CN106706792A - 一种计算化学药物中有关物质含量的hplc‑elsd双校正因子法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，公开了一种计算化学药物中有关物质含量的HPLC‑ELSD双校正因子法。本发明特别针对大多数无紫外吸收的热稳定化学药物，采用HPLC‑ELSD，即高效液相色谱和通用型检测器蒸发光散射检测器相结合的技术，可达到快速有效的检测，不受流动相梯度的影响。根据标准曲线方程，用本发明的双校正因子主成分自身对照法，即同时对斜率k和截距b进行校正，不仅能精确的计算出化学药物中有关物质的百分含量，还可以减少杂质对照品的使用量，操作简单，经济实用，准确可靠，可通用于所有化学药物中有关物质含量的计算。

Description

一种计算化学药物中有关物质含量的HPLC-ELSD双校正因 子法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，特别涉及一种计算化学药物中有关物质含量的HPLC-ELSD双校正因子法。

背景技术

相对校正因子F：由于同一检测器对不同物质的响应值不同，所以当相同质量的不同物质通过检测器时，产生的峰面积不一定相等。为使峰面积能够准确地反映待测组分的含量，就必须先用已知量的待测组分测定在所用色谱条件下的峰面积，以计算定量校正因子F＝(A杂/C杂)/(A样/C样)，对于常规线性方程可推导F＝杂质斜率/样品斜率。

蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector，简称ELSD)，又称蒸发型质量检测器，是一种通用型质量检测器。不仅可弥补常规紫外检测(UVD)不能检测无紫外吸收或只有紫外末端吸收物质的缺陷,而且与同样可用于无紫外吸收物质检测的示差折光检测(RID)相比,灵敏度略高、受温度等实验条件影响小和可用于梯度洗脱等优点，对比较新型的电雾式检测器(CAD)具有性价比高，更低的使用成本和普遍通用的优点。

虽然ELSD在相同的色谱条件下，物理性质相似的物质在ELSD中形成的颗粒大小、形状接近，因而可以给出相对一致的响应。然而在实际运用的过程中发现，不同物质的响应略有差别，特别是梯度变化前后的物质响应差较大。由于ELSD的标准方曲线方程是对数型线性LgC＝kLgA+b，待测物浓度计算为指数型C＝10^((LgA-b)/k)。所以样品及其有关物质的标准曲线方程k、b值只要略有差异，测得量就会有指数级别的差异。如粗略用相对校正因子＝1的主成分自身对照法或只对斜率k进行精确校正后代入计算，其测定结果极不准确。因而ELSD多采用对照品外标法，但对于有关物质较多的样品来说操作复杂且成本昂贵。目前，对于用HPLC-ELSD检测有关物质含量的报道一般采用杂质对照品外标法或将校正因子近似为1代入计算，前者杂质对照品消耗量大，后者的结果经验证回收率范围远超2015版药典规定，现并没有一种方法能精确的计算化学药物与其有关物质校正因子，对于运用HPLC-ELSD精准的检测有关物质的含量存在瓶颈。

发明内容

为了解决上述问题，本发明推算出一种计算化学药物中有关物质含量的HPLC-ELSD双校正因子法，此方法可用于所有ELSD检测器测定化学药物有关物质的含量，测量精确，操作方便，简单易实施，无需消耗昂贵且不易获得的杂质对照品。

本发明的目的通过以下技术方案实现，包括以下：

一种HPLC-ELSD双校正因子计算方法：

a)通过标准曲线方程LgA＝kLgC+b，得到k_{供试品对照}、k_杂质对照、b_{供试品对照}、b_杂质对照

斜率k＝SLOPE(LgA,LgC)

截距b＝INTERCEPT(LgA,LgC)，

其中A表示供试品对照品、杂质对照品峰面积；

C表示供试品对照品、杂质对照品浓度(mg/ml)；

k_{供试品对照}表示供试品对照品标准曲线方程的斜率；

k_杂质对照表示杂质品对照品标准曲线方程的斜率；

b_{供试品对照}表示供试品对照品标准曲线方程的截距；

b_杂质对照表示杂质品对照品标准曲线方程的截距；

b)计算双校正因子F_k＝k_{供试品对照}/k_杂质对照，

F_b＝b_{供试品对照}/b_杂质对照。

上述HPLC-ELSD双校正因子计算法，所述计算公式b)双校正因子亦可表述为F_k’＝k_杂质对照/k_{供试品对照}，F_b’＝b_杂质对照/b_{供试品对照}。

