CN106661578A - 用于疼痛治疗的寡核苷酸诱饵 - Google Patents

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Abstract

提供了治疗剂诸如称为寡核苷酸诱饵的双链核酸、包含其的药物组合物，以及调节感受伤害的信号传导例如以预防和/或治疗疼痛的相关方法。

Description

用于疼痛治疗的寡核苷酸诱饵
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2014年8月15日提交的美国申请第62/037,996号的优先权，其通过引用整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质拷贝提供，并且通过引用据此并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为ADDY_003_01WO_SeqList_ST25.txt。文本文件约13KB，于2015年8月14日创建，并通过EFS-Web以电子方式提交。
背景
发明领域
本发明涉及治疗剂，诸如称为寡核苷酸诱饵的双链核酸，包含其的药物组合物，以及调节感受伤害信号传导以例如预防和/或治疗疼痛的相关方法。
相关领域的描述
疼痛可被定义为与真实或潜在组织损伤相关联，或者以这样损伤的措辞描述的令人不悦的感觉和情感体验。慢性疼痛折磨至少40％的美国人口并且与许多有害的医学病况有关。持续性和高度衰弱的慢性疼痛通常伴有虚弱、失眠、缺乏食欲、易怒和抑郁。随着时间的推移，生活质量受到深刻影响，患者常常无法完成日常生活的简单任务。
目前使用的疼痛治疗应用三步止痛法(three-step pain ladder)，其推荐如下施用药物：非阿片样物质(例如，阿司匹林、对乙酰氨基酚等)，然后，必要时，温和阿片样物质(例如，可待因)和最后强阿片样物质(例如，吗啡)。尽管有这种药物库，但超过50％的慢性疼痛患者没有得到有效治疗。
目前的疼痛治疗的无效性尤其归因于现有药物疗法的显着毒性问题。所有种类的疼痛药物引起轻度至严重的毒性：非甾体抗炎药物引起胃肠损伤，昔布类(coxibs)与心力衰竭相关，且阿片样物质引起许多副作用，包括呼吸抑制、镇静、消化功能障碍和成瘾。
转录因子是多种信号传导通路中的重要因子，并且经常控制许多基因的同时表达。许多转录因子参与牵涉疼痛的基因的表达调控，所述基因包括但不限于BDNF、转化生长因子(TGFB1)、CDKN1A、GFAP、POU因子、上游刺激因子(USF1、USF2)、EGR1、cAMP应答元件结合蛋白/活化转录因子(CREB/ATF)、活化蛋白1(AP1)、血清应答因子(SRF)、启动子选择性转录因子(SP1)和runt相关转录因子1(CBFA2)。
因此，为了监测牵涉疼痛的基因的表达，在抑制转录因子中可能具有显著的治疗潜力。因此，需要的是选择性的，易于获得的非毒性转录因子抑制剂。
概述
本发明的实施方案总地来说涉及抑制至少一种Krüppel样家族(KLF)转录因子与其内源性转录因子结合位点结合的治疗剂(诸如寡核苷酸)、包含此类药剂的药物组合物，以及调节感受伤害的信号传导，例如，以预防和/或治疗有此需要的受试者的疼痛的相关方法。在一些实施方案中，治疗剂是双链寡核苷酸(例如，寡核苷酸诱饵)，其包含结合至少一种KLF转录因子的一个或多个转录因子结合位点。
因此，本发明的实施方案包括包含一个或多个转录因子结合位点的寡核苷酸诱饵，其中所述一个或多个转录因子结合位点结合选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组的转录因子。在一些实施方案中，所述一个或多个转录因子结合位点结合选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17中的一个或多个的一种或多种转录因子(1、2、3、4、5种等)。
在具体实施方案中，所述寡核苷酸诱饵包含至少两个转录因子结合位点的组合，其中每个转录因子结合位点结合选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组的转录因子。在具体实施方案中，每个转录因子结合位点结合不同的KLF转录因子。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸诱饵在长度上为约15至约35个碱基对。
在具体实施方案中，所述寡核苷酸诱饵包含第一转录因子结合位点和第二转录因子结合位点，其中所述第一和第二转录结合位点重叠。在某些实施方案中，所述第一转录因子结合位点结合KLF9，且所述第二转录因子结合位点结合KLF15。在某些实施方案中，所述第一转录因子结合位点结合KLF9，且所述第二转录因子结合位点结合KLF6。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸诱饵具有第一转录因子结合位点、第二转录因子结合位点和第三转录因子结合位点，其中所述第一、第二和第三转录因子结合位点重叠。在具体实施方案中，所述第一转录因子结合位点结合KLF6，所述第二转录因子结合位点结合KLF9，且所述第三转录因子结合位点结合KLF15。
