invention may be a peptide containing the amino acid region described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6. That is, as a preferred embodiment of the peptide of the present invention, a cytotoxic T cell epitope peptide specific for adenovirus is a peptide comprising at least one amino acid sequence selected from the group power consisting of SEQ ID NOs: 1-6. is there.
  • the epitope peptide of the present invention may be a modified form of the above peptide, as long as it does not substantially modify physiological activity and immune activity and does not have harmful activity when administered. Good.
  • a preferred embodiment of the present invention is a peptide comprising an amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and Z or added.
  • a peptide having a function equivalent to that of the peptide described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 before modification can be exemplified.
  • the "equivalent function” includes, for example, (1) a function capable of inducing an adenovirus-specific cytotoxic T cell, (2) a human major histocompatibility antigen (HLA) -A24 molecule, etc.
  • cytotoxic T cells with a T cell receptor (CTL) that can specifically recognize cells that present HLA-A * 2402, or HLA-Cw * 0401 molecules or complexes with Cw * 0702 on the cell surface.
  • CTL T cell receptor
  • the peptide having the function (2) may be expressed as a restricted antigen peptide such as HLA-A24.
  • Whether or not a modified peptide has the above-described function can be evaluated by, for example, the method described in Examples below or a method obtained by appropriately modifying the method.
  • the peptides of the present invention include both those modified from the naturally occurring state !, and those that have been modified. Modifications include acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, flavin covalent bond, heme moiety covalent bond, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, lipid or lipid derivative covalent bond, phosphatidylinositol covalent bond , Cross-linking, cyclization, disulfide bond formation, methylation, demethylation, covalent bridge formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, y-carboxyl ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , glycosylation, GPI anchor formation, hydroxyl , Iodination, methylation, myristoyl This includes the transfer of amino acids to proteins such as phosphorylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sul
  • the peptide of the present invention may have an additional amino acid sequence at the N-terminus or C-terminus.
  • the peptide of the present invention can be used in the form of a complex to which saccharides, polyethylene glycol, lipids and the like are added, a derivative with a radioisotope, or a polymer.
  • the amino acids in the present invention include so-called “amino acid analogs”. Examples of the amino acid analog include N-acyl derivatives, 0-acylated products, esterified products, acid amidated products, and alkylated products of various amino acids.
  • the complex of the peptide of the present invention and the molecule such as HLA-A24 is recognized by CTL having TCR capable of specifically recognizing a cell presenting the complex on the cell surface.
  • CTL having TCR capable of specifically recognizing a cell presenting the complex on the cell surface.
  • a formyl group, a acetyl group, a t-butoxycarbol (t-Boc) group or the like may be bound thereto.
  • a methyl group, an ethyl group, a t-butyl group, a benzyl group, or the like may be bonded to the C terminal or free carboxyl group.
  • the peptide of the present invention may be subjected to various modifications that can be easily introduced into a living body.
  • the PT (Protein Transduction) domain is famous as an example of various modifications that can be easily introduced into a living body.
  • the PT domain of HIV human immunodeficiency virus
  • HIV human immunodeficiency virus
  • MHC class I molecules Most antigens presented via MHC class I molecules are proteasomes in the cytoplasm It is then transported to TAP (transporter in antigen processing) and binds to the complex of MHC class I molecule and / 3 2-microglobulin associated with TAP in the rough endoplasmic reticulum. And then transported to the cell surface by exocytosis. Effective antigen presentation can be achieved by fusing HSP (heart shock prtein) 70, HSP90, or gp96, which are chaperones acting in a series of these antigen presentation pathways, with the target peptide or protein.
  • HSP heart shock prtein
  • a protein in which the above-mentioned PT domain or chaperone is fused to the peptide of the present invention constitutes one embodiment of the present invention.
  • the peptide of the present invention can be prepared by various conventional peptide synthesis methods.
  • organic chemical synthesis methods such as solid phase peptide synthesis methods, or nucleic acids encoding peptides can be prepared and prepared using recombinant DNA technology.
  • synthesis using a commercially available chemical synthesizer for example, a peptide synthesizer from Applied Systems is also possible.
  • the peptide of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method according to its amino acid sequence, and the method includes peptide synthesis methods by a normal liquid phase method and a solid phase method. Is done. More specifically, the peptide synthesis method is based on amino acid sequence information V, and each amino acid is synthesized sequentially one by one to extend the chain, followed by a stepwise gelation method and several amino acids. Including the fragment 'condensation method in which fragments are synthesized in advance and then each fragment is coupled, any method may be used to synthesize the peptides of the present invention.
  • the condensation method used in such a peptide synthesis method can also be performed according to various methods. Specific examples thereof include an azide method, a mixed acid anhydride method, a DCC method, an active ester method, an oxidation-reduction method, a DPPA (diphenylphosphoryl azide) method, and a Woodward method.
  • Solvents that can be used in these various methods can also be selected from commonly used solvents. Examples thereof include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), hexaphosphoramide, dioxane, tetrahydrofuran (THF), ethyl acetate. And mixed solvents thereof.
  • DMF dimethylformamide
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • THF tetrahydrofuran
  • ethyl acetate ethyl acetate
  • mixed solvents thereof ethyl acetate.
  • amino acids that do not participate in the reaction and carboxyl groups in the peptide are generally esterified, for example, lower alkyl esters such as methyl esters, ethyl esters, and tertiary butyl esters, such as benzyl esters.
  • amino acids having a functional group in the side chain such as the hydroxyl group of Tyr, may be protected with a acetyl group, benzyl group, benzyloxycarbonyl group, tertiary butyl group, etc. Is not required.
  • Arg's guazino group includes nitro group, tosyl group, 2-methoxybenzenesulfol group, methicylene-2-sulfol group, benzyloxycarbonyl group, isobornoxycarbonyl group, adamantyl group. It can also be protected with an appropriate protecting group such as an oxycarbonyl group.
  • the peptide of the present invention that can be obtained as described above can be obtained by a conventional method, for example, ion exchange resin, partition chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC). Purification can be appropriately performed according to a method widely used in the field of peptide chemistry such as countercurrent distribution.
  • the peptide of the present invention can also be obtained by a genetic engineering technique in which a DNA nucleic acid molecule encoding the peptide of the present invention is synthesized, introduced into an appropriate expression vector, and then expressed in a host cell.
  • a nucleic acid encoding the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 is synthesized.
  • Such methods include chemical synthesis means such as the phosphate triester method and phosphate amidite method [J. Am. Chem. Soc, 89, 4801 (1967); 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 ( 1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); 24, 245 (1983)] and combinations thereof. More specifically, the synthesis of DNA can be performed by chemical synthesis by the phosphoramidite method or triester method, and can also be performed on a commercially available automated polynucleotide synthesizer.
  • a double-stranded fragment is a chemically synthesized single strand that synthesizes a complementary strand and either anneals the strands together under appropriate conditions, or adds a complementary strand using DNA polymerase with an appropriate primer sequence.
  • the product power gains.
  • the peptides of the present invention include peptides functionally equivalent to the epitope peptides (SEQ ID NOs: 1 to 6) identified by the present inventors as described above.
  • a peptide functionally equivalent to the peptide can be prepared by introducing.
  • amino acid mutations in the peptide may occur naturally.
  • one or a plurality of amino acid sequences were mutated in the amino acid sequence of the epitope peptide (SEQ ID NOs: 1 to 6) identified by the present inventors, whether artificially or naturally occurring.
  • a peptide having an amino acid sequence and functionally equivalent to the peptide is included in the peptide of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated (substitution, insertion, deletion, etc.) in the above mutants is not limited as long as the function of the peptide of the present invention is maintained, but is usually within 5 amino acids and is preferable. It is preferably within 4 amino acids, more preferably within 3 amino acids, and even more preferably 1-2 amino acids.
  • the above modification is, for example, addition of an amino acid residue to the end of the peptide described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, the number of added amino acids is included in the peptide of the present invention.
  • the function is maintained, it is usually within 20 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids, and even more preferably within 3 amino acids, most preferably. Is 1-2 amino acids.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G , H, K, S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, A ⁇ V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, T, ⁇ ), a sulfur atom-containing side Amino acids with chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with salt-containing side chains (R, K, ⁇ ), aromatic Amino acids with side chains (H, F, Y , W) can be mentioned (both parentheses represent single letter amino acids).
  • a peptide having an amino acid sequence modified by deletion or addition of one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence and substitution by Z or another amino acid can maintain its biological function (activity) (Mark, DF et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, MJ & Smith, M. Nucleic Acids Re search (1982) 10, 6487 —6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431—1433, Dalbadie—McFarland, G. et al ”Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409—6413).
  • the peptide in which a plurality of amino acid residues are added to the amino acid sequence of the peptide of the present invention includes a fusion peptide containing these peptides.
  • the fusion peptide is a fusion of the peptide of the present invention and another peptide.
  • a polynucleotide encoding a peptide of the present invention for example, the peptides described in SEQ ID NOs: 1 to 6
  • a polynucleotide encoding another peptide are linked so that the frames match. Any method known to those skilled in the art can be used as long as it is introduced into an expression vector and expressed in a host.
  • peptides to be subjected to fusion with the peptide of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include j8 2-microglobulin. That is, a fusion peptide of the peptide of the present invention and j8 2-microglobulin is also included in the present invention.
  • peptides that are subjected to fusion with the peptide of the present invention are suitable for various purposes such as isolation and purification of the peptide or applied research, in addition to the purpose of CTL induction. It can be selected as appropriate.
  • FLAG Hopp, TP et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210
  • 6 X His, 10 X His consisting of 6 His (histidine) residues, influenza agglutinin (HA), human c -myc fragment, VSV-GP fragment, pl8HIV fragment, T7-tag, HSV-tag, E-tag, SV40T antigen fragment, lck tag, a-tubulin fragment, B-tag, Protein C fragment, etc.
  • Any known peptide can be used.
  • examples of other proteins to be subjected to fusion with the peptide of the present invention include GST (glutathione 1 S transferase), HA (influenza agglutinin), immunoglobulin constant region, / 3 galactosidase, MBP (maltose). Binding protein) and the like.
  • a commercially available polynucleotide encoding these peptides or peptides is fused with a polynucleotide encoding the peptide of the present invention, and the fusion polynucleotide thus prepared is expressed, thereby producing a fusion peptide. Chido can be prepared.
  • a protease cleavage site peptide sequence such as FactorXa, enterokinase or thrombin can be inserted at the fusion site.
  • a protease cleavage site peptide sequence such as FactorXa, enterokinase or thrombin
  • it is expressed as a peptide fusion to which a purification tag such as GST, MBP, or FLAG tag is added, purified, and then, if necessary, of the peptide fusion, the object of the present invention.
  • a region other than the peptide can be cleaved and removed by a protease such as FactorXa, enterokinase, or thrombin, which is useful.
  • the present invention includes a peptide encoded by a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide encoding the peptide described in SEQ ID NOs: 1 to 6 of the present invention, and described in SEQ ID NOs: 1 to 6 Peptides that are functionally equivalent to peptides are included.
  • the conditions of hybridization and isolation for isolating a polynucleotide encoding a peptide functionally equivalent to the peptides described in SEQ ID NOs: 1 to 6 are appropriately selected by those skilled in the art. can do.
  • Examples of the hybridization conditions include low stringency conditions. Low stringent conditions are, for example, 42 ° C, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, and preferably 50 ° C, 0.1 X SSC, 0.1% SDS in the post-hybridization cleaning. It is a condition. More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions. Highly stringent conditions are, for example, conditions of 65 ° C., 5 ⁇ SSC and 0.1% SDS.
  • a primer is designed based on a part of the polynucleotide encoding the peptide of the present invention (SEQ ID NO: 1 to 6), and has high homology with the polynucleotide encoding the peptide identified by the present inventors! It is also possible to isolate a polynucleotide fragment and obtain a peptide functionally equivalent to the peptide identified by the present inventors based on the polynucleotide.
  • PCR gene amplification technology
  • a peptide functionally equivalent to the peptide of SEQ ID NOS: 1 to 6 encoded by a polynucleotide isolated by the above-described hybridization technique or gene amplification technique is usually an amino acid and the peptide. There is usually a high homology in the sequence.
  • the peptides of the present invention also include peptides that are functionally equivalent to the peptides described in SEQ ID NOs: 1 to 6 and have high homology with the amino acid sequences of the peptides. High homology usually means at least 50% identity, preferably 75% identity, more preferably 85% identity, more preferably 95% (eg 96%) at the amino acid level. 97% or more, 98% or more, 99% or more).
  • the algorithm described in the literature Wang, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730
  • the peptide of the present invention can be prepared as a recombinant peptide or a natural peptide by methods known to those skilled in the art.
  • a recombinant peptide for example, a transformant obtained by incorporating a polynucleotide encoding the peptide of the present invention into an appropriate expression vector and introducing it into an appropriate host cell is recovered and extracted.
  • the column is subjected to chromatography such as ion exchange, reverse phase, gel filtration, etc., or affinity chromatography in which an antibody against the peptide of the present invention is immobilized on the column, or these columns are further treated. It is possible to purify and prepare by combining several.
  • Host cell as a recombinant peptide fused with a purification tag (eg, histidine tag)
  • a purification tag eg, histidine tag
  • the expressed fusion peptide is purified using a commercially available purification column corresponding to the fused tag (nickel column in the case of histidine tag). can do.
  • an antibody that binds to the peptide of the present invention is bound to a tissue or cell extract expressing a peptide of the present invention by a method well known to those skilled in the art. It can be isolated by purifying with a tea column.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • nucleic acids or vectors encoding the peptides of the present invention are also included in the present invention.
  • the nucleic acid (polynucleotide) of the present invention may be in any form as long as it can encode the peptide of the present invention. That is, it does not matter whether it is a cDNA synthesized from mRNA, a force that is genomic DNA, or a chemically synthesized DNA.
  • a polynucleotide having an arbitrary base sequence based on the degeneracy of the genetic code is included as long as it can encode the peptide of the present invention.
  • the nucleic acid (polynucleotide) of the present invention can be obtained by methods known to those skilled in the art. For example, it can be appropriately produced using a commercially available nucleic acid synthesizer.
  • the base sequence of the prepared polynucleotide can be confirmed by a known method, for example, a dideoxynucleotide termination method.
  • the nucleic acid encoding the peptide of the present invention may be synthesized using, for example, a gene recombination technique. It is important for producing light peptides in the host. In this case, the codon usage of the amino acid codon differs between hosts, so it is desirable to change the codon of the amino acid so that it matches the codon usage of the host to be produced.
  • the nucleic acid encoding the peptide of the present invention can be used as a vaccine and can be transferred as a bare nucleic acid or can be transferred using an appropriate virus or bacterial vector (Berzofsky JA, Ahlers JD).
  • Suitable bacterial vectors may include Salmonella subspecies bacterial vectors.
  • suitable virus vectors include retrovirus vectors, adenovirus vectors, Sendai virus vectors, lentivirus vectors, and silkworm vector vectors.
  • An example of a suitable vaccinia vector is the modified vaccinia Ankara vector.
  • a vector capable of expressing the peptide of the present invention can be exemplified.
  • the vector is usually a vector carrying a DNA construct having a structure in which the nucleic acid of the present invention is operably linked downstream of a promoter.
  • the vector is generally a plasmid or a viral vector.
  • a vector having a desired DNA can be appropriately produced by a general genetic engineering technique.
  • various commercially available expression vectors can be used.
  • the vector of the present invention is also useful for retaining the polynucleotide of the present invention or expressing the peptide of the present invention in a host cell.
  • Nucleic acid of the present invention polynucleotide
  • the vector is not particularly limited as long as it can stably hold the inserted DNA.
  • Escherichia coli is used as a host, a cloning vector such as pBluescript vector (manufactured by Stratagene) is preferred.
  • pBluescript vector manufactured by Stratagene
  • a variety of commercially available vectors can be used.
  • the expression vector One is useful.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a peptide in vitro, in E. coli, in cultured cells, or in an organism.
  • pBEST vector manufactured by Promega
  • E. coli for in vitro expression.
  • PET vector manufactured by Invitrogen
  • pME18S-FL3 vector GenBank Accession No. ABO 09864
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988) for living organisms
  • the nucleic acid of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for peptide expression include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), insect cells (eg, Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells ( Examples: CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells.
  • Vectors can be introduced into host cells by, for example, calcium phosphate precipitation, electric pulse perforation (Current protocol in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, bee tion 9.1-9.9), It can be carried out by a known method such as a lipofusion method (GIBCO-BRL) or a microinjection method.
  • GEBCO-BRL lipofusion method
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the peptide of interest. These signals may be endogenous to the peptide of interest or heterologous! /.
  • the medium is recovered in the above production method.
  • the peptide of the present invention is produced intracellularly, the cell is first lysed and then the peptide is recovered.
  • nucleic acid of the present invention is incorporated into an appropriate vector, for example, a retrovirus method, a ribosome method, a cationic ribosome method.
  • a method of introducing it into a living body by the adenovirus method comprising, but are not limited to, a retroviral vector and the like.
  • General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to conventional methods (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • In vivo administration can be ex vivo or in vivo.
  • the peptide of the present invention can be used as a peptide vaccine in active immunotherapy. That is, a vaccine comprising the CTL epitope peptide of the present invention can be administered to a healthy person or patient, and CTL specific for adenovirus can be proliferated in the body, which can be used for prevention or treatment of diseases. Only one type of epitope peptide can be used, or two or more types of peptides can be combined and mixed according to the intended use of the vaccine.
  • the present invention provides a vaccine for treating or preventing an adenovirus infection comprising the peptide of the present invention or the nucleic acid of the present invention as an active ingredient.
  • the "vaccine” of the present invention can also be expressed as “active immunotherapeutic agent”, “immunotherapeutic agent”, “adenovirus-related disease therapeutic agent”.
  • the “therapeutic agent” can also be expressed as “medicine”, “pharmaceutical composition”, “therapeutic drug”, and the like.
  • the antigen-presenting cell on which the CTL epitope peptide of the present invention is presented can be used as a vaccine in active immunotherapy.
  • Epitope peptide pulse antigen-presenting cells in which antigen-presenting cells and CTL epitope peptide are mixed for 30 minutes to 1 hour in an appropriate culture medium
  • Antigen-presenting cells include, for example, rod cells, B cells, macrophages, certain T cells, etc., and are cells expressing HLA to which the peptide can bind on their surfaces, L means having the ability to stimulate.
  • Artificial antigen-presenting cells that have an antigen-presenting ability are, for example, a lipid bilayer, a stick made of plastic or latex, a ternary complex of HLA, CTL epitope peptide, and 13 2-microglobulin.
  • a vaccine comprising an antigen-presenting cell presenting the peptide of the present invention on HLA as an active ingredient.
  • the nucleic acid of the present invention can be used for DNA vaccines, recombinant virus vector vaccines, and the like in active immunotherapy.
  • the nucleic acid sequence of the CTL epitope peptide can be changed to codon usage suitable for the host that produces the recombinant vaccine or the recombinant virus vaccine.
  • a vaccine comprising the peptide of the present invention or an antigen-presenting cell presented with the peptide of the present invention can be prepared by a method known in the art.
  • a viable vaccine there is a drug such as an injection or a solid containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the peptide of the present invention can be used for the preparation of a passive immunotherapeutic agent against adenovirus.
  • CTL specific for adenovirus obtained as described below can be suspended in human albumin-containing PBS or the like and used as a passive immunotherapy for adenovirus.
  • CTL specific for adenovirus contained in the passive immunotherapeutic agent can be obtained by the following preparation method, and can be purified and used to increase the purity of CTL.
  • PBMC React PBMC with an appropriate concentration of adenovirus-specific MHC tetramer reagent. Since adenovirus-specific CTL bound to the MHC tetramer reagent is stained with the labeled dye, isolate only the stained CTL using a cell sorter or microscope. CTLs specific to adenovirus isolated in this way are antigens whose proliferation ability has been lost by anti-CD3 antibodies, T cell stimulating drugs such as PHA, IL-2, X-ray irradiation or mitomycin treatment. Stimulate growth with the presenting cells to ensure the number of cells required for passive immunotherapy.
  • T cell stimulating drugs such as PHA, IL-2, X-ray irradiation or mitomycin treatment. Stimulate growth with the presenting cells to ensure the number of cells required for passive immunotherapy.
  • Adenovirus-specific MHC monomer and Z or MHC tetramer reagent are immobilized on a sterile plate and PBMCs are cultured on the immobilized plate.
  • PBMCs are cultured on the immobilized plate.
  • Adenovirus-specific CTLs isolated in this way are anti-CD3 antibodies, PHA, IL-2 and other T cell stimulating agents, and antigen-presenting cells whose proliferation ability has been lost by X-ray irradiation or mitomycin treatment. Increase the number of cells needed for passive immunotherapy by stimulating growth. [0084] (c) CTL preparation method 3
  • PBMC has the ability to directly stimulate T cells with the CTL epitope peptide of the present invention
  • CTL epitope peptide and IL-2
  • MHC-monomer and MHC-tetramer using the peptide of the present invention can be obtained by known methods (US Patent Number 5,635, 3 ⁇ 3, Inventors: JD Altman, MG McHeyzer- Williams, Mark M. Davis, Composit ions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells, French Application Number FR9911 ⁇ 33, Inventor: M. Bonneville, et al., M eans for detecting and for purifying CD8 + T—lymphocyte populations specific for pep tides presented in the HLA context).
  • MHC-monomer which is a complex of HLA class I molecule, j82 2-microglobulin, and CTL epitope peptide of the present invention, which is also purified by recombinant host for protein expression, is formed in the buffer.
  • a Piotin binding site is added to the C-terminus of the recombinant HLA class I molecule in advance, and Piotin is added to this site after MHC-monomer formation.
  • MHC-tetramers can be prepared by mixing commercially available dye-labeled streptavidin and piotinylated MHC-monomer at a molar ratio of 1: 4. [0087]
  • CTL can be recovered with high purity by using the following method at any time.
  • the adenovirus-specific MHC-tetramer reagent can be reacted with the CTL induced by the CTL preparation method, and the antibody against the labeled dye labeled with the MHC-tetramer can be separated using a magnetically labeled secondary antibody.
  • a magnetically labeled secondary antibody Is possible.
  • Such magnetically labeled secondary antibodies and magnetic cell separators are also available, for example, from Dynal and Miltenyi Biotec GmbH.
  • the adenovirus-specific CTL isolated in this manner is stimulated and proliferated with a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc., to secure the number of cells necessary for passive immunotherapy.
  • Adenovirus-specific CTLs can be purified by utilizing the force of release of cytoplasm, etc., and adenovirus-specific CTLs can be purified.
  • the site force-in released from the CTL is supplemented with a specific antibody on the cell surface, followed by staining with a site-force-in-specific labeled antibody.
  • a magnetically labeled cell separation device after staining with an antibody specific to the labeling substance magnetically labeled.
  • the adenovirus-specific CTL isolated in this manner is stimulated and proliferated with a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc., to secure the number of cells necessary for passive immunotherapy.
  • CTL can be purified.
  • these antibodies can be coated on a culture plastic plate, and PBMCs can be stimulated using this plate, and the cell population that does not bind to the plate can be washed and run to generate specific CTLs. It is also possible to purify.
  • the adenovirus-specific CTL isolated in this manner is stimulated and proliferated with a T cell stimulating agent such as anti-CD3 antibody, PHA, IL-2, etc., to secure the number of cells necessary for passive immunotherapy.
  • the present invention provides a passive immunotherapeutic agent (immunotherapeutic agent) against adenovirus comprising cytotoxic T cells (CTL) obtained and purified as described above as an active ingredient.
  • the “passive immunotherapeutic agent” of the present invention can also be expressed as “immunotherapeutic agent”, “adenovirus-related disease therapeutic agent”, or “CTL inducer”.
  • the passive immunotherapeutic agent of the present invention cytotoxicity specific to an adenovirus obtained by stimulating peripheral blood lymphocytes with the peptide of the present invention or an antigen-presenting cell presenting the peptide on HLA. It is a passive immunotherapeutic agent against adenovirus containing sex T cells as an active ingredient.
  • the major tissue-compatible antigen complex and Z or major histocompatibility complex-tetramer prepared from the peptide of the present invention are reacted with peripheral blood lymphocytes, and the major tissue is reacted.
  • a cytotoxic T cell obtained by forming a conjugate of a cytotoxic T cell bound to a compatible antigen complex and / or a major histocompatibility complex-tetramer and isolating it from the conjugate is an active ingredient. It is a passive immunotherapy for adenovirus.
  • the drug of the present invention (such as the vaccine or passive immunotherapeutic agent of the present invention) is mixed with a physiologically acceptable carrier, excipient, diluent or the like, and orally or parenterally as a pharmaceutical composition.
  • a physiologically acceptable carrier such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions can be used.
  • parenterals dosage forms such as injections, infusions, external medicines, or suppositories can be selected. Examples of injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections. Examples of the medicine for external use include nasal administration agents and ointments.
  • the preparation technique of the above-mentioned dosage form so as to include the drug of the present invention as the main component is known.
  • a tablet for oral administration is prepared by adding an excipient, a disintegrant, a binder, and a lubricant to the drug of the present invention. It can be manufactured by adding a mixture or the like and mixing and compression shaping.