上述两种HPLC-ELSD双校正因子计算方法，具体步骤：

所述步骤a)具体操作方法：配制n组不同浓度的化学药物及其有关物质混合对照溶液，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，得到标准曲线方程LgA＝k_{供试品对照}LgC+b_{供试品对照}、LgA＝k_杂质对照LgC+b_杂质对照，分别于不同时间或不同品牌相同填料色谱柱获得m条化学药物及其各有关物质的标准曲线方程，得到m组k_{供试品对照j}和b_{供试品对照j}、k_{杂质对照j}和b_{杂质对照j}数据，n为大于等于2的整数，j为大于0且小于等于m的整数，m为大于等于1的整数，m优选为3；

所述步骤b)具体计算方法：F_kj＝k_{供试品对照j}/k_{杂质对照j}和F_bj＝b_{供试品对照j}/b_{杂质对照j}，将F_k1～F_km、F_b1～F_bm值取平均，得到各个杂质相对于化学药物的双校正因子F_k、F_b或者F_k’、F_b’。

所述的HPLC-ELSD双校正因子计算法的优选方案，所述n取值为3，优选限度浓度为50％～80％、90％～110％、120％～150％，进一步优选限度浓度为50％、100％、150％。

所述的HPLC-ELSD双校正因子计算法，优选方案，各杂质相对于化学物质的双校正因子F_k、F_b或者F_k’、F_b’，优选保留3位有效数字。

上述HPLC-ELSD双校正因子计算方法，中涉及到的标准曲线方程的线性相关系数R²都满足条件：R²≥0.99。

本发明另一方面，提供一种计算化学药物中有关物质杂质浓度的HPLC-ELSD双校正因子法，包括如下步骤：

1)通过上述方法计算得到F_b、F_k或F_b’、F_k’；

2)绘制样品对照品标准曲线方程，计算b_对、k_对；

3)测定待测化学药物的杂质峰面积A_杂；

4)杂质浓度由以下公式计算得到：C_杂(mg/ml)＝10^{[LgA_杂-(b_对/F_b)]/(k_对/F_k)}，或C

_杂(mg/ml)＝10^{[LgA_杂-(b_对*F_b’)]/(k_对*F_k’)}。

优选方案，所述有关物质杂质浓度的HPLC-ELSD双校正因子法，所述步骤2)具体计算方法：优选限度浓度为50％～80％、90％～110％、120％～150％，进一步优选按限度浓度的50％、100％、150％配制化学药物对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，以对照品溶液中各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算线性回归方程，得本次化学药物对照品的标准曲线LgA＝k_对LgC+b_对，计算得到b_对、k_对。

优选方案，所述关物质杂质浓度的HPLC-ELSD双校正因子法，所述步骤3)具体步骤如下：将待测化学药物配制成一定浓度的溶液，注入高效液相色谱仪，测定各有关物质色谱峰峰面积A_杂。

优选方案，上述所有关物质杂质浓度的HPLC-ELSD双校正因子法，中涉及到的标准曲线方程的线性相关系数R²都满足条件：R²≥0.99。

本发明另一方面，提供一种计算化学药物中有关物质杂质含量的HPLC-ELSD双校正因子法：

所述杂质浓度上述方法计算得到。对于未

知杂质，按双校正因子为1带入计算。

在一些实施例中，所述的HPLC-ELSD双校正因子计算法，其特征在于不限紫外无吸收或末端吸收的化合物，包括所有于ELSD检测器有响应的化合物。

相比于现有技术，本发明的优点在于：

1、HPLC-ELSD双校正因子法可通用于HPLC-ELSD检测所有适用于ELSD检测的化学药物中的有关物质，各杂质用双校正因子计算回收率于90％～108％，符合2015版中国药典要求。

2、本发明相比杂质对照品外标法节省杂质的使用量，算得双校正因子后可直接用样品校正后的标准曲线方程计算化合物所有已知杂质和未知杂质含量，具有更好的性价比和实用价值。

3、本发明相比于不加校正因子的主成分自身对照法，准确度高、解决了目前用ELSD检测器不能按2015版中国药典要求用自身对照法准确检测药物中有关物质含量的问题，进一步确保产品的质量。

附图说明

图1鹅去氧胆酸-16031901批标准曲线方程图。

图2盐酸庆大霉素-15101102批标准曲线方程图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

鹅去氧胆酸EP的有关物质检测方法为TLC，只能限度测定，不能准确定量，灵敏度和专属性均较差，我公司现开发的HPLC-ELSD法能有效检出其有关物质，并采用双校正因子的主成分自身对照法精确计算其有关物质的含量。