某些实施方案涉及本文所述的寡核苷酸诱饵的一个或多个群体，其中寡核苷酸诱饵的群体在标准ELISA测定中提供等于或小于约0.8或等于或高于约1.0的KLF15/KLF9的转录因子结合比。
一些实施方案涉及寡核苷酸诱饵的群体，其中寡核苷酸诱饵的群体在标准ELISA测定中提供等于或高于预定值例如约0.2OD450的光密度值的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸诱饵(例如，在群体中)包含由式1或式2表示的序列：
a1t2c3c4T5T6Y7G8M9M10T11Y12Y13K14Y15C16N17H18h19n20n21v22n23n24y25m26h27w28b29v30a31w32(式1；SEQ ID NO:1)
t1g2t3k4b5K6K7D8D9V10D11N12S13D14N15B16N17N18d19v20m21b22v23m24h25r26m27a28(式2；SEQID NO:2)
其中S为G或C；W为A或T；Y为T或C；D为A、G或T；B为C、G或T；K为T或G；M为C或A；H为C、T或A；V为C、G或A；R为A或G；并且N为任意核苷酸，其中小写字母可以存在或不存在，并且其中下标中的数字表示核苷酸在所述序列中的位置。
在一些实施方案中，所述寡核苷酸诱饵包含选自由SEQ ID NO：3-35组成的组的序列或其变体。在具体实施方案中，所述诱饵包含与SEQ ID NO:28(16.6.5)、SEQ ID NO:25(16.6.2)、SEQ ID NO:19(17.5)、SEQ ID NO:34(T16.6-T17.5Fu1)或SEQ ID NO:35(T16.6-T17.5Fu2)的序列具有至少70％同一性的序列。
某些实施方案包括包含由式1或式2表示的序列的寡核苷酸诱饵：
a1t2c3c4T5T6Y7G8M9M10T11Y12Y13K14Y15C16N17H18h19n20n21v22n23n24y25m26h27w28b29v30a31w32(式1；SEQ ID NO:1)
t1g2t3k4b5K6K7D8D9V10D11N12S13D14N15B16N17N18d19v20m21b22v23m24h25r26m27a28(式2；SEQID NO:2)
其中S是G或C；W是A或T；Y是T或C；D是A、G或T；B是C、G或T；K是T或G；M是C或A；H是C、T或A；V是C、G或A；R是A或G；并且N是任意核苷酸，其中小写字母可以存在或不存在，并且其中下标中的数字表示核苷酸在序列中的位置。
在一些实施方案中，所述诱饵包含选自由SEQ ID NO：3-35组成的组的序列或其变体，或由所述序列或其变体组成，或基本上由所述序列或其变体组成。在具体实施方案中，所述诱饵包含与SEQ ID NO:28(16.6.5)、SEQ ID NO:25(16.6.2)、SEQ ID NO:19(17.5)、SEQ ID NO:34(T16.6-T17.5Fu1)或SEQ ID NO:35(T16.6-T17.5Fu2)的序列具有至少70％同一性的序列。
还包括药物组合物，其包含本文所述的寡核苷酸诱饵或诱饵群体和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述寡核苷酸诱饵作为盐、水合物、溶剂合物或N-氧化物衍生物提供。
一些实施方案包括一个或多个试剂盒，其包含本文所述的寡核苷酸诱饵或诱饵群体，任选地使用寡核苷酸诱饵的说明书。
还包括用于调节存在于细胞中的参与感受伤害的信号传导的基因的转录的方法，其包括向所述细胞施用有效量的本文所述的寡核苷酸诱饵或药物组合物。
还包括用于调节细胞中感受伤害的信号传导的方法，其包括向细胞施用有效量的本文所述的寡核苷酸诱饵或药物组合物。
某些实施方案包括用于预防和/或治疗受试者的疼痛的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的寡核苷酸诱饵或药物组合物。在一些实施方案中，疼痛是慢性疼痛。在具体实施方案中，疼痛是神经性疼痛。在一些实施方案中，疼痛与炎症相关。在某些的实施方案中，疼痛与中枢神经系统或内脏病症相关。在具体实施方案中，疼痛是与炎症相关的神经性疼痛。
还包括用于调节细胞中感受伤害的信号传导的方法，其包括向所述细胞施用治疗有效量的治疗剂，其中所述治疗剂抑制转录因子与其转录因子结合位点的结合，其中所述转录因子选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组。
