CN104000003B - 湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物，将荞麦蛋白、糖、水按1:1:1000～1:7:1000的质量比混合，调pH到10～12，50～70℃水浴90～120min，冰浴5～10min，-15～-25℃冷冻6-12h后进行冷冻干燥。本发明还公开了由以上方法得到的荞麦蛋白-糖接枝物及其在功能性食品的应用。本发明还提供了一种产量较高的荞麦蛋白的提取方法，经处理，得到了荞麦蛋白，是一种优质的植物蛋白。本发明制备方法简单，效果良好。测定上述荞麦蛋白-糖接枝物的抗氧化效果，并用相同量的糖类、荞麦蛋白、抗坏血酸作对照，结果显示，荞麦蛋白-糖接枝物表现出良好的抗氧化性。

Description

湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物

技术领域

本发明属于植物蛋白领域，具体涉及湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物及其应用。

背景技术

植物蛋白具有资源丰富、价格低廉、能量转化效率高、几乎不含胆固醇和饱和脂肪酸等优点，逐渐成为人类主要的蛋白质来源。荞麦属于蓼科荞麦属双子叶植物，具有较高的营养价值和药用价值，被现代营养学家誉为21世纪有前途的最风行的绿色食品。荞麦蛋白是荞麦中的主要生物活性成分，它不同于谷类作物蛋白，荞麦蛋白质主要是谷蛋白、水溶性清蛋白和盐溶性球蛋白等。这类蛋白质的粘性差，无面筋性，近似于豆类植物蛋白，其蛋白质质量优于大米、小麦和玉米蛋白。从氨基酸组成来看，荞麦蛋白含有19种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸，且氨基酸配比适宜，符合或超过联合国粮农组织和世界卫生组织对食物蛋白质中必需氨基酸含量规定的指标，与鸡蛋蛋白质的营养相似。荞麦蛋白还具有降低液胆固醇、抑制脂肪蓄积、改善便秘、抗衰老、抑制有害物的吸收等生理功能。荞麦蛋白具有较高的持水性、乳化性、起泡性和咀嚼性及良好的生理生化性质。这为荞麦蛋白在食品工业的广泛应用提供了基础。这正是本发明的出发点。

美拉德反应，又称羰氨反应，是指含有氨基的化合物和含有羰基的化合物之间经缩合、聚合，最终生成类黑精的反应。由于其产物是棕色的，也被称为褐变反应。反应物中羰基化合物包括还原糖、醛、酮；氨基化合物包括氨基酸、肽、蛋白质、胺。MRPs中含有类黑精、还原酮及一系列含I、H的杂环化合物，它们有一定的抗氧化性能。通常美拉德反应所需要的氨基化合物和羰基化合物的选择范围非常广泛，但是接枝物的抗氧化性各有差异。选择适当的氨基化合物和羰基化合物，可以显著提高接枝物的抗氧化性。

湿热法是以液相为反应体系，一般用于蛋白质与单糖或双糖的接枝反应中。其反应的初始步骤与干热法类似，将蛋白质和糖按照一定的糖配比混合，并用特定pH值的缓冲溶液将其溶解，搅拌均匀后，利用水浴或者油浴进行反应，反应结束后立即冰浴。湿热法的反应时间相对于干热法来说要短，通常适用于蛋白质-单糖(或双糖)接枝物的制备。

冷冻干燥是将待干燥物快速冻结后，再在高真空条件下将其中的冰升华为水蒸气而去除的干燥方法。由于冰的升华带走热量使冻干整个过程保持低温冻结状态，有利于保留一些生物样品的活性。因此用冷冻干燥法制备一种荞麦蛋白-木糖接枝物。

与很多化学和酶法对蛋白质改性的方法相比，美拉德反应的方法具有很好的安全性；此外，该法还能极大的改善蛋白乳化性，改善不溶的面筋蛋白溶解性。这种以美拉德反应制备的荞麦蛋白-糖接枝物可用作乳化剂、抗氧化剂和抑菌剂，可应用于食品、药品和化妆品中。荞麦蛋白被糖类接枝后，其消化率增加，利于人体吸收，本身的很多功能性质也会有所提高。因此，本发明以荞麦蛋白为氨基化合物，以糖类为羰基化合物，利用湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物。以羟基自由基(·OH)的清除率，二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除率和超氧阴离子(O₂ ^-·)的清除率为考察指标，利用单因素试验，确定制备荞麦蛋白-糖接枝物各因素的最佳参数。

