CN107296283A - 一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法制备方法属于食品加工技术；该方法包括以下步骤：(1)碱溶酸沉工艺制备大豆分离蛋白；(2)大豆分离蛋白溶液中添加自由基引发物；(3)添加花青素，利用引发物结构中过氧键分解断裂产生的自由基引发花青素聚合至蛋白大分子，制备大豆分离蛋白‑花青素自由基接枝物；(4)样品溶液进行超滤离心处理，以超滤出未发生反应的游离花青素；(5)冻干制备大豆分离蛋白‑花青素自由基接枝物粉末。依据本技术发明生产的大豆分离蛋白‑花青素自由基接枝物具有高抗氧化性能，其铁离子还原力可达0.634Abs，DPPH自由基清除率为63.26％，羟自由基(·OH)清除能力为42.60％，超氧阴离子自由基(O2 －·)清除能力为59.82％。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术，主要涉及一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法。
背景技术
大豆分离蛋白的氨基酸种类将近20种，同时含人体必需氨基酸。不含胆固醇，其具有独特的高营养价值及感官特性，为植物蛋白中不可多得的能够代替动物蛋白的食品之一。随着大豆分离蛋白在食品领域中越来越广泛地应用，消费者对拥有特定营养以及功能特性的蛋白质需求量也日渐增加。因此，可以借助物化技术及生物学手段，赋予大豆分离蛋白抗氧化功能及更优异的功能特性，能够有效地促进大豆分离蛋白在食品等加工领域的迅速发展。花青素属于酚类化合物中的类黄酮类(flavonoids)，基本结构包含二个苯环，并由-3碳的单位连结，主要包括矢车菊素、飞燕草素、芍药花色素、牵牛花色素等。花青素具有突出的抗氧化能力，并兼有预防心脑血管疾病，保护肝脏等作用，也是良好的肿瘤抑制剂、血管保护剂、辐射防护剂及抗发炎剂。但是通过简单的搅拌复合等方式很难制备十分稳定的大豆分离蛋白-花青素复合物，两者的相互作用不够紧密，因而并非能有效增强蛋白质的抗氧化能力及其他功能特性。故需要利用开发一种新的技术来增强两者互作作用，制备具有高抗氧化能力的营养型复合物。
接枝聚合在由一种或几种单体组成的聚合物的主链上，通过一定的途径接上由另一种单体或几种单体组成的支链的共聚反应。接枝聚合手段是高聚物改性手段中最易实现的一种化学改性方式，其目的是把拥有特定功能特性的小分子接枝到高分子上以制备新型复合物，使复合物兼有两种物质的功能特性，赋予大分子新的特性，因而拓宽蛋白等大分子在各领域内的应用。接枝聚合技术中，选择合适的自由基引发剂尤为重要，其中Vitamin C-H2O2的引发体系越来越受到关注。这种引发体系的操作条件温和，不会产生有毒害成分，同时Vitamin C又具有增强免疫力，预防癌症、心脏病、中风，保护牙齿和牙龈等作用。因此该引发体系在食品领域的应用前景十分良好。
Vitamin C-H2O2引发体系在食品接枝聚合应用方面的研究并非十分成熟，蛋白质与酚类物质的互作机理及两者复合产品在人体消化吸收中发挥的保健作用机理也尚处于研究阶段。针对此类研究，国内外的相关专利为数不多。现有的发明也都主要集中在较单一的蛋白原料上，同时由于使用的蛋白来源不同，与酚类物质的互作效果也就各有差异，而利用花青素与蛋白互作形成共聚物的研究尚未见报道。因而，考虑到因具有高营养价值而受到食品及保健品行业广泛亲睐的大豆分离蛋白抗氧化性能差，本发明将利用自由基引发剂中过氧键分解断裂产生的自由基来引发花青素聚合到蛋白大分子上，以制备大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物，从而赋予大豆分离蛋白显著抗氧化能力。这为大豆蛋白作为食品配料和功能性食品配方的使用开拓了更好的前景。故对于开发一种大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物的制备方法，意义重大。
发明内容
本发明所要解决的问题，提供一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，以赋予大豆分离蛋白自身不具备的强抗氧化性能。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白溶于水，制成大豆蛋白溶液，加热大豆蛋白溶液到50℃，调节其pH为9.2后，向溶液中加入碱性蛋白酶酶解0.5h，酶解后灭酶得到混合液；
(2)向混合液中添加自由基引发物进行反应；
(3)添加花青素进行反应，利用引发物结构中过氧键分解断裂产生的自由基而引发花青素聚合至蛋白分子上，制备大豆蛋白-花青素复合物溶液；
(4)将大豆蛋白-花青素复合物溶液进行超滤离心处理，以超滤出未发生反应的游离花青素；
(5)冷冻干燥得到大豆蛋白-花青素复合物粉末。
所述的步骤(2)中优选自由基引发物为Vitamin C及H2O2。
所述的步骤(2)中Vitamin C最终浓度0.02-0.05g·L-1，H2O2最终浓度0.05-0.15mol·L-1。
所述的步骤(3)中优选大豆蛋白与花青素质量比值为20:1-100:1。
所述的步骤(3)中花青素的终浓度为0.1-0.5g·L-1。
所述步骤(2)中自由基引发体系同大豆蛋白反应条件为25℃，3.5h；所述的步骤(3)中花青素同大豆蛋白的反应条件为25℃，36h。
所述的步骤(4)中超滤离心优选参数为：相对离心力5000×g，超滤时间15min。
所述的大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物在保健品及医药领域的应用。