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站

蒸发光散色检测器：ALLTECH-6000

百万分之一电子天平：赛多利斯MAS6.6S

色谱柱：Phenomenex Luna C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。用三氟乙酸调节pH至2.2为水相，流动相为水相-甲醇-乙腈＝45：20：35，设置流速为1.0ml/min，柱温25℃，蒸发光散色检测器：漂移管温度98℃，气体流速2.6L/min。

(2)鹅去氧胆酸有关物质的双校正因子计算

分别取鹅去氧胆酸及其有关物质熊去氧胆酸(CDCA-A)、猪去氧胆酸(CDCA-B)、胆石酸(CDCA-C)、鹅去氧胆酸甲酯(CDCA-D)、鹅去氧胆酸二聚体(CDCA-E)适量，用甲醇溶解并稀释成每1ml中约含鹅去氧胆酸及其杂质各15ug、30ug、45ug的混合溶液，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)。

取上述对照品溶液(1)、(2)、(3)各30μl，注入液相色谱仪，记录鹅去氧胆酸及其有关物质峰面积，以对各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算线性回归方程LgA_鹅＝k_鹅LgC_鹅+b_鹅、LgA_杂＝k_杂LgC_杂+b_杂；(不同时间不同品牌相同填料色谱柱供重复上述实验3次)。将3组k_鹅、b_鹅与k_杂、b_杂别进行校正F_kj＝k_鹅j/k_杂j和F_bj＝b_鹅j/b_杂j。

将3次算得得F_kj、F_bj值取平均，得到各个杂质相对于鹅去氧胆酸的双校正因子F_k和F_b，此步骤无需重复。

校正因子	CDCA-A	CDCA-B	CDCA-C	CDCA-D	CDCA-E
						Fk	1.20	1.15	0.95	1.07	1.16
Fb	1.14	1.12	0.95	1.06	1.14

(3)双校正因子计算待化合物的有关物质

按(1)中的条件，取检测步骤(2)获得的杂质相对于鹅去氧胆酸的双校正因子代入本次鹅去氧胆酸标准曲线中LgA＝1.2341LgC+3.123(图1)。精密称取鹅去氧胆酸-16031901批20.05mg置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，计算各杂质浓度C(mg/ml)＝10^{[LgA-(3.123/F_b)]/(1.2341/F_k)}，未知杂质按双校正因子F_k、F_b＝1带入计算。

计算杂质百分含量：

(4)回收率验证其准确性

实验方法：取鹅去氧胆酸约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，共9份，分别精密加入限度浓度的50％、100％、150％的杂质混合对照品(CDCA-A、CDCA-B、CDCA-C、CDCA-D、CDCA-E)各浓度平行3份，用甲醇溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。注入液相色谱仪，记录杂质峰面积，回收率＝(测得量-原有量)/加入量*100％。

1)按外标法计算：

分别取鹅去氧胆酸有关物质混合对照品CDCA-A、CDCA-B、CDCA-C、CDCA-D、CDCA-E适量，溶剂溶解并稀释成每1ml中含杂质各15ug、30ug、45ug的混合溶液，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)，注入液相色谱仪，记录有关物质峰面积，以各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算各有关物质线性回归方程LgA＝k_杂质对照LgC+b_杂质对照；按每个杂质所对应的标准曲线方程，计算供试品溶液中有关物质的测得量。

2)按不加校正因子(校正因子＝1)计算：

取鹅去氧胆酸适量，用溶剂溶解并稀释成每1ml中含鹅去氧胆酸15ug、30ug、45ug的溶液，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)，注入液相色谱仪，记录鹅去氧胆酸峰面积，以浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算鹅去氧胆酸线性回归方程LgA＝k_鹅LgC+b_鹅。按鹅去氧胆酸标准曲线计算供试品溶液中有关物质的测得量。

3)按双校正因子计算：

实验方法同2)，取(2)获得的双校正因子代入鹅去氧胆酸标准曲线中计算供试品溶液中有关物质的测得量。

带双校正因子的主成分自身对照法和杂质对照品外标法相比无明显差异，回收率在90％～108％之间符合2015版中国药典要求，但双校正因子的主成分自身对照法大大减少了杂质对照品用量，操作简易，具有极高的实用价值和深远的经济意义。而对不加校正因子的主成分自身对照法，杂质的回收率均不符合要求，带双校正因子的主成分自身对照法有明显的优越性，能更精准的测得杂质百分含量，解决了HPLE-ELSD计算有关物质方面精准性的现存问题。