  • the antigen-presenting cell on which the peptide of the present invention is presented is pharmaceutically acceptable and is compatible with the peptide or the activity of the cell, such as water, saline, dextro It can be used as a mixture with ethanol, ethanol, glycerol, DMSO (dimethyl sulphoxide), other adjuvants, or combinations thereof. Furthermore, auxiliary agents such as albumin, wetting agent and emulsifier may be added as necessary.
  • the disintegrant calcium carbonate or carboxymethyl cellulose calcium is generally used.
  • binder gum arabic, carboxymethylcellulose, or polyvinylpyrrolidone is used.
  • talc magnesium stearate and the like are known.
  • the tablet containing the drug of the present invention can be subjected to known coating for masking or enteric preparation.
  • the coating agent ethyl cellulose, polyoxyethylene glycol or the like can be used.
  • the injection can be obtained by dissolving the agent of the present invention, which is the main component, together with an appropriate dispersant, or dissolving or dispersing in a dispersion medium.
  • aqueous solvent distilled water, physiological saline, Ringer's solution, or the like is used as a dispersion medium.
  • oil-based solvents various vegetable oils such as propylene glycol are used as dispersion media.
  • a preservative such as paraben can be added as necessary.
  • a known isotonic agent such as sodium chloride or glucose can be added.
  • a soothing agent such as salt benzalcoum can be added.
  • an external preparation can be obtained by making the agent of the present invention into a solid, liquid, or semi-solid composition.
  • a solid or liquid composition it can be set as an external preparation by setting it as the composition similar to what was described previously.
  • a semi-solid composition can be prepared by adding a thickener to an appropriate solvent as required.
  • the solvent water, ethyl alcohol, polyethylene glycol, or the like can be used.
  • the thickener bentonite, polybutyl alcohol, acrylic acid, methacrylic acid, polyvinylpyrrolidone, or the like is generally used.
  • a preservative such as salt benzalkonium.
  • oily base materials such as cocoa butter or cellulose
  • a suppository can also be obtained by combining an aqueous gel base material such as a cellulose derivative.
  • the peptide of the present invention can be formulated in a neutral or salt form.
  • pharmaceutically acceptable salts include inorganic salts such as hydrochloric acid and phosphoric acid, or acetic acid and tartaric acid.
  • Organic acids such as
  • the drug of the present invention is used as a gene therapy agent
  • a method of directly administering the drug of the present invention by injection and a method of administering a vector incorporating a nucleic acid can be mentioned.
  • the above-mentioned vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes vinores vectors, vaccinia vinores betaters, retro winores betaters, and lentivirus vectors. Can be invested well.
  • the drug of the present invention into a phospholipid vesicle such as a ribosome and administer the vesicle.
  • a phospholipid vesicle such as a ribosome
  • administer the vesicle For example, the endoplasmic reticulum holding the peptide or vector of the present invention is introduced into a predetermined cell by the ribofusion method.
  • the obtained cells are administered systemically, for example, intravenously or intraarterially.
  • the drug of the present invention can be administered by parenteral administration or oral administration.
  • parenteral administration includes nasal administration, subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection and other suppositories, and suppositories.
  • parenteral administration it can be prepared as a mixture with excipients such as starch, mannitol, latatose, magnesium stearate and cellulose.
  • the vaccine of the present invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • the dose to be administered depends on the subject to be treated and the immune system, and the required dose is determined by the judgment of the clinician. In general, the appropriate dose is 1 to 100 mg for the peptide of the present invention (epitorp peptide) and 10 6 to 10 9 for the epitope peptide pulsed cells per patient.
  • the dosing interval can be set according to the subject and purpose.
  • adenovirus-related disease expected to be prevented or treated by the agent of the present invention
  • respiratory infection represented by pneumonia
  • ocular infection represented by pool fever and epidemic keratoconjunctivitis And intestinal infections
  • gastroenteritis and urogenital infections
  • hemorrhagic cystitis and urethritis for example, respiratory infection represented by pneumonia, ocular infection represented by pool fever and epidemic keratoconjunctivitis And intestinal infections such as gastroenteritis and urogenital infections such as hemorrhagic cystitis and urethritis.
  • the animal that can be inoculated with the drug of the present invention is not particularly limited as long as it has an immune system and can be infected with adenovirus, but is preferably a human.
  • Adenovirus-specific CTL is a high-risk patient (a person who has been immunocompromised for some reason, a patient with congenital immunodeficiency, or bone marrow transplantation, hematopoietic stem cell transplantation, cord blood transplantation, solid organ transplantation) Patients who have received immunosuppressants to prevent rejection, patients with chronic viral infections, AIDS patients, elderly people, young children, pregnant women, etc.) This is important information for the management of these infections, including the proper use of antiviral and immunosuppressive agents.
  • the quantification of adenovirus-specific CTLs can be performed by the following three methods using the peptide of the present invention (CTL epitope peptide), for example, but is not necessarily limited to these methods.
  • CTL specific for adenovirus in peripheral blood can be quantified using an MHC-tetramer reagent prepared using the CTL epitope peptide of the present invention.
  • the quantification can be performed, for example, as follows. Peripheral blood or PBMC are reacted with an appropriate concentration of MHC-tetramer reagent. Since the CTL bound to the MHC-tetramer reagent is stained with a labeling dye, it is counted using a flow cytometer, a microscope or the like.
  • anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody, etc. labeled with a dye different from MHC-tetramer reagent, are reacted to adenovirus-specific CTL T cell subsets Can also be determined at the same time.
  • I FN y nterferon gamma which CTL are produced by stimulating the CTL E pitot flop peptides of the present invention PBMC), TNF (tumor necrosis factor ), the site forces in and Z or chemokines such as inter ⁇ Roy 3 r down It is a method of quantification. The specific method is shown below using IFN y as an example.
  • PBMCs are suspended in a suitable medium at a cell concentration of approximately 2 ⁇ 10 6 / mL, and the CTL of the present invention is added. Get pitope peptides. Further, add an intracellular protein transport inhibitor (eg, Brefeldin A, Monensin, etc.) and incubate at 37 ° C for 5 to 16 hours in a 5% CO thermostat. After culture, T cell
  • an intracellular protein transport inhibitor eg, Brefeldin A, Monensin, etc.
  • each antibody (anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody) or Z or MHC-tetramer reagent, fix the cells, perform membrane permeabilization, and react with dye-labeled anti-IFN y antibody . Analyze using a flow cytometer, etc., and quantitate the percentage of IFN ⁇ -positive cells in all cells, T cells, or MHC-tetramer positive cells.
  • PBMCs are placed in a 96-well MultiScreen-HA plate (Millipore) with anti-IFN y antibody immobilized. Put the epitope peptide in each well and incubate for 20 hours in a 37 ° C 5% CO incubator.
  • the plate is washed and reacted in the order of anti-IFN y antibody and peroxidase-labeled anti-IgG antibody.
  • the peroxidase substrate is added and the IFN y spot is visualized by color development and counted with a stereomicroscope.
  • PBMCs are suspended in a suitable medium at a cell concentration of approximately 2 ⁇ 10 6 / mL, and the CTL epitope peptide of the present invention is encapsulated. Incubate for 24-48 hours at 37 ° C in a 5% CO oven. After culture
  • the supernatant is collected, and the concentration of IFNy contained therein is quantified using a commercially available ELISA kit (eg, HUMAN IFN gamma ELISA from MBL).
  • a commercially available ELISA kit eg, HUMAN IFN gamma ELISA from MBL.
  • CTL has been reported to be a cell surface protein whose expression is enhanced on the cell surface by stimulation of a specific peptide (eg, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.).
  • a specific peptide eg, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.
  • the CTL bound to the labeled antibody is stained with the labeled dye, so it can be counted using a flow cytometer, microscope, etc. To do.
  • CTLs specific to adenovirus can be reacted simultaneously or sequentially with an anti-CD3 antibody, anti-CD4 antibody, anti-CD8 antibody, etc. labeled with a dye different from the labeled antibody. T cell subsets can be determined simultaneously.
  • a preferred embodiment of the quantification method of the present invention is a site force that stimulates peripheral blood with the peptide of the present invention, obtains cytotoxic T cells specific for the virus, and produces cytotoxic T cells.
  • the present invention relates to a method for quantifying cytotoxic ⁇ cells specific for adenovirus, characterized by measuring in and Z or chemokine and Z or cell surface molecules.
  • the MHC-tetramer (or monomer or multimer) reagent can be used for specific CTL quantification, as described above.
  • the present invention comprises preparing an MHC-tetramer reagent from the peptide of the present invention and reacting the MHC-tetramer reagent with peripheral blood, which is specific to adenovirus in the peripheral blood.
  • the present invention relates to a method for quantifying sex T cells.
  • a peripheral blood sample obtained and isolated in advance can be used.
  • the present invention provides a method for inducing (activating) cytotoxic T cells, which comprises inducing cytotoxic T cells using the peptide of the present invention.
  • the peptide of the present invention (for example, HLA-A24 or other restricted antigen peptide) is contacted with peripheral blood mononuclear cells in a medium containing plasma. And a method for inducing adenovirus-specific cytotoxic T cells (CTL).
  • CTL adenovirus-specific cytotoxic T cells
  • a method for detecting and quantifying adenovirus-specific CTL induced by the above method is also included in the present invention.
  • the present invention provides a method for producing a passive immunotherapeutic agent using the adenovirus-specific cytotoxic T cell induction method of the present invention.
  • a step of stimulating peripheral blood lymphocytes with the peptide of the present invention or antigen-presenting cells presenting the peptide on HLA to obtain adenovirus-specific cytotoxic T cells is obtained. It is a method including.
  • the major histocompatibility antigen complex prepared from the peptide of the present invention and / or the major histocompatibility antigen complex-tetramer and peripheral blood lymphocytes are reacted. Cytotoxicity obtained by forming a conjugate in which cytotoxic T cells are bound to the major histocompatibility complex and Z or major histocompatibility complex-tetramer and isolating the conjugate.
  • a method for producing a passive immunotherapeutic agent against adenovirus, comprising the step of obtaining T cells.
  • the production method may include a “step of mixing a pharmaceutically acceptable carrier with the obtained cytotoxic T cells” as necessary.
  • the MHC-tetramer reagent prepared using the peptide of the present invention can be used not only for quantification of specific CTLs but also in combination with intracellular cytoforce-in-producing cell quantification methods and specific antibodies against cell surface proteins. It is possible to determine the specific CTL differentiation stage and functionality at the same time.
  • the present invention includes a peptide according to the present invention, a nucleic acid encoding the peptide, an antigen-presenting cell presenting the peptide on HLA, and an antigen-presenting cell presenting the peptide or the peptide on HLA.
  • Adenovirus-specific cytotoxic T cells obtained by stimulating peripheral blood lymphocytes, or major histocompatibility complex and Z or major histocompatibility complex-tetramer and peripheral blood prepared from the peptide It reacts with lymphocytes to form a conjugate in which cytotoxic T cells are bound to the major histocompatibility complex and Z or major histocompatibility complex-tetramer, and is isolated from the conjugate.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing adenovirus infection, which comprises the step of administering any of the cytotoxic T cells obtained to an individual (eg, a patient).
  • the individual in the method for preventing or treating according to the present invention is not particularly limited as long as it is an organism having an immune system and capable of infecting adenovirus, but is preferably a human.
  • Administration to an individual can be performed in accordance with the administration of the drug of the present invention.
  • the present invention includes a peptide according to the present invention, a nucleic acid encoding the peptide, an antigen-presenting cell presenting the peptide on HLA, and an antigen-presenting cell presenting the peptide or the peptide on HLA.
  • Adenovirus-specific cytotoxic T cells obtained by stimulating peripheral blood lymphocytes, or major histocompatibility complex prepared from the peptide and z or major histocompatibility antigen complex-tetramer is allowed to react with peripheral blood lymphocytes, and cytopathic ⁇ cells are added to the major histocompatibility antigen complex and z or major histocompatibility antigen complex-tetramer.
  • a passive immunotherapeutic agent against vaccines or adenoviruses to treat or prevent adenovirus infection either cytotoxic ⁇ cells obtained by forming a bound conjugate and isolated from the conjugate ( It relates to use in the manufacture of immunotherapeutic agents.
  • Adenoviruses have been reported with 51 serotypes and are classified into 6 subgroups (AF). To invent the epitope peptide that specifically recognizes type 11 of subgroup B, which is a particular problem in infectious diseases after transplantation, and the epitope peptide that is specific not only to subgroup B but also to all adenoviruses In addition, hexon, which is the most homologous protein among 51 serotypes, was analyzed. Adenovirus particles have a regular icosahedron structure without an envelope with a diameter of 80-90 nm. A hexon forms 20 triangular faces and edges of a regular icosahedron.
  • peptides were synthesized by selecting 10 types of CTL epitope candidate peptides consisting of 9 amino acids having the binding motif of HLA-A * 24 molecule from the amino acid sequence of adenovirus type 11 hexon.
  • the synthesized CTL epitope candidate peptides are shown below.
  • Positive conte mouth EBV BRLF1 protein HLA-A * 2402 restricted epitope peptide (TYPVLEEMF (SEQ ID NO: 11)
  • HCMV pp65 protein HLA—A * 2402 restricted peptide peptide QYDPVAALF (SEQ ID NO: 12) was synthesized.
  • HLA-A * 2402-restricted peptide As a negative control peptide, an HLA-A * 2402-restricted peptide (RYLRDQQLL (SEQ ID NO: 13)), an HIV envelope protein, was synthesized (Kuzushima K, Hayashi N, Kudoh A, Akatsu a Y , Tsujimura K, Morishima Y, Tsurumi T. Tetramer—assisted identification and characterization of epitopes recognized by HLA A * 2402—restricted Epstein—Barr virus-specific CD8 + T cells. Blood. 2003; 101: 1460—1468).
  • Table 1 shows the characteristics of the synthesized adenovirus type 11 hexon HLA-A * 24-binding peptide.
  • the three amino acid sequences from the N-terminal side of the synthesized peptide are shown as abbreviations with the peptide name. From left, peptide name, amino acid sequence, adenovirus type 11 hexon amino acid sequence position, number of amino acids, BIMAS (BioInformatics & Molecular Analysis Section / http://thr.cit.nih.gov/ The score calculated by HLA Peptide Binding Predictions (http: //thr.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/) of index.shtml) is shown. This score is a numerical value that predicts the affinity between HLA-A * 24 and peptide. The higher the score, the more likely that HLA and peptide may form a stable complex.
  • a Anchor motif is indicated by bold amino acids.
  • Example 2 Identification of adenovirus-specific CTL epitope peptide-selection of HLA type Adenovirus-specific CTL epitope peptide has a binding motif for HLA-A * 24 molecule. Therefore, it is desirable to identify epitope peptides using peripheral blood derived from HLA-A * 24 molecule carriers.
  • a serum method was used to determine whether a donor is an HLA-A * 24 or HL AA * 2 molecule carrier.
  • An isotype antibody was added in the same manner as each negative control, and after reaction at room temperature for 15 to 30 minutes, FIT C (fluorescein isothiocyanate) labeled anti-mouse IgG antibody was reacted.
  • FIG. 1 shows an example of HLA type determination. Subsequent studies were conducted using 10 healthy adult PBMCs that were reactive to anti-HLA-A * 24 antibodies.
  • EBV-infected B cell line Lymphoblastoid cell 1ine, hereinafter referred to as EBV-infected LCL.
  • EBV-infected LCL EBV-infected B cell line
  • NIH3T3 cells into which human CD40L was introduced and stably expressed were co-cultured in the presence of IL-4.
  • NIH-CD40L inhibited growth by 96 Gy X-ray irradiation and repeated co-culture every 3-4 days (Kondo E, Topp MS, Kiem HP, Obata Y, Morishima Y, Kuzushima K, Tanimoto M, Harada M, Takahasni ⁇ , Akatsuka Y. Efficient generati on of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40— activate d B cells. J Immunol. 2002; 169: 2164- 2171). About two weeks later, HLA molecule expression and CD80, CD83 and CD86 expression were confirmed.
  • PBMCs are cultured in a plastic culture dish at 37 ° C, 5% CO for 2 hours.
  • the cells that did not adhere to the dish were washed gently and washed away. After culturing GM-CSF and IL-4 for 24 hours, TNFa, IL-1 ⁇ and PGE2 (Prostaglandin E2) were subsequently added and cultured for 24-48 hours. Cells recovered by light washing with an appropriate medium were used as rod-shaped cells (Dauer M, Obermaier B, Herten J, Haerle, Pohi, Rothenfusser S, bchnurr M, Enares 3 ⁇ 4, Ei gler A. Mature dendritic cells derived from human monocytes within 48 hours: a nov el strategy for dendritic cell differentiation from blood precursors. J Immunol. 2003; 1 70: 4069-4076). After 48 hours, HLA molecule expression and CD80, CD83 and CD86 expression were confirmed.
  • Antigen-presenting cells (EBV-infected LCL, CD40-B cells, and rod-shaped cells) were prepared in advance from PBMCs of healthy adults that showed reactivity to anti-HLA-A * 24 antibodies. Suspend antigen-presenting cells in pulsing medium (0.1% human serum albumin Z55 M 2-mercaptoethanol ZRPMI 1640) or AIM-V medium (Invitrogen) and compensate for CTL epitopes at a concentration of 10 ⁇ g / mL. Peptide is added and gently mixed at approximately 15 minute intervals for 30 to 60 minutes at room temperature, then washed 3 times with an excess amount of washing solution (2% urine fetal serum (FCS) ZPBS) to Unbound peptide was washed away.
  • pulsing medium 0.1% human serum albumin Z55 M 2-mercaptoethanol ZRPMI 1640
  • AIM-V medium Invitrogen
  • the antigen-presenting cell subjected to this operation is called a peptide pulse antigen-presenting cell.
  • Peptide pulse antigen-presenting cells were treated with a lethal dose of X-rays or mitomycin C to lose their ability to grow. This was mixed with PBMC or CD8-positive or CD4-positive T cells separated from the same human power, and cultured in a 37 ° C, 5% CO incubator.
  • the medium used is RPMI1640 medium containing 10% FCS.
  • IL-2 (Shinogi Pharmaceutical Co., Ltd.) was added for the purpose of maintaining the survival of T cells and assisting proliferation, but the timing is usually 7-10 days after the start of mixed culture. IL-2 was studied at the start of culture, 2 days after the start of culture, 6 days after the start of the culture, etc., but good results were obtained when administered 2 days after the start of the culture. Added by concentration. Seven days after the start of culture, stimulation was again performed using peptide-pulse antigen-presenting cells.
  • This induction method is a method for inducing CTL by introducing a peptide into a PBMC culture solution.
  • Peptides are presented to antigen-presenting cells present in PBMC, such as rod cells, B cells, macrophages, and certain T cells, and CTL progenitor cells contained in PBMC are thought to proliferate upon stimulation.
  • antigen-presenting cells such as rod cells, B cells, macrophages, and certain T cells
  • CTL progenitor cells contained in PBMC are thought to proliferate upon stimulation.
  • Peripheral blood collected from healthy adults reactive to anti-HLA-A * 24 antibody was centrifuged at 3,000 rpm for 5 to 10 minutes, and the plasma portion of the supernatant was collected. Except for the plasma part, PBMCs were separated according to the conventional method. It is characterized in that several percent of plasma is stored in the medium used for induction. In the present invention, good results were obtained when 5% plasma was added.
  • the medium was generally supplemented with appropriate additives and antibiotics for the medium used for cell culture.
  • As the CTL induction medium used in the present invention a medium containing RPMI1640 Hepes modify (Sigam) with 2-mercaptoethanol, L-glutamine, and streptomycin and penicillin as antibiotics was used.
  • PBMC 1 to 3 10 6 cells were suspended in the medium 1 to 2.5 mL.
  • Candidate peptides were enumerated at a concentration of 1-20 / ⁇ / 1 ⁇ 2. The peptide concentration can be varied depending on the solubility of the peptide. In this invention, it implemented at 10 g / mL.
  • IL-2 was added at a final concentration of 20-100 U / mL.
  • a 14-mL round-bottom tube made of polypropylene (BECTON DIKINSON) or a 96-well U-bottom A microtest plate for cell culture (BECTON DIKINSON) was used. Confirmation of adenovirus-specific CTL was performed after 2 weeks and 4 weeks of culture. After 2 weeks of culture, stimulation with 10 g / mL peptide was performed again. When induction of adenovirus-specific CTL was confirmed, stimulation was performed using peptide pulse antigen-presenting cells to establish the CTL line.
  • Example 5 Identification of adenovirus-specific CTL epitope peptide-confirmation of adenovirus-specific CTL To examine whether adenovirus-specific CTLs are present in the cell population cultured by the method described above, we examined intracellular IFN y-producing cell quantification method, MHC-tetramer method, elicitor assay, and expression of membrane surface proteins. It carried out by.
  • FIG. 2 shows the results of examining the intracellular IFN y-producing cell quantification method using a known positive control peptide without using antigen-presenting cells!
  • Donor ID * 24-2 PBMC were stimulated with EBV BRLF1 (a, b) or CMV pp65 (c, d) HLA-A * 240 2-restricted epitope peptide for 13 days, followed by negative control (HIV) peptide ( A, c) and each peptide (b, d) used for stimulation were stimulated for 14 hours in the presence of Monensin.
  • results are shown in a triple stain with PE-labeled MHC-tetramer reagent (MBL), PC5-labeled CD8 antibody and FITC-labeled IFNy antibody, and analyzed using a flow cytometer.
  • MHC-tetramer reagent MHC-tetramer reagent
  • PC5-labeled CD8 antibody PC5-labeled CD8 antibody
  • FITC-labeled IFNy antibody analyzed using a flow cytometer.
  • the numbers in the figure indicate the percentage of the total number of living cells in the cells divided into four.
  • the four-segment region will be referred to as UL (upper left), UR (upper right), LL (lower left), and LR (lower right).
  • EBV BRLF1 and CMV pp65 are restimulated with their specific peptides (b, d). IFN y-positive CD8-positive cells appear only in UR, and (a, c) hardly appears when HIV peptide is added. However, EBV BRLF1 and CMV pp65-specific CTL are present in both cell populations that have received HIV or a positive control peptide.
  • IFN y-producing cells were induced by restimulation in PBMC cultured with CTL epitope peptide, and this cell was also stained with MHC-tetramer reagent. It was revealed to be a specific CTL. In other words, it was considered that the ability to induce specific CTLs can be determined by the intracellular IFN y-producing cell quantification method. Similarly, an adenovirus-specific CTL epitope candidate peptide was used to examine whether or not a specific CTL could be induced using 10 healthy adult PBMCs.
  • Figures 3a-d and 3e-h show the results of quantification of intracellular IFN y-producing cells of two representatives (Donor ID * 24-8 and * 24-12).
  • Elispot Atsey can purchase a commercial kit (for example, MABTECH) and follow the document. It can also be implemented as follows. A 96-well MultiScreen-H A plate (Millipore) was coated with anti-IFNy monoclonal antibody (R & D Systems) at 4 ° C. After washing each hole with PBS, the target cells were spread in each hole. Target cells can be used as long as they express HLA-A * 24 molecules on the cell surface. For example, cultured cells in which HLA-A * 24 molecule genes are introduced into 174CEM.T2 cells T2-A24 Can be used. EBV-infected LCL that expresses HLA-A * 24 molecule on the cell surface can also be used as target cells.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example in which specific CTLs are detected by the Elispot accessory. IFN ⁇ spots were observed in adenovirus-specific CTL epitope candidates LYA, VYS, TYF and LYS compared to negative control (HIV) peptides. This was applied and graphed under a stereomicroscope.
  • CTL has been reported to increase the expression of cell surface proteins (eg, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.) by specific stimulation.
  • cell surface proteins eg, CD107a, CD107b, CD63, CD69, etc.
  • Table 2 shows the evaluation results of the epitope candidate peptides using the quantification method of site force-in.
  • ⁇ in the table means that a specific CTL could be induced using a candidate peptide
  • X means that it was unable to induce a specific CTL.
  • 6 kinds of epitopic candidates DYL, VYS, LYA, TYF, LYS and GYK were peptides. Production of specific site force in was confirmed. Therefore, these 6 types of epitope candidate peptides are adenovirus-specific CTL epitope peptides.
  • Adenovirus-specific CTL epitope peptide has an HLA-A * 24 binding motif, so it is highly likely that it is an HLA-A * 2402-restricted epitope peptide possessed by more than 60% of Japanese people! . Based on these results, we synthesized MHC-tetramer reagents using five types of epitope peptides and examined their usefulness.
  • MBL to which the present inventors belong, has patents on MHC-tetramer reagents (US Patent No. 5,635, 363 and French Application No. FR9911133 and US Patent Numbers. 5, 723,584; 5,874,239; 5,932,433; 6,265,552.) Have obtained an exclusive patent licensing right in Japan from Beckman Coulter. Based on these patents, PE-labeled MHC-tetramer reagents were prepared using adenovirus-specific CTL epitope peptide and HLA-A * 2402 molecule.
  • the MHC-tetramer reagent prepared in the present invention is indicated by an abbreviation, for example, TYF-Tet. This is a combination of HLA-A * 2402 molecule, peptide TYF (TYFNLGNKFZ sequence number: 4) and j8 2-microglobulin. It shows what was synthesized using the complex.