发明内容

本发明的目的在于由湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物，制备方法简单、效果良好、易于生产。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物，荞麦蛋白、糖、水按1:1:1000～1:7:1000的质量比混合，调pH到10～12，50～70℃水浴90～120min，冰浴5～10min，-15～-25℃冷冻6～12h后冷冻干燥。

优选地，所述糖为单糖。

优选地，所述荞麦蛋白由荞麦粉经碱溶酸沉法的提取方法制备。

优选地，所述提取方法的操作步骤如下：

第一步、取质量比为1:6～1:14的荞麦粉和水混合，调节pH到10～12，搅拌，离心得到上清液；调节所述上清液的pH到4.5，离心获得沉淀物；

第二步、将第一步所得的沉淀物经透析、冷冻干燥得荞麦蛋白。

优选地，第一步中，所述搅拌是在20℃磁力搅拌30～120min；

所述离心是10～30℃下，4000～5000r/min离心10～20min。

优选地，所述第二步具体操作为所得的沉淀物用流动水透析18～24h，用去离子水透析18～24h后，低温静置18～24h，经冷冻干燥获得荞麦蛋白粉末。

本发明还提供所述湿热法制备的荞麦蛋白-糖接枝物。

本发明还提供所述荞麦蛋白-糖接枝物在功能性食品中的应用。

本发明提供了一种荞麦蛋白的制备方法，经处理，得到了荞麦蛋白，是一种优质的植物蛋白。这种蛋白与糖经过湿热法美拉德反应，制备了荞麦蛋白-糖接枝物。本发明制备方法简单，效果良好。测定上述荞麦蛋白-糖接枝物的抗氧化效果，并用相同量的糖、荞麦蛋白、抗坏血酸作对照，结果显示，荞麦蛋白-糖接枝物表现出良好的抗氧化性。

附图说明

本发明附图4幅，

图1、荞麦蛋白-糖接枝物对羟自由基(·OH)的清除；

图2、荞麦蛋白-糖接枝物对二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除；

图3、荞麦蛋白-糖接枝物对超氧阴离子(O₂ ^-·)的清除；

图4、荞麦蛋白-糖接枝物的溶解率。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：

本发明所用荞麦粉为市售普通荞麦粉。

实施例1

荞麦蛋白的制备

荞麦蛋白的提取方法如下：

第一步、取荞麦粉与水按1:10的质量比混合，用1mol/LNaOH调pH到10后，20℃磁力搅拌30min；20℃、5000r/min离心20min得到上清液；再用1mol/LHCl调pH到4.5，产生沉淀后20℃、4000r/min离心15min，离心获得沉淀物；

第二步、所得的沉淀物用流动水透析18～24h，用去离子水透析18～24h后，低温静置18～24h，经冷冻干燥获得米白色荞麦蛋白粉末。

实施例2

荞麦蛋白-木糖接枝物的制备及抗氧化性的研究

一、将所得米白色荞麦蛋白粉末与木糖制备成荞麦蛋白-木糖接枝物,接枝物的的原材料是以荞麦蛋白为氨基化合物，以木糖为羰基化合物：将荞麦蛋白、木糖、水按1:5:1000的质量比混合，用1mol/LNaOH调pH到12，在温度50℃的条件下水浴120min，反应结束后立即冰浴5min，然后-20℃冷冻6～12h，冷冻干燥成粉末得到荞麦蛋白-木糖接枝物粗产品，4℃条件下保存。

二、将所得荞麦蛋白和荞麦蛋白-木糖接枝物进行抗氧化性比对

1、荞麦蛋白和荞麦蛋白-木糖接枝物对羟基自由基(·OH)清除率的测定

取磷酸盐缓冲液(0.15mol/L，pH7.4)1.5mL，1.10-菲咯啉(0.75mmol/L)1.0mL，新配制的硫酸亚铁溶液(0.75mmol/L)1mL，再加入浓度为1.2mg/mL的荞麦蛋白水溶液或荞麦蛋白-木糖接枝物水溶液1mL，最后再加入0.01％的过氧化氢1.0mL，混匀后于37℃恒温水浴中保温30min，冷却后在530nm处测吸光度值。以蒸馏水调零，空白组以等体积去离子水代替样品溶液，对照组以等体积去离子水代替样品溶液和过氧化氢溶液，以同一浓度的抗坏血酸水溶液代替样品作对比实验。结果按下式计算：