实施例2

盐酸大观霉素2015版中国药典的计算方法为不加校正因子的主成分自身对照法，由于HPLC-ELSD峰面积指数型增长的特殊性，将校正因子近似为1计算结果不准确。我公司现开发的双校正因子的主成分自身对照法能精准计算其有关物质的含量。如下：

(1)仪器与色谱条件

高效液相色谱仪：U3000高效液相色谱系统及工作站

蒸发光散色检测器：ALLTECH-6000

百万分之一电子天平：赛多利斯MAS6.6S

色谱柱：Phenomenex Luna C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。以0.1mol/L三氟醋酸溶液为流动相，设置流速为0.6ml/min，柱温30℃，蒸发光散色检测器：漂移管温度110℃，气体流速2.6L/min。(以2015版药典盐酸大观霉素方法为准)

(2)盐酸大观霉素有关物质的双校正因子

分别取盐酸大观霉素及其有关物质放线菌胺(杂质A)、壮观霉素酸(杂质B)、4S-双氢大观霉素(杂质C)、双羟大观霉素(杂质D)、N-去甲基大观霉素(杂质E)、4R-双氢大观霉素适量，用水溶解并稀释成每1ml中约含盐酸大观霉素及其有关物质各17ug、80ug、170ug的混合溶液，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)。

取上述对照品溶液(1)、(2)、(3)各20μl，注入液相色谱仪，记录盐酸大观霉素和其有关物质的峰面积，以对各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算线性回归方程LgA_大观霉素＝k_大观霉素LgC_大观霉素+b_大观霉素、LgA_杂＝k_杂LgC_杂+b_杂；(不同时间不同品牌相同填料色谱柱供重复上述实验3次)。将3组k_大观霉素、b_大观霉素与k_杂、b_杂别进行校正F_kj＝k_{大观霉素j}/k_杂j和F_bj＝b_{大观霉素j}/b_杂j。

将3次算得得F_kj、F_bj值取平均，得到各个杂质相对于盐酸大观霉素的双校正因子F_k和F_b，此步骤无需重复。

校正因子	杂质A	杂质B	杂质C	杂质D	杂质E	4R-双氢大观霉素
							Fk	1.09	1.06	0.62	1.05	0.74	1.05
Fb	1.04	1.08	0.69	1.01	0.77	1.01

(3)双校正因子计算待化合物的有关物质

按(1)中的条件，取检测步骤(2)获得的杂质相对于盐酸大观霉素的双校正因子代入盐酸大观霉素曲线中LgA＝1.1651LgC+3.2234(图2)。精密称取盐酸大观霉素-15101102批35.12mg置10ml量瓶中，用水稀释至刻度，计算各杂质浓度C(mg/ml)＝10^{[LgA-(3.2234/F_b)]/(1.1651/F_k)}，未知杂质按双校正因子F_k、F_b＝1带入计算。

计算杂质百分含量：

(4)回收率验证其准确性

实验方法：取盐酸大观霉素约35mg，精密称定，置10ml量瓶中，共9份，分别精密加入限度浓度的50％、100％、150％的杂质混合对照品(杂质-A、B、C、D、E、4R-双氢大观霉素)各浓度平行3份，用溶剂溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。注入液相色谱仪，记录杂质峰面积，回收率＝(测得量-原有量)/加入量*100％。

1)按外标法计算：

分别取盐酸大观霉素有关物质混合对照品杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、4R-双氢大观霉素适量，用水溶解并稀释成每1ml中含杂质各17ug、80ug、170ug的混合溶液，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)，注入液相色谱仪，记录有关物质峰面积，以各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算各有关物质线性回归方程LgA＝k_杂质对照LgC+b_杂质对照；按每个杂质所对应的标准曲线方程，计算供试品溶液中有关物质的测得量。

4)不加校正因子(校正因子＝1)计算：

取盐酸大观霉素适量，用溶剂溶解并稀释成每1ml中含盐酸大观霉素17ug、80ug、170ug的溶液，作为对照品溶液(1)、(2)、(3)，注入液相色谱仪，记录盐酸大观霉素峰面积，以浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算盐酸大观霉素线性回归方程LgA＝k_大观霉素LgC+b_大观霉素。按盐酸大观霉素标准曲线计算供试品溶液中有关物质的测得量。

