CN106755219A - 一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质发酵技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法。本发明所述利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，以发酵豆粕为发酵原料，并优选各项工艺参数，有效提高了大豆肽的得率。所得大豆肽产品的DPPH自由基清除率及超氧阴离子自由基清除率较高，具有较好的抗氧化效果。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质发酵技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法。
背景技术
大豆多肽即“肽基大豆蛋白水解物”的简称，是大豆蛋白质经蛋白酶作用再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物。而我们通常所说的大豆多肽(soybean peptide)是指大豆蛋白经水解后，形成具有3-6个氨基酸残基的多肽混合物，它的分子量低于1000u，而且主要是集中在在300u-700u之间。
据研究，大豆中含有将近40％的蛋白质，人体中所需的必需氨基酸在大豆中都可以找到，而且其比例和含量都与人体必需氨基酸相似，所以说大豆是优质蛋白质的重要来源。大豆多肽的分子结构比较简单以及相对分子质量比较小，大豆多肽的消化率与大豆蛋白的消化率相比显得更高，因此大豆多肽的生物学效价更高。大豆肽中含有大量的且比例均衡的氨基酸，不仅能加快微生物的发酵速度而且还可以降低血压及降低血脂的作用，人体内消化吸收蛋白质大多以多肽的形式。因此，大豆肽比大豆蛋白质更容易在肠道中消化吸收，还减少了脱水及腹泻等不适应的情况，另外，大豆肽比糖类、脂肪更容易加速能量代谢更高程度的满足人体的正常生理需求，并具有防病、治病、调节人体生理机能的作用，被广大的老年人和肥胖人群所接受。而且大豆多肽没有大豆本身的腥味以及苦涩的味道、没有其他残留物，大豆多肽受热不凝结成固态和多肽液体不浓稠等特性；并且大豆肽与大豆蛋白相比较大豆肽更易溶于水而且吸水能力更强。因此，大豆肽不仅克服了大豆蛋白所不具备的理化功能的缺点，而且还具有大豆蛋白的丰富营养，是一种价格实惠的大豆深加工产品，是极具潜力的一种功能性食品基料，已逐渐成为21世纪的健康食品。
由于大豆肽的诸多优点所以在食品工业中大豆肽的应用比较广泛。如对于一些特殊的病人由于他们的消化功能健全或衰退，例如，一些老年人、婴幼儿以及康复期的病人，他们的消化系统需要的营养品应具有易消化吸收且吸收速度快的特点，因此大豆肽可作为特殊病人的营养剂。大豆肽与其他材料搭配加工可以制成加工还可以与其他的辅料相互结合制成各种食品，如高蛋白、高果糖、低动物性脂肪、易消化的速溶性老年奶粉。在发酵工业中大豆肽还可以作为催化剂，大豆肽可以加速微生物生长发育促进微生物的代谢。在酸奶的加工、酱油的生产和火腿的发酵中等，大豆肽都发挥着功不可没的功能。
伴随着我国经济的发展，人们已越来越重视自身的健康问题，对大豆肽的营养功了解已普遍加深，在最近的几年里市场的需求对大豆肽不断的增加，并亟需开发出更适合、更有营养、有利人们健康的大豆肽产品。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，包括如下步骤：
(1)取豆粕粉加水溶解得豆粕粉溶液，并将所述豆粕粉进行灭菌处理；
(2)取灭菌后的豆粕粉溶液接种入枯草芽孢杆菌，并进行发酵培养；
(3)取发酵液滤除残渣，取滤液并调节滤液pH值至4-4.2，离心并收集上清液；
(4)将所述上清液蒸发浓缩至黏稠状少许液体，随后冷冻至凝固态，并冷冻干燥至粉状，即得大豆肽粉。
所述步骤(1)中，所述豆粕粉和水的料液比为1：10-30。
所述步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1wt％-5wt％。
所述步骤(2)中，所述发酵温度为25-45℃。
所述步骤(2)中，所述发酵时间为16-48h。
所述步骤(2)中，还包括在接种步骤前将所述豆粕粉溶液的pH值调节至6.0-8.0的步骤。
所述步骤(3)中，所述离心步骤为3000-4000rpm低速离心。
所述步骤(2)中，所述发酵步骤具体为：在发酵过程的后1/2发酵时间内，其发酵温度相比于前1/2发酵时间内提升5℃。
本发明还公开了由所述方法制备得到的大豆肽。
本发明还公开了所述大豆肽用于制备抗氧化制剂的用途。
本发明所述利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，以发酵豆粕为发酵原料，并优选各项工艺参数，所得大豆肽产品的水解度高达24.51％，更有效提高了大豆肽的得率。并且所得大豆肽产品的DPPH自由基清除率的IC50高达13.29mg/mL，超氧阴离子自由基清除率IC50高达3.99mg/mL。同时对发酵所得大豆肽粉的理化指标进行测定，结果表明所得的大豆肽粉中粗蛋白质含量高达80.14％，比未发酵豆粕中的蛋白质含量高出一倍多，大豆肽粉中多肽含量更高达73.61％。通过枯草芽孢杆菌对豆粕进行发酵，提高了大豆多肽的提取率，增强大豆肽的抗氧化能力，为大豆粕的综合利用提供理论技术依据。
本发明优选在整个发酵过程中，采用分段控温的方式，更进一步的提高了大豆肽的提取率。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为绘制的蛋白质标准曲线；
图2为绘制的大豆肽标准曲线；
图3-A为样品的超氧阴离子自由基清除率测定结果；图3-B为谷胱甘肽对超氧阴离子的清除能力测定结果；
图4-A为样品的DPPH自由基的清除能力测定结果；图4-B为谷胱甘肽对DPPH自由基的清除能力测定结果。
具体实施方式
实施例1