清除率(％)＝[A_对照-A_样品/A_对照-A_空白]×100％

测定荞麦蛋白、荞麦蛋白-木糖接枝物和抗坏血酸对羟基自由基(·OH)清除率，荞麦蛋白-木糖接枝物的清除率较荞麦蛋白的清除率提高了很多，结果表明荞麦蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力强于荞麦蛋白(见表4、图1)。

2、荞麦蛋白和荞麦蛋白-木糖接枝物对二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)清除率的测定

取浓度为1.2mg/mL的荞麦蛋白水溶液或荞麦蛋白-木糖接枝物水溶液2.0mL，分别加入0.2mmol/L的DPPH溶液2.0mL，混匀后避光反应静置30min。以无水乙醇调零，在517nm处测定吸光度值A_样品，无水乙醇代替DPPH溶液的吸光度值为A_对照，无水乙醇代替样品溶液的吸光度值为A_空白，以同一浓度抗坏血酸水溶液代替样品作对比实验。结果按下式计算：

清除率(％)＝[1-(A_样品-A_对照)/A_空白]×100％

测定荞麦蛋白、荞麦蛋白-木糖接枝物和抗坏血酸对二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)清除率，荞麦蛋白-木糖接枝物的清除率较荞麦蛋白的清除率有所提高，结果表明荞麦蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力强于荞麦蛋白(见表5、图2)。

3、荞麦蛋白和荞麦蛋白-木糖接枝物对超氧阴离子(O₂ ^-·)清除率的测定

取4.5mL的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.2)于比色管中，置于25℃恒温水浴中预热20min，加入浓度为1.2mg/mL的荞麦蛋白水溶液或荞麦蛋白-木糖接枝物水溶液0.1mL，再加入0.4mL在25℃恒温水浴中早已预热好的邻苯三酚溶液(7mmol/L)，摇匀后与25℃恒温水浴准确反应4min，然后加入2滴浓盐酸(10mol/L)终止反应，于320nm处测其吸光度值。以同一浓度的抗坏血酸水溶液代替样品作对比实验。结果按下式计算：

清除率(％)＝[1-(A_b-A_c)/A_a]×100％

其中：

A_a:不加样品，加邻苯三酚

A_b:加样品，加邻苯三酚

A_c:加样品，不加邻苯三酚(见表6、图3)。

测定荞麦蛋白、荞麦蛋白-木糖接枝物和抗坏血酸对超氧阴离子(O₂ ^-·)清除率，荞麦蛋白-木糖接枝物的清除率较荞麦蛋白的清除率有所提高，结果表明荞麦蛋白-木糖接枝物的抗氧化能力强于荞麦蛋白。

三、将所得荞麦蛋白与荞麦蛋白-木糖接枝物做体内抗氧化性评价，测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力、过氧化氢酶(CAT)的活力及丙二醛(MDA)的含量。

选取健康昆明种小鼠72只，体重20±2g，用普通饲料喂养7天以适应环境；之后随机分为6组，每组12只，雌雄各半。空白对照组小鼠每天灌胃生理盐水，阳性对照组小鼠每天灌胃抗坏血酸水溶液，正常对照组小鼠每天灌胃荞麦蛋白水溶液，三剂量组每日分别按10mg/kg·d、20mg/kg·d、50mg/kg·d剂量灌胃荞麦蛋白-木糖接枝物，各组自由饮水，自由摄食，饲喂40天后，禁食12h，摘除眼球进行眼眶采血，并解剖取肝脏，冷冻备用。

(1)超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

按照试剂盒(生产厂商：南京建成)说明书要求采用黄嘌呤氧化酶法。

测定原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计在550nm处测定其吸光度。

表1荞麦蛋白与荞麦蛋白-木糖接枝物对小鼠体内SOD活力的影响

(2)过氧化氢酶(CAT)活力测定

按照试剂盒(生产厂商：南京建成)说明书要求采用钼酸铵比色法。

测定原理：过氧化氢酶分解过氧化氢的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的过氧化氢与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其吸光度，计算出CAT的活力。