在一些实施方案中，治疗剂在标准ELISA测定中提供等于或小于约0.8或等于或高于约1.0(例如，基于OD450值或等效的标准ELISA测量单位)的KLF15/KLF9的结合比。在具体实施方案中，治疗剂在标准ELISA测定中提供等于或高于约0.2OD450的光密度值或使用等同的标准ELISA测量单位的相当的结合水平的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。
还包括用于治疗受试者的疼痛的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的治疗剂，其中所述治疗剂抑制转录因子与其转录结合位点的结合，其中所述转录因子选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组。在一些实施方案中，治疗剂在标准ELISA测定中提供等于或小于约0.8或等于或高于约1.0的KLF15/KLF9的结合比。在某些实施方案中，治疗剂在标准ELISA测定中提供等于或高于约0.2OD450的光密度值的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。在具体实施方案中，疼痛是神经性疼痛、与炎症相关的疼痛和/或与炎症相关的神经性疼痛。
附图简述
图1显示了某些寡核苷酸诱饵相对于对照KLF诱饵(以灰色突出显示的)的的KLF结合特征。与KLF6、KLF9和KLF15的结合值表示为来自实施例1中描述的体外ELISA结合测定的平均值和SEM OD450值。还列出了相应的N。治疗神经性疼痛和/或神经炎性疼痛的功效表示为在相应的动物研究的测试期期间(取决于研究，总共～4-8周，治疗后～2-4周)相对于对照的疼痛减轻的百分比(％)。N/A＝不适用。
图2A-B显示某些寡核苷酸诱饵在慢性神经性疼痛的保留性神经损伤(SNI)模型中的功效。使用重复的von Frey细丝将疼痛测量为机械超敏性(mechanicalhypersensitivity)。在术后第14天(POD14)，鞘内注射寡核苷酸诱饵(200纳摩尔)或媒介物一次。将对von Frey刺激的总反应的平均值+SEM值针对在注射媒介物或诱饵之前于POD14测量的基线疼痛值进行标准化；跨组组合POD14之前的注射前数据，给定的时间点上的对比媒介物的T检验：*p≤0.05，诱饵对比媒介物的治疗后数据分布(POD 17-POD31)：对于TFD16、16.6.2、16.6.5、TFD17、17.5，p≤0.001，对于17.1，p＝0.005，对于16.9，p＝0.39，以及对于17.9，p＝0.46；每个测试组n＝4只大鼠。X轴显示术后天数(POD)。
图3A-B显示某些寡核苷酸诱饵在慢性神经炎性疼痛的慢性压迫性损伤(CCI)模型中的功效。使用重复的von Frey细丝将疼痛测量为机械超敏性。在术后第14天(POD14)，鞘内注射寡核苷酸诱饵(200纳摩尔)或媒介物一次。将对von Frey刺激的总反应的平均值+SEM值针对在注射媒介物或诱饵之前于POD14测量的基线疼痛值进行标准化；跨组组合POD14之前的注射前数据，给定的时间点上的对比媒介物的T检验：*p≤0.1，**p≤0.05，诱饵对比媒介物的治疗后数据分布(POD 17-POD31)：对于TFD16，p＝0.23，对于16.6.2，p＝0.01，对于16.6.5，p＝0.03，对于16.9为0.02，对于TFD17，p＝0.0004，对于17.1，p＝0.005，对于17.5，p＝0.004以及对于17.9，p＝0.12；每个测试组n＝4只大鼠(除17.9外：n＝3，因为1只大鼠由于在POD14处的基线疼痛值不足而被排除)。X轴显示术后天数(POD)。
图4A-C显示与它们的KLF15/KLF9结合比率相关的某些寡核苷酸诱饵的功效水平(4A)，治疗慢性神经性疼痛的功效与对KLF6、KLF9和KLF15的结合参数之间的线性相关系数(4B)，以及与它们的KLF15/KLF9结合比率(不包括～0.9的比率)相关的所测试的诱饵群体的功效水平的线性回归(4C)。将每种诱饵的功效水平在慢性疼痛的SNI模型中测量为测试期间(总共～4-8周，治疗后～2-4周，取决于研究)对比对照的疼痛缓解的百分比。
图5A-C显示与它们的对KLF6、KLF9和KLF15的组合结合相关的某些寡核苷酸诱饵的功效水平(5A)，治疗慢性神经炎性疼痛的功效与对KLF6、KLF9和KLF15的结合参数之间的线性相关系数(5B)，以及与它们对KLF6和KLF9的总结合能力相关的所测试的诱饵群体的功效水平(如通过它们的1/(KLF6+KLF9)结合比率所指示的)的线性回归(5C)。在慢性疼痛的CCI模型中将每一种诱饵的功效水平测量为测试期间(总共～4-8周，治疗后～2-4周，取决于研究)对比对照的疼痛减轻的百分比。