  • MHC-tetramer reagent prepared using the CTL epitope peptide of the present invention as a sample peripheral blood, PBMC separated from peripheral blood, and CTL line derived using CTL epitope peptide were used as samples. Quantification of adenovirus-specific CTL was performed. Examples are shown below using PE labeled MHC-tetramer reagent as an example.
  • the labeling dye is not limited to the following as long as it is used in an appropriate combination according to the type of flow cytometer used.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • a PE-labeled MHC- tetramer reagent 10 mu L with respect to proper amount of CTL lines were derived using the CTL E pitot flop peptide, FITC target of 20 mu L T cell surface antibodies (eg CD8, CD4, CD3) etc. were collected.
  • CD45 antibody labeled with PC5 or the like may be added in order to exclude non-specific fluorescence due to contaminated erythrocytes. Gently mixed and left at room temperature for 30 minutes. 3 mL of PBS was stirred and centrifuged at 400 xg for 5 minutes.
  • 7-AAD viability dye (dead cell detection reagent, MBL) may be purchased to exclude non-specific fluorescence due to dead cells. The analysis was performed with a flow cytometer within 24 hours.
  • Fig. 5 shows the results of staining with five types of MHC-tetramer reagents that produced peptide-induced CTL lines.
  • the X-axis shows CD8, and the Y-axis shows a dot plot developed by analyzing the fluorescence intensity against the MHC-tetramer reagent on a log scale.
  • TYF-Tet was detected in CD8-positive TYF-Tet-positive cell population 3 ⁇ 4R apparent with Donor ID * 24-2 and * 24-8. This proves that TYF is an adenovirus hexon-specific CTL epitope peptide that is HLA-A * 2402 restricted.
  • VYS-Tet was detected in CD8-positive VYS-Tet-positive cell population 3 ⁇ 4R apparent with Donor ID * 24-2 and * 24-8. This proves that VYS is an adenovirus hexon-specific CTL epitope peptide that is HLA-A * 2402 restricted.
  • VYS-Tet CD8-negative VYS-Tet-positive cell populations in UL were detected with Donor ID * 24-1, * 24-3, * 24-11, * 24-12, * 24-14. This indicates that VYS is an epitope peptide capable of inducing not only CD8 positive CTL but also CD8 negative CTL.
  • CD4 positive LYA-Tet positive cells were 0.09%
  • CD8 positive LYA-Tet positive cells were 0.18%
  • the ratio of CD3 positive LYA-Tet positive cells was the highest. Therefore, CD4 negative CD8 negative CD3 positive H
  • the presence of LA class I-restricted CTL has been shown to be involved in the elimination of adenovirus-infected cells.
  • LYS confirmed the production of peptide-specific IFN y in 2 out of 10 people examined, as shown in Fig. 3e-h. In spite of the presence of 2.95% of 0 : ⁇ producing cells, no corresponding LYS-Tet positive cell images were obtained. In addition, as shown in Table 2, DYL also confirmed that peptide-specific IFN ⁇ production was confirmed in 4 out of 10 patients examined. As shown in Fig. 3e-h, 0.49% of IFN y-producing cells were also produced in DYL. Despite the presence, a corresponding DYL-Tet positive cell image could not be obtained.
  • LYS and DYL are not restricted by HLA-A * 2402, but are restricted by another HLA molecule.
  • analysis of the two HLA dienotypes with Donor ID * 24-12 and * 24-13, and searching for a common HLA other than HLA-A * 24 for the two persons reveals the HLA restriction. I think it can be done.
  • DYL four HLA dienotypes with Donor ID * 24-1, * 24-2, * 24-10, and * 24-12 were analyzed, and the four HLA non-HLA-A * 24 It is considered that the HLA restriction can be clarified by searching for.
  • HLA-A * 24-restricted peptide has either Tyr, Phe, Met or Trp located at the 2nd position from the N-terminal, and Leu, Ile, Trp or Phe at the 9th or 10th position Are arranged peptides.
  • HLA-Cw * 0401 restricted peptide is a peptide in which either Tyr, Phe or Pro is placed at the 2nd position from the N-terminal, and either Leu or Phe is placed at the 9th or 10th position. Yes, both are very similar. In fact, the score calculated by BIMAS was 280 for A * 24 and 200 for Cw * 0401. Similarly, DYL was 360 for A * 24 and 220 for Cw * 0401.
  • Adenovirus-specific MHC-tetramer reagent can be used to determine the presence of adenovirus-specific CTL within 1 hour after blood collection.
  • FIG. 7-a Peripheral blood of Donor ID * 24-8 was stained with four types of adenovirus-specific MHC-tetramer reagents and EBV BRLF1 and CMV pp65 MHC-tetramer reagents (MBL).
  • the X-axis shows CD8, and the Y-axis shows fluorescence intensity with respect to INF y on a log scale.
  • the numerical value in the dot plot development chart shows the percentage of the CD8 positive MHC-tetramer reagent positive cells in the living cells as the positive ratio (%).
  • EBV BRLF1 increased by about 520 times from 0.03% to 15.6% after 10 days of culture.
  • a clear CD8 positive MHC-tetramer positive image was obtained with TYF-Tet and VYS-Tet compared to the negative tetramer reagent (MBL).
  • Adenovirus-specific CTLs were observed to increase 153 times (0.01% to 1.53%) in TYF and 15 times (0.015 force 0.15%) in VYS.
  • MHC-tetramer reagent not only quantifies specific CTLs, but also combines intracellular cytoforce-in production cell quantification methods and specific antibodies against cell surface proteins, so that the separation stage and functionality of specific CT L can be achieved simultaneously. It is possible to judge.
  • the ability of the MHC-tetramer reagent synthesized using the CTL epitope peptide provided in the present invention to be effective in the quantification and functional analysis of adenovirus-specific CTL was examined. The results are shown in FIG.
  • Fig. 8ab shows the results of analysis using an intracellular IFN ⁇ -producing cell quantification method after stimulation with PTY of Donor ID * 24-8 with TYF peptide for 10 days.
  • Fig. 8cd shows the results of analysis of intracellular IFN y-producing cells after stimulation with VYS peptide in Donor ID * 24-2 PBMC for 27 days.
  • a and c are negative control (HIV) peptides
  • b and d are the results of restimulation with specific peptides.
  • the X-axis is CD8, and the Y-axis is a dot plot developed by analyzing the fluorescence intensity for the MHC-tetramer reagent on a log scale, showing the CTL quantitative results.
  • the X-axis is IFN y
  • the Y-axis is the log scale of the fluorescence intensity for the MHC-tetramer reagent.
  • the qualitative result of CTL is shown in the dot plot development diagram analyzed in step 1.
  • the numerical values in the dot plot development figure show the percentage (%) of each cell in the whole living cell when divided into four.
  • UR cell population is specific peptide Is added to the X-axis side compared to the HIV peptide, the reactivity to the MHC-tetramer reagent is reduced, that is, the expression level of TCR that binds to the MHC-tetramer reagent is specific. It is clear that it has declined. In other words, this means that adenovirus-specific CTL exists. From the qualitative results of specific CTL, when HIV peptide was calorieated, MHC-tetramer reagent positive cells (UL and UR) were almost IFN, both TYF specific CTL (1.76%) and VYS specific CTL (8.24%). There are no cells that produce y! However, it is clear that the cell population moves to UR and LR by specific peptide stimulation and produces IFN y.
  • the adenovirus-specific MHC-tetramer reagent labeled with CTL induced by the CTL preparation method was mixed and left at room temperature for 30 minutes.
  • the plate was washed once with an excess amount of washing solution, and magnetically labeled anti-microbeads (Miltenyi Biotec GmbH) were covered and allowed to stand at 4-8 ° C for 15 minutes. Wash once with excess wash solution, dilute cells in 1 mL wash solution, Using a separation device (AutoMACS, Miltenyi Biotec GmbH), MHC-tetramer positive cells, ie adenovirus-specific CTLs, were purified.
  • the X-axis shows the fluorescence intensity for the adenovirus-specific MHC-tetramer reagent on a log scale
  • the Y-axis shows a histogram development analyzed by the number of cells.
  • the upper row is the cell population containing CTL before purification, and the lower row is the result of analysis of the purified cell population.
  • the percentage of specific CTL contained in the cell population before and after purification was shown as a numerical value.
  • Adenovirus-specific CTLs were recovered by this method with a purity of 90% or more. This indicates that adenovirus-specific CTL can be purified with high purity using an adenovirus-specific MHC tetramer reagent.
  • Purified adenovirus-specific CTLs were stimulated and proliferated with antigen-presenting cells that had been irradiated with anti-CD3 antibody, IL-2, and X and lost their proliferative capacity to ensure the number of cells required for passive immunotherapy.
  • the TYF identified by the present invention has a subgroup C-specific CT L epitope and amino acid mutations at the 4th and 6th positions as shown in FIG. Therefore, using the CTL line induced by TYF, subgroup C-specific CTL epitopes (TYFSLMNKF (SEQ ID NO: 14), underlined indicate mutated amino acids) (Leen AM, Sili U, Vanin EF, Jewell AM , X ie W, Vignali D, Piedra PA, Brenner MK, Rooney CM. conserveed CTL epitopes on t he adenovirus hexon protein expand subgroup cross-reactive and subgroup-specific CD8 + T cells.Blood. 2004; 104: 2432- 2440.) The cross-reactivity with was investigated.
  • TCR expression is suppressed by TYF re-stimulation in the TYF-specific CTL line, and CD8-positive TYF-Tet
  • the number of positive cells was 1.22% when TYF was added, and a slight decrease was observed compared with the case where TYFSL NKF (SEQ ID NO: 14) was added (1.97%).
  • TYF-Tet positive when TYFSL NKF (SEQ ID NO: 14) is obtained from a dot-blot development analysis of the fluorescence intensity for IFN y on the X-axis and TYF-Tet on the Y-axis on a log scale Most cells (UL and UR) were present in UL and no INF ⁇ -producing cells were present, but when TYF was added, IFN ⁇ -producing cell strength 3 ⁇ 4R and LR were observed.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information, http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/) to examine the reactivity of CTL epitope peptides obtained in the present invention between adenovirus subgroups More than 50 types of adenovirus hexon amino acid sequences were obtained (accession numbers are listed in Table 3), and amino acid homologous sequence analysis was performed. Recently, it has been reported that a mutation occurs in the amino acid immediately after the anchor motif on the C-terminal side of the CTL epitope changes the place where it is degraded in the intracellular proteolytic pathway, resulting in the absence of the CTL epitope peptide.
  • SEQ ID NO: l (DYL) showed 100% homology with adenoviruses belonging to subgroups B, C, D and E (Fig. 11-1).
  • SEQ ID NO: 2 (LYA) showed 100% homology with adenoviruses belonging to all subgroups (Fig. 11 2).
  • SEQ ID NO: 3 (VYS) showed 100% homology with adenoviruses belonging to subgroups B, D and E (Fig. 11 3).
  • SEQ ID NO: 4 (TYF) showed 100% homology with only 11, 21, 34 and 35 types belonging to subgroup B (FIG. 11-4).
  • SEQ ID NO: 5 (LYS) showed 100% homology with adenoviruses belonging to subgroups D and F (FIG.
  • SEQ ID NO: 6 (GYK) showed 100% homology with adenoviruses belonging to type 18 belonging to subgroup A, D and E (Fig. 11-6). None of the epitope peptides showed any mutation in the amino acid immediately after the C-terminal side. These results are summarized in Table 4. SEQ ID NO: 4 (TYF) was considered to be a CTL epitope peptide highly specific to subgroup B. The other epitope peptides were considered to be CTL epitope peptides showing not only subgroup B but also broad specificity among subgroups.
  • Each peptide of SEQ ID NOs: 1 to 6 was dissolved in DMSO to a final concentration of 20 mg / ml and sterilized by filtration.
  • the obtained peptide-containing solution was aliquoted and sealed in sterile bottles of lmL to make a vaccine injection.
  • CTL recognizes a peptide consisting of 8 to 10 amino acids in a viral protein (hereinafter referred to as an epitope peptide) and destroys infected cells.
  • This epitope peptide is presented by binding to a complex of human leucocyte antigen (hereinafter referred to as HLA) and ⁇ 2-microglobulin on the surface of virus-infected cells.
  • HLA human leucocyte antigen
  • TCR T cell receptor
  • HLA differs between races and individuals, and if the HLA is different, the epitope peptide is different even in the same virus (this is called HLA restriction of the epitope peptide).
  • the CTL of the present invention means a cytotoxic T cell that expresses CD8 or CD4, which is one of the surface antigen molecules present on human T cells, and exhibits HLA class I restriction.
  • the adenovirus-specific CTL of the present invention is an HLA class I molecule expressed on the cell membrane surface of adenovirus-infected cells, ⁇ 2-microglobulin, and an HLA class I-restricted epitope specific to adenovirus.
  • TCR T cell receptor
  • An adenovirus-specific HLA class I-restricted epitope peptide is a peptide consisting of an 8 to 10 amino acid sequence at a specific site in an adenovirus protein that can be recognized by CTLs. It is a structural part of adenovirus that forms a ternary complex of I molecule and / 3 2-microglobulin, and TCR on the surface of CTL membrane can immunorecognize and bind.
  • adenovirus-specific CTL By using the epitope peptide provided in the present invention as a vaccine, adenovirus-specific CTL can be induced in vivo to retain immunity against adenovirus infection. Adenovirus-specific CTLs can be artificially induced and proliferated and used for cell immunotherapy safely and efficiently without infecting a biological sample such as peripheral blood in vitro. Furthermore, the present invention provides an effective treatment method and diagnostic method for adenovirus infection that can be used to diagnose the presence or absence of immunity against adenovirus.

Abstract

　本発明者らは、種々のサブグループに属するアデノウイルス遺伝子の中で最も相同性の高いヘキソン蛋白質を用いて、サブグループＢに属するアデノウイルス特異的なエピトープペプチドと、アデノウイルス全般に特異性を示すエピトープペプチドを同定することに成功した。該ペプチドは、アデノウイルス特異的な細胞傷害性Ｔ細胞(CTL)を効率的に誘導し得る機能を有する。従って該ペプチドは能動免疫ワクチンとして有用である。また、該ペプチドによって誘導されたCTLは、受動免疫療法剤として有用である。

Description

明 細 書
細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド及びその用途
技術分野
[0001] 本発明は、アデノウイルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド、該ぺ プチドを用いたアデノウイルスの感染を治療又は予防するワクチン、アデノウイルスに 対する受動免疫療法剤に関する。
背景技術
[0002] アデノウイルスは、肺炎を代表とする呼吸器感染症、プール熱や流行性角結膜炎 を代表とする眼感染症、胃腸炎などの腸管感染症、出血性膀胱炎や尿道炎等の泌 尿生殖器感染症などの原因ウィルスで、新生児では重篤な症状を起こす場合もある 。しかし成人に対しては適切な治療が施される限り、重症化することは稀で、比較的 安全なウィルスベクターとして、遺伝子治療やワクチン開発の研究に用いられている
。ところが、先天性免疫不全、 HIV (human immunodeficiency virus)感染や移植等に より免疫的に無防備状態の場合は、肝炎、肺炎、脳炎、出血性膀胱炎を引き起こし、 患者の予後と死亡率に多大な影響を与えている (非特許文献 1〜3参照)。
[0003] 近年、骨髄バンクと臍帯血バンクの拡充により、非血縁者間あるいは臍帯血を利用 した造血幹細胞移植が著しく増加している。例えば移植後 1ヶ月以内は、細菌や真 菌による敗血症、単純へルぺスウィルス（herpes simplex virus ;HSV)による口内炎が 生じやすい。移植後 1〜6ヶ月頃には、ヒトサイトメガロウィルス（human cytomegaloviru s ;HCMV)による間質性肺炎や肝炎、アデノウイルスによる出血性膀胱炎、水痘帯状 疱疹ウィルス（varicella- zoster virus ; VZV)による帯状疱疹、ェプスタイン-バールウイ ルス (Epstein- Barr virus ;EBV)による Bリンパ球増殖性疾患（B- cell lymphoproliferati ve disorder ;BLPD)などを発症する危険性が高い。このような感染症を如何に制御す るかという問題が移植の成功を左右しており、移植現場では感染症に対する対策は 最重要課題と言える。細菌や真菌に対しては抗生物質の投与により、 HSV、 HCMV、 VZVは効果的な抗ウィルス薬を前処置として投与することでかなりの部分で解決が見 られる。しかし、抗ウィルス薬耐性の HCMV感染症や Bリンパ球増殖性疾患、アデノウ ィルスによる感染症に対しては長らく有効な治療法が存在しな力つた。
[0004] 最近になって、抗ウィルス薬耐性の HCMV感染症や BLPDに対して、原因となるウイ ルス感染細胞を排除し得る免疫担当細胞を患者体内に輸注する、いわゆる細胞免 疫療法の試みが始まり効果を上げつつある (非特許文献 4〜6参照)。しかしながら依 然としてアデノウイルス感染症に対しては有効な治療法が存在せず、対症かつ支持 的な治療に留まっており、一部でドナーリンパ球輸注療法が試み始められているだ けである (非特許文献 7及び 8参照)。