表2荞麦蛋白与荞麦蛋白-木糖接枝物对小鼠体内CAT活力的影响

(3)丙二醛(MDA)含量测定

按照试剂盒(生产厂商：南京建成)说明书要求采用硫代巴比妥酸法。

测定原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在532nm处测定其吸光度。

表3荞麦蛋白与荞麦蛋白-木糖接枝物对小鼠体内MDA含量的影响

四、将所得荞麦蛋白与荞麦蛋白-木糖接枝物溶于水中，测其不同pH条件下的溶解率。

将相同质量的荞麦蛋白粉末和荞麦蛋白-木糖接枝物粉末用少量水溶解，用考马斯亮蓝法对比研究了荞麦蛋白与荞麦蛋白-木糖接枝物在不同pH条件下的溶解情况。结果显示荞麦蛋白-木糖接枝物的溶解状态非常好。(见图4)。

实施例3

荞麦蛋白-葡萄糖接枝物的制备及抗氧化性的研究。

一、将所得米白色荞麦蛋白粉末与葡萄糖制备成荞麦蛋白-葡萄糖接枝物，接枝物的的原材料是以荞麦蛋白为氨基化合物，以葡萄糖为羰基化合物：将荞麦蛋白、葡萄糖、水按1:5:1000的质量比混合，用1mol/LNaOH调pH到12，在温度50℃的条件下水浴120min，反应结束后立即冰浴5min，然后-20℃冷冻过夜，冷冻干燥成粉末得到荞麦蛋白-葡萄糖接枝物粗产品，4℃条件下保存。

二、将所得荞麦蛋白和荞麦蛋白-葡萄糖接枝物进行抗氧化性比对

1、荞麦蛋白和荞麦蛋白-葡萄糖接枝物对羟基自由基(·OH)清除率的测定

取磷酸盐缓冲液(0.15mol/L，pH7.4)1.5mL，1.10-菲咯啉(0.75mmol/L)1.0mL，新配制的硫酸亚铁溶液(0.75mmol/L)1mL，再加入浓度为1.2mg/mL的荞麦蛋白溶液或荞麦蛋白-葡萄糖接枝物溶液1mL，最后再加入0.01％的过氧化氢1.0mL，混匀后于37℃恒温水浴中保温30min，冷却后在530nm处测吸光度值。以蒸馏水调零，空白组以等体积去离子水代替样品溶液，对照组以等体积去离子水代替样品溶液和过氧化氢溶液，以同一浓度的抗坏血酸代替样品作对比实验。结果按下式计算：

清除率(％)＝[A_对照-A_样品/A_对照-A_空白]×100％

最终得到荞麦蛋白、荞麦蛋白-葡萄糖接枝物和抗坏血酸对羟基自由基(·OH)清除率，荞麦蛋白-葡萄糖接枝物的清除率较荞麦蛋白的清除率有所提高，说明荞麦蛋白-葡萄糖接枝物的抗氧化能力强于荞麦蛋白。(见表4、图1)。

表4荞麦蛋白-糖接枝物对羟自由基(·OH)的清除

2、荞麦蛋白和荞麦蛋白-葡萄糖接枝物对二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)清除率的测定

取浓度为1.2mg/mL的荞麦蛋白溶液或荞麦蛋白-葡萄糖接枝物溶液2.0mL，分别加入0.2mmol/L的DPPH溶液2.0mL，混匀后避光反应静置30min。在517nm处测定吸光度值A_样品，以无水乙醇代替DPPH溶液的吸光度值为A_对照，无水乙醇代替样品溶液的吸光度值为A_空白，以同一浓度抗坏血酸代替样品作对比实验。结果按下式计算：

清除率(％)＝[1-(A_样品-A_对照)/A_空白]×100％

最终得到荞麦蛋白、荞麦蛋白-葡萄糖接枝物和抗坏血酸对二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)清除率，荞麦蛋白-葡萄糖接枝物的清除率较荞麦蛋白的清除率有所提高，说明荞麦蛋白-葡萄糖接枝物的抗氧化能力强于荞麦蛋白。(见表5、图2)

表5荞麦蛋白-糖接枝物对二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除

3、荞麦蛋白和荞麦蛋白-葡萄糖接枝物对超氧阴离子(O₂ ^-·)清除率的测定

取4.5mL的Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH8.2)于比色管中，置于25℃恒温水浴中预热20min，加入浓度为1.2mg/mL的荞麦蛋白溶液或接枝物溶液0.1mL，再加入0.4mL在25℃恒温水浴中早已预热好的邻苯三酚溶液(7mmol/L)，摇匀后与25℃恒温水浴准确反应4min，然后加入2滴浓盐酸(10mol/L)终止反应，于320nm处测其吸光度值。以同一浓度抗坏血酸代替样品作对比实验。结果按下式计算：