图6显示某些寡核苷酸诱饵(白色菱形)跨疼痛的补充性病因(从神经病变(Y-轴)至包括炎症组分的疼痛(X-轴))的相对于来自文献的对照KLF诱饵(TFDC1、TFDC2和TFD3，其含有两个KLF-共有CACCC-盒结合位点，黑色菱形)的功效的差异模式。
图7显示表2中的本发明的寡核苷酸诱饵的1/(KLF6+KLF9)结合比率(菱形)(其指示治疗神经炎性疼痛的功效(越低，功效越强))和KLF15/KLF9结合比率(方块)(其指示治疗神经性疼痛的功效(越高，功效越强)的曲线图(X轴，KLF诱饵：1＝16.5，2＝16.6.7，3＝17.7，4＝17.1，5＝16.2，6＝16.6.2，7＝17.3，8＝16.6，9＝17.9，10＝17.5，11＝16.8，12＝16.9，13＝17.8，14＝17.4，15＝17.1，16＝16.4，17＝16.1，18＝17.2，19＝16.0，20＝17.5.3，21＝16.6.3，22＝17.5.1，23＝16.3，24＝16.6.5，25＝16.10，26＝17.6，27＝T16.6-T17.5Fu2，28＝17.0，29＝16.6.4，30＝16.6.6，31＝17.5.2，32＝16.7，T16.6-T17.5Fu1由于不适用的值而未列出)。
图8A-B显示递升剂量水平的16.6.5寡核苷酸诱饵在慢性神经性疼痛(A)的SNI模型和慢性神经炎性疼痛(B)的CCI模型中的作用。使用重复的von Frey细丝将疼痛测量为机械超敏性。在术后第14天(POD14)鞘内注射16.6.5或媒介物一次。将对von Frey刺激的总反应的平均值+SEM值针对在注射媒介物或诱饵前于POD14测量的基线疼痛值进行标准化；跨组组合POD14之前的注射前数据，给定时间点上的对比媒介物的T检验：*p≤0.05，16.6.5对比媒介物的治疗后数据分布(POD 17-POD31)：在SNI模型中，对于100、200和300纳摩尔剂量水平，p≤0.001，对于200摩尔，p＝0.02，以及在CCI模型中，对于300纳摩尔剂量水平，p≤0.001；每个测试组n＝4只大鼠。X轴显示术后天数(POD)。
详述
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但描述了优选方法和材料。为了本发明的目的，在下文中定义以下术语。
定义
冠词“一个/一种(a/an)”在本文中用于指一个或多于一个(即，指至少一个)该冠词的语法对象。作为示例，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
“约”是指相对于参照数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
如在结合治疗剂诸如寡核苷酸诱饵的转录因子的上下文中所使用的，“结合”是指转录因子与寡核苷酸诱饵之间的直接相互作用(例如，转录因子与寡核苷酸诱饵之间的非共价键合，包括氢键合、范德华键合等)。因此，不结合转录因子的治疗剂诸如寡核苷酸不与所述转录因子直接相互作用，反之亦然。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise/comprises/comprising)”将被理解为暗示包含所述步骤或元素或步骤或元件的组，但不排除任何其它步骤或元素或步骤或元素的组。
“由...组成”意指包括并且不限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示所列元素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它元素。“基本上由......组成”意指包括在短语之后列出的任何元素，并且限于不干扰或促成本公开中针对所列元素指定的活性或作用的其它元素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列元素是所需的或强制性的，但其它元素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否实质影响所列元素的活性或作用。
“慢性”是指包括数月(例如，至少两个月)或数年的时段。
“同源性”是指相同或构成保守取代的核苷酸的百分数。同源性可使用序列比较程序诸如EMBOSS逐对比对算法(可从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得)、ClustalW程序(可从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得)或BLAST程序(((BLAST Manual,Altschul等，NatlCent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.和Altschul等，(1997)NAR 25:3389 3402)或GAP(Deveraux等，1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)来确定。这样，可通过将缺口插入比对中来比较长度与本文引用的那些序列相似或大体上不同的序列，此类缺口例如通过由GAP所使用的比较算法来确定。