[0005] このような医療事情と社会的背景において、アデノウイルスを安全にかつ有効に制 御する新し 、方法が強く望まれて 、る。
非特干文献 1 : Flomenberg P,外 d名着、「Characterization of human proliferative T c ell responses to adenovirus.」、 J Infect Dis.、 1995年、 Vol.171, p.1090- 1096 非特許文献 2： Hale GA,外 6名 、「Adenovirus infection after pediatric bone marro w transplantation.」、 Bone Marrow Transplant.ゝ 1999年、 Vol.23, p.277— 282 非特許文献 3 : Howard DS,外 7名著、「Adenovirus infections in hematopoietic stem cell transplant recipients.」、 Clin Infect Dis.ゝ 1999年、 Vol.29, p.1494-1501 非特許文献 4 : Einsele H,外 13名著、「Infosion of cytomegalovirus (CMV)- specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.」 、 Blood.、 2002年、 Vol.99, p.3916-3922
非特許文献 5 : Heslop HE,及び Rooney CM.著、「Adoptive cellular immunotherapy f or EBV lymphoproliferative disease.」、 Immunol Rev.、 1997年、 Vol.157, p.217-222 特許文献 6 : Walter EA,外 6名著、「Reconstitution of cellular immunity against cyt omegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T— cell clones fro m the donor. J , N Engl J Med., 1995年、 Vol.333, p.1038-1044
非特許文献 7： Hromas R,外 4名 、「Donor leukocyte infusion as therapy of life- thr eatening adenoviral infections after T— cell— depleted bone marrow transplantation.」、 Blood.、 1994年、 Vol.84, p.1689- 1690
非特許文献 8 : Chakrabarti S,外 4名著、「Adenovirus infections following haematopoi etic cell transplantation: is there a role for adoptive immunotherapy？」、 Bone Marro w Transplant., 2000年、 Vol.26, p.305- 307
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、アデノウイルス に特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド、該ペプチドを用いたアデノウィル スの感染を治療又は予防するワクチン、アデノウイルスに対する受動免疫療法剤、及 びアデノウイルスに特異的な CTLの定量方法の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行った。
アデノウイルス感染細胞の活動を制御して 、る主な免疫担当細胞は細胞傷害性 T 細胞（Cytotoxic T cell； CTL、以下 CTLと称する）である。 CTLはアデノウイルス感染 細胞を発見し、それを破壊する能力を持っているため、その機能を有効に活用すれ ば、アデノウイルス関連疾患の新し 、診断と治療法の開発につながる可能性が高 、 と考え本発明技術の開発の糸口とした。
[0008] アデノウイルスは、 51タイプの血清型が報告されており、 6種類のサブグループ (A 〜F)に分類される。病原性が高いのはサブグループ A、 B及び Cに分類されるタイプ のウイノレスで fcO (Flomenberg P, Piaskowski V, Truitt RL, Casper JT., し haracteriza tion of human proliferative T cell responses to adenovirus., J Infect Dis., 1995;171:1 090— 109b, Carrigan DR., Adenovirus infections in immunocompromised patients., A m J Med., 1997;102:71-74) 0
[0009] 先天性免疫不全、エイズ患者、移植後の免疫抑制剤の作用により免疫無防備状態 にある人において、肝炎、肺炎、脳炎、出血性膀胱炎等を引き起こし、患者の予後と 死亡率に多大な影響を与えて 、るアデノウイルスは、サブグループ Bに分類されるタ イブが最も多く報告されて！ヽる。
[0010] 本発明者らはアデノウイルス遺伝子の中で最も相同性の高いへキソン蛋白質を用 いて、サブグループ Bに属するアデノウイルス特異的なェピトープペプチドと、アデノ ウィルス全般に特異性を示すェピトープペプチドを同定することに成功し、本発明を 完成させた。 [0011] 本発明者らによって同定されたェピトープペプチドは、アデノウイルス特異的な CTL を効率的に誘導させる機能を有し、該ペプチド及び該ペプチドをコードする核酸は、 アデノウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン (能動免疫療法剤）として 有用である。
[0012] また、本発明のこれらのェピトープペプチドによって誘導される CTLは、アデノウィ ルス感染細胞を特異的に破壊する機能を有し、受動免疫療法剤の成分として非常 に有用である。
[0013] さらに、該ェピトープペプチドを用いることにより、アデノウイルスに特異的な CTLを 定量することが可能である。アデノウイルスに特異的な CTLが、ノ、ィリスクの患者の末 梢血に存在するカゝ否かを知ることは、抗ウィルス剤や免疫抑制剤の適正な使用を含 め、これらの感染症管理の上で重要な情報である。本発明者らによって、ェピトープ ペプチドを利用した CTLの定量方法が提供された。
[0014] また、本発明者らによって同定されたェピトープペプチドのアミノ酸配列を基に、所 望の機能 (例えば、アデノウイルス特異的な CTL誘導能)を保持する範囲内で、適宜 、該ペプチドを改変させることが可能である。本願によって具体的に開示されたぺプ チドに対して、一般的な遺伝子工学技術を用いて、適宜アミノ酸を改変することは容 易である。また、本願のペプチドに対して改変されたペプチドの中から、所望の機能 を有するペプチドある ヽは該ペプチドを提示する細胞を選択することは、当業者にお いては通常の試行の範囲内である。即ち、本願によって具体的に開示されたぺプチ ドの構造を基に、アデノウイルス特異的な CTL誘導能を保持する種々の形態の分子 ( ペプチド等）を作製することが可能である。さらに、該ペプチドを適宜改変することに より、より CTL誘導能が強い、あるいはよりアデノウイルス感染細胞に対する特異性の 高い CTLを誘導可能な分子を作出することも可能である。
[0015] 即ち本発明は、アデノウイルス特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド、該 ペプチドを用いたアデノウイルスの感染を治療又は予防するワクチン、アデノウイルス に対する受動免疫療法剤、及びアデノウイルスに特異的な CTLの定量方法に関し、 より詳しくは、
〔1〕 アデノウイルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチド、 〔2〕 アデノウイルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチドが配列番号： 1 〜6からなる群力も選択される少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むものである、〔1〕に 記載のペプチド、
〔3〕 配列番号： 1〜6のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数の アミノ酸が置換、欠失、挿入及び Ζ又は付加されたアミノ酸配列力 なるペプチドで あって、アデノウイルス特異的な細胞傷害性 Τ細胞を誘導し得る機能を有することを 特徴とする、〔1〕に記載のペプチド、
〔4〕 HLA- Α*2402分子、 HLA- Cw*0401分子あるいは HLA- Cw*0702分子の拘束性 抗原ペプチドであって、 HLA-A*2402分子、 HLA-Cw*0401分子あるいは HLA-Cw*0 702分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうる T細胞レセプタ 一を有する細胞傷害性 T細胞を誘導し得る機能を有することを特徴とする、〔1〕〜〔3 〕の!、ずれかに記載のペプチド、
〔5〕 〔1〕〜〔4〕の!、ずれかに記載のペプチドをコードする核酸、
〔6〕 〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、アデノウイルス の感染を治療又は予防するためのワクチン、
〔7〕 [5]に記載の核酸を有効成分として含む、アデノウイルスの感染を治療又は予 防するためのワクチン、
〔8〕 〔1〕〜〔4〕の 、ずれかに記載のペプチドを HLAに提示した抗原提示細胞を有 効成分として含む、アデノウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン、 〔9〕 〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示した 抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるアデノウイルス特異的な細胞 傷害性 T細胞を有効成分として含む、アデノウイルスに対する受動免疫療法剤、 〔10〕 〔1〕〜〔4〕の 、ずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複 合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応 させ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テト ラマーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得 られる細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、アデノウイルスに対する受動免疫療 法剤、 〔11〕 〔1〕〜〔4〕の 、ずれかに記載のペプチドで末梢血を刺激し、該ウィルスに特 異的な細胞傷害性 T細胞を取得し、細胞傷害性 T細胞が産生するサイト力イン及び
Z又はケモカイン及び Z又は細胞表面分子を測定することを特徴とする、アデノウィ ルスに特異的な細胞傷害性 T細胞の定量方法、
〔12〕 〔1〕〜〔4〕の 、ずれかに記載のペプチドから主要組織適合性抗原複合体-テ トラマーを調製し、主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血とを反応させるこ とを特徴とする、該末梢血中のアデノウイルスに特異的な細胞傷害性 T細胞の定量 方法、
〔13〕 〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドを用いて細胞傷害性 T細胞を誘導す ることを特徴とする、細胞傷害性 T細胞の誘導方法、
〔14〕 〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドと、末梢血単核球を血漿を含む培地 中で接触させることにより、アデノウイルス特異的細胞傷害性 T細胞を誘導する、〔13 〕に記載の誘導方法、
〔15〕 〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示した 抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激してアデノウイルス特異的な細胞傷害性 T 細胞を取得する工程を含む、アデノウイルスに対する受動免疫療法剤の製造方法、 〔16〕 〔1〕〜〔4〕の 、ずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複 合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応 させ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テト ラマーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得 られる細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む、アデノウイルスに対する受動免疫 療法剤の製造方法、を提供するものである。
さらに本発明は、本発明に記載のペプチド、該ペプチドをコードする核酸、該ぺプ チドを HLAに提示した抗原提示細胞、該ペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示し た抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるアデノウイルス特異的な細 胞傷害性 T細胞、または該ペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主 要組織適合性抗原複合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーに細 胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞 傷害性 τ細胞の ヽずれかを投与する工程を含む、アデノウイルスの感染を治療また は予防する方法に関する。あるいは本発明は、本発明に記載のペプチド、該ぺプチ ドをコードする核酸、該ペプチドを HLAに提示した抗原提示細胞、該ペプチドもしく は該ペプチドを HLAに提示した抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得ら れるアデノウイルス特異的な細胞傷害性 Τ細胞、または該ペプチドから調製した主要 組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢 血リンパ球とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び Ζ又は主要組織適合 性抗原複合体-テトラマーに細胞傷害性 Τ細胞が結合した結合体を形成させ、該結 合体から単離して得られる細胞傷害性 Τ細胞の ヽずれかの、アデノウイルスの感染を 治療または予防するためのワクチンまたはアデノウイルスに対する受動免疫療法剤（ 免疫治療剤)の製造における使用に関する。
図面の簡単な説明
[図 1]抗 HLA抗体を用いて HLA型を判定した結果の一例を示す図である。左力も HL Α型の判定結果、その判定結果の根拠となる抗 HLA-A*24抗体で染色した結果のヒ ストグラム展開図、抗 HLA-A*2抗体で染色した結果のヒストグラム展開図を示した。ま た、解析した細胞の領域 (R1)を、 X軸に FSC (前方散乱光）、 Y軸に SSC (側方散乱光 )にて展開したドットプロットで示した。ヒストグラム展開図では、 X軸に FITCの蛍光強 度を logスケールで、 Y軸は細胞数を示した。黒い塗りつぶしが特異抗体を用いた染 色結果で、白抜きがアイソタイプコントロール IgGで染色した結果である。例えば、 HL A型 A*24+/A*2—は、抗 HLA-A*24抗体に反応性を示し、抗 HLA-A*2抗体に反応性 を示さなカゝつた場合の判定結果を示す。なお左側 2列の各ヒストグラム展開図の X軸 および Y軸の目盛りおよびタイトルについては図下部左側に、右側 1列の各ドットプロ ットの X軸および Y軸の目盛りおよびタイトルにつ 、ては図下部右側に別途示した。
[図 2]コントロールペプチドを用いた細胞内 IFN y産生細胞定量法の検討を示した図 である。 Donor ID*24- 2の PBMCを EBV BRLFl(a,b)または CMV pp65(c,d)の HLA- A* 2402拘束性ェピトープペプチドで 13日間刺激後、陰性コントロール (HIV)ペプチド（a ,c)と、刺激に用いたそれぞれのペプチド (b,d)で刺激し、テトラマー (Tetramer)陽性 細胞が、特異的ペプチドに応答し、 IFN yを産生する事を示した図である。なお各列 (左側、中央、右側）のドットプロットにおける X軸および Y軸の目盛りおよびタイトルに ついて、図下部に別途示した。
[図 3a-d]細胞内 IFN y産生細胞定量法による特異的 CTL誘導の確認 (Donor ID *24 -8)を示す図である。 X軸に CD8、 Y軸に IFN yに対する蛍光強度を logスケールで示 したドットプロット展開図で、 a、 cは誘導に用いたペプチドと同じペプチドを用いて再 刺激した結果を、 b、 dは陰性コントロールの HIVペプチドを用いて再刺激した結果を 示し、 URに CD8陽性 IFN y陽性細胞数が PBMCに占める割合（％)を数値で示した。 なお aおよび bのドットプロットにおける X軸および Y軸の目盛りおよびタイトルについて 、 bの下部に別途示した。同じく cおよび dのドットプロットにおける X軸および Y軸の目 盛りおよびタイトルについて、 dの下部に別途示した。
[図 3e-h]細胞内 IFN y産生細胞定量法による特異的 CTL誘導の確認 (Donor ID *24
-12)を示す図である。 X軸に CD8、 Y軸に IFN yに対する蛍光強度を logスケールで示 したドットプロット展開図で、 e、 gは誘導に用いたペプチドと同じペプチドを用いて再 刺激した結果を、 f、 hは陰性コントロールの HIVペプチドを用いて再刺激した結果を 示し、 URに CD8陽性 IFN y陽性細胞数が PBMCに占める割合（％)を数値で示した。 なお eおよび fのドットプロットにおける X軸および Y軸の目盛りおよびタイトルにつ!/、て
、 fの下部に別途示した。同じく gおよび hのドットプロットにおける X軸および Y軸の目 盛りおよびタイトルについて、 hの下部に別途示した。
[図 4]エリスポットアツセィにより特異的 CTLを検出した例を示す図である。
圆 5]作製した MHC—テトラマー試薬を用いて染色した結果を示す図である。なおド ットプロットにおける X軸および γ軸の目盛りおよびタイトルについて、図下部に別途 示した。
[図 6]Donor ID*24- 14の PBMCを 24日間 LYAにて刺激後、 LYA- Tetおよび CD4、 CD3 、 CD8にて染色した。また陰性コントロールとして Negativeテトラマー試薬と反応性を 比較した図である。
[図 7]短期間培養による AdV特異的 CTL誘導の有効性を示す図である。 Donor ID*24 -8の PBMCを単離直後に各テトラマー試薬で染色した図である。 bは 10日間、ぺプチ ドを加えて培養後、各テトラマー試薬を用いて特異的 CTLが誘導されたことを確認し た図である。各ドットプロットにおける X軸および Y軸の目盛りおよびタイトルについて 下部に別途示した。
[図 8]アデノウイルス特異的 CTLの機能性評価を示す図である。 abは Donor ID*24-8 の PBMCを用いて誘導した TYF特異的 CTLの機能性評価、 cdは Donor ID*24-2の PB MCを用いて誘導した VYS特異的 CTLの機能性評価を示す図である。なおこれら各ド ットプロットの X軸タイトルについては各ドットプロット中に記載した力 X軸の目盛りお よび Y軸の目盛りおよびタイトルについては dの下部に別途記載した。
圆 9]MHC—テトラマー試薬を用いて CTLを精製した例を示す図である。
[図 10]Donor ID*24-8の PBMCを用いて誘導した TYF特異的 CTLは、サブグループ C のェピトープペプチドとは交差反応しないことを示す図である。なお、左側の各ドット プロットの X軸および Y軸の目盛りおよびタイトルについては左側のドットプロットの下 部に、中央の各ドットプロットの X軸および Y軸の目盛りおよびタイトルについては中央 のドットプロットの下部に、右側の各ドットプロットの X軸および Y軸の目盛りおよびタイ トルについては右側のドットプロットの下部に別途記載した。
[図 11-1]アミノ酸相同配列解析による反応性を検討した図である。配列番号： 1のサ ブグループ間の相同性を示す。
[図 11-2]アミノ酸相同配列解析による反応性を検討した図である。配列番号： 2のサ ブグループ間の相同性を示す。
[図 11-3]アミノ酸相同配列解析による反応性を検討した図である。配列番号： 3のサ ブグループ間の相同性を示す。
[図 11-4]アミノ酸相同配列解析による反応性を検討した図である。配列番号： 4のサ ブグループ間の相同性を示す。
[図 11-5]アミノ酸相同配列解析による反応性を検討した図である。配列番号： 5のサ ブグループ間の相同性を示す。
[図 11-6]アミノ酸相同配列解析による反応性を検討した図である。配列番号: 6のサ ブグループ間の相同性を示す。
発明を実施するための最良の形態 [0018] 本発明は、アデノウイルスに特異的に細胞傷害性 T細胞を誘導し得る機能を有する T細胞ェピトープペプチドに関する。従って本発明は、アデノウイルスに特異的な細 胞傷害性 T細胞ェピトープペプチドを提供する。該ェピトープペプチドは、本明細書 において「ェピトープペプチド」、あるいは単に「本発明のペプチド」と記載する場合が ある。
[0019] 本発明のペプチドは、生理活性を有し、隣接するアミノ酸残基の (X -ァミノ基とカル ボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した線状のアミノ酸の分子鎖を意味 する。ペプチドは特定長のものを意味するものではなぐ種々の長さであり得る。従つ て、本発明のペプチドには、所謂「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」も含まれる。
[0020] また、無電荷又は塩の形態であってもよぐ場合によっては、グリコシル化、アミドィ匕 、ホスホリル化、カルボキシル化、リン酸ィ匕等により修飾されていてもよい。
以下に、ェピトープの候補ペプチドの選択方法にっ 、てその一例を記載する。
[0021] 1.コンピュータを用いた解析
本発明のアデノウイルスに特異的な CTLェピトープペプチドは、アデノウイルスタン パク質のアミノ酸配列について、 目的とする HLA分子の各結合モチーフを有する 8〜 10個のアミノ酸よりなるェピトープペプチドを検索し得る、インターネット上に公開され TV、o ¾数のソフト'ノエ ~~ (Pingping Guan, Ιπηι A. Doytchinova,し hnstianna Zygo uri, and Darren R. Flower, MHCPred: a server for quantitative prediction of peptide -MHC binding, Nucleic Acids Res., 2003;31:3621-3624)に照合して CTLェピトープ の候補ペプチドを選択する事ができる。
[0022] 2.アンカーモチーフを用いた検討
HLAクラス I分子は、主として HLA-A、 HLA-B、 HLA-Cがあり、これらに結合して提 示されるェピトープペプチドは、 8〜10個のアミノ酸からなる。ェピトープペプチドの N 末端側から 2番目と、 9あるいは 10番目のアミノ酸は HLA分子との結合に対して最も重 要なアミノ酸であり、アンカーモチーフと呼ばれている。このアンカーモチーフは、各 々の HLA分子の種類によって異なることが報告されている。例えば、世界的に最も頻 度の高い HLA-A2分子に結合するペプチドとしては、 N末端より 2番目の位置に Leu が配置され、 9あるいは 10番目の位置に Leu又は Valが配置されたペプチドであって、 9〜10個のアミノ酸残基からなるペプチドが最も良く知られている（T Sudo, N Kamika waji, A Kimura, Y Date, し J bavoie, H Nakashima, E Furuichi, S uhara, ana Γ basa zuki, Differences in MHC class I self peptide repertoires among HLA— A2 subtypes, J. Immunol, 199δ;155:4749-4756)。また、日本人を含むアジアの人種に多い HLA- A24に結合するペプチドとしては、 N末端より 2番目の位置に Tyr、 Phe、 Met又は Trp のいずれかが配置され、 9あるいは 10番目の位置に Leu、 Ile、 Trp又は Pheのいずれか が配置されたペプチドであって、 9〜 10個のアミノ酸力もなるペプチドが最もよく知ら れて 、る (A Kondo, J bidney, S Southwood, MF del Guercio, E Appella, H Sakamoto , E Celis, HM Grey, RW Chesnut, and RT Kubo, Prominent roles of secondary anch or residues in peptide Dinding to HLA- A24 human class I molecules, J. Immunol., 1 995;155:4307-4312) o蛋白質のアミノ酸配列中力 このアンカーモチーフを有する配 列を検索し、 CTLェピトープの候補ペプチドを選択する事ができる。
[0023] 3.ペプチドライブラリーの作製
アデノウイルス蛋白質の蛋白質全体を網羅する 20個前後のアミノ酸よりなるぺプチ ドライブラリーを合成する。 20個前後のアミノ酸のうち、前後 10個程度のアミノ酸は、前 後のペプチド配列と重複するようにライブラリーを作製する。これによつて、蛋白質全 体を網羅的に検索する事ができ、一度ライブラリーを作製すれば HLA拘束性も網羅 的に検討する事が可能になる。
[0024] なお、前述の方法にて選択されたェピトープ候補ペプチドは必ずしも CTLェピトー プになり得る訳ではなぐ以下に示す検討を経て初めてアデノウイルス特異的 CTLェ ピトープになり得る。以下に、ェピトープペプチドの検討方法について記載する。
[0025] (1)ェピトープペプチド決定方法 1
アデノウイルス感染歴がある人から分離した末梢血単核球 (peripheral blood monon uclear cells ; PBMC)、あるいは PBMCから分離した T細胞を適切な培地に 0.1〜2 X 10 VmLの細胞濃度で浮遊させる。これに同じ人力もあらかじめ分離培養しておいたァ デノウィルス感染細胞 1 X 105/mLをカ卩え、 5%炭酸ガス（CO )恒温槽にて 37°Cで 7日
2
間培養する。培養 7日後にアデノウイルス感染細胞とインターロイキン 2 (IL-2)を添カロ し、以後、アデノウイルス感染細胞と IL-2による刺激を毎週繰返すことにより CTLを誘 導する。このようにして誘導した CTLがェピトープ候補ペプチドに対して特異性がある かどうかの検討は、 MHC—テトラマー法、エリスポットアツセィ、クロムリリースアツセィ 、細胞内サイト力イン染色法等で判定する（Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, W arren Strober, 6.19 ELISPOT Assay to Detect Cytokine— Secreting Murine and Hum an Cells, 6.24 Detection of Intracellular Cytokines by Flow Cytometry, published by
John Wiley & Sons, Inc.)。
[0026] (2)ェピトープペプチド決定方法 2
アデノウイルス感染歴がある人から分離した PBMCを適切な培地に 0.1〜2 X loVmL の細胞濃度で浮遊させ、これにェピトープ候補ペプチドの任意の 1種を 0.01〜100 μ gZmLの濃度でカ卩える。 5% CO恒温槽にて 37°Cで培養し、 2日後に IL- 2を添加する。
2
以後、前記ペプチドと IL-2による刺激を週に 1度あるいは 2週間に 1度繰返すことによ り CTLを誘導する。このようにして誘導した CTLがェピトープ候補ペプチドに対して特 異性があるかどうかの検討は、 MHC—テトラマー法、エリスポットアツセィ、クロムリリー スアツセィ、細胞内サイト力イン染色法等で判定する。
[0027] (3)ェピトープペプチド決定方法 3
アデノウイルス感染歴がある人から分離した PBMCを適切な培地に 0.1〜2 X loVmL の細胞濃度で浮遊させ、これに合成したペプチドライブラリーを適当な数 (例えば 10 種類ずつ）にプールした物をカ卩える。 5% CO恒温槽にて 37°Cで培養し、 2日後に IL-2
2
を添加する。以後、プールペプチドと IL-2による刺激を週に 1度あるいは 2週間に 1度 繰返すことにより、 CTLを誘導する。このようにして誘導した CTLがェピトープ候補べ プチドに対して特異性があるかどうかの検討は、エリスポットアツセィ、クロムリリースァ ッセィ、細胞内サイト力イン染色法等で判定する。良好な結果を示したプールべプチ ドに対しては、 1種類ずつペプチドを加えて上記実験を繰返せば、 CTL誘導能を有 するペプチドを選択する事が可能である。反応したペプチドについて順次短くし、基 幹のペプチドを得て本発明のェピトープペプチドとする。一般的に、ェピトープぺプ チドは最終的に 8〜10個のアミノ酸までに短くすることができる。
[0028] 本発明のペプチドとして具体的には、配列番号： 1〜6のいずれかに記載の塩基配 列からなるペプチドを例示することができる。
また本発明のペプチドは、配列番号： 1〜6のいずれかに記載のアミノ酸領域を含 むペプチドであってもよい。即ち、本発明のペプチドの好ましい態様としては、アデノ ウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞ェピトープペプチドが配列番号： 1〜6からなる 群力も選択される少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むペプチドである。
[0029] さらに、本発明のェピトープペプチドは、生理活性及び免疫活性を実質的に改変 せず、投与した場合に有害な活性を有するものでない限り、上記のペプチドの改変 体であってもよい。
即ち本発明の好ましい態様としては、配列番号： 1〜6のいずれかに記載のアミノ酸 配列において、 1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び Z又は付加された アミノ酸配列からなるペプチドであって、改変前の配列番号： 1〜6のいずれかに記載 のペプチドと同等の機能を有するペプチドを挙げることができる。
[0030] 上記「同等の機能」とは、例えば、（1)アデノウイルス特異的な細胞傷害性 T細胞を 誘導し得る機能、（2)ヒト主要組織適合性抗原 (HLA)-A24分子等、特に HLA-A*240 2、または HLA-Cw*0401分子もしくは Cw*0702との複合体を細胞表面に提示する細 胞を特異的に認識しうる T細胞レセプターを有する細胞傷害性 T細胞 (CTL)を誘導し 得る機能、等を言う。（上記（2)の機能を有するペプチドは、本明細書において、 HL A-A24等拘束性抗原ペプチドと表現する場合がある。 )
[0031] 改変されたペプチドが、上記の機能を有するか否かは、例えば、後述の実施例に 記載の方法、あるいは該方法を適宜改変した方法によって、評価することが可能であ る。
[0032] 本発明のペプチドは、天然に存在する状態から修飾されて!、な ヽもの、及び修飾さ れているものの双方を含む。修飾としては、ァセチル化、ァシル化、 ADP-リボシルイ匕 、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド 誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール の共有結合、架橋、環化、ジスルフイド結合の形成、メチル化、脱メチル化、共有架 橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、 y -カルボキシル ィ匕、グリコシル化、 GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル ィ匕、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノィル化、硫酸 ィ匕、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移 RNA媒介付加、ュビキチン 化等が含まれる。
[0033] また、本発明のペプチドは、 N末端又は C末端に付加的アミノ酸配列が介在するも のであってもよい。また、本発明のペプチドは、糖類、ポリエチレングリコール、脂質 等が付加された複合体、放射性同位元素等による誘導体、あるいは重合体等の形 態として用いることができる。また、本発明におけるアミノ酸には、所謂「アミノ酸アナ口 グ」が含まれる。該アミノ酸アナログとしては、例えば、種々のアミノ酸の N-ァシルイ匕 物、 0-ァシル化物、エステル化物、酸アミド化物、アルキル化物等が挙げられる。
[0034] また、本発明のペプチドと該 HLA-A24等の分子との複合体が、該複合体を細胞表 面に提示する細胞を特異的に認識しうる TCRを有する CTLによって認識されるもので ある限り、本発明のペプチドの N末端や遊離のァミノ基には、ホルミル基、ァセチル基 、 t-ブトキシカルボ-ル (t-Boc)基等が結合していてもよぐ本発明のペプチドの C末 端や遊離のカルボキシル基には、メチル基、ェチル基、 t-ブチル基、ベンジル基等 が結合していてもよい。