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉(取豆粕放入粉碎机中多次粉碎，并置于40目的筛子过滤3-4遍制得，下同)放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入200mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为7.0。向三角瓶中按照接种量为2％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为30℃、180r/min，培养发酵24h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例2
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入100mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为6.5。向三角瓶中按照接种量为1％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为25℃、180r/min，培养发酵16h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例3
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入300mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为8.0。向三角瓶中按照接种量为5％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为35℃、180r/min，培养发酵40h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例4
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入150mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为7.5。向三角瓶中按照接种量为3％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为40℃、180r/min，培养发酵32h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例5
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入250mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为6.0。向三角瓶中按照接种量为4％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为45℃、180r/min，培养发酵48h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例6
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入250mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为7.5。向三角瓶中按照接种量为2％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为35℃、180r/min，培养发酵48h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例7
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入300mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为7.0。向三角瓶中按照接种量为2％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为35℃、180r/min，培养发酵48h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例8
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入250mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为8.0。向三角瓶中按照接种量为2％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为35℃、180r/min，培养发酵24h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例9
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入300mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为7.0。向三角瓶中按照接种量为2％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为35℃、180r/min，培养发酵24h，随后将双显恒温振荡器调为40℃、180r/min，继续培养发酵24h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实施例10
取清洗干净的三角瓶，称取10g豆粕粉放入三角瓶中，然后向三角瓶中加入250mL的去离子水，将装有豆粕粉溶液的三角瓶用布包扎好，放入高温高压灭菌锅中，于120℃杀菌20min，取出温度降到常温，并将溶液pH值调为8.0。向三角瓶中按照接种量为2％的计量接入直投式枯草芽孢杆菌，将双显恒温振荡器调为35℃、180r/min，培养发酵24h，随后将双显恒温振荡器调为40℃、180r/min，继续培养发酵24h。发酵结束后，将三角瓶从摇床取出，用4层纱布过滤掉发酵液中的残渣，用去离子水清洗滤渣，再次过滤，如此重复两遍，用盐酸将滤液的pH值调至4.2，将调节好的滤液放入低速大容量离心机中调节转速为4000r/min离心20min，取上清液测量其肽得率。同时用旋转蒸发器将上清液蒸发至黏稠状少许液体，取出蒸发后的液体倒入培养基中，培养基中的液体不宜过厚以免干燥不完全，将装有液体的培养基放入冰箱中直到液体被冻住，取出放入冷冻干燥机中干燥，得大豆肽粉。