“分离的”意指大体上或基本上不含通常以其天然状态伴随其的组分的材料。例如，如本文中所用，“分离的多核苷酸”或“分离的寡核苷酸”可以指已被从以天然存在的状态侧翼连接其的序列纯化或去除的多核苷酸，例如被从在基因组中与DNA片段相邻的序列去除的所述DNA片段。术语“分离”，当其涉及细胞时，是指从来源受试者(例如，具有多核苷酸重复疾病的受试者)纯化细胞(例如，成纤维细胞、淋巴母细胞)。在mRNA或蛋白质的上下文中，“分离”是指从来源(例如，细胞)中回收mRNA或蛋白质。
术语“调节”包括使一个或多个可量化参数“增加”或“减少”任选地确定的和/或统计学显著的量。“增加(increase/increasing)”、“促进(enhance/enhancing)”或“刺激(stimulate/stimulating)”通常是指一种或多种试剂诸如寡核苷酸诱饵在细胞或受试者中产生或引起相对于由无试剂或对照化合物引起的反应更大的生理或细胞反应(诸如转录因子的活性(例如，基因表达))的能力。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对本领域技术人员而言将是显而易见的。相对于由无试剂或对照组合物产生的量或反应，“增加”或“增强”的量或反应可以是“统计学显著的”，并且可包括为由无试剂或对照化合物产生的量或反应的1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其间并且高于1(例如1.5、1.6、1.7、1.8)的所有整数和范围)的增加。术语“减少”或“抑制”通常可涉及一种或多种试剂诸如寡核苷酸诱饵在细胞或受试者中“减少”相关生理或细胞反应的能力，诸如转录因子的活性(例如，基因表达)、生理过程(例如，感受伤害的信号传导)或本文所述的疾病或病况的症状(例如，疼痛)。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可以按照常规技术测量。相较于无药剂或对照组合物产生的反应，反应的“减少”可以是“统计学显著的”，并且可包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的减少，包括其间的所有整数和范围。
“基因表达水平的调节”包括基因表达水平的任何变化，包括诱导或活化(例如，基因表达的增加)、抑制或阻遏(例如，基因表达的减少)或稳定化(例如，阻止通常响应于刺激诸如疼痛诱导刺激而发生的基因的上调或下调)。
“感受伤害的信号传导”是指牵涉有害刺激或潜在有害刺激的检测的分子和细胞机制，其导致疼痛的感知。具体实例包括神经递质合成和释放、神经递质诱导的信号传导、膜去极化，以及相关的细胞内和细胞间信号传导事件。
“疼痛”是指与实际或潜在组织损伤相关或以此类术语描述的不愉快的感觉和情感体验。疼痛的所有不同表现和性质，包括机械性疼痛(例如，由机械刺激或身体运动引起的)、温度引起的疼痛(例如，由热、温和/或冷的温度引起的疼痛)以及化学诱导的疼痛(例如，由化学物质诱导的疼痛)。在某些实施方案中，疼痛是慢性、亚慢性、急性或亚急性的。在某些实施方案中，疼痛特征是痛觉过敏(例如，对疼痛刺激的敏感性增加)和/或异常性疼痛(例如，对通常非疼痛刺激的疼痛反应)。在某些实施方案中，疼痛预先存在于患者体内。在其它实施方案中，疼痛是医源性的，在患者中诱导的(例如，手术后疼痛)。
“预防/防止(preventing/pervention)”包括(1)获得疾病或病症(例如，导致疾病的至少一个临床症状在患者中不发展，所述患者可能暴露于疾病或对疾病易感，但尚未经历或显示疾病的症状)的风险的降低，和/或(2)与疾病或病症相关的症状的可能严重性的降低(例如，降低患者的疾病的至少一种临床症状，所述患者可能暴露于或倾向于疾病但尚未经历或表现出疾病症状)。