清除率(％)＝[1-(A_b-A_c)/A_a]×100％

其中：A_a:不加样品，加邻苯三酚

A_b:加样品，加邻苯三酚

A_c:加样品，不加邻苯三酚

最终得到荞麦蛋白、荞麦蛋白-葡萄糖接枝物和抗坏血酸对超氧阴离子(O₂ ^-·)清除率，荞麦蛋白-葡萄糖接枝物的清除率较荞麦蛋白的清除率提高了很有所提高，说明荞麦蛋白-葡萄糖接枝物的抗氧化能力强于荞麦蛋白。(见表6、图3)。

表6荞麦蛋白-糖接枝物对超氧阴离子(O₂ ^-·)的清除

三、将所得荞麦蛋白与荞麦蛋白-葡萄糖接枝物做体内抗氧化性评价，测定超氧化物歧化酶(SOD)的活力、过氧化氢酶(CAT)的活力及丙二醛(MDA)的含量。

选取健康昆明种小鼠72只，体重20±2g，用普通饲料喂养7天以适应环境；之后随机分为6组，每组12只，雌雄各半。空白对照组小鼠每天灌胃生理盐水，阳性对照组小鼠每天灌胃抗坏血酸溶液，正常对照组小鼠每天灌胃荞麦蛋白溶液，三剂量组每日分别按10mg/kg·d、20mg/kg·d、50mg/kg·d剂量灌胃荞麦蛋白-葡萄糖接枝物，各组自由饮水，自由摄食，饲喂40天后，禁食12h，摘除眼球进行眼眶采血，并解剖取肝脏，冷冻备用。

(1)超氧化物歧化酶(SOD)活力测定

按照试剂盒说明书要求采用黄嘌呤氧化酶法。

表7荞麦蛋白与荞麦蛋白-葡萄糖接枝物对小鼠体内SOD活力的影响

(2)过氧化氢酶(CAT)活力测定

按照试剂盒说明书要求采用钼酸铵比色法。

表8荞麦蛋白与荞麦蛋白-葡萄糖接枝物对小鼠体内CAT活力的影响

(3)丙二醛(MDA)含量测定

按照试剂盒说明书要求采用硫代巴比妥酸法。

表9荞麦蛋白与荞麦蛋白-葡萄糖接枝物对小鼠体内MDA含量的影响

四、将所得荞麦蛋白与荞麦蛋白-葡萄糖接枝物溶于水中，测其不同pH条件下的溶解率。

将相同质量的荞麦蛋白粉末和荞麦蛋白-葡萄糖接枝物粉末用少量水溶解，用考马斯亮蓝法对比研究了荞麦蛋白与荞麦蛋白-葡萄糖接枝物在不同pH条件下的溶解情况。结果显示接枝物的溶解状态非常好。(见图4)。

Claims (7)

1.一种采用湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物的制备方法，其特征在于荞麦蛋白、糖、水按1:1:1000～1:7:1000的质量比混合，调pH到10～12，50～70℃水浴90～120min，冰浴5～10min，-15～-25℃冷冻6～12h后进行冷冻干燥；

所述糖为木糖或葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的采用湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物的制备方法，其特征在于所述荞麦蛋白由荞麦粉经碱溶酸沉的提取方法制备。

3.根据权利要求2所述的采用湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物的制备方法，其特征在于所述提取方法的操作步骤如下：

第一步、取质量比为1:6～1:14的荞麦粉和水混合，调节pH到10～12，搅拌，离心得到上清液；调节所述上清液的pH到4.5，离心获得沉淀物；

第二步、将第一步所得的沉淀物经透析、冷冻干燥得荞麦蛋白。

4.根据权利要求3所述的采用湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物的制备方法，其特征在于：

第一步中，所述搅拌是在20℃磁力搅拌30～120min；所述离心是10～30℃下，4000～5000r/min离心10～20min。

5.根据权利要求3所述的采用湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物的制备方法，其特征在于：

所述第二步具体操作为所得的沉淀物用流动水透析18～24h，用去离子水透析18～24h后，低温静置18～24h，经冷冻干燥获得荞麦蛋白粉末。

6.权利要求1～5任意一项所述采用湿热法美拉德反应制备荞麦蛋白-糖接枝物的制备方法得到的荞麦蛋白-糖接枝物。

7.权利要求6所述荞麦蛋白-糖接枝物在功能性食品中的应用。