本发明的制备方法时采用大豆分离蛋白为主料，添加Vitamin C-H2O2引发体系作自由基引发剂，大豆分离蛋白分子在羟基自由基作用下能够变成具有活性的大分子，以便同花青素小分子互作产生具有显著抗氧化性的大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物。同时，大豆分离蛋白原材料来源广，营养价值高，易于生产制备等优点，花青素具有高效生物活性市场，大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物前景广泛,可应用于一定工业规模的生产。
本发明的显著效果
相较于单一的大豆分离蛋白及搅拌混合制备的复合物，本发明制备的大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物，抗氧化能力显著提高，铁离子还原力最高可达0.634Abs，DPPH自由基清除率为63.26％，羟自由基(·OH)清除能力为42.60％，超氧阴离子自由基(O2 －·)清除能力为59.82％。本发明采用大豆分离蛋白为主料制备的大豆分离蛋白-花青素具有较高的抗氧化能力。
附图说明
附图 大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物的制备工艺流程
具体实施方式
下面结合附图1对本发明具体实施例进行详细描述：
一种大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)利用碱溶酸沉工艺制备大豆分离蛋白；(2)在大豆分离蛋白溶液中添加自由基引发物；(3)依照大豆蛋白与花青素质量比添加花青素，利用引发物结构中过氧键分解断裂产生的自由基而引发花青素聚合至蛋白大分子，制备大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物；(4)样品溶液在适宜相对离心力条件下进行超滤离心处理，以超滤出未发生反应的游离花青素；(5)冷冻干燥处理制备大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物粉末。
所述的优选自由基引发物为Vitamin C及H2O2。
所述的Vitamin C最终浓度0.02-0.05g·L-1，H2O2最终浓度0.05-0.15mol·L-1。
所述的优选大豆蛋白与花青素质量比值为20:1-100:1。
所述花青素的终浓度为0.1-0.5g·L-1。
所述自由基引发体系同大豆分离蛋白反应条件为2℃，3.5h；所述花青素同大豆分离蛋白的反应条件为25℃，36h。
所述的超滤离心优选参数为：相对离心力5000×g，超滤时间15min。
所述方法制备的大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物。
所述的大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物在保健品及医药领域的应用。
(1)还原力测定
取蛋白浓度为5mg/mL的样品溶液0.5mL，注入浓度为0.2mol/L pH为6.6的磷酸盐缓冲液和1％铁氰化钾溶液各2.5mL，混合均匀，置于50℃水浴中20min，后迅速冷却，加入10％的三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混匀后于3000r/min条件下离心处理10min。取2.5mL得到的上清液，分别加入去离子水2.5mL及0.1％的氯化铁溶液0.5mL，混匀后静置10min，于700nm波长处测定吸光值A700。
(2)DPPH自由基清除能力测定
配制浓度为0.1mmol/L的DPPH-乙醇溶液，现用现配，避光保存。取2mL的上述溶液，加入1mL一定蛋白浓度的蛋白或者接枝物溶液，混合均匀后，室温下置于黑暗中反应30min，然后测定517nm下溶液的吸光值。用去离子水替代样品溶液作为对照，用无水乙醇替代DPPH-乙醇的溶液作为空白。DPPH自由基清除能力根据下式计算：
式中，AC为对照的吸光值；AS为样品溶液的吸光值；A0为空白的吸光值。
(3)羟基自由基(OH·)清除能力的测定
取9mmol/L FeSO4和9mmol/L水杨酸乙醇溶液各2mL混匀，后加入2mL 10mg/mL的样品液，最后加入2mL 8.8mmol/L H2O2。以2mL去离子水代替样液作为对照液，置于37℃下保温30min。以去离子水为参比，在510nm波长处测定吸光值。OH·清除率的计算公式为：
式中：OD0为空白对照液吸光度值；ODx为加入样品液后吸光值；ODx0为样品的本底吸光度值
(4)超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力的测定
取10mg/mL蛋白和复合物的溶液0.2mL，依次加入4.5mL 50mmol/L tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)，4mL去离子水，混合均匀后置于27℃下保持10min，此为试剂A，邻苯三酚溶于10mmol/L HCl溶液配制浓度为3mmol/L的溶液，置于25℃下保温10min，此为试剂B。向试剂A中加入0.3mL的10mmol/mL HCl溶液混匀后作为空白对仪器调零，向试剂A中加入0.3mL试剂B快速混匀后，于320nm波长处测定溶液在3min内吸光度值的变化情况，每0.5min记录一次数据，回归计算得到吸光值变化率K1。用去离子水替代样品溶液重复上述操作过程作对照，计算得到吸光值变化率K0。对O2-·清除率的计算公式为：