如本文中所用，术语“序列同一性”或例如包含“与……具有50％同一性的序列”，是指序列在比较窗口中在逐个核苷酸的基础上相同的程度。因此，可通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在两个序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C或G)的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分数来计算“序列同一性百分比”。在一些实施方案中，用于比对比较窗口的序列的最佳比对可以通过使用EMBOSS逐对比对算法(可从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得)、ClustalW程序(也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得)或BLAST程序(BLAST Manual,Altschul等，Natl Cent.Biotechnol.Inf.,NatlLib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.和Altschul等，(1997)NAR 25:3389 3402)来进行。在某些实施方案中，针对参照序列(例如，来自序列表)的整个长度进行用于比对比较窗的序列比对。在一些实施方案中，针对参照序列的一部分进行用于比对比较窗口的序列比对，所述参照序列的一部分是例如参照序列的约、至少约或不超过约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个或100个连续核苷酸。
“受试者”或“有此需要的受试者”或“患者”包括哺乳动物受试者诸如灵长类动物或人受试者。
“亚急性”是指包括数小时(例如，1-24小时，包括其间的所有整数和范围)的时段。
“亚慢性”是指包数括天或数月(例如，少于2或3个月)的时段。
在一些实施方案中，任何疾病或病症的“治疗(treating/treatment)”是指改善疾病或病症(例如，阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在一些实施方案中，“治疗”是指改善患者不能辨别的至少一个物理和/或生物学参数。在某些实施方案中，“治疗”是指物理地(例如，可辨别的症状的稳定化)、生理地(例如，物理参数的稳定化)或在这两个方面抑制疾病或病症。在一些实施方案中，“治疗”是指延迟疾病或病症的发作。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除、治愈或预防疾病或病况或其相关症状。
“治疗有效量”是指当向患者施时足以实现特定疾病或病症的此类治疗的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病、疾病的严重性以及待治疗的患者的年龄、体重等而变化。
寡核苷酸诱饵和其它治疗剂
本发明的实施方案总地来说涉及抑制至少一种转录因子与其(内源)转录结合位点中的至少一个的结合的治疗剂。具体实例包括包含一个或多个转录结合位点的寡核苷酸诱饵，其结合至少一种转录因子，从而改变转录因子调节基因表达的能力。在某些实施方案中，转录因子是转录因子的Krüppel样家族(KLF)的一个或多个成员，其实例包括KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17。
因此，某些实施方案包括包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个等)转录因子结合位点的寡核苷酸诱饵，其中所述一个或多个转录因子结合位点结合选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组的转录因子。
还包括寡核苷酸诱饵，其包含至少两个(例如例如，2个、3个、4个、5个等)转录因子结合位点的组合，其中每个转录因子结合位点结合选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组的转录因子。转录因子结合位点的组合的具体实例包括结合KLF6/KLF9、KLF9/KLF15或KLF6/KLF9/KLF15的那些组合。
术语“寡核苷酸”包括通常小于约200个核苷酸(或100个碱基对)并且包括但不限于DNA、RNA和RNA-DNA杂交体的任何双链或基本上双链的含核酸的聚合物。
在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为约、至少约或不超过约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个核苷酸(包括其间的所有整数和范围)，并且任选地包含约、至少约或不超过约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个碱基配对的核苷酸(包括其间的所有整数和范围)。在具体实施方案中，所述寡核苷酸诱饵的长度为约15至约35个碱基对。
在一些实施方案中，寡核苷酸诱饵包含第一转录因子结合位点和第二转录结合位点，任选地其中所述第一转录结合位点和第二转录结合位点重叠。在具体实施方案中，第一转录因子结合位点结合KLF9，且第二转录因子结合位点结合KLF15。在具体实施方案中，第一转录因子结合位点结合KLF9，且第二转录因子结合位点结合KLF6。