[0035] また、本発明のペプチド (例えば、 HLA-A24等拘束性抗原ペプチド）は、生体内へ の導入を容易にしうる各種修飾を施されたものであってもよ ヽ。生体内への導入を容 易にしうる各種修飾の例としては、 PT (Protein Transduction)ドメインが有名である。 HIV (human immunodeficiency virus)の PTドメインは、 Tatタンパク質の 49〜57番目の アミノ酸 (Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg ArgZ配列番号： 26)で構成されたぺプ チドで、このペプチド配列を目的とするタンパク質あるいはペプチド配列の前後、又 はいずれかに付加することで、容易に細胞内に導入できることが報告されている（Ryu J, Han K, Park J,し hoi SY., Enhanced uptake of a heterologous protein with an HIV -1 Tat protein transduction domains (PTD) at both termini., Mol Cells., 2003;16:38 5-391, Kim DT, Mitchell DJ, Brockstedt DG, Fong L, Nolan GP, Fathman CG, Engl eman EG, Rothbard JB., Introduction of soluble proteins into the MHC class I pathw ay by conjugation to an HIV tat peptide., J Immunol., 1997 59:16t»o- 1668)。
[0036] MHCクラス I分子を介して提示されるほとんどの抗原は、細胞質内のプロテアソーム により分解された後、 TAP (transporter in antigen processing)へと移送され、粗面小 胞体内において TAPに会合している MHCクラス I分子と /3 2-ミクログロブリンの複合体 と結合し、ゴルジ装置を経てェクソサイト一シスにより細胞表面へと運搬される。これら 一連の抗原提示経路にて作用するシャペロンである HSP (heart shock prtein) 70や H SP90、又は gp96と目的とするペプチドやタンパク質を融合させることで、効果的な抗 原提示がなされることが報告されており（Basu S, Binder RJ, Ramalingam T, Srivastav a PK., CD91 is a common receptor for heat shock proteins gp96, hsp90, hsp70, and calreticulin., Immunity., 2001;14:303-313)、本発明のペプチドに上記 PTドメインま たはシャペロンを融合させたタンパクは本発明の一態様を成す。
[0037] また、本発明のペプチドは、従来の各種のペプチド合成方法によって調製され得る 。例えば、固相ペプチド合成法等の有機化学的合成法、あるいは、ペプチドをコード する核酸を調製し、組換え DNA技術を用いて調製することも可能である。また、市販 の化学合成装置 (例えば、アプライドバイォシステムズ社のペプチド合成装置）による 合成も可能である。
[0038] 即ち本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により 製造することが可能であり、該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド 合成法が包含される。該ペプチド合成法は、より詳しくはアミノ酸配列の情報に基づ V、て、各アミノ酸を 1個ずつ逐次合成させて鎖を延長して 、くステップワイズェロンゲ ーシヨン法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントを カップリング反応させるフラグメント'コンデンセーシヨン法を包含し、本発明のぺプチ ドの合成は、いずれの方法を用いてもよい。
[0039] このようなペプチド合成法にて用いられる縮合法も、各種方法に従って行うことがで きる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、 DCC法、活性エステ ル法、酸化還元法、 DPPA (ジフヱ-ルホスホリルアジド）法、ウッドワード法等を例示 できる。
[0040] これら各種方法に利用できる溶媒もまた、一般的に使用されるものを適宜利用する ことができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（DMF)、ジメチルスルホキ シド（DMSO)、 へキサホスホロアミド、ジォキサン、テトラヒドロフラン（THF)、酢酸ェチ ル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。なお、上記ペプチド合成反応に 際して、反応に関与しないアミノ酸及びペプチドにおけるカルボキシル基は、一般に はエステル化により、例えばメチルエステル、ェチルエステル、第三級ブチルエステ ル等の低級アルキルエステル、例えばべンジルエステル、 P—メトキシベンジルエステ ル、 p—-トロべンジルエステルァラルキルエステル等として保護することができる。ま た、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えば Tyrの水酸基は、ァセチル基、ベンジル 基、ベンジルォキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずし も力かる保護は必須ではない。また、例えば、 Argのグァ-ジノ基は、ニトロ基、トシル 基、 2—メトキシベンゼンスルホ-ル基、メチシレンー2—スルホ-ル基、ベンジルォキ シカルボニル基、イソボル-ルォキシカルボ-ル基、ァダマンチルォキシカルボ-ル 基等の適当な保護基により保護することも可能である。
[0041] 上記のようにして得ることが可能な本発明のペプチドは、通常の方法に従って、例 えばイオン交換榭脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、ァフィユティー クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)、向流分配法等のペプチド化 学の分野で汎用されている方法に従って、適宜、精製を行うことができる。
[0042] 本発明のペプチドは、本発明のペプチドをコードする DNA核酸分子を合成し、適当 な発現ベクターへ導入した後、宿主細胞内において発現させる遺伝子工学的手法 によっても取得することができる。
[0043] 一例を示せば、まず配列番号： 1〜6のいずれかに記載されたアミノ酸配列をコード する核酸を合成する。該方法としては、リン酸トリエステル法ゃリン酸アミダイト法など の化学合成手段〔J. Am.Chem. Soc, 89, 4801 (1967) ;同 91, 3350 (1969) ; Science, 150, 178 (1968) ; Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981) ;同 24, 245 (1983)〕及びそれら の組合せ方法などが例示できる。より具体的には、 DNAの合成は、ホスホルアミダイト 法又はトリエステル法による化学合成により行うこともでき、市販されている自動ポリヌ クレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な 条件下で該鎖を共にアニーリングさせる力、又は適当なプライマー配列と共に DNAポ リメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物力 得る ことちでさる。 [0044] 本発明のペプチドには、上述のように、本発明者らによって同定されたェピトープ ペプチド (配列番号： 1〜6)と機能的に同等なペプチドが含まれる。
[0045] あるペプチドと機能的に同等なペプチドを調製するための、当業者によく知られた 方法としては、例えばペプチド中のアミノ酸配列に変異を導入する方法が挙げられる 。具体的には当業者であれば部位特異的変異誘発法 (Hashimoto-Gotoh, T. et al. ( 1995) Gene. 152, 271-275、 Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468—500、 Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456、 Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350—367、 Kunkel,TA(1985) Proc Natl A cad Sci USA. 82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763- 2766)などを 用いて、配列番号： 1〜6のいずれかに記載のアミノ酸配列に適宜変異を導入するこ とにより、該ペプチドと機能的に同等なペプチドを調製することができる。また、ぺプ チド中のアミノ酸の変異は自然に生じることもある。このように、人工的か自然に生じ たもの力を問わず、本発明者らにより同定されたェピトープペプチド (配列番号： 1〜 6)のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸配列が変異したアミノ酸配列を有 し、該ペプチドと機能的に同等なペプチドは、本発明のペプチドに含まれる。
[0046] 上述のようなアミノ酸の変更（改変）目的は、例えば、
1. HLAとの親和性を高める為の変更（Rosenberg SA, Yang JC, Schwartzentruber DJ , Hwu P, Marincola FM, Topalian SL, Restifo NP, Dudley ME, Schwarz SL, Spiess P J, Wunderlich JR, Parkhurst MR, Kawakami Y, Seipp CA, Einhorn JH, White DE.、 I mmunologic and therapeutic evaluation of a synthetic peptide vaccine for the treatm ent of patients with metastatic melanoma.、 Nat Med. 1998;4:321— 327、 Berzofsky JA, Ahlers JD, Belyakov IM.ゝ Strategies for designing and optimizing new generation va ccines.、 Nat Rev Immunol. 2001;1:209-219) ,
2. TCRの認識性を向上させるための変更（Fong L, Hou Y, Rivas A, Benike C, Yuen A, Fisher GA, Davis MM, Engleman EG., Altered peptide ligand vaccination with Fl t3 ligand expanded dendritic cells for tumor immunotherapy., Proc Natl Acad Sci U S A., 2001;98:8809-8814, Rivoltini L, Squarcina P, Loftus DJ, Castelli C, Tarsini P, Mazzocchi A, Rini F, Viggiano V, Belli F, Parmiani G., A superagonist variant of pe ptide MARTl/Melan A27- 35 elicits anti-melanoma CD8+ T cells with enhanced lun ctional characteristics: implication for more effective immunotherapy. , Cancer Res., 1999;59:301-306)、
3.血清中のペプチド分解酵素等による代謝を回避する為の変更 (Berzofsky JA, Ahl ers JD, Belyakov IM., Strategies for designing and optimizing new generation vaccin es.， Nat Rev Immunol, 2001;1:209-219, Parmiani G, Castelli C, Dalerba P, Mortari ni R, Rivoltini L, Marincola FM, Anichini A., Cancer immunotherapy with peptide— b ased vaccines: what have we achieved? Where are we going?, J Natl Cancer Inst., 2 002;94:805-818, Brinckerhoff LH, Kalashnikov VV, Thompson LW, Yamshchikov G V, Pierce RA, Galavotti HS, Engelhard VH, Slingluff CL Jr., Terminal modifications i nhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART- 1(27-35) peptide: implicati ons for peptide vaccines., Int J Cancer. 1999;83:32b-334)
等が挙げられる。
[0047] 上記変異体における、変異 (置換、挿入、欠失等)するアミノ酸数は、本発明のぺプ チドの有する機能が保持される限り制限はないが、通常 5アミノ酸以内であり、好まし くは 4アミノ酸以内であり、より好ましくは 3アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 1〜2ァ ミノ酸である。また、上記改変が、例えば、配列番号： 1〜6のいずれかに記載のぺプ チドの末端へのアミノ酸残基の付加である場合には、付加されるアミノ酸数は本発明 のペプチドの有する機能が保持される限り制限はないが、通常、 20アミノ酸以内であ り、好ましくは 10アミノ酸以内であり、より好ましくは 5アミノ酸以内であり、さらに好まし くは 3アミノ酸以内であり、最も好ましくは 1〜2アミノ酸である。
[0048] 変異するアミノ酸残基の種類としては、改変前のアミノ酸の性質が保存されている 他のアミノ酸 (改変前のアミノ酸と類似のアミノ酸）に変異されることが望ましい。例え ばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水 性アミノ酸 (R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 Aゝ V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有す るアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩 基含有側鎖を有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y 、 w)を挙げることができる (括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す)。
[0049] あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び Z又は他 のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドがその生物学 的機能（活性）を維持し得ることはすでに知られている（Mark, D. F. et al, Proc. Natl . Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Re search (1982) 10, 6487—6500、 Wang, A. et al., Science 224, 1431—1433、 Dalbadie— McFarland, G. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409—6413)。
[0050] 本発明のペプチドのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたペプチドに は、これらペプチドを含む融合ペプチドが含まれる。融合ペプチドは、本発明のぺプ チドと他のペプチドとが融合したものである。融合ペプチドを作製する方法は、本発 明のペプチド（例えば、配列番号： 1〜6に記載のペプチド）をコードするポリヌクレオ チドと他のペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結して これを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよぐ当業者に公知の手法を用 いることができる。本発明のペプチドとの融合に付される他のペプチドは、特に制限さ れないが、例えば、 j8 2-ミクログロブリンを挙げることができる。即ち、本発明のぺプチ ドと j8 2-ミクログロブリンとの融合ペプチドもまた、本発明に含まれる。
[0051] 本発明のペプチドとの融合に付される他のペプチドは、 CTLの誘導目的以外にも、 例えば、該ペプチドの単離'精製、あるいは応用研究等の種々の目的に応じて、適 宜選択することができる。例えば FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210)、 6個の His (ヒスチジン）残基からなる 6 X His、 10 X His、インフルエンザ凝 集素（HA)、ヒト c- mycの断片、 VSV- GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7- tag、 HSV- tag、 E-tag、 SV40T抗原の断片、 lck tag, a -tubulinの断片、 B-tag、 Protein Cの断片等の 公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のペプチドとの融合に付される 他のタンパク質としては、例えば、 GST (グルタチオン一 S トランスフェラーゼ）、 HA( インフルエンザ凝集素）、ィムノグロブリン定常領域、 /3 ガラクトシダーゼ、 MBP (マ ルトース結合タンパク質)等が挙げられる。市販されて 、るこれらペプチド又はべプチ ドをコードするポリヌクレオチドを本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドと融 合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ぺプ チドを調製することができる。
[0052] また、本発明のペプチドの融合体作製する場合、融合箇所に FactorXa,ェンテロキ ナーゼまたはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位ペプチド配列を挿入することも できる。このような場合、上記 GST、 MBP、あるいは FLAGタグのような精製用タグを付 加させたペプチド融合体として発現させ、精製した後、必要に応じてペプチド融合体 のうち、本発明の目的のペプチド以外の領域を、対応する FactorXa,ェンテロキナー ゼまたはトロンビンのようなプロテアーゼなどにより切断、除去することも可能であり、 有用である。
[0053] また、あるペプチドと機能的に同等なペプチドを調製する当業者によく知られた他 の方法としては、ハイブリダィゼーシヨン技術（SambrookJ et al.， Molecular Cloning 2 nd ed.， 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)を利用する方法が挙げら れる。即ち、当業者であれば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくは その一部をもとに、種々の生物由来（例えば、アデノウイルス由来）のポリヌクレオチド 試料、あるいは人工的に合成されたペプチドライブラリ一等から、これと相同性の高 いポリヌクレオチドを単離して、該ポリヌクレオチドから本発明のペプチドと機能的に 同等なペプチドを単離することも通常行 、うることである。
[0054] 本発明には、本発明の配列番号： 1〜6に記載のペプチドをコードするポリヌクレオ チドとハイブリダィズするポリヌクレオチドによってコードされるペプチドであって、配 列番号： 1〜6に記載のペプチドと機能的に同等なペプチドが含まれる。
[0055] 配列番号： 1〜6に記載のペプチドと機能的に同等なペプチドをコードするポリヌク レオチドを単離するためのノ、イブリダィゼーシヨンの条件は、当業者であれば適宜選 択することができる。ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば、低ストリンジェン トな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダィゼーシヨン後の洗 浄において、例えば 42°C、 0.1 X SSC, 0.1%SDSの条件であり、好ましくは 50°C、 0.1 X SSC, 0.1%SDSの条件である。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件としては、 高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば 65°C、 5 X SSC及び 0.1 %SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い 相同性を有する DNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダィゼー シヨンのストリンジエンシーに影響を及ぼす要素としては温度や塩濃度など複数の要 素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジ ンシーを実現することが可能である。
[0056] また、ハイブリダィゼーシヨンにかえて、遺伝子増幅技術 (PCR) (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley&Sons sectionり. 1-6.4)を用いて、本発明のペプチド（配列番号： 1〜6)をコードするポリヌクレオチド の一部を基にプライマーを設計し、本発明者らにより同定されたペプチドをコードす るポリヌクレオチドと相同性の高!、ポリヌクレオチド断片を単離し、該ポリヌクレオチド を基に本発明者らにより同定されたペプチドと機能的に同等なペプチドを取得するこ とも可能である。
[0057] 上述のハイブリダィゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離されるポリヌクレオ チドがコードする、配列番号： 1〜6に記載のペプチドと機能的に同等なペプチドは、 通常、該ペプチドとアミノ酸配列において、通常高い相同性を有する。本発明のぺプ チドには、配列番号： 1〜6に記載のペプチドと機能的に同等であり、かつ該ペプチド のアミノ酸配列と高い相同性を有するペプチドも含まれる。高い相同性とは、アミノ酸 レベルにおいて、通常、少なくとも 50%以上の同一性、好ましくは 75%以上の同一性 、さらに好ましくは 85%以上の同一性、さらに好ましくは 95%以上（例えば、 96%以上、 97%以上、 98%以上、 99%以上）の同一性を指す。ペプチドの相同性を決定するには、 文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-73 0)に記載のアルゴリズムに従えばよい。
[0058] アミノ酸配列の同一性は、例えば、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAST ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:587 3-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、 BLASTX と呼ばれるプログラムが開発されている (Altschul et al. J. Mol. Biol.215: 403-410, 19 90)。 BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータ一は例えば、 sco re = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には 、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法 は公知で &)る (nttp://www.ncbi. nlm.nih.gov.)。 [0059] 本発明のペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えペプチドとして、また 天然のペプチドとして調製することが可能である。組み換えペプチドであれば、例え ば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込 み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、 イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のペプチドに 対する抗体をカラムに固定したァフィユティークロマトグラフィーにかけることにより、ま たは、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可 能である。
[0060] 精製用タグ (例えばヒスチジンタグ)を融合させた組み換えペプチドとして宿主細胞
(例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた融合ぺプ チドは、市販の、融合したタグに対応した精製カラム (ヒスチジンタグの場合ニッケル カラム)を用いて精製することができる。
[0061] 天然のペプチドであれば、当業者に周知の方法、例えば本発明のペプチドを発現 して 、る組織や細胞の抽出物に対し、本発明のペプチドに結合する抗体が結合した ァフィユティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポ リクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよ 、。
本発明のペプチドをコードする上記核酸もしくはベクターもまた、本発明に含まれる
[0062] 本発明の核酸 (ポリヌクレオチド）は、本発明のペプチドをコードし得るものであれば いかなる形態でもよい。即ち、 mRNAから合成された cDNAである力、ゲノム DNAであ る力、化学合成 DNAであるかなどを問わない。また、本発明のペプチドをコードしうる 限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる
[0063] 本発明の核酸 (ポリヌクレオチド）は、当業者に公知の方法により取得することがで きる。例えば、市販の核酸合成装置を用いて、適宜作製することができる。作製した ポリヌクレオチドの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデォキシヌクレオチドチ イ ンターミネーシヨン法等により確認することができる。
[0064] 本発明のペプチドをコードする核酸は、例えば、遺伝子組換え技術を用いて、本発 明のペプチドを宿主内で産生させる為に重要である。この場合、宿主間でアミノ酸コ ドンの使用頻度（codon usage)が異なる為、産生させる宿主の codon usageに適合す るようアミノ酸のコドンを変更することが望ましい。本発明のペプチドをコードする核酸 は、ワクチンとしても利用可能で、むき出しの核酸として移送することもできるし、また は適切なウィルスもしくは細菌ベクターを用いて移送することもできる（Berzofsky JA, Ahlers JD, Janik J, Morris J, Oh b, Terabe M, Belyakov IM , Progress on new vacci ne strategies against chronic viral infections., J Clin Invest., 2004;114:450-462, Ber zofsky JA, Terabe M, Oh S, Belyakov IM, Ahlers JD, Janik JE, Morris JC, Progress on new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer., J Clin I nvest., 2004;113:1515-1525)。適切な細菌ベクターとしては、サルモネラ属亜種の細 菌ベクターを挙げることができる。適切なウィルスベクターとしては、レトロウイルスべク ター、アデノウイルスベクター、センダイウィルスベクター、レンチウィルスベクター、ヮ クシ-アベクタ一等を例示することができる。適切なワクシニアベクターの 1例は、改 変ワクシニア ·アンカラベクターである。
[0065] 本発明の核酸の好ましい態様としては、本発明のペプチドを発現し得るベクターを 例示することができる。該ベクターは、通常、プロモーターの下流に本発明の核酸が 機能的に連結された構造の DNA構築物を担持するベクターである。該ベクターとして は、通常、プラスミドもしくはウィルスベクター等が一般的である。
[0066] 当業者にお!ヽては、所望の DNAを有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術に よって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々の発現ベクターを利用 することができる。
[0067] 本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のポリヌクレオチドを保持したり、 本発明のペプチドを発現させるためにも有用である。本発明の核酸 (ポリヌクレオチド
)は、通常、適当なベクターへ担持 (挿入)され、宿主細胞へ導入される。該ベクター としては、挿入した DNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿 主に大腸菌を用いるのであれば、クロー-ング用ベクターとして pBluescriptベクター（ Stratagene社製)などが好まし 、が、巿販の種々のベクターを利用することができる。 本発明のペプチドを生産する目的としてベクターを用いる場合には、特に発現べクタ 一が有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個 体内でペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管 内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であれば pETベクター（Invit rogen社製）、培養細胞であれば pME18S- FL3ベクター（GenBank Accession No. ABO 09864)、生物個体であれば pME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988))などを 例示することができる。ベクターへの本発明の核酸の挿入は、常法により、例えば、 制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。
[0068] 上記宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞が用いられ る。ペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞 (例:ストレプトコッ カス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞（例：ドロソフィ ラ S2、スポドプテラ SF9)、動物細胞（例： CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK2 93、 Bowesメラノーマ細胞)及び植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベ クタ一導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法 (Current protoc ols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, bee tion 9.1-9.9)、リポフエクシヨン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法など の公知の方法で行うことが可能である。
[0069] 宿主細胞において発現させたペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または 細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のペプチドに組み込 むことができる。これらのシグナルは目的のペプチドに対して内因性であっても、異種 シグナルであってもよ！/、。
[0070] 上記製造方法におけるペプチドの回収は、本発明のペプチドが培地に分泌される 場合は、培地を回収する。本発明のペプチドが細胞内に産生される場合は、その細 胞をまず溶解し、その後にペプチドを回収する。
[0071] 組換え細胞培養物力 本発明のペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモ-ゥ ム又はエタノール沈殿、酸抽出、ァ-オン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホス ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィ-ティーク 口マトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィ 一を含めた公知の方法を用いることができる。 [0072] また、動物の生体内で本発明のポリヌクレオチド (核酸)を発現させる方法としては、 本発明の核酸を適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、リボソーム法 、カチォニックリボソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法など が挙げられる。これにより、免疫療法を行うことが可能である。用いられるベクターとし ては、例えば、レトロウイルスベクターなどが挙げられる力 これらに制限されない。ベ クタ一への本発明の DNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うこ とが可能である（Molecular Cloning ,5.61-5.63)。生体内への投与は、 ex vivo法であ っ飞 ¾、 in vivo法であってもよ ヽ。