实验例
实验例1、大豆肽得率测定
1.1测定方法
(1)蛋白质标准曲线绘制
蛋白质在范德华作用下能与考马斯亮蓝G250成一种蓝色染料，反应后的溶液在波长为595nm处有最大吸收值，吸光值的与蛋白质含量成正比。因此可通过对溶液颜色变化进行比色分析，来测定溶液中蛋白质含量。考马斯亮蓝使用前需进行过滤处理以防有沉淀，对测量结果产生较大影响。
准确配好100μg/mL的牛血清蛋白溶液。取6支试管，分别从0到5标上序号，按下表1中计量加入不同的试剂。绘制蛋白质的标准曲线，豆粕及大豆肽粉中的蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。
表1蛋白质含量测定标准曲线的制作
| 试剂 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 去离子水/mL | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 |
| 牛血清蛋白溶液/(100μg/mL) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
| 考马斯亮蓝G-250染液/mL | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示。标准曲线的回归方程为y＝0.0058x+0.0499，R2＝0.9977。
(2)大豆肽标准曲线的绘制
取6支试管按下表2的添加量分别加入牛血清蛋白、水和双缩脲试剂，在540nm处测量各试管吸光度，绘制大豆肽的标准曲线，发酵液及大豆肽粉中的多肽含量用双缩脲法测定。
表2大豆肽含量测定标准曲线的制作
| 试剂 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 去离子水/mL | 5.0 | 4.0 | 3.0 | 2.0 | 1.0 | 0 |
| 牛血清蛋白溶液/(5mg/mL) | 0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 |
| 双缩脲试剂/mL | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图2所示。标准曲线的回归方程为y＝0.0987x+0.0123，R2＝0.9971。
(3)大豆肽得率的测定
称取一定量的发酵液，加入2毫升双缩脲试剂，然后在540nm处测量吸光度，重复3次，把结果代入上述标准曲线中得到大豆肽含量。按照公式如下计算大豆肽得率：
T＝X/X1×100％
式中：T――大豆肽提取率，以质量分数计％；
X1――豆粕中蛋白质含量，单位为克每毫升(mg/mL)；
X――发酵液中大豆肽含量，单位为克每毫升(mg/mL)。
1.2测定结果
按照上述1.1中方法测定上述实施例1-10中所述方法制得发酵液中大豆肽的得率，记录于下表3中。
表3各实施例中大豆肽含量测定结果
可见，本发明所述利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，可有效利用豆粕为原料提取大豆肽，且大豆肽的提取效率较高。
实验例2抗氧化性能测定
2.1水解度的测定--甲醛滴定法
氨基酸为两性电解质，氨基酸的羧基不能直接用碱来滴定。常温状态下甲醛可以与氨基快速结合，形成羟甲基化合物，促使-NH3释放出H+，当H+释放之后就可用NaOH标准溶液去滴定H+，我们可以根据消耗NaOH标准溶液体积计算出氨基酸的含量。
蛋白质在酶的作用下，其水解包括下面三个过程
①肽键断裂：
②质子交换过程：-CHR'-COOH-NH2-CHR"→-CHR'-COO-+NH3 +-CHR"；
③氨基滴定阶段：
将3mL的水解液(100℃的灭菌锅中灭菌10min)放入100mL烧杯中，加入60mL去离子水，用0.05mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH为8.2，加入10mL中性甲醛溶液，继续滴定至pH为9.2，记下加入甲醛后消耗的NaOH标准溶液体积V1。空白组以相同体积未经水解的豆粕溶液做实验，V0为加入中性甲醛后所耗的NaOH标准溶液体积。以上的滴定需在磁力搅拌器上进行保证溶液的充分混匀。
水解度的计算见下式：
式中，C--样品蛋白浓度(mg/mL)；
V--用于甲醛滴定的水解液的体积数(mL)；
0.05--氢氧化钠摩尔浓度(mol/L)；
htot--每克黑豆蛋白质中肽键的毫摩尔数(7.8mmol/g)。
按照上述方法对实施例7和8中所得大豆肽产物的水解度进行测定，结果见下表4。
表4大豆肽水解度测定结果
| 编号 | 大豆肽得率/％ |
| 实施例7 | 24.51 |
| 实施例8 | 19.47 |
2.2超氧阴离子自由基清除率的测定
当邻苯三酚处在弱碱性的环境中时(pH为8.2的Tris-HCL缓冲液)它自身能够迅速氧化分解，产生超氧阴离子自由基和黄棕色的中间产物，黄棕色的中间产物在325nm处有最大吸收波长，可根据黄棕色中间产物生成量来判断Pyrogallol自氧化程度。反应体系有抗氧化剂的存在时，超氧阴离子被清除，黄棕色中间产物的生成减少，吸光度降低。在325nm最大吸收波长处进行吸光度测定，可以检测抗氧化剂清除超氧阴离子自由基的能力。
取质量浓度2％的大豆肽溶液0.1mL，然后加入0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和0.45mol/L焦性没食子酸溶液0.1mL，空白组以相同体积的去离子水代替样品溶液。放于漩涡混匀器混匀，待反应至4分钟后时立即加入2％的盐酸溶液0.1mL，依旧放于漩涡混匀器混匀，在325nm波长处测吸光度A。盐酸溶液可以改变Pyrogallol的碱性环境，为了减少实验误差，在本实验中盐酸作为Pyrogallol氧化分解的促停剂来使用。