还包括具有第一转录因子结合位点、第二转录因子结合位点和第三转录因子结合位点的寡核苷酸诱饵，任选地其中第一、第二和第三转录结合位点重叠。在具体实施方案中，第一转录因子结合位点结合KLF6，第二转录因子结合位点结合KLF9，且第三转录因子结合位点结合KLF15。
在某些实施方案中，寡核苷酸诱饵(例如，诱饵的有义链)包含由下表1所示的式1或式2所示的序列(例如，双链序列)或其变体或其互补序列(例如，反义序列)，由所述序列或其变体或其互补序列组成或基本上由所述序列或其变体或其互补序列组成。
在具体实施方案中，寡核苷酸诱饵(例如，诱饵的有义链)包含下表2中的序列或其变体或其互补序列(例如，反义序列)，由所述序列或其变体或其互补序列组成或基本上由所述序列或其变体或其互补序列组成。
在本文所述的式和序列中，“A”是腺嘌呤核苷酸，“C”是胞嘧啶核苷酸，“G”是鸟嘌呤核苷酸，“T”是胸腺嘧啶核苷酸，“N”可以是任意核苷酸，优选A、C、G或T。尽管所述式和序列显示单链，但应理解，互补反义链被包括作为寡核苷酸诱饵的结构的部分。在某些实施方案中，任何一个或多个“T”可以是“U”或尿嘧啶核苷酸。
因此，某些寡核苷酸诱饵包含表1或表2(例如，SEQ ID NO：1-35)中的序列或其变体或连续或非连续部分，由所述序列或其变体或连续或非连续部分组成或基本上由所述序列或其变体或连续或非连续部分组成。例如，某些寡核苷酸诱饵包含表1或表2中的靶向序列(例如，SEQ ID NO：1-35)中的任何靶向序列的约或至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34个或35个连续或非连续核苷酸，并且其结合一种或多种的本文所述的KLF转录因子(例如，KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16、KLF17)。对于非连续部分，可删除间插核苷酸，或用不同的核苷酸取代间插核苷酸，或可添加间插核苷酸。变体的另外的实例包括与表1或表2中的序列(例如，SEQ ID NOS:1-35)的整个长度或连续部分具有至少或至少约70％序列同一性或同源性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性或同源性)的寡核苷酸诱饵，并且所述寡核苷酸诱饵结合一种或多种本文所述的KLF转录因子(例如，KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16、KLF17)。在一些实施方案中，连续部分为表1或表2中的序列(例如，SEQ ID NO：1-35)的约、至少约或不超过约10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、60个、70个、80个、90个或100个连续核苷酸。
与另一序列具有一定百分比(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)序列同一性的寡核苷酸诱饵意指，当比对时，该百分比在比较两个序列中确定碱基排列的对应性水平。该比对和百分比同源性或同一性可以使用本领域已知的允许局部比对的任何合适的软件程序来测定。在一些实施方案中，此类程序包括但不限于EMBOSS逐对比对算法(可从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得)、ClustalW程序(也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)获得)或BLAST程序(BLAST Manual,Altschul等，Natl Cent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.和Altschul等，(1997)NAR25:3389 3402)。
如上所述，本领域技术人员将认识到本发明包括的序列包括与本文所述的序列完全或部分互补的那些序列，包括在严格杂交条件下与示例序列(例如，表1和2；SEQ ID NO：1-35)杂交的那些序列。当核酸的单链形式可在适当的温度和溶液离子强度条件下与另一单链核酸退火时，核酸可与另一核酸杂交。杂交条件是本领域熟知的。在一些实施方案中，退火可在含盐溶剂(例如Tris-EDTA缓冲液)中，在从变性温度(例如，100℃)至室温的温度缓慢降低期间发生。
还包括寡核苷酸诱饵的群体，包括提供与KLF转录因子的组合(例如，KLF15/KLF9)的转录因子结合比率，和/或与一种或多种个(例如，1种、2种、3种、4种、5种等)KLF转录因子(例如，KLF6+KLF9)的总转录结合能力的那些寡核苷酸诱饵的群体，所述转录因子结合比率和/或总转录结合能力是相对于预定量定义的。在一些实施方案中，转录因子结合比率或总转录结合能力约等于、小于或高于预定水平或量。可以使用多种技术(诸如标准ELISA测定法(参见实施例))建立用于定义相对结合比率或总结合能力的“预定水平”。