[0073] 本発明のペプチド (アデノウイルス特異的 CTLェピトープペプチド）は、能動免疫療 法においてペプチドワクチンとして用いることができる。即ち、本発明の CTLェピトー プペプチドを含んでなるワクチンを健常人あるいは患者に投与し、アデノウイルスに 特異的な CTLを体内で増殖させ、疾患に対する予防あるいは治療に役立てることが できる。使用するェピトープペプチドは 1種のみの使用であっても、あるいはワクチン の使用目的に応じて 2種以上のペプチドを組み合わせ、混合して使用することもでき る。
[0074] 従って本発明は、本発明のペプチドもしくは本発明の核酸を有効成分として含む、 アデノウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチンを提供する。
[0075] なお、本発明の「ワクチン」は、「能動免疫療法剤」、「免疫治療剤」、「アデノウィル ス関連疾患治療剤」と表現することも可能である。また、本発明において「治療剤」は 、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
[0076] さらに、本発明の CTLェピトープペプチドが提示された抗原提示細胞は、能動免疫 療法にお 、てワクチンとして用いることができる。 CTLェピトープペプチドが提示され た抗原提示細胞とは、
1. 適当な培養液中で、抗原提示細胞と CTLェピトープペプチドを 30分から 1時間 混合したェピトープペプチドパルス抗原提示細胞、
2. CTLェピトープペプチドをコードする核酸を用い、遺伝子導入等で抗原提示細 胞に CTLェピトープペプチドを提示された細胞、
3. 人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞、等を意味する。 [0077] 抗原提示細胞とは、例えば、榭状細胞、 B細胞、マクロファージ、ある種の T細胞等 を示すが、該ペプチドが結合し得る HLAをその表面上に発現する細胞であって、 CT L刺激能を有するものを意味する。人工的に作製した抗原提示能を有する人工抗原 提示細胞とは、例えば脂質 2重膜やブラスティックあるいはラテックス等のビーズに HL Aと CTLェピトープペプチドと 13 2-ミクログロブリンとの 3者複合体を固定し、 CTLを刺 激し得る CD80、 CD83、 CD86等の共刺激分子を固定するか、もしくは、共刺激分子と 結合する T細胞側のリガンドである CD28に対してァゴニスティックに作用する抗体等 を固定することで作製可能である（Oelke M, Maus MV, Didiano D, June CH, Macken sen A, Schneck JP., Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA— Ig— coated artificial antigen-presenting cells., Nat Med. 2003;9:619-6 24, Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee H , Stevanovic S., Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expand ed on calibrated MHC/anti—CD28— coated microspheres., J Immunol. 2003 71:4974 -4978, Oosten LE, Blokland E, van Halteren AG, Curtsinger J, Mescher MF, Falke nburg JH, Mutis T, Goulmy E., Artificial antigen— presenting constructs efficiently st imulate minor histocompatibility antigen-specific cytotoxic T lymphocytes., Blood. 2 004; 104:224- 226)。
[0078] 従って本発明の好ましい態様としては、本発明のペプチドを HLAに提示した抗原 提示細胞を有効成分とするワクチンを提供する。
[0079] 本発明の核酸は、能動免疫療法において DNAワクチンや組換えウィルスベクター ワクチン等に用いる事ができる。この場合、 CTLェピトープペプチドの核酸配列は、 組換えワクチンや、組換えウィルスワクチンを産生させる宿主に適合した codon usage に変更する事力 S望 ¾し ヽ (Casimiro, D.R. et al.， Comparative Immunogenicity in Rhe sus Monkeys of DNA Plasmid, Recombinant Vaccinia Virus, and Replication— Defecti ve Adenovirus Vectors Expressing a Human Immunodeficiency Virus Type 1 gag Ge ne, J. Virol, 2003;77:6305-6313, Berzofsky JA, Ahlers JD, Janik J, Morris J, Oh S, Terabe M, Belyakov IM., Progress on new vaccine strategies against chronic viral in fections., J Clin Invest., 2004;114:450-462)。 [0080] 本発明のペプチド、又は本発明のペプチドが提示された抗原提示細胞を含んでな るワクチンは、当分野において公知の方法を用いて調製することができる。例えば、 力かるワクチンの一例としては、本発明のペプチドを有効成分として含有する注射剤 又は固形剤等の薬剤が挙げられる。
[0081] 本発明のペプチドは、アデノウイルスに対する受動免疫治療剤の調製に用いること 力 Sできる。下記のようにして得られたアデノウイルスに特異的な CTLはヒトアルブミン 含有 PBS等に懸濁させて、アデノウイルスに対する受動免疫療法剤とすることができ る。受動免疫療法剤に含まれるアデノウイルスに特異的な CTLは、以下のような調製 方法によって得ることができ、 CTLの純度を高める為に精製して用いる事も可能であ る。
以下に CTLの調製方法の具体例を記載するが、必ずしもこれらの方法に制限され ない。
[0082] (a) CTL調製方法 1
PBMCと、適当な濃度のアデノウイルス特異的 MHC テトラマー試薬を反応させる 。 MHC テトラマー試薬と結合したアデノウイルス特異的 CTLは標識色素により染色 されるので、セルソーター、顕微鏡などを用いて染色された CTLのみを単離する。こ のようにして単離されたアデノウイルスに特異的な CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL-2 等の T細胞刺激薬剤や、 X線照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させ た抗原提示細胞で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0083] (b) CTL調製方法 2
アデノウイルス特異的 MHC モノマー及び Z又は MHC テトラマー試薬を無菌プ レートなどに固相化し、 PBMCを固相化プレートで培養する。プレートに固相化された MHC モノマー及び Z又は MHC テトラマーに結合したアデノウイルス特異的 CTL を単離するためには、結合せずに浮遊している他の細胞を洗い流した後に、プレート 上に残った抗原特異的 CTLだけを新 、培地に懸濁する。このようにして単離された アデノウイルス特異的 CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL-2等の T細胞刺激薬剤や、 X線 照射あるいはマイトマイシン処理等で増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖 させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。 [0084] (c) CTL調製方法 3
アデノウイルス特異的 MHC—モノマー及び Z又は MHC—テトラマー試薬と、 CD80 、 CD83、 CD86等の共刺激分子か、もしくは、共刺激分子と結合する T細胞側のリガン ドである CD28に対してァゴ-スティックに作用する抗体等を無菌プレートなどに固相 化し、 PBMCを固相化プレートで培養する。 2日後に IL-2を培地に添カ卩し 5% CO恒温
2 槽にて 37°Cで 7〜10日培養する。培養した細胞を回収し新たな固相化プレート上で 培養を続ける。この操作を繰り返す事で受動免疫療法に必要な細胞数の CTLを確保 する。
[0085] (d) CTL調製方法 4
PBMCある 、は T細胞を本発明の CTLェピトープペプチドで直接刺激する力 該ぺ プチドをパルスした抗原提示細胞、遺伝子導入した抗原提示細胞、又は人工的に作 製した抗原提示能を有する人工抗原提示細胞で刺激する。刺激によって誘導された CTLを 5% CO恒温槽にて 37°Cで 7〜10日培養する。 CTLェピトープペプチドと IL-2、
2
又は抗原提示細胞と IL-2による刺激を週に 1度繰り返す事で受動免疫療法に必要な 細胞数の CTLを確保する。
[0086] なお、本発明のペプチド（アデノウイルス特異的 CTLェピトープペプチド）を使用し た MHC—モノマー及び MHC—テトラマーは、公知の方法（US Patent Number 5,635, 3り《3 , Inventors： J. D. Altman, M. G. McHeyzer- Williams, Mark M. Davis, Composit ions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells, French Application Number FR9911丄 33, Inventor： M. Bonneville, et al., M eans for detecting and for purifying CD8+ T— lymphocyte populations specific for pep tides presented in the HLA context)〖こより調製することができる。タンパク質発現用 の遺伝子組換え宿主力も精製した HLAクラス I分子、 j8 2—ミクログロブリン及び本発 明の CTLェピトープペプチドの複合体である、 MHC—モノマーをバッファー内で形成 させる。組換え HLAクラス I分子の C末端には予めピオチン結合部位を付加しておき、 MHC—モノマー形成後この部位にピオチンを付加する。市販の色素標識されたスト レプトアビジンとピオチン化 MHC—モノマーをモル比 1 : 4で混合することによって MH C—テトラマーを作製することができる。 [0087] また、 CTL調製方法にぉ 、て、特異的 CTLの割合が低 、場合は、随時以下の方法 を用いる事で CTLを高純度で回収する事が可能である。
[0088] (a) MHC—テトラマー試薬による精製
アデノウイルス特異的 MHC—テトラマー試薬と、 CTL調製方法にて誘導された CTL を反応させ、 MHC—テトラマーを標識している標識色素に対する抗体等を磁気標識 した 2次抗体を用いて分離する事が可能である。このような磁気標識した 2次抗体と、 磁気細胞分離装置は例えば、 Dynal社や Miltenyi Biotec GmbH社力も入手可能であ る。このようにして単離されたアデノウイルス特異的 CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL-2 等の T細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0089] (b)分泌されるサイト力インによる精製
アデノウイルス特異的 CTLが、放出するサイト力イン等を利用して、アデノウイルスに 特異的な CTLを精製する事ができる。例えば、 Miltenyi Biotec GmbH社力 入手可 能なキットを用いる事で、 CTLから放出されるサイト力インを細胞表面で特異抗体によ り補足し、サイト力イン特異的な標識抗体で染色し、続いて磁気標識した標識物質特 異的な抗体で染色後、磁気標識細胞分離装置を用いて精製する事も可能である。こ のようにして単離されたアデノウイルス特異的 CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL-2等の T 細胞刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0090] (c)細胞表面蛋白質特異的抗体を用いた精製
特異的 CTLの細胞表面では、特異的なペプチドの刺激により発現が増強する細胞 表面蛋白質（例えば CD107a、 CD107b、 CD63、 CD69など）が報告されている（Betts MR, Brenchley JM, Price DA, De Rosa SC, Douek DC, Roederer M, Koup RA., Sen sitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation., J Immunol Methods., 2003;281:65-78, Trim Die LA, bhanka r P, Patterson M, Daily JP, Lieberman J., Human immunodeficiency virus-specific ci rculating CD8 T lymphocytes have down-modulated CD3zeta and CD28, key signali ng molecules for T- cell activation., J Virol., 2000;74:7320-7330) 0このような蛋白質 の特異抗体を磁気標識する事で、磁気分離装置等を用いて CTLを精製する事が可 能である。また、このような特異抗体に対する抗 IgG抗体等を磁気標識する事でも同 様に CTLの精製が可能である。あるいは、これら抗体を培養用のブラスティックプレー トにコートし、このプレートを用いて刺激を加えた PBMCを培養し、プレートに結合しな 力つた細胞集団を洗 、流す事で特異的な CTLを精製することも可能である。このよう にして単離されたアデノウイルス特異的 CTLは、抗 CD3抗体、 PHA、 IL-2等の T細胞 刺激薬剤で刺激増殖させ、受動免疫療法に必要な細胞数を確保する。
[0091] 本発明は、上述のようにして取得 ·精製された細胞傷害性 T細胞 (CTL)を有効成分 として含む、アデノウイルスに対する受動免疫療法剤 (免疫治療剤)を提供する。 なお、本発明の「受動免疫療法剤」は、「免疫治療剤」、「アデノウイルス関連疾患治 療剤」、又は「CTL誘導剤」と表現することも可能である。
[0092] 本発明の受動免疫療法剤の好ましい態様としては、本発明のペプチド、もしくは該 ペプチドを HLAに提示した抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるァ デノウィルス特異的な細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、アデノウイルスに対 する受動免疫療法剤である。
[0093] また、別の態様としては、本発明のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複 合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応 させ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テト ラマーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得 られる細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、アデノウイルスに対する受動免疫療 法剤である。
[0094] 本発明の薬剤 (本発明のワクチンもしくは受動免疫療法剤等）は、生理学的に許容 される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは 非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル 剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注 射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤に は、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用 薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明 の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
[0095] 例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、及び滑 沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。
[0096] 例えば、本発明のペプチドが提示された抗原提示細胞は、製薬上許容され、該ぺ プチド又は該細胞の活性と相容性を有する賦形剤、例えば、水、食塩水、デキストロ ース、エタノール、グリセロール、 DMSO (dimethyl sulphoxide)、及びその他のアジュ バント等、又はこれらの組み合わせと混合して用いることができる。さらに、必要に応 じて、アルブミン、湿潤剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。崩壊剤としては、炭 酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般的に用いられる。結 合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドン が用いられる。滑沢剤としては、タルクゃステアリン酸マグネシウム等が公知である。
[0097] 本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコー ティングを施すことができる。コーティング剤には、ェチルセルロースやポリオキシェ チレングリコール等を用いることができる。
[0098] また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒 に溶解、あるいは分散させること〖こより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶 剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生 理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油ゃプ ロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存 剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩ィ匕ナトリウムゃブドウ糖等の公知の 等張化剤をカ卩えることができる。更に、塩ィ匕ベンザルコ-ゥムゃ塩酸プロ力インのよう な無痛化剤を添加することができる。
[0099] また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外 用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたもの と同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当 な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、ェチル アルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、 一般にベントナイト、ポリビュルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビ -ルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の保存剤 を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロー ス誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
[0100] また、本発明のペプチドは、中性又は塩の形態で処方することができ、例えば、薬 学上許容され得る塩としては、塩酸、リン酸などの無機塩、又は、酢酸、酒石酸など の有機酸が挙げられる。
[0101] 本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により 直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる 。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、ヘル ぺスゥイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、レトロウイノレスベタター、レンチウ ィルスべクタ一等が挙げられ、これらのウィルスベクターを用いることにより効率よく投 与することができる。
[0102] また、本発明の薬剤をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投 与することも可能である。例えば、本発明のペプチドもしくはベクターを保持させた小 胞体をリボフヱクシヨン法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例え ば静脈内、動脈内等に全身投与する。
[0103] 本発明の薬剤は、非経口投与及び経口投与により投与することができるが、該薬剤 がペプチドを主成分とする場合には、一般的に非経口投与が好ましい。非経口投与 としては経鼻投与や皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射等の注射剤、座薬等がある 。また、経口投与としては、スターチ、マン-トール、ラタトース、ステアリン酸マグネシ ゥム、セルロース等の賦形剤との混合物として調製することができる。
[0104] 本発明のワクチンは、治療上有効な量で投与する。投与される量は、治療対象、免 疫系に依存し、必要とする投与量は臨床医の判断により決定される。通常、適当な投 与量は、患者一人当たり、本発明のペプチド（ェピトープペプチド）では 1〜100 mg、 ェピトープペプチドパルス細胞では 106〜109個の含有量とする。また、投与間隔は、 対象、目的により設定することができる。
[0105] また本発明の薬剤によって予防もしくは治療効果が期待されるアデノウイルス関連 疾患としては、例えば、肺炎を代表とする呼吸器感染症、プール熱や流行性角結膜 炎を代表とする眼感染症、胃腸炎などの腸管感染症、出血性膀胱炎や尿道炎等の 泌尿生殖器感染症等を挙げることができる。 [0106] 本発明の薬剤 (ワクチン等）が接種可能な動物としては、免疫系を有し、かつアデノ ウィルスに感染し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくは、ヒトである。
[0107] 本発明の更なる一局面として、本発明のペプチドを利用したアデノウイルスに特異 的な細胞傷害性 T細胞の定量 (検出 ·測定)方法を提供する。
[0108] アデノウイルスに特異的な CTLが、ハイリスクの患者 (何らかの原因により免疫能が 低下した人、先天性免疫不全症患者、又は骨髄移植、造血幹細胞移植、臍帯血移 植、固形臓器移植を受けて拒絶予防のために免疫抑制剤の投与を受けて 、る患者 、慢性ウィルス感染症患者、エイズ患者、高齢者、幼小児、妊婦等)の末梢血に存在 するカゝ否かを知ることは、抗ウィルス剤や免疫抑制剤の適正な使用を含め、これらの 感染症管理の上で重要な情報である。アデノウイルスに特異的な CTLの定量は、例 えば、本発明のペプチド（CTLェピトープペプチド）を用いた以下の 3つの方法によつ て行うことができる力 必ずしもこれらの方法に制限されない。
[0109] (a)定量方法 1
本発明の CTLェピトープペプチドを使用して作製した MHC—テトラマー試薬を用 ヽ て、末梢血中のアデノウイルスに特異的な CTLを定量することができる。定量は、例 えば、以下のようにして実施することができる。末梢血あるいは PBMCを、適当な濃度 の MHC—テトラマー試薬と反応させる。該 MHC—テトラマー試薬と結合した CTLは標 識色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。 MHC—テトラマー試薬と反応させる時に、 MHC—テトラマー試薬と異なる色素で標 識された抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗 CD8抗体等を反応させる事で、アデノウイルス に特異的な CTLの T細胞サブセットも同時に判定できる。
[0110] (b)定量方法 2
PBMCを本発明の CTLェピトープペプチドで刺激することによって CTLが産生する I FN y nterferon gamma)、 TNF (tumor necrosis factor)、インタ ~~ロイ3 rン等のサイト 力イン及び Z又はケモカインを定量する方法である。以下に IFN yを例にとり具体的 に方法を示す。
[0111] b— 1 サイト力イン定量による方法 1 (細胞内 IFN y産生細胞定量）
PBMCを適当な培地におよそ 2 X 106/mLの細胞濃度で浮遊させ、本発明の CTLェ ピトープペプチドをカ卩える。さらに細胞内蛋白輸送阻止剤（例えば、 Brefeldin Aや Mo nensin等）をカ卩え、 5% CO恒温槽にて 37°Cで 5〜16時間培養する。培養後、 T細胞マ
2
一力一抗体 (抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗 CD8抗体)あるいは Zまたは、 MHC—テト ラマー試薬と反応させ、細胞を固定後、膜透過処理を行い、色素標識抗 IFN y抗体 を反応させる。フローサイトメーター等を用いて解析し、全細胞中、 T細胞中あるいは MHC—テトラマー陽性細胞中の IFN γ陽性細胞率を定量する。
[0112] b- 2 サイト力イン定量による方法 2 (エリスポットアツセィ）
抗 IFN y抗体を固相化した 96穴 MultiScreen- HAプレート（Millipore社)に PBMCをま く。ェピトープペプチドを各穴に入れ 37°Cの 5% CO恒温槽培養器にて 20時間培養す
2
る。翌日、プレートを洗浄し、抗 IFN y抗体、ペルォキシダーゼ標識抗 IgG抗体の順で 反応させる。さらにペルォキシダーゼの基質をカ卩え、発色により IFN yスポットを可視 化し、実体顕微鏡でカウントする。
[0113] b— 3 サイト力イン定量による方法 3 (培養上清中に分泌された IFN yを定量する方 法）
PBMCを適当な培地におよそ 2 X 106/mLの細胞濃度で浮遊させ、本発明の CTLェ ピトープペプチドをカ卩える。 5% CO恒温槽にて 37°Cで 24〜48時間培養する。培養後
2
、上清を回収し、その中に含まれる IFN y濃度を市販の ELISAキット (例えば MBL社 の HUMAN IFN gamma ELISA)を使用して定量する。
[0114] (c)定量方法 3
細胞表面蛋白質特異的抗体を用いて定量を行う。特異的 CTLは、特異的なぺプチ ドの刺激により細胞表面に発現が増強する細胞表面蛋白質 (例えば CD107a、 CD10 7b、 CD63、 CD69など）が報告されている。このような蛋白質を特異的に認識する標識 抗体と、ペプチド刺激した PBMC等を混合する事で、標識抗体と結合した CTLは標識 色素により染色されるので、フローサイトメーター、顕微鏡等を用いてカウントする。標 識抗体と反応させる時に、同時にあるいは、順番に、標識抗体と異なる色素で標識さ れた抗 CD3抗体、抗 CD4抗体、抗 CD8抗体等を反応させる事で、アデノウイルスに特 異的な CTLの T細胞サブセットも同時に判定できる。
[0115] 本発明の定量方法の好ましい態様として、具体的には、上述の（a)〜（c)の定量方 法を挙げることができる。
[0116] 従って本発明の定量方法の好ましい態様は、本発明のペプチドで末梢血を刺激し 、該ウィルスに特異的な細胞傷害性 T細胞を取得し、細胞傷害性 T細胞が産生する サイト力イン及び Z又はケモカイン及び Z又は細胞表面分子を測定することを特徴と する、アデノウイルスに特異的な細胞傷害性 τ細胞の定量方法に関する。
[0117] また、 MHC—テトラマー（またはモノマーもしくは多量体)試薬は、前述のように特異 的な CTLの分離精製特異的な CTLの定量だけでなぐ特異的な CTLの定量に用い る事ができ、別の態様としては、本発明のペプチドから MHC—テトラマー試薬を調製 し、 MHC—テトラマー試薬と末梢血とを反応させることを特徴とする、該末梢血中の アデノウイルスに特異的な細胞傷害性 T細胞の定量方法に関する。
上記方法にぉ 、ては、被検者力 予め取得 ·単離された末梢血試料を用いることが できる。
[0118] さらに本発明は、本発明のペプチドを用いて、細胞傷害性 T細胞を誘導することを 特徴とする、細胞傷害性 T細胞の誘導 (活性化)方法を提供する。
[0119] 本発明の誘導方法の好ましい態様としては、本発明のペプチド (例えば、 HLA-A24 等拘束性抗原ペプチド)と、末梢血単核球を血漿を含む培地中で接触させることによ り、アデノウイルス特異的な細胞傷害性 T細胞 (CTL)を誘導する方法に関する。
また、上記方法によって誘導されたアデノウイルス特異的 CTLを検出及び定量する 方法もまた本発明に含まれる。
また、上述の方法によって誘導されたアデノウイルス特異的な細胞傷害性 T細胞は
、アデノウイルスに対する受動免疫療法剤の成分となり得る。従って、上述の方法に よってアデノウイルス特異的な細胞傷害性 T細胞を誘導し、該 T細胞を取得すること によって、受動免疫療法剤を製造することが可能である。
[0120] 本発明は、本発明のアデノウイルス特異的な細胞傷害性 T細胞の誘導方法を用い た受動免疫療法剤の製造方法を提供する。
[0121] 本製造方法の好ましい態様としては、本発明のペプチドもしくは該ペプチドを HLA に提示した抗原提示細胞によって末梢血リンパ球を刺激してアデノウイルス特異的 な細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む方法である。 [0122] また好まし 、別の態様にぉ 、ては、本発明のペプチドから調製した主要組織適合 性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球 とを反応させ、該主要組織適合性抗原複合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合 体-テトラマーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離 して得られる細胞傷害性 T細胞を取得する工程を含む、アデノウイルスに対する受動 免疫療法剤の製造方法である。
上記製造方法には、上述の工程に加えて、必要に応じて、「取得される細胞傷害性 T細胞へ薬学的に許容される担体を混合する工程」を含んで 、てもよ 、。
[0123] さらに本発明のペプチドを用い作製した、 MHC—テトラマー試薬は、特異的な CTL の定量だけでなく細胞内サイト力イン産生細胞定量法や細胞表面蛋白質に対する特 異抗体と組み合わせることで、特異的 CTLの分ィ匕段階や機能性も同時に判定する事 が可能である。
[0124] さらに本発明は、本発明に記載のペプチド、該ペプチドをコードする核酸、該ぺプ チドを HLAに提示した抗原提示細胞、該ペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示し た抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるアデノウイルス特異的な細 胞傷害性 T細胞、または該ペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主 要組織適合性抗原複合体及び Z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーに細 胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞 傷害性 T細胞のいずれかを、個体 (例えば患者等)へ投与する工程を含む、アデノウ ィルスの感染を治療または予防する方法に関する。本発明の予防もしくは治療する 方法における個体とは、免疫系を有し、かつアデノウイルスに感染し得る生物であれ ば特に制限されないが、好ましくはヒトである。個体への投与については、上記本発 明の薬剤の投与にならって行うことができる。
[0125] さらに本発明は、本発明に記載のペプチド、該ペプチドをコードする核酸、該ぺプ チドを HLAに提示した抗原提示細胞、該ペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示し た抗原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるアデノウイルス特異的な細 胞傷害性 T細胞、または該ペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合体及び z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応させ、該主 要組織適合性抗原複合体及び z又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーに細 胞傷害性 τ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得られる細胞 傷害性 τ細胞の ヽずれかの、アデノウイルスの感染を治療または予防するためのワク チンまたはアデノウイルスに対する受動免疫療法剤 (免疫治療剤）の製造における使 用に関する。
[0126] なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0127] 以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され るものではない。特に断りがない限り、実験法は、下記の成書を参考に行った (免疫 実験操作法、右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之、南江堂)。
[0128] 〔実施例 1〕 アデノウイルス特異的 CTLェピトープ候補ペプチドの選択