以空白的吸光度为A0，加大豆肽样品时吸光度为AS，按照如下公式计算超氧阴离子自由基清除率。
取上述实施例7和实施例8中发酵所得的大豆肽，分别配置成浓度为1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL和1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL溶液，按照上述方法测其超氧阴离子清除率，结果见图3-A、3-B所示。实施例7中大豆肽对自由基清除能力IC50为3.99mg/mL，实施例8中大豆肽对自由基清除能力IC50为5.25mg/mL。2.3DPPH·清除率的测定
DPPH是一种稳定的有机自由基，在有机溶剂乙醇中呈现紫红色，在波长为517nm处有最大吸收值。当反应体系中有自由基清除剂的存在时存在时，由于与其单电子配对而使其紫红色逐渐消失吸光度减小，其减小的程度与其所接受的电子数成定量关系。DPPH法是一种测定大豆肽抗氧化能力的简单有效的方法，在国内外广泛应用。
试剂配制：准确称取4mgDPPH置于100mL的棕色容量瓶中，加入95％的乙醇定容至刻度线，将配好后的0.1mmol/LDPPH乙醇溶液，放入冰箱中避光保存备用。
取相同质量浓度的大豆肽溶液0.5mL，在100℃的灭菌锅中灭菌10min，加入3.5mL0.1mmol/LDPPH乙醇溶液混合均匀后，在室温反应20min后，以4000r/min离心10min，于517nm处测量其吸光值Ai。空白组不加入DPPH·溶液而加入3.5mL 95％的乙醇溶液，在相同的波长处测定其吸光值Aj。将样品溶液换为相同体积的去离子水是对照组，并在相同波长处测量的吸光值A0，空白管是加入0.5mL去离子水和3.5mL 95％的乙醇溶液，按如下公式计算DPPH·清除率。重复测量三次，取平均值。
DPPH·清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％。
分别取实施例7和8中所制得的含大豆肽，都配置成浓度为5mg/mL，10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL溶液，按照上述方法测其DPPH·清除率，结果见图4-A、4-B所示。实施例7中大豆肽对DPPH自由基清除能力IC50为13.29mg/mL，实施例8中大豆肽对自由基清除能力IC50为15.52mg/mL。
可见，本发明所述制备大豆肽的方法所得大豆肽产品的抗氧化性能较好。
实施例3大豆肽粉感官评定
3.1大豆肽粉的理化指标
以GB/T 22492-2008大豆肽粉的标准对冷冻干燥后的大豆肽粉进行理化指标测定，其检测结果见表5。
表5大豆肽粉的理化指标
| 项目 | 含量/％ | GB/T 22492—2008标准 |
| 大豆肽粉中粗蛋白含量/％ | 80.14 | ≥80.0 |
| 大豆肽粉中多肽含量/％ | 73.61 | ≥55.0 |
3.2大豆肽粉的感官评定
对冷冻干燥后的大豆肽粉进行感官评定，以GB/T 22492-2008大豆肽粉中的感官要求为评价标准，将实施例7和8中经冷冻干燥后得到的大豆肽粉进行各项感官指标测定，测定标准及测定结果见下表6。
表6大豆肽粉的感官指标及结果
由表6数据可知本发明所述方法发酵制备出的大豆肽粉达到GB/T22492--2008大豆肽粉要求的三级指标，感官指标亦达到其要求。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取豆粕粉加水溶解得豆粕粉溶液，并将所述豆粕粉进行灭菌处理；
(2)取灭菌后的豆粕粉溶液接种入枯草芽孢杆菌，并进行发酵培养；
(3)取发酵液滤除残渣，取滤液并调节滤液pH值4-4.2，离心并收集上清液；
(4)将所述上清液蒸发浓缩至黏稠状少许液体，随后冷冻至凝固态，并冷冻干燥至粉状，即得大豆肽粉。
2.根据权利要求1所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述豆粕粉和水的料液比为1：10-30。
3.根据权利要求1或2所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述枯草芽孢杆菌的接种量为1wt％-5wt％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述发酵温度为25-45℃。
5.根据权利要求1-4任一项所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述发酵时间为16-48h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，还包括在接种步骤前将所述豆粕粉溶液的pH值调节至6.0-8.0的步骤。
7.根据权利要求1-6任一项所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述离心步骤为3000-4000rpm低速离心。
8.根据权利要求1-7任一项所述的利用枯草芽孢杆菌发酵制备大豆肽的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述发酵步骤具体为：在发酵过程的后1/2发酵时间内，其发酵温度相比于前1/2发酵时间内提升5℃。
9.由权利要求1-8任一项所述方法制备得到的大豆肽。
10.权利要求9所述大豆肽用于制备抗氧化制剂的用途。
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| CN110564795A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-13 | 泉后(广州)生物科技研究院有限公司 | 大豆多肽及其制备方法和在化妆品中的应用 |
| CN110637916A (zh) * | 2018-06-27 | 2020-01-03 | 北京天地中科生态工程技术研究院(普通合伙) | 一种食用发酵短肽及制备方法 |
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