5)按双校正因子计算：

实验方法同2)，取(2)获得的双校正因子代入盐酸大观霉标准曲线中计算供试品溶液中有关物质的测得量。

带双校正因子的主成分自身对照法和外标法相比无明显差异，回收率在90％～108％之间符合2015版中国药典要求，但双校正因子的主成分自身对照法大大减少了杂质对照品用量，操作简易，具有极高的实用价值和深远的经济意义。而对比不加校正因子的自身对照法，杂质的回收率均不符合要求，带双校正因子的主成分自身对照法有明显的优越性，能更精准的测得杂质百分含量，解决了HPLE-ELSD计算有关物质方面精准性的现存问题。

Claims (10)

1.一种HPLC-ELSD双校正因子计算方法，其特征在于：

a)通过标准曲线方程LgA＝kLgC+b，得到k_{供试品对照}、k_杂质对照、b_{供试品对照}、b_杂质对照

斜率k＝SLOPE(LgA,LgC)

截距b＝INTERCEPT(LgA,LgC)

b)计算双校正因子F_k＝k_{供试品对照}/k_杂质对照，

F_b＝b_{供试品对照}/b_杂质对照。

2.如权利要求1所述的HPLC-ELSD双校正因子计算法，其特征在于，所述计算公式b)双校正因子亦可表述为F_k’＝k_杂质对照/k_{供试品对照}，F_b’＝b_杂质对照/b_{供试品对照}。

3.如权利要求1或2所述的HPLC-ELSD双校正因子计算法，其特征在于，

所述步骤a)具体操作方法：配制n组不同浓度的化学药物及其有关物质混合对照溶液，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，得到标准曲线方程LgA＝k_{供试品对照}LgC+b_{供试品对照}、LgA＝k_杂质对照LgC+b_杂质对照，分别于不同时间或不同品牌相同填料色谱柱获得m条化学药物及其各有关物质的标准曲线方程，得到m组k_{供试品对照j}和b_{供试品对照j}、k_{杂质对照j}和b_{杂质对照j}数据，n为大于等于2的整数，j为大于0且小于等于m的整数，m为大于等于1的整数；

所述步骤b)具体计算方法：F_kj＝k_{供试品对照j}/k_{杂质对照j}和F_bj＝b_{供试品对照j}/b_{杂质对照j}，将F_k1～F_km、F_b1～F_bm值取平均，得到各个杂质相对于化学药物的双校正因子F_k、F_b或者F_k’、F_b’。

4.如权利要求3所述的HPLC-ELSD双校正因子计算法，其特征在于，所述n取值为3，配制的浓度为限度浓度的50％～80％、90％～110％、120％～150％。

5.如权利要求3所述的HPLC-ELSD双校正因子计算法，其特征在于，各杂质相对于化学物质的双校正因子F_k、F_b或者F_k’、F_b’，为保留3～4位有效数字的固定常数。

6.一种计算化学药物中有关物质杂质浓度的HPLC-ELSD双校正因子法，其特征在于：包括如下步骤：

1)通过权利要求1-5任一项方法计算得到F_b、F_k或F_b’、F_k’；

2)绘制样品对照品标准曲线方程，计算b_对、k_对；

3)测定待测化学药物的杂质峰面积A_杂；

4)杂质浓度由以下公式计算得到：C_杂(mg/ml)＝10^{[LgA_杂-(b_对/F_b)]/(k_对/F_k)}，或C_杂(mg/ml)＝10^{[LgA_杂-(b_对*F_b’)]/(k_对*F_k’)}。

7.如权利要求6所述有关物质杂质浓度的HPLC-ELSD双校正因子法，其特征在于，所述步骤2)具体计算方法：按限度浓度的50％～80％、90％～110％、120％～150％配制化学药物对照品溶液，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，以对照品溶液中各组分浓度的对数值与相应峰面积的对数值计算线性回归方程，得本次化学药物对照品的标准曲线LgA＝k_对LgC+b_对，计算得到b_对、k_对。

8.如权利要求6所述关物质杂质浓度的HPLC-ELSD双校正因子法，其特征在于，所述步骤3)具体步骤如下：为将待测化学药物配制成一定浓度的溶液，注入高效液相色谱仪，测定各有关物质色谱峰峰面积A_杂。

9.如权利要求6、7、8所述的关物质杂质浓度的HPLC-ELSD双校正因子法，其特征在于，所述方法中涉及到的标准曲线方程的线性相关系数R²都满足条件：R²≥0.99。

10.一种计算化学药物中有关物质杂质含量的HPLC-ELSD双校正因子法，其特征在于：

所述杂质浓度使用权利要求6-9任一项方法计算得到。