アデノウイルスは、 51タイプの血清型が報告されており、 6種類のサブグループ (A 〜F)に分類される。移植後の感染症で特に問題となるサブグループ Bの 11型を特異 的に認識するェピトープペプチド、及びサブグループ Bだけでなくアデノウイルス全 般に特異的なェピトープペプチドを発明する為に、 51タイプの血清型の中で、最も相 同性の高い蛋白質であるへキソンに関して解析を行った。アデノウイルス粒子は直径 80〜90 nmのエンベロープをもたない正 20面体構造をしている。正 20面体の 20個の 三角形の面と稜を形づくるのがへキソンである。
[0129] 本発明のアデノウイルスのへキソンに特異的なェピトープ候補ペプチドの選択は、 日本人の約 60%が保持する HLA-A*24分子に対して実施した。具体的には、 HLA- A*24分子に対して結合モチーフを有する 8〜10個のアミノ酸よりなるェピトープ候補 ペプチドを検索し得る、インターネット上に公開されている複数のソフトウェアーに照 合して実施した。
[0130] その結果、アデノウイルス 11型へキソンのアミノ酸配列より HLA-A*24分子の結合モ チーフを有する 9個のアミノ酸よりなる CTLェピトープ候補ペプチドを 10種類選択しぺ プチドを合成した。以下に合成した CTLェピトープ候補ペプチドを示す。陽性コント口 ール用のペプチドとして EBVの BRLF1蛋白質の HLA-A*2402拘束性ェピトープぺプ チド（TYPVLEEMF (配列番号 : 11) )と HCMVの pp65蛋白質の HLA— A*2402拘束'性 ェピトープペプチド（QYDPVAALF (配列番号： 12) )を合成した。陰性コントロール用 のペプチドとしては、 HIVのエンベロープ (envelope)蛋白質の HLA-A*2402拘束性ぺ プチド（RYLRDQQLL (配列番号： 13) )を合成した（Kuzushima K, Hayashi N, Kudoh A, Akatsu a Y, Tsujimura K, Morishima Y, Tsurumi T. Tetramer— assisted identifica tion and characterization of epitopes recognized by HLA A*2402— restricted Epstein — Barr virus-specific CD8+ T cells. Blood. 2003; 101 :1460—1468)。
[0131] 合成したアデノウイルス 11型へキソンの HLA-A*24結合性ペプチド
Lys Tyr Thr Pro Ser Asn Val Thr Leu (KYT) (配列番号： 7)
Asp Tyr Leu Ser Ala Ala Asn Met Leu (DYL) (配列番号： 1)
Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala Leu (LYA) (配列番号： 2)
Val Tyr Ser Gly Ser He Pro Tyr Leu (VYS) (配列番号： 3)
Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe (TYF) (配列番号： 4)
Ser Tyr Gin Leu Leu Leu Asp Ser Leu (SYQ) (配列番号： 8)
Leu Tyr Ser Asn Val Ala Leu Tyr Leu (LYS) (配列番号： 5)
Asn Tyr Asn lie Gly Tyr Gin Gly Phe (NYN) (配列番号： 9)
Asn Tyr lie Gly Phe Arg Asp Asn Phe (NYI) (配列番号： 10)
Gly Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe (GYK) (配列番号： 6)
[0132] 表 1に合成したアデノウイルス 11型へキソンの HLA-A*24結合性ペプチドの特徴を 示す。合成したペプチドの N末端側から 3つのアミノ酸配列をペプチド名とした略号で 示す。左から、ペプチド名、アミノ酸配列、アデノウイルス 11型へキソンのアミノ酸配列 上の位置、アミノ酸数、解析に用いた BIMAS (BioInformatics & Molecular Analysis Se ction/ http://thr.cit.nih.gov/index.shtml)の HLA Peptide Binding Predictions (http: //thr.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)で算出されたスコアを示した。このスコアは、 HLA -A*24とペプチドとの親和性を予測する数値で、スコアが高い程、 HLAとペプチドが 安定した複合体を形成する可能性がある事を意味する。
[0133] [表 1] ペプチド名 アミノ酸
アミノ酸数 スコア11 配列 a
KYT KY PSNVTL 482-490 9 480
(配列番号: 7)
SYQ SYQLLLDSL 366-374 9 360
(配列番号: 8)
DYL DYLSAAN L 641-649 9 360
(配列番号： 1)
LYS LYSNVALYL 469-477 9 280
(配列番号: 5)
VYS VYSGSIPYL 696-704 9 200
(配列番号 :3)
LYA LYANSAHAL 889-897 9 200
(配列番号: 5)
NYN NYNIGYOGF 769-777 9 180
(配列番号 :9)
TYF TYFNLGNKF 9 158
(配列番号: 4)
NY I NYIGFRDNF 322-330 9 150
(配列番号： 10)
GYK GYKDRMYSF 782-790 9 120
(配列番号: 6) 寸
[0134] 上記表 1中の aおよび bの記号の説明を以下に示す。
a アンカーモチーフは、太字のアミノ酸で示されている。
b 算出された HLA-A*24力 解離する半分の時間は、コンピュータープログラム (Biol nformatics & Molecular Analysis ¾ection(BIMA¾ HLA Peptide Binding Predictions のウェブサイト)によって得られた。
[0135] 〔実施例 2〕 アデノウイルス特異的 CTLェピトープペプチドの同定- HLA型の選定 アデノウイルス特異的 CTLェピトープ候補ペプチドは、 HLA-A*24分子に対して結 合モチーフを有する。したがって、 HLA-A*24分子保持者由来の末梢血を用いてェ ピトープペプチドを同定する事が望ましい。最初に、供血者が HLA-A*24あるいは HL A-A*2分子保持者であるかどうかの判定を血清法にて実施した。具体的には、健康 成人末梢血 100 μ L、あるいは末梢血から分離した PBMC 2〜10X 105細胞に対して 抗 HLA- A*24抗体（クローン名 22E1、 MBL社）あるいは抗 HLA- A*2抗体（クローン名 BB7.2, MBL社）を 1 μ gあるいは 10 g/mLの濃度でそれぞれ加えた。それぞれの陰 性コントロールとしてアイソタイプ抗体を同様に加え、室温にて 15〜30分反応後、 FIT C (fluorescein isothiocyanate)標識抗マウス IgG抗体を反応させた。末梢血を用いた 場合は、溶血固定試薬（OptiLyse B、 Beckman Coulter社）の手法に従い、 PBMCの 場合は洗浄後、それぞれフローサイトメーター FACSCalibur (BECTON DICKINSON 社）にて反応性を検討した。図 1に HLA型の判定例を示す。以降の検討は、抗 HLA- A*24抗体に反応性を示した 10名の健康成人の PBMCを用いて行った。
[0136] 〔実施例 3〕 アデノウイルス特異的 CTLェピトープペプチドの同定-抗原提示細胞の 調製
(l)EBV感染 B細胞株の調製
定法 (Kuzushima K, Yamamoto M, Kimura H, Ando Y, Kudo T, Tsuge I, Monshima T. Establishment of antト Epstein— Barr virus (EBV) cellular immunity by adoptive tr ansfer of virus-specific cytotoxic T lymphocytes from an HLA— matched sibling to a patient with severe chronic active EBV infection. Clin Exp Immunol. 1996;103:192- 198)に従い、 EBV産生細胞株である B95-8細胞（JCRB Cell Bankより入手）の上清 (生 EBVウィルスを含む）と PBMCを混合培養し、 EBV感染 B細胞株 (Lymphoblastoid cell 1 ine、以下、 EBV感染 LCLと称する)を榭立した。約 2週間後に HLA分子の発現、 CD80 、 CD83と CD86の発現を確認した。
[0137] (2)CD40-B細胞の調製
ヒト CD40Lを遺伝子導入し、安定的に発現させた NIH3T3細胞（NIH-CD40L)と PBM Cを、 IL-4存在下で共培養した。 NIH- CD40Lは 96 Gyの X線照射により増殖阻害し、 3 〜4日毎に共培養を繰り返した (Kondo E, Topp MS, Kiem HP, Obata Y, Morishima Y , Kuzushima K, Tanimoto M, Harada M, Takahasni Γ, Akatsuka Y. Efficient generati on of antigen-specific cytotoxic T cells using retrovirally transduced CD40— activate d B cells. J Immunol. 2002;169:2164- 2171)。約 2週間後に HLA分子の発現、 CD80、 CD83と CD86の発現を確認した。
[0138] (3)榭状細胞の調製
PBMCをプラスティック製の培養皿で 37°C、 5% CO 恒温槽内にて 2時間培養し、培
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養皿に接着しな力つた細胞を軽く洗 、流した。これに GM-CSFと IL-4をカ卩ぇ 24時間培 養後、続けて TNF aと IL- 1 βおよび PGE2 (Prostaglandin E2)を加え、 24〜48時間培 養した。適当な培地等で軽く洗い流して回収できた細胞を榭状細胞とした (Dauer M, Obermaier B, Herten J, Haerleし, Pohi , Rothenfusser S, bchnurr M, Enares ¾, Ei gler A. Mature dendritic cells derived from human monocytes within 48 hours: a nov el strategy for dendritic cell differentiation from blood precursors. J Immunol. 2003;1 70:4069-4076)。 48時間後に HLA分子の発現、 CD80、 CD83と CD86の発現を確認し た。
〔実施例 4〕 アデノウイルス特異的 CTLェピトープペプチドの同定-アデノウイルス特 異的 CTLの誘導
(1)抗原提示細胞を利用した誘導
抗 HLA-A*24抗体に反応性を示した健康成人の PBMCより、前述の抗原提示細胞（ EBV感染 LCL、 CD40-B細胞、榭状細胞）を予め調製した。抗原提示細胞をパルス用 培地（0.1%人血清アルブミン Z55 M 2-メルカプトエタノール ZRPMI 1640)あるい は、 AIM-V medium (Invitrogen社)に浮遊させ、 10 μ g/mLの濃度で CTLェピトープ候 補ペプチドを加え、およそ 15分間隔で穏やかに混合させながら室温にて 30〜60分間 放置後、過剰量の洗浄液 (2%ゥシ胎児血清 (FCS) ZPBS)にて 3回洗浄し、 HLA分子 に未結合のペプチドを洗い流した。この操作を行う事で、抗原提示細胞上の HLA分 子に CTLェピトープ候補ペプチドが結合すると考えられる。この操作を行った抗原提 示細胞をペプチドパルス抗原提示細胞と呼ぶ。ペプチドパルス抗原提示細胞は、増 殖能を失わせる為に、致死量の X線照射、またはマイトマイシン C処理を行った。これ を同一人物力も分離した PBMC、あるいは CD8陽性または CD4陽性の T細胞と混和し 37°C、 5% CO恒温槽にて培養を行った。用いる培地は、 10%FCS含有 RPMI1640培
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地、あるいは 10%ヒト血清含有 RPMI1640培地、または、 1〜10%のヒト血漿含有 RPMI1 640培地等の検討を行った力 本方法においては、 10%ヒト血清含有 RPMI1640培地 で良好な結果が得られた。 T細胞の生存の維持と、増殖を補助する目的で IL-2 (シォ ノギ製薬社)を添加したが、そのタイミングは通常混合培養開始後 7〜10日目とする 報告が多ぐ本発明では IL-2は培養開始時、培養開始 2日後、 6日後等の検討を行 つたが培養開始 2日後に投与した場合に良好な結果が得られた為、培養開始 2日後 に 50 U/mLの濃度で加えた。培養開始 7日後に再度ペプチドパルス抗原提示細胞を 用いて刺激をカ卩えた。 1週間毎にペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激をカロえ 、 CTL誘導の評価は、およそ 2週間後と 4週間後に実施した。アデノウイルス特異的 C TLの誘導が確認できた場合は、更にペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激を 加え CTLラインを榭立した。
[0140] (2)抗原提示細胞を利用しな ヽ誘導法
本誘導法は、 PBMC培養液中にペプチドを投入して CTLを誘導する方法である。 P BMC中に存在する抗原提示細胞、例えば、榭状細胞、 B細胞、マクロファージ、ある 種の T細胞にペプチドが提示され、 PBMCに含まれる CTL前駆細胞が刺激を受け増 殖すると考えられる。前述の抗原提示細胞を利用した誘導法と異なり、前もって抗原 提示細胞を調製する必要が無 、点で区別され、簡便に実施できる事が利点である。
[0141] 抗 HLA-A*24抗体に反応性を示した健康成人より採血した末梢血を 3,000 rpmで 5 〜10分間遠心処理し、上清の血漿部分を回収した。血漿部分以外は従来法に従い PBMCを分離した。誘導に用いる培地に数 %の血漿をカ卩える事が特徴である。本発明 では 5%の血漿を加えた場合に良好な結果が得られた。培地は一般に細胞培養に 用いる培地に適切な添加物と抗生物質を加えた。本発明に用いた CTL誘導培地は 、 RPMI1640 Hepes modify(Sigam社)に 2-メルカプトエタノール、 L-グルタミン、抗生物 質としてストレプトマイシンとペニシリンをカ卩えた培地を使用した。これ以外にインスリ ン、トランスフェリン、亜セレン酸、ピルビン酸、人血清アルブミン、非必須アミノ酸溶 液等をカ卩える事もできる。 PBMC 1〜3 106個を培地1〜2.5 mLに浮遊させた。これ に 1〜20 /^/½しの濃度で候補ペプチドをカ卩えた。ペプチドの濃度は、ペプチドの溶 解度に応じて変更できる。本発明では 10 g/mLにて実施した。 2日後に 20〜100 U/ mLの最終濃度で IL-2の添加を行った。 PBMCとペプチドの混合培養は、炭酸ガス交 換可能な丸底の培養皿を用いる事が望ましぐ本発明においては、ポリプロピレン製 14 mLの丸底チューブ（BECTON DIKINSON社）または、 96穴 U底細胞培養用マイ クロテストプレート（BECTON DIKINSON社）を用いた。アデノウイルス特異的 CTLの 確認は、培養 2週間および 4週間後を目処に実施した。培養 2週間後を目処に、再度 10 g/mLのペプチドで刺激した。アデノウイルス特異的 CTLの誘導が確認できた場 合は、ペプチドパルス抗原提示細胞を用いて刺激を加え CTLラインを榭立した。
[0142] 〔実施例 5〕 アデノウイルス特異的 CTLェピトープペプチドの同定-アデノウイルス特 異的 CTLの確認 前述の方法で培養した細胞集団にアデノウイルス特異的な CTLが存在するかどう かの検討は、細胞内 IFN y産生細胞定量法、 MHC—テトラマー法、エリスポットアツ セィ、膜表面蛋白質の発現検討により実施した。
[0143] 1.細胞内 IFN y産生細胞定量法による特異的 CTL誘導の確認
前述の方法で誘導した細胞集団の約 1/10〜全量を 96穴 U底細胞培養用マイクロテ ストプレートに移し、誘導に用いたペプチドを最終 0.01〜0.05 g/mLの濃度でカロえ た。さらに細胞内蛋白輸送阻止剤（例えば、 Brefeldin Aや Monensin等）をカ卩え、 5% C 0恒温槽にて 37°Cで 5〜16時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、 PE (phycoerythri
2
n)標識 MHC—テトラマー試薬と PC5 (phycoerythrin-Cy5)標識 CD8抗体（Beckman C oulter社）をカ卩え、室温にて 15〜30分放置した。洗浄後、 4%ホルムアルデヒドにて、 4 。C、 15分固定後、過剰量の洗浄液にて洗った。 0.1%サポニンにて膜透過処理後、 FI TC標識抗 IFN y抗体（Beckman Coulter社）をカ卩え、室温にて 15〜30分反応させた。 洗浄後、フローサイトメーターを用いて、 T細胞中の IFN y陽性細胞率あるいは MHC —テトラマー試薬陽性細胞中の IFN γ陽性細胞率を定量した。
[0144] 図 2に既知陽性コントロールペプチドを用いて、抗原提示細胞を利用しな!、誘導法 にて特異的 CTLを誘導し、細胞内 IFN y産生細胞定量法にて検討した結果を示す。 Donor ID *24- 2の PBMCを EBV BRLF1 (a, b)または CMV pp65 (c, d)の HLA- A*240 2拘束性ェピトープペプチドで 13日間刺激後、陰性コントロール (HIV)ペプチド (a, c) と、刺激に用いたそれぞれのペプチド (b, d)で Monensin存在下 14時間刺激した。これ を、 PE標識 MHC—テトラマー試薬 (MBL社）、 PC5標識 CD8抗体、 FITC標識 IFN y抗 体で 3重染色しフローサイトメーターを用いて解析した結果を示す。ドットプロット展開 図中の数字は、四分割した領域に存在する細胞が全生細胞に占める割合 (％)を示 す。四分割した領域は今後、 UL (左上)、 UR (右上）、 LL (左下）、 LR (右下）と表記す る。 X軸に CD8、 Y軸に INF yに対する蛍光強度を logスケールで示したドットプロット展 開図（左列）では、 EBV BRLF1と CMV pp65はそれぞれの特異的ペプチド（b, d)で再 刺激された場合にのみ URに IFN y陽性 CD8陽性細胞が出現し、 HIVペプチドを加え た場合 (a, c)は殆ど出現しない。しかしながら HIVあるいは陽性コントロールペプチド をカロえたどちらの細胞集団にも、 EBV BRLF1や CMV pp65特異的 CTLが存在してい る事は、 X軸に CD8、 Y軸に MHC—テトラマー試薬に対する蛍光強度を logスケール で示したドットプロット展開図（中央列）で URに CD8陽性 MHC—テトラマー試薬陽性 細胞集団を見れば明らかである。すなわち、 HIVペプチドをカ卩えた EBV BRLF1では 1 3.0%の、 CMV pp65では 28.8%の特異的 CTLが存在する力 特異的なペプチド刺激 が加えられない限りこれらの CTLは IFN yを産生しない事が明らかになった。更に、 X 軸に IFN y、 Y軸に MHC—テトラマー試薬に対する蛍光強度を logスケールで示した ドットプロット展開図（右列）では、 HIVペプチドをカ卩えた場合 (a, c)、 MHC—テトラマ 一試薬陽性の細胞集団（ULと UR)の殆どは IFN γを産生せず ULに存在して ヽるが、 特異的ペプチド (b, d)の刺激により、その半分以上の細胞が URに移動し、 IFN yを 産生した。
[0145] この結果より、 CTLェピトープペプチドを加えて培養した PBMC中には、再刺激によ り IFN yを産生する細胞が誘導され、この細胞は MHC—テトラマー試薬で染色される 事力も特異的な CTLであることが明らかになった。すなわち特異的な CTLが誘導され ている力否かは、細胞内 IFN y産生細胞定量法にて判断できると考えられた。同様 にアデノウイルス特異的 CTLェピトープ候補ペプチドを用いて特異的な CTLが誘導 されるカゝ否かの検討を 10名の健康成人 PBMCを用いて実施した。図 3a-dおよび図 3e -hに代表的な 2名（Donor ID*24-8および *24-12)の細胞内 IFN y産生細胞を定量し た結果を示す。
[0146] 陽性コントロールの EBV BRLF1では、多量の CD8陽性 IFN γ陽性（産生）細胞（*24 -8では 24.9%、 *24-12では 9.57%)が URに出現する。しかし陰性コントロールの HIVぺ プチドを再刺激で加えた場合は、殆ど URに出現しない（*24-8では 0.62%、 *24_12で は 0.18%)。このように HIVペプチドを加えた場合の CD8陽性 IFN y陽性細胞（UR)とァ デノウィルス特異的 CTLェピトープ候補ペプチドで再刺激した場合の CD8陽性 IFN y 陽性細胞（UR)の割合を比較した結果、 Donor ID *24-8 (図 3a-d)では、 VYS、 LYA、 TYFと GYKで特異的な CTLの誘導が確認された。 LYAのように、 HIVペプチドを加え た場合と比較して余り差が無くても、 LYAペプチドを再刺激に用いた場合に蛍光強度 の強い IFN y産生細胞が URにドットして確認されたため、特異的 CTLが誘導されたと 考えられた。同様に Donor ID *24-12 (図 3e-h)では、 DYLと LYSで特異的 CTLの誘 導が確認された。
[0147] 2.エリスポットアツセィによる CTLの確認
エリスポットアツセィは市販のキット（例えば MABTECH社等）を購入し、その能書に 従い実施する事ができる。また以下のように実施する事もできる。 96穴 MultiScreen-H Aプレート (Millipore社)を抗 IFN yモノクローナル抗体（R&D Systems社)でー晚、 4°C にてコーティングした。各穴を PBSで洗浄後、標的細胞を各穴にまいた。標的細胞は HLA-A*24分子を細胞表面に発現して 、る細胞であれば使用する事ができ、例えば 174CEM.T2細胞に HLA-A*24分子の遺伝子を導入した培養細胞 T2-A24を使用す る事ができる。また HLA-A*24分子を細胞表面に発現して 、る EBV感染 LCLも標的 細胞として用いる事ができる。これら標的細胞と、アデノウイルス特異的な CTLェピト ープ候補ペプチド、あるいは陰性コントロール (HIV)ペプチドを各穴に入れて、 30分 室温で静置した後、適当な数の CTLを添カ卩し、 37°C、 5% CO培養器にて 20時間培養
2
した。ェピトープ候補ペプチドに反応した CTLはこの培養期間に IFN yを分泌し、こ の IFN yはプレートにコーティングした抗 Ν γモノクローナル抗体と結合した。培養 後、 0.05% Tween-20添加 PBSでプレートを洗浄し、抗 IFN γポリクローナル抗体 (Genz yme社)、ペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ IgGャギ血清の順で各々 90分ずつ室温にて 反応させた。さらにペルォキシダーゼの基質である 3- amino- 9- ethylcarbasole (Sigma 社)と 0.015%の H 0を含む 0.1M sodium acetate buffer (pH 5.0)を各穴に入れ、室温
2 2
で 40分反応させ、 IFN yスポットを可視化した。スポットは実体顕微鏡でカウントした。
[0148] 図 4は、エリスポットアツセィにより特異的 CTLを検出した例を示す図である。アデノ ウィルス特異的な CTLェピトープ候補ペプチド LYA、 VYS、 TYFと LYSで陰性コント口 ール (HIV)ペプチドと比較して IFN γスポットが観察された。これを実体顕微鏡下で力 ゥントし、グラフィ匕した。
[0149] 3.膜表面蛋白質の発現によるによる CTLの確認
CTLは、その特異的刺激により細胞表面蛋白質 (例えば CD107a、 CD107b、 CD63 、 CD69など)の発現が増強する事が報告されている。前述の方法で誘導した細胞集 団の約 1/10〜全量を 96穴 U底細胞培養用マイクロテストプレートに移し、誘導に用い たペプチドを最終 0.01〜0.05 μ g/mLの濃度で加え、 5% CO恒温槽にて 37°Cで 5〜1 6時間培養した。培養後、細胞を洗浄し、各種標識された細胞表面蛋白質抗体等と M HC—テトラマー試薬あるいは CD8抗体をカ卩ぇ穏やかに攪拌後、室温にて 15〜30分 間放置した。洗浄後、フローサイトメーターを用いて、 CD8陽性細胞あるいは MHC— テトラマー陽性細胞中の各種膜表面蛋白質発現細胞数を検討した。
[0150] サイト力インの定量法を用いたェピトープ候補ペプチドの評価結果を表 2に示す。
表中の「〇」は候補ペプチドを用いて、特異的 CTLが誘導できたことを意味し、「X」 は特異的 CTLを誘導できな力つた事を意味する。 10名の HLA-A*24分子保持者由 来の PBMCに対して 10種類のペプチドを用いて検討した結果、 6種類のェピトープ候 補ペプチド DYL、 VYS、 LYA、 TYF、 LYSと GYKにおいて、ペプチド特異的なサイト力 インの産生が確認された。従ってこれら 6種類のェピトープ候補ペプチドは、アデノウ ィルス特異的な CTLェピトープペプチドである。アデノウイルス特異的な CTLェピトー プペプチドは HLA-A*24結合モチーフを有する為、 日本人の 60%以上の人が有する HLA-A*2402拘束性のェピトープペプチドである可能性が高!、。これらの結果を元に 、 5種類のェピトープペプチドを用いて MHC—テトラマー試薬を合成し、その有用性 に関する検討を実施した。
[0151] [表 2]
RV アデノウイルス 11型へキソンェピトープ候ネ甫ペプチド
Donor ID BRLF1 KYT DYL VYS LYA TYF SYQ LYS NYN NYI GY
★24-1 o X o X X X X X X X X
*24 -2 〇 X O 〇 X O X X X X X
★24 - 3 o X X X 〇 X X X X X X
*24 - 5 X X X X X X X X X X X
〇 X X 〇 O O X X X X 〇
*24 - 10 〇 X O X X X X X X X X
♦24 - 11 〇 X X X X X X X X X X
★24 - 12 〇 X 〇 X X X X o X X X 24 - 13 o X X X X X X 〇 X X X
*24 - 14 〇 X X X X X X X X X X
〔実施例 6〕 アデノウイルス特異的 MHC—テトラマー試薬を用いた検討
[MHC—テトラマー試薬の合成]
本発明者らの所属する MBL社は、 MHC—テトラマー試薬に関する特許 (US Patent No. 5,635, 363と French Application No. FR9911133および、 U.S. Patent Numbers. 5, 723,584; 5,874,239; 5,932,433; 6,265,552.)を有する Beckman Coulter社より、日本 国内における独占的な特許使用許諾権を得ている。これら特許に基づきアデノウイ ルス特異的な CTLェピトープペプチドと HLA-A*2402分子を用いて PE標識 MHC—テ トラマー試薬を作製した。本発明で作製した MHC—テトラマー試薬は例えば、 TYF- Tetと略号で示すが、これは、 HLA-A*2402分子とペプチド TYF (TYFNLGNKFZ配 列番号: 4)と j8 2—ミクログロブリンの 3者複合体を用いて合成されたものを示す。
[0153] [MHC—テトラマー試薬を用いた定量法]
本発明の CTLェピトープペプチドを使用して作製した MHC—テトラマー試薬を用 ヽ て、末梢血、末梢血から分離した PBMC、 CTLェピトープペプチドを使用して誘導し た CTLラインを試料として、アデノウイルス特異的な CTLの定量を行った。以下に PE 標識 MHC—テトラマー試薬を用いた場合を例に実施例を示す。用いるフローサイトメ 一ターの機種に合わせ標識色素は適切な組合せで用いれば良ぐ下記に限定され る物ではない。
[0154] 〈末梢血の場合〉
採血した末梢血 200 μ Lに対して、 10 μ Lの PE標識 MHC—テトラマー試薬と、 20 μ L の FITC標識 T細胞表面抗体（例えば CD8, CD4, CD3)等をカ卩えた。さらに、混入した 赤血球による非特異的な蛍光を除外するために、 PC5等で標識された CD45抗体を 加えても良い。穏やかに混合し室温にて 30分間放置した。 OptiLyse Bを加え能書に 従い溶血固定処理を行った。 2 mLの PBSを加え攪拌後、 400 x gで 5分間遠心分離し た。上澄みを吸引廃棄後、細胞を 500 Lの PBSに再懸濁し、 24時間以内にフローサ イトメーターにて解析した。
[0155] く PBMCまたは CTLェピトープペプチドを使用して誘導した CTLラインの場合〉
適量の PBMC (105〜106個）または、 CTLェピトープペプチドを使用して誘導した適 量の CTLラインに対して 10 μ Lの PE標識 MHC—テトラマー試薬と、 20 μ Lの FITC標 識 T細胞表面抗体 (例えば CD8, CD4, CD3)等をカ卩えた。さらに、混入した赤血球に よる非特異的な蛍光を除外するために、 PC5等で標識された CD45抗体を加えても良 い。穏やかに混合し室温にて 30分放置した。 3 mLの PBSをカ卩ぇ攪拌後、 400 x gで 5 分間遠心分離した。上澄みを吸引廃棄後、細胞を 500 /z Lの PBSに再懸濁した。 CTL ラインの場合は、死細胞による非特異的な蛍光を除外するために、 7-AAD viability Dye (死細胞検出試薬、 MBL社)をカ卩えてもよい。 24時間以内にフローサイトメーター にて解析した。
[0156] 図 5にペプチドにて誘導した CTLラインを作製した 5種類の MHC—テトラマー試薬 を用いて染色した結果を示す。 X軸に CD8、 Y軸に MHC—テトラマー試薬に対する蛍 光強度を logスケールで解析したドットプロット展開図で示す。
[0157] (1) HLA-A*2402 TYFNLGNKF (配列番号： 4) テトラマー試薬（TYF- Tet)の反応 性について
TYF- Tetは、 Donor ID*24-2と *24-8で明らかな CD8陽性 TYF- Tet陽性の細胞集団 力 ¾Rに検出された。この事は、 TYFが HLA-A*2402拘束性を示すアデノウイルスへ キソン特異的な CTLェピトープペプチドである事を証明している。
[0158] (2) HLA-A*2402 VYSGSIPYL (配列番号： 3) テトラマー試薬 (VYS- Tet)の反応性 について
VYS- Tetは、 Donor ID*24- 2と *24- 8で明らかな CD8陽性 VYS- Tet陽性の細胞集団 力 ¾Rに検出された。この事は、 VYSが HLA-A*2402拘束性を示すアデノウイルスへ キソン特異的な CTLェピトープペプチドである事を証明して!/、る。また VYS-Tetでは U Lに CD8陰性 VYS- Tet陽性の細胞集団が Donor ID *24- 1、 *24- 3、 *24- 11、 *24- 12、 *24-14で検出された。これは、 VYSが CD8陽性の CTLだけでなぐ CD8陰性の CTLも 誘導する事が可能なェピトープペプチドである事を示している。
[0159] (3) HLA-A*2402 LYANSAHAL (配列番号： 2) テトラマー試薬（LYA- Tet)の反応 性について
LYA-Tetでは、 ULに CD8陰性テトラマー試薬陽性の細胞集団が検出された。この 事は、 CD8陰性 LYA-Tet陽性の CTLが存在する事を示唆しており、更に詳細な検討 結果を図 6に示す。 Donor ID*24-14の PBMCを 24日間 LYAにて刺激後、 LYA-Tetお よび CD4、 CD3、 CD8にて染色した。また陰性コントロールとして Negativeテトラマー試 薬 (MBL社)と反応性を比較した。その結果、 CD4陽性 LYA-Tet陽性細胞が 0.09%、 CD8陽性 LYA- Tet陽性細胞が 0.18%存在し、かつ CD3陽性細胞 LYA- Tet陽性細胞 の比率（1.13%)が最も高い事が判明した。従って、 CD4陰性 CD8陰性 CD3陽性の H LAクラス I拘束性の CTLが存在し、アデノウイルス感染細胞の排除に関与して 、る可 能性が示された。
(4) HLA-A*2402 LYSNVALYL (配列番号： 5)テトラマー試薬（LYS- Tet)と HLA- A* 2402 DYLSAANML (配列番号： 1)テトラマー試薬（DYL-Tet)の反応性につ!、て
LYSでは、表 2に示した通り、検討した 10名中 2名で、ペプチド特異的な IFN yの産 生が確認され、図 3e-hに示した通り Donor ID *24-12の1^3では2.95%もの0:^ 産 生細胞が存在して ヽたにも関わらず、相応の LYS-Tet陽性の細胞像は得られなかつ た。また DYLでも、表 2に示した通り、検討した 10名中 4名で、ペプチド特異的な IFN γの産生が確認され、図 3e-hに示した通り、 DYLでも 0.49%の IFN y産生細胞存在 していたにも関わらず、相応の DYL-Tet陽性の細胞像は得られなかった。この事は、 LYSと DYLが HLA-A*2402拘束性を受けず、別の HLA分子の拘束性を受けている事 を強く示唆している。 LYSの場合、 Donor ID*24-12と *24-13の 2名の HLAジエノタイプ を解析し、その 2名に HLA-A*24以外で共通の HLAを検索する事で HLA拘束性は明 らかにできると考えられる。 DYLの場合は、 Donor ID*24-1、 *24-2、 *24-10と *24-12 の 4名の HLAジエノタイプを解析し、その 4名に HLA-A*24以外で共通の HLAを検索 する事で HLA拘束性は明らかにできると考えられる。最近報告された論文では、 HC MVの pp65蛋白質の HLA-A*2402拘束性のェピトープペプチドである QYDPVAALF ( 配列番号： 12、アミノ酸番号 341-349)は同時に HLA_Cw*0401の拘束性を受ける事 力報告 れた (Kondo E, Akatsuka Y, Kuzushima K, Tsujimura K, Asakura S, Tajima K, Kagami Y, Kodera Y, Tanimoto M, Morishima Y, Takahashi T. Identification of n ovel CTL epitopes of CMV— pp65 presented by a variety of HLA alleles. Blood. 200 4;103:630- 638.)。 HLA- A*24拘束性ペプチドは、 N末端より 2番目の位置に Tyr、 Phe 、 Met又は Trpのいずれかが配置され、 9あるいは 10番目の位置に Leu、 Ile、 Trp又は P heのいずれかが配置されたペプチドである。 HLA-Cw*0401拘束性ペプチドは、 N末 端より 2番目の位置に Tyr、 Phe又は Proのいずれかが配置され、 9あるいは 10番目の 位置に Leu又は Pheのいずれかが配置されたペプチドであり、両者は良く似ている。 実際 BIMASにて算出されたスコアは、 LYSは A*24の場合は 280で、 Cw*0401で 200で あった。また同様に DYLは A*24の場合は 360で、 Cw*0401で 220であった。 LYSと DYL に関して日本人で頻度の高い HLA-A、 Bおよび Cに関して同様の検索を実施したが 、このような高いスコアを示す HLAは HLA-Cw*0401以外には存在しなかった。これら のことから、 LYS、および DYLの HLA拘束性に関して HLA-Cw*0401の可能性が示唆 された。
