CN106755374B - 一种蜱虫巢式pcr特异性引物及蜱虫巢式pcr鉴定方法 - Google Patents

一种蜱虫巢式pcr特异性引物及蜱虫巢式pcr鉴定方法 Download PDF

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Abstract

一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，采用更为敏感的巢式PCR方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，通过在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，本发明巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。

Description

一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法
技术领域
本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法。
背景技术
蜱类是一种专性、非永久性寄生于陆生脊椎动物的医学节肢动物，可通过直接叮咬和释放毒素或携带病原体对宿主造成伤害。在进出境口岸蜱种类的调查中，对蜱虫的鉴定及进化分型具有重要意义。目前，我国对于蜱种的鉴定主要依靠形态学方法，还没有简单、稳定的分子生物学手段。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，能够在低DNA模板浓度下快速、稳定的鉴定蜱虫的种类。
本发明采用的技术解决方案是：一种蜱虫巢式PCR特异性引物，包括设计的两对特异性引物，具体为：
T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；
T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；
T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；
T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。
一种蜱虫巢式PCR鉴定方法，包括以下步骤：
(1)将需要检测的蜱虫样品进行形态学上初步分型；
(2)将经过形态学初步分型鉴定处理后的蜱虫样品，每种各取一只，进行基因组提取DNA，蜱虫样品无需RNA酶处理；
(3)以蜱虫样品基因组DNA为模板，以所述的T18sF1+T18sR1为第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、双蒸水，进行第一轮PCR；
(4)以第一轮PCR产物DNA为模板，分别以所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1为第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、双蒸水，进行第二轮PCR；
(5)取第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(6)将第二轮PCR产物进行序列测定；
(7)根据NCBI数据库中记载的蜱虫18s rRNA基因序列，进行系统进化分析，最终得出蜱虫样品鉴定结果。
所述的步骤(3)中的第一轮PCR反应条件为：预热95℃，5min；94℃ 1min，60℃1min，72℃ 2min，共10个循环；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。
所述的步骤(4)中的第二轮PCR反应条件为：预热95℃，5min；94℃ 1min，60℃1min，72℃ 2min，共25个循环；末次延伸72℃，10min，4℃保存10min。
所述的步骤(3)中蜱虫样品基因组DNA量为2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loading buffer为2.5μl，双蒸水16.25μl。
所述的步骤(4)中第一轮PCR产物DNA量为1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loading buffer为2.5μl，双蒸水17.25μl。
所述的步骤(5)中第二轮PCR产物量为2μl。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种蜱虫巢式PCR特异性引物及蜱虫巢式PCR鉴定方法，采用更为敏感的巢式PCR方法，单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定，通过在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，本发明巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。
附图说明
图1为18s rRNA巢式PCR方法克隆示意图。
图2为温州口岸进口生牛皮中截获蜱虫形态学观察。
图3为两轮轮PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定结果。
图4为根据18s rRNA基因序列对蜱虫进行系统进化分析结果。
具体实施方式
根据蜱虫18s rRNA序列保守区设计两对特异性引物
T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；
T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；
T 18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；
T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。
巢式PCR具体步骤
(1)蜱虫
温州口岸进口生牛皮中截获蜱虫，形态学上进行初步分型。
(2)提取蜱虫基因组
形态学鉴定后，每一种蜱虫取一只，按照基因组提取试剂盒(ZYMOL)说明进行基因组提取DNA，样品无需RNA酶处理。
(3)克隆策略
克隆分两步，按照图1所示，