实施例1：大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物的制备
大豆分离蛋白溶解于50mL蒸馏水中，置于100mL锥形瓶内，加入3.5mL 2M H2O2及2.5mg Vitamin C，搅拌混合3.5h，加入0.02g花青素，25℃条件下反应36h，将混合物在相对离心力5000×g条件下超滤15min，以完全除去游离花青素。获得的蛋白产品具有抗氧化能力。
实施例2：大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物的制备
大豆分离蛋白溶解于50mL蒸馏水中，置于100mL锥形瓶内，加入4.5mL 2M H2O2及3.5mg Vitamin C，搅拌混合3.5h，加入0.03g花青素，25℃条件下反应36h，将混合物在相对离心力5000×g条件下超滤15min，以完全除去游离花青素。获得的蛋白产品具有较强抗氧化能力。
实施例3：大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物的制备
大豆分离蛋白溶解于50mL蒸馏水中，置于100mL锥形瓶内，加入6.5mL 2M H2O2及4.5mg Vitamin C，搅拌混合3.5h，加入0.04g花青素，25℃条件下反应36h，将混合物在相对离心力5000×g条件下超滤15min，以完全除去游离花青素。获得的蛋白产品具有强抗氧化能力。
对照例1：大豆分离蛋白空白样的制备
大豆分离蛋白溶解于50mL蒸馏水中，置于100mL锥形瓶内，25℃条件下反应36h，将蛋白样品在相对离心力5000×g条件下超滤15min，最终制备成冷冻干燥蛋白粉末。
对照例2：大豆分离蛋白对照样的制备
大豆分离蛋白溶解于50mL蒸馏水中，置于100mL锥形瓶内，添加3.5mL 2M H2O2及2.5mg Vitamin C，搅拌混合3.5h，再于25℃条件下反应36h，将混合样品在相对离心力5000×g条件下超滤15min，最终制备成冷冻干燥粉末。
对照例3：大豆分离蛋白-花青素混合复合物的制备
大豆分离蛋白溶解于50mL蒸馏水中，置于100mL锥形瓶内，添加0.02g花青素，于25℃条件下反应36h，将混合样品在相对离心力5000×g条件下超滤15min，最终制备成冷冻干燥粉末。
对照例4：大豆分离蛋白-花青素混合复合物的制备
大豆分离蛋白溶解于50mL蒸馏水中，置于100mL锥形瓶内，添加0.03g花青素，于25℃条件下反应36h，将混合样品在相对离心力5000×g条件下超滤15min，最终制备成冷冻干燥粉末。
对照例5：大豆分离蛋白-花青素混合复合物的制备
大豆分离蛋白溶解于50mL蒸馏水中，置于100mL锥形瓶内，添加0.04g花青素，于25℃条件下反应36h，将混合样品在相对离心力5000×g条件下超滤15min，最终制备成冷冻干燥粉末。
对实施例1-3与对照例1-5的制备方法得到的复合物进行抗氧化能力的比对，比对结果见表1.
表1蛋白-花青素复合样品抗氧化性测定
还原力、DPPH自由基清除能力、羟基自由基(OH·)清除能力及超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力的测定是用来检测样品抗氧化能力的常用手段。测定结果越高，代表该样品的抗氧化能力越强。经上表比对可知，本发明制备的大豆分离蛋白-花青素自由基接枝物具有优越的抗氧化能力。
Claims (7)
1.一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将大豆分离蛋白溶于水，制成大豆蛋白溶液，加热大豆蛋白溶液到50℃，调节其pH为9.2后，向溶液中加入碱性蛋白酶酶解0.5h，酶解后灭酶得到混合液；
(2)向混合液中添加自由基引发物进行反应；
(3)添加花青素进行反应，利用引发物结构中过氧键分解断裂产生的自由基而引发花青素聚合至蛋白分子上，制备大豆蛋白-花青素复合物溶液；
(4)将大豆蛋白-花青素复合物溶液进行超滤离心处理，以超滤出未发生反应的游离花青素；
(5)冷冻干燥得到大豆蛋白-花青素复合物粉末。
2.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中优选自由基引发物为Vitamin C及H2O2。
3.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中Vitamin C最终浓度0.02-0.05g·L-1，H2O2最终浓度0.05-0.15mol·L-1。
4.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中优选大豆蛋白与花青素质量比值为20:1-100:1。
5.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中花青素的终浓度为0.1-0.5g·L-1。
6.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中自由基引发体系同大豆蛋白反应条件为25℃，3.5h；所述的步骤(3)中花青素同大豆蛋白的反应条件为25℃，36h。
7.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白—花青素复合物的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中超滤离心优选参数为：相对离心力5000×g，超滤时间15min。
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