[0161] 〔実施例 7〕 MHC—テトラマー試薬による健康成人末梢血中のアデノウイルス特異 的 CTLの検出
何らかの原因により免疫能が低下した人、先天性免疫不全症患者、または骨髄移 植、造血幹細胞移植、臍帯血移植、固形臓器移植を受けて拒絶予防のために免疫 抑制剤の投与を受けている患者、慢性ウィルス感染症患者、エイズ患者、高齢者、 幼小児、妊婦等のハイリスクの患者、または移植ドナーの末梢血中にアデノウイルス 特異的 CTLが存在するカゝ否かを知ることは、抗ウィルス剤や免疫抑制剤の適正な使 用を含めた感染症管理の上で重要である。アデノウイルス特異的 MHC—テトラマー 試薬を用いれば、採血から 1時間程度でアデノウイルス特異的 CTLの存在を判定で きる。
[0162] そこで本発明者らは、健康成人末梢血を用いてアデノウイルス特異的 CTLが検出 できるか検討した。その結果を図 7-aに示す。 Donor ID*24-8の末梢血を用いて 4種 類のアデノウイルス特異的 MHC—テトラマー試薬と EBV BRLF1および CMV pp65 M HC—テトラマー試薬 (MBL社）にて染色した。 X軸に CD8、 Y軸に INF yに対する蛍光 強度を logスケールで解析したドットプロット展開図にて示した。ドットプロット展開図中 の数値は、 CD8陽性 MHC—テトラマー試薬陽性細胞が生細胞中に占める割合を陽 性率 (％)として示した。
[0163] その結果、採血直後（day 0)において CD8陽性 MHC—テトラマー試薬陽性の細胞 集団が明確に検出されたのは、 EBV BRLF1 0JR: 0.03%)のみであった。他 9名でも アデノウイルス特異的 MHC—テトラマー試薬を用いて明確な陽性細胞集団は得られ なかった。これは、用いた末梢血がいずれも健康成人で、アデノウイルスに感染ある いはアデノウイルス感染症を発症して 、る可能性が低かった事が原因として挙げられ る。
[0164] それに対して EBVは成人の 90%以上が感染しており、表 2に示したように、本発明 で検討した 10名中 9名で EBV BRLF1特異的 CTLの誘導に成功した。従って、アデノ ウィルスに感染している事が明らかな場合や、感染の可能性が高い場合には容易に day 0でも検出できる可能性は高い。続けて、 PBMCをそれぞれのェピトープペプチド で 10日間刺激培養後（day 10)、同様に MHC—テトラマー試薬にて染色した（図 7-b)
[0165] その結果、 10日間の培養で、 EBV BRLF1は 0.03%から 15.6%と約 520倍もの陽性率 の増加が観察された。 TYF- Tetと VYS- Tetで Negativeテトラマー試薬（MBL社）と比較 して明らかな CD8陽性 MHC—テトラマー陽性像が得られた。アデノウイルス特異的 C TLは、 TYFでは 153倍（0.01%から 1.53%)、 VYSでも 15倍（0.01%力ら 0.15%)の陽性 率の増加が観察された。
[0166] これらの結果から、 EBV特異的 CTLと比較して陽性率は低いが、アデノウイルス特 異的 CTLは健康成人末梢血中に存在し、 10日間の培養で CTL存在の有無を判定で きる程度の増殖が可能である事が明らかになった。この事は、本発明で実施した、抗 原提示細胞を利用しない誘導法がアデノウイルス特異的 CTLの検出の為の簡便で 短期間の培養に有効である事を意味している。
[0167] 〔実施例 8〕 MHC—テトラマー試薬を用いた CTLの機能性評価
MHC—テトラマー試薬は、特異的な CTLの定量だけでなく細胞内サイト力イン産生 細胞定量法や細胞表面蛋白質に対する特異抗体と組み合わせることで、特異的 CT Lの分ィ匕段階や機能性も同時に判定する事が可能である。本発明で提供される CTL ェピトープペプチドを用いて合成された MHC—テトラマー試薬がアデノウイルス特異 的 CTLの定量と機能解析に有効である力検討した。その結果を図 8に示した。
[0168] 図 8abは、 Donor ID*24-8の PBMCに TYFペプチドをカ卩えて 10日間刺激後、細胞内 I FN γ産生細胞定量法にて解析した結果である。図 8cdは、 Donor ID*24-2の PBMC に VYSペプチドをカ卩えて 27日間刺激後、細胞内 IFN y産生細胞定量法にて解析した 結果である。 aと cは、陰性コントロール (HIV)ペプチドにて、 bと dは特異的ペプチドに て再刺激した結果である。左側は X軸に CD8、 Y軸に MHC—テトラマー試薬に対する 蛍光強度を logスケールで解析したドットプロット展開図で、 CTLの定量結果を示す。 右側は、 X軸に IFN y、 Y軸に MHC—テトラマー試薬に対する蛍光強度を logスケール で解析したドットプロット展開図で、 CTLの定性結果を示す。ドットプロット展開図中の 数値は、四分割した場合の各細胞が全生細胞中に占める割合 (％)を示す。
[0169] 特異的 CTLを定量した結果から、 HIVペプチドで刺激した場合と比較して特異的ぺ プチドで刺激した場合では、 TYF特異的 CTLでは 1.67%対 0.80%、 VYS特異的 CTL では 8.33%対 5.07%と特異的 CTL量が低下する事が明らかになった。
[0170] これは特異的 CTLでは特異的刺激により細胞表面上で TCRの発現レベルが低下 する力らである (Valitutti S, Muller b, Dessing M, Lanzavecchia A.Different response s are elicited in cytotoxic T lymphocytes by different levels of T cell receptor occup ancy.J Exp Med. 1996 ;183： 1917-1921. Betts MR, Price DA, Brenchley JM, Lore K, Guenaga FJ, Smed— Sorensen A, Ambrozak DR, Migueles SA, Connors M, Roeder er M, Douek DC, Koup RA.The functional profile of primary human antiviral CD8 T cell effector activity is dictated by cognate peptide concentration. J Immunol. 2004 ； 172： 6407-6417) o URの細胞集団が特異的ペプチドを加えた場合、 HIVペプチド の場合と比較して X軸側に移動していることからも MHC—テトラマー試薬に対する反 応性の低下、すなわち MHC—テトラマー試薬と結合する TCRの発現レベルが特異的 に低下して 、ることが明らかである。これは言 、換えればアデノウイルス特異的 CTL が存在している事を意味している。特異的 CTLの定性結果からは、 HIVペプチドをカロ えた場合は、 MHC—テトラマー試薬陽性細胞 (ULと UR)は、 TYF特異的 CTL (1.76% )も VYS特異的 CTL (8.24%)でも殆ど IFN yを産生する細胞は存在しな!、して 、な!ヽ 。し力しながら特異的ペプチド刺激により URや LRに細胞集団が移動し IFN yを産生 している事が明らかである。
[0171] この結果から、生体外でペプチド刺激により IFN γを産生するアデノウイルス特異的 CTLを効率的に誘導できる事が示された。
[0172] 〔実施例 9〕 MHC—テトラマー試薬による CTLの精製
ΡΕ標識したアデノウイルス特異的 MHC—テトラマー試薬と、 CTL調製方法にて誘 導された CTLを混合し、室温にて 30分間放置した。過剰量の洗浄液で 1回洗い、磁 気標識抗 ΡΕマイクロビーズ (Miltenyi Biotec GmbH社）をカ卩え、 4〜8°Cで 15分間静置 した。過剰量の洗浄液で 1回洗い、細胞を 1 mLの洗浄液に希釈後、自動磁気細胞分 離装置（AutoMACS、 Miltenyi Biotec GmbH社）を用いて、 MHC—テトラマー陽性細 胞、すなわちアデノウイルス特異的 CTLを精製した。
[0173] 結果の一例を図 9に示す。 X軸にアデノウイルス特異的 MHC—テトラマー試薬に対 する蛍光強度を logスケールで、 Y軸に細胞数で解析したヒストグラム展開図で示す。 上段は精製前の CTLを含む細胞集団で、下段は精製後の細胞集団を解析した結果 である。精製前後の細胞集団に含まれる特異的 CTLの割合を数値で示した。アデノ ウィルス特異的 CTLは 、ずれも 90%以上の純度で本方法にて回収された。この事は 、アデノウイルス特異的 MHC テトラマー試薬を用いて、アデノウイルス特異的 CTL を高純度で精製できる事を示している。精製したアデノウイルス特異的 CTLは、抗 CD 3抗体と IL-2、 X照射し増殖能を損失させた抗原提示細胞で刺激増殖し、受動免疫 療法に必要な細胞数を確保した。
[0174] 〔実施例 10〕 アデノウイルスサブグループ間の反応性の検討
[CTLェピトープ TYFに関するサブグループ Cとの反応性検討]
本発明にて同定された TYFは、図 11 4に示すようにサブグループ C特異的な CT Lェピトープと 4番目と 6番目の 2箇所でアミノ酸変異が存在する。そこで、 TYFにて誘 導した CTLラインを用いてサブグループ C特異的な CTLェピトープ（TYFSLMNKF (配 列番号： 14)、下線は変異アミノ酸を示す）（Leen AM, Sili U, Vanin EF, Jewell AM, X ie W, Vignali D, Piedra PA, Brenner MK, Rooney CM. Conserved CTL epitopes on t he adenovirus hexon protein expand subgroup cross-reactive and subgroup-specific CD8+ T cells. Blood. 2004;104:2432- 2440.)との交差反応性を検討した。
[0175] ID*24-8から調製した PBMCを 13日間 TYFにて刺激後、 TYFある!/、は、 TYFSLNNK F (配列番号： 14)にて再刺激し、 CTLラインが IFN yを産生するか否力検討した。そ の結果を図 10に示す。 X軸に CD8、 Y軸に TYF-Tetに対する蛍光強度を logスケール で解析したドットプロット展開図より、 TYF特異的 CTLラインでは、 TYFの再刺激により TCRの発現抑制が生じ、 CD8陽性 TYF-Tet陽性細胞数は TYFをカ卩えた場合に 1.22 %で、 TYFSL NKF (配列番号： 14)をカ卩えた場合（1.97%)と比較して若干の低下が 観察された。 X軸に IFN y、 Y軸に TYF-Tetに対する蛍光強度を logスケールで解析し たドットブロット展開図より、 TYFSL NKF (配列番号： 14)をカ卩えた場合 TYF-Tet陽性 細胞（ULと UR)は殆ど ULに存在し INF γ産生細胞は存在しないが、 TYFを加えた場 合は、 IFN γ産生細胞力 ¾Rと LRに観察された。 X軸に CD8、 Y軸に IFN yに対する蛍 光強度を logスケールで解析したドットプロット展開図より、 TYFを加えた場合は多数 の IFN y産生細胞が URに出現する力 TYFSL NKF (配列番号： 14)を加えた場合 は殆ど出現しない。 TYFにて誘導した CTLラインは TYF特異的に IFN yを産生し、 2 箇所でアミノ酸配列の異なる TYFSL NKF (配列番号： 14)に対しては、 Ν γを産生 しなかった。
[0176] 従って、本発明にて同定された TYF CTLェピトープペプチドは、サブグループじと 交差反応性を示さない事が明らかになった。
[0177] 〔実施例 11〕 アデノウイルスへキソン蛋白質のアミノ酸相同配列解析による反応性 の検討
アデノウイルスのサブグループ間で、本発明で得られた CTLェピトープペプチドの 反応'性を検討するために NCBI (National Center for Biotechnology Information, http ：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/)より 50タイプのアデノウイルスへキソンのアミノ酸配列を入 手し (Accession Numberの一覧を表 3に示す）、アミノ酸相同配列解析を行った。最近 、 CTLェピトープ C末端側のアンカーモチーフ直後のアミノ酸に変異が生じる事で、 細胞内蛋白質分解経路にて分解される場所が変化し、結果として CTLェピトープぺ プチドが生じなくなる事が報告されている（Beekman NJ, van Veelen PA, van Hall T, Neisig A, Sijts A, Camps M, Kloetzel PM, Neeljes JJ, Melief CJ, Ossendorp F. Abro gation of CTL epitope processing by single amino acid substitution flanking the C— te rminal proteasome cleavage site. J Immunol. 2000;164:1898-1905.) 0これは、 HIVや HCVのような慢性ウィルス疾患にお!、て、ウィルス感染細胞力 SCTLの標的からエスケ ープし、持続感染が継続する原因の 1つと考えられている（Furutsuki T, Hosoya N, Kawana- fachikawa A, i，omizawa M, Odawara , Goto M, Kitamura Y, Nakamura Ί , Kelleher AD, Cooper DA, Iwamoto A. Frequent transmission of cytotoxic— T—lympho cyte escape mutants of human immunodeficiency virus type 1 in the highly HLA— A2 4- positive Japanese population. J Virol. 2004;78:8437- 8445.)。
[0178] 本発明にて同定された 6種類のェピトープペプチドにつ 、て、ェピトープ領域だけ でなく C末端側のアンカーモチーフ直後のアミノ酸についても相同性を検索した。
[0179] その結果、配列番号： l(DYL)は、サブグループ B、 C、 Dおよび Eに属する型のアデ ノウィルスと 100%の相同性を示した（図 11— 1)。配列番号： 2 (LYA)は、全てのサブ グループに属する型のアデノウイルスと 100%の相同性を示した (図 11 2)。配列番 号： 3 (VYS)は、サブグループ B、 Dおよび Eに属する型のアデノウイルスと 100%の相 同性を示した (図 11 3)。配列番号: 4 (TYF)は、サブグループ Bに属する 11, 21, 34 と 35型のみと 100%の相同性を示した (図 11—4)。配列番号： 5 (LYS)は、サブグルー プ Dおよび Fに属するアデノウイルスと 100%の相同性を示した (図 11 5)。配列番 号： 6 (GYK)は、サブグループ Aに属する 18型、 Dおよび Eに属するアデノウイルスと 1 00%の相同性を示した (図 11— 6)。いずれのェピトープペプチドも、その C末端側直 後のアミノ酸に変異は認められな力つた。これらの結果を表 4にまとめた。配列番号： 4 (TYF)はサブグループ Bに特異性の高い CTLェピトープペプチドと考えられた。そ れ以外のェピトープペプチドはサブグループ Bだけでなく、サブグループ間で広範に 特異性を示す CTLェピトープペプチドと考えられた。
[0180] この事は、本発明の CTLェピトープペプチドを単独、あるいは組み合わせて用いる 事で広範なアデノウイルスに対する免疫力の診断情報を提供できる事を意味する。さ らにアデノウイルスに感染する事無ぐ広範な反応性を示すアデノウイルス特異的な CTLを誘導できる事から、養子免疫療法に有効であることが示された。
[0181] [表 3]
ウィルス ACCESSION アミノ酸数
サブグループ comment 血清型 Number (aa)
1 C AP000512 964
2 C AP000175 968
3 B AAO24104 944 full
4 E AAS16286 936
5 C AP00021 1 952
6 C Q04966 465 partial
7 B AP000548 934
8 D P36852 517 partial
9 D CAI05969 953
10 D BAA84982 383 partial
1 1 B AP000452 948 full
12 A AP000121 919
13 D BAD15125 305 partial
14 B BAA76594 425 partial
15 D S37277 509 partial
16 B S37216 940 full
17 D BAA84983 378 partial
18 A CAA76709 318 partial
19 D BAA84984 519 partial
20 D BAD15129 305 partial
21 B AAG21823 949 full
22 D BAA84985 399 partial
23 D BAA84986 404 partial
24 D BAA84987 363 partial
25 D BAD15133 305 partial
26 D BAA84988 376 partial
27 D BAD15135 305 partial
28 D BAD15136 305 partial
29 D BAD15137 305 partial
30 D BAD15138 305 partial
31 A P36855 468 partial
32 D BAD15139 305 partial
33 D BAD15140 305 partial
34 B BAB20014 951 full
35 B AP 000585 952 full
36 D BAD15141 305 partial
37 D BAA84989 507 partial
38 D BAD15143 305 partial
39 D BAD15144 305 partial
40 F P1 1819 923 full
41 F P1 1820 925 full
42 D BAD15145 305 partial
43 D BAD15146 305 partial
44 D BAD 15147 305 partial
45 D BAA84990 376 partial
46 D BAA84991 364 partial
47 D BAA84992 373 partial
48 D AAB 17439 947 partial
49 D BAD 15152 305 partial
50 B BAD15153 305 partial
51 D 登録無し [0182] [表 4]
Figure imgf000058_0001
[0183] 〔実施例 12〕 ワクチン注射剤
DMSOに、配列番号： 1〜6のペプチドを最終濃度 20 mg/mlとなるように各々溶解し 、ろ過滅菌した。得られたペプチド含有溶液を滅菌ノ ィアル瓶に lmLずつ分注密栓 し、ワクチン注射剤とした。
産業上の利用可能性
[0184] CTLがウィルス感染細胞を認識する際、以下のような特徴がある。
(1) CTLはウィルス粒子そのものを直接認識することはできない。
(2) CTLはウィルスタンパク質中の 8〜10個のアミノ酸からなるペプチド（以下、ェピトー プペプチドと称する）を認識して感染細胞を破壊する。
(3)このェピトープペプチドは、ウィルス感染細胞表面にあるヒト白血球抗原（human le ucocyte antigen,以下、 HLAと称する）と β 2-ミクログロブリンの複合体に結合して提 示され、これに CTL細胞表面上の Τ細胞受容体（T cell receptor ;TCR)が結合する事 で CTLはウィルス感染細胞を認識し破壊する。
(4) HLAは人種間、個人間によつて異なり、 HLAが異なると同じウィルスでもェピトープ ペプチドが異なる（これをェピトープペプチドの HLA拘束性と称する）。
[0185] (1)から (4)で述べたことから明らかなように、アデノウイルスに特異的なェピトープぺ プチドは HLA型によって異なることから、 HLA拘束性を受ける。本発明者らは、 日本 人の約 60%が保有し、かつ世界的にも頻度の高い HLA-A24型等について、アデノウ ィルスに特異的な CTLェピトープペプチドを解析する事で、アデノウイルス感染症に 対して有効な免疫がある力否かの診断、アデノウイルスの感染を治療又は予防する ために有用なェピトープペプチドの提供に成功した。
[0186] 本発明の CTLとは、ヒト T細胞上に存在する表面抗原分子の 1つである CD8又は、 C D4を発現し、かつ HLAクラス I拘束性を示す細胞傷害性 T細胞を意味する。また本発 明のアデノウイルス特異的 CTLとは、アデノウイルス感染細胞の細胞膜表面上に発 現する HLAクラス I分子と β 2-ミクログロブリン及びアデノウイルスに特異的な HLAクラ ス I拘束性ェピトープペプチドとの 3者複合体を、 CTL膜表面に発現して 、る T細胞受 容体 (T cell receptor,以下 TCR)で認識する事で、アデノウイルス感染細胞を直接的 に傷害し、アデノウイルス感染細胞を排除し得る T細胞を示す。また、アデノウイルス に特異的な HLAクラス I拘束性ェピトープペプチドとは、 CTLに認識され得るアデノウ ィルスタンパク質中の特定部位にある 8〜10個のアミノ酸配列からなるペプチドであつ て、 HLAクラス I分子と /3 2-ミクログロブリンとの 3者複合体を形成し、 CTL膜表面上の TCRが免疫的に認識して結合する事が可能なアデノウイルスの構造部分である。
[0187] 本発明で提供されるェピトープペプチドは、ワクチンとして用いる事で、アデノウィル ス特異的 CTLを生体内で誘導し、アデノウイルス感染に対して免疫力を保持させるこ とができる。生体外にて末梢血等の生体試料に対してもアデノウイルスを感染させる 事無ぐ安全かつ効率的にアデノウイルス特異的 CTLを人為的に誘導増殖させ細胞 免疫療法に用いる事ができる。さらに、アデノウイルスに対する免疫力の有無の診断 に用いる事ができ、アデノウイルス感染症に対して有効な治療法と診断方法を提供 する。

Claims

請求の範囲
[1] アデノウイルスに特異的な細胞傷害性 τ細胞ェピトープペプチド。
[2] アデノウイルスに特異的な細胞傷害性 Τ細胞ェピトープペプチドが配列番号： 1〜6 力もなる群力も選択される少なくとも 1つのアミノ酸配列を含むものである、請求項 1に 記載のペプチド。
[3] 配列番号： 1〜6のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 1もしくは複数のァミノ 酸が置換、欠失、挿入及び Ζ又は付加されたアミノ酸配列力もなるペプチドであって 、アデノウイルス特異的な細胞傷害性 Τ細胞を誘導し得る機能を有することを特徴と する、請求項 1に記載のペプチド。
[4] HLA- Α*2402分子、 HLA- Cw*0401分子あるいは HLA- Cw*0702分子の拘束性抗 原ペプチドであって、 HLA-A*2402分子、 HLA-Cw*0401分子あるいは HLA-Cw*070 2分子との複合体を細胞表面に提示する細胞を特異的に認識しうる T細胞レセプター を有する細胞傷害性 T細胞を誘導し得る機能を有することを特徴とする、請求項 1〜 3の!、ずれかに記載のペプチド。
[5] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドをコードする核酸。
[6] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、アデノウイルス の感染を治療又は予防するためのワクチン。
[7] 請求項 5に記載の核酸を有効成分として含む、アデノウイルスの感染を治療又は予 防するためのワクチン。
[8] 請求項 1〜4の ヽずれかに記載のペプチドを HLAに提示した抗原提示細胞を有効 成分として含む、アデノウイルスの感染を治療又は予防するためのワクチン。
[9] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示した抗 原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激して得られるアデノウイルス特異的な細胞傷 害性 T細胞を有効成分として含む、アデノウイルスに対する受動免疫療法剤。
[10] 請求項 1〜4の 、ずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合 体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応さ せ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テトラ マーに細胞傷害性 T細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得ら れる細胞傷害性 T細胞を有効成分として含む、アデノウイルスに対する受動免疫療 法剤。
[11] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドで末梢血を刺激し、該ウィルスに特異的 な細胞傷害性 τ細胞を取得し、細胞傷害性 τ細胞が産生するサイト力イン及び Ζ又 はケモカイン及び ζ又は細胞表面分子を測定することを特徴とする、アデノウイルス に特異的な細胞傷害性 τ細胞の定量方法。
[12] 請求項 1〜4の 、ずれか〖こ記載のペプチドから主要組織適合性抗原複合体-テトラ マーを調製し、主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血とを反応させること を特徴とする、該末梢血中のアデノウイルスに特異的な細胞傷害性 Τ細胞の定量方 法。
[13] 請求項 1〜4の 、ずれかに記載のペプチドを用いて細胞傷害性 Τ細胞を誘導する ことを特徴とする、細胞傷害性 Τ細胞の誘導方法。
[14] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドと、末梢血単核球を血漿を含む培地中 で接触させることにより、アデノウイルス特異的細胞傷害性 Τ細胞を誘導する、請求 項 13に記載の誘導方法。
[15] 請求項 1〜4のいずれかに記載のペプチドもしくは該ペプチドを HLAに提示した抗 原提示細胞により末梢血リンパ球を刺激してアデノウイルス特異的な細胞傷害性 Τ細 胞を取得する工程を含む、アデノウイルスに対する受動免疫療法剤の製造方法。
[16] 請求項 1〜4の 、ずれかに記載のペプチドから調製した主要組織適合性抗原複合 体及び/又は主要組織適合性抗原複合体-テトラマーと末梢血リンパ球とを反応さ せ、該主要組織適合性抗原複合体及び,又は主要組織適合性抗原複合体-テトラ マーに細胞傷害性 Τ細胞が結合した結合体を形成させ、該結合体から単離して得ら れる細胞傷害性 Τ細胞を取得する工程を含む、アデノウイルスに対する受動免疫療 法剤の製造方法。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016540779A (ja) * 2013-12-06 2016-12-28 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新生物ワクチン用製剤
WO2018110374A1 (ja) 2016-12-14 2018-06-21 国立大学法人信州大学 殺細胞効果を有するキメラ抗原受容体遺伝子改変リンパ球
US10801070B2 (en) 2013-11-25 2020-10-13 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer
US10835585B2 (en) 2015-05-20 2020-11-17 The Broad Institute, Inc. Shared neoantigens
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
US10993997B2 (en) 2014-12-19 2021-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t cell repertoire
US11452768B2 (en) 2013-12-20 2022-09-27 The Broad Institute, Inc. Combination therapy with neoantigen vaccine
US11549149B2 (en) 2017-01-24 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
EP4289944A2 (en) 2015-10-08 2023-12-13 National University Corporation Tokai National Higher Education and Research System Method for preparing genetically-modified t cells which express chimeric antigen receptor

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102353794B (zh) * 2011-07-22 2013-11-20 中国人民解放军第三军医大学 筛选与鉴定幽门螺杆菌抗原表位肽的方法
CN107849111B (zh) * 2015-05-04 2022-02-22 Vcn生物科学有限公司 在免疫显性腺病毒抗原表位中具有突变的溶瘤腺病毒及其在癌症治疗中的用途
JP2019520840A (ja) * 2016-07-18 2019-07-25 ザ カウンシル オブ ザ クイーンズランド インスティテュート オブ メディカル リサーチ マルチウイルス特異的ｔ細胞免疫療法
WO2021096829A1 (en) * 2019-11-11 2021-05-20 Vanderbilt University Human monoclonal antibodies to hantavirus and methods of use therefor

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEEN A.M. ET AL.: "Conserved CTL epitopes on the adenovirus hexon protein expand subgroup cross-reactive and subgroup-specific CD8+ T cells", BLOOD, vol. 104, no. 8, 15 October 2004 (2004-10-15), pages 2432 - 2440, XP003008551 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10801070B2 (en) 2013-11-25 2020-10-13 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer
US11834718B2 (en) 2013-11-25 2023-12-05 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the DNA methylation status
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
JP2016540779A (ja) * 2013-12-06 2016-12-28 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新生物ワクチン用製剤
US11452768B2 (en) 2013-12-20 2022-09-27 The Broad Institute, Inc. Combination therapy with neoantigen vaccine
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
US10993997B2 (en) 2014-12-19 2021-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t cell repertoire
US11939637B2 (en) 2014-12-19 2024-03-26 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
US10835585B2 (en) 2015-05-20 2020-11-17 The Broad Institute, Inc. Shared neoantigens
EP4289944A2 (en) 2015-10-08 2023-12-13 National University Corporation Tokai National Higher Education and Research System Method for preparing genetically-modified t cells which express chimeric antigen receptor
WO2018110374A1 (ja) 2016-12-14 2018-06-21 国立大学法人信州大学 殺細胞効果を有するキメラ抗原受容体遺伝子改変リンパ球
US11549149B2 (en) 2017-01-24 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide

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