①以蜱虫基因组DNA为模板(2μl)，以T18sF1+T18sR1为第一套引物(各1μl)，LAtaq酶(0.25μl)，dNTP(2μl)，10×Buffer(2.5μl)，ddH2O(16.25μl)进行第一轮PCR，PCR程序为：
②以第一轮PCR产物DNA为模板(1μl)，分别以T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1为第二套引物(各1μl)，LAtaq酶(0.25μl)，dNTP(2μl)，10×Buffer(2.5μl)，ddH2O(17.25μl)进行第一轮PCR，PCR程序为：
(4)PCR产物鉴定
取第二轮PCR产物2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(5)测序
将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。
(6)根据18s rRNA基因序列进行基因型分析
在NCBI数据库中下载蜱虫18s rRNA基因序列，通过MEGA5.0软件，进行系统进化分析
实验结果
1、截获蜱虫形态学观察
根据形态学观察，将所截获蜱虫分成10种，命名为T1～T10，如图2所示。
2、提取蜱虫基因组
每种蜱虫取一只，按照基因组提取试剂盒(ZYMOL)说明进行基因组提取DNA，所提基因组DNA浓度为50～100ng/μl。
3、巢式PCR结果
以所获得的蜱虫基因组DNA为模板，经两轮PCR，通过琼脂糖凝胶电泳初步鉴定产物，如图3所示。以T18sF1+T18sR1为第一套引物，进行PCR，结果显示T3、T4、T5、T8、T10均出现目的条带，但其余5种蜱虫未出现扩增产物条带，如图3a；以第一轮产物为模板，进行第二轮巢式PCR后，10种测试样品均出现目的条带，如图3b。将克隆产物送公司进行测序。
4、根据18srRNA基因序列进行基因型分析
测序产物，通过拼接后，为18s rRNA基因序列。与NCBI中已公布的蜱虫18s rRNA基因序列进行比对分析，通过MEGA5.0软件，进行系统进化分析，结果表明，T1、T2、T3、T4、T8可能为Amblyomma或Aponomma的亚种；T5、T9与Boophilus和Rhipicephalus序列相似性为100％；T6、T10为Boophilus和Rhipicephalus的亚种，如图4所示。
本发明通过建立了更为敏感的巢式PCR方法。单蜱虫甚至蜱虫的部分组织器官提取的微量基因组DNA即可作为模板进行鉴定。
现有技术对于蜱虫的分型主要通过形态学观察，本发明是在基因水平上进行蜱虫的分型、系统进化分析，与形态学方法具有本质的区别。
本发明中，巢式PCR方法第一轮只需10个循环，第二轮需25个循环，缩短了简单的两轮普通PCR所需时间。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种蜱虫巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：
T18sF1：5`-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3`；
T18sR1：5`-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3`；
T18sF2：5`-CAARTGTCTGCCYTATCAACT-3`；
T18sR2：5`-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3`。
2.一种采用权利要求1所述的特异性引物的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将需要检测的蜱虫样品进行形态学上初步分型；
(2)将经过形态学初步分型鉴定处理后的蜱虫样品，每种各取一只，进行基因组提取DNA，蜱虫样品无需RNA酶处理；
(3)以蜱虫样品基因组DNA为模板，以权利要求1中所述的T18sF1+T18sR1为第一套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、双蒸水，进行第一轮PCR；
(4)以第一轮PCR产物DNA为模板，分别以权利要求1中所述的T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1为第二套引物，加入LAtaq酶、dNTP、10×Loading buffer、双蒸水，进行第二轮PCR；
(5)取第二轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(6)将第二轮PCR产物进行序列测定；
(7)根据NCBI数据库中记载的蜱虫18s rRNA基因序列，进行系统进化分析，最终得出蜱虫样品鉴定结果。
3.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的第一轮PCR反应条件为：
95℃预热5min；
94℃保持1min，60℃保持1min，72℃保持2min，该步骤进行共10个循环；
末次延伸至72℃，保持10min，4℃保存10min。
4.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(4)中的第二轮PCR反应条件为：
95℃，预热5min；
94℃保持1min，60℃保持1min，72℃保持2min，该步骤进行共25个循环；
末次延伸至72℃，保持10min，4℃保存10min。
5.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(3)中蜱虫样品基因组DNA量为2μl，第一套引物中T18sF1+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loadingbuffer为2.5μl，双蒸水16.25μl。
6.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(4)中第一轮PCR产物DNA量为1μl，第二套引物T18sF1+T18sR2、T18sF2+T18sR1各为1μl，LAtaq酶为0.25μl，dNTP为2μl，10×Loading buffer为2.5μl，双蒸水17.25μl。
7.根据权利要求2所述的蜱虫巢式PCR鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(5)中第二轮PCR产物量为2μl。
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