例如，在具体实施方案中，寡核苷酸诱饵的群体提供等于或小于约0.8或等于或高于约1.0(基于来自标准ELISA测定(参见实施例)的OD450值(或等效的标准ELISA测量单位，例如，荧光))的KLF15/KLF9的转录因子结合比率。在具体实施方案中，KLF15/KLF9的转录因子结合比率等于或小于约0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01或更小(包括其间的所有范围和整数)(基于来自标准ELISA测定的OD450值)。在一些实施方案中，KLF15/KLF9的转录因子结合比率等于或高于约1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0或更高(包括其间的所有范围和整数)(基于来自标准ELISA测定法的OD450值(或等效的标准ELISA测量单位))。
在一些实施方案中，寡核苷酸诱饵的群体提供等于或高于预定量的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。在一些情况下，预定量是如在标准ELISA测定(参见实施例)中测量的约0.2OD450或更高的光密度值(或等效的标准ELISA测量单位，例如荧光)。在一些实施方案中，对KLF6和KLF9的预定量或总转录因子结合能力等于或高于约0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更高(包括其间的所有范围和整数)(基于来自标准ELISA测定法的OD450值(或等效的标准ELISA测量单位))。
在一些实施方案中，寡核苷酸诱饵的群体提供等于或小于预定量的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。在一些实施方案中，对KLF6和KLF9的预定量或总转录因子结合能力表示为1/(KLF6+KLF9)(基于来自标准ELISA测定(参见实施例)的光密度值(或等效的标准ELISA测量单位，例如荧光))。例如，在具体实施方案中，对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力(如由1/(KLF6+KLF9)表示的)为约5或更小(基于来自标准ELISA测定的OD450值(或等效的标准ELISA测量单位)。在一些实施方案中，对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力(如由1/(KLF6+KLF9)表示的)等于或小于约5、4、3、2、1、0.5、0.1或更小(包括其间的所有范围和整数)(基于来自标准ELISA测定的OD450值(或等效的标准ELISA测量单位))。
寡核苷酸诱饵的群体可由一种寡核苷酸诱饵，或两种或更多种(例如2种、3种、4种、5种等)寡核苷酸诱饵的组合组成。在某些实施方案中，寡核苷酸诱饵的群体由具有单个KLF转录因子结合位点的一种寡核苷酸诱饵组成。在一些实施方案中，寡核苷酸诱饵的群体由具有至少两个(例如2个、3个、4个、5个等)转录因子结合位点的组合的一种寡核苷酸诱饵组成，其结合相同或不同(例如，两种或至少两种不同的)KLF转录因子。在一些实施方案中，寡核苷酸诱饵的群体包含具有至少3个(例如，3个、4个、5个等)转录因子结合位点的组合的一种寡核苷酸诱饵，其结合相同或不同(例如，3种或至少3种不同的)KLF转录因子。其它组合对于本领域技术人员是显而易见的。
通常，本文公开的寡核苷酸诱饵可用于结合调节牵涉感受伤害的信号传导和/或受试者(例如，患者)的疼痛感觉的基因表达的转录因子，例如，从而抑制所述转录因子。被设计来结合特定转录因子的寡核苷酸诱饵具有模拟通常被转录因子结合的内源基因组DNA序列的核酸序列。因此，在一些方面，本文公开的寡核苷酸诱饵抑制基因表达和调节的必要步骤。此外，本文公开的寡核苷酸诱饵可以结合一种或多种不同的转录因子。
术语寡核苷酸涵盖包括任何已知的DNA和RNA的碱基类似物的序列，所述碱基类似物包括但不限于2,6-二氨基嘌呤、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、尿嘧啶-5-氧基乙酸、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、辫苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、甲缩醛(ormacetal)、3'-硫代甲缩醛、硝基氧主链、砜、氨基磺酸酯、吗啉代衍生物、锁核酸(LNA)衍生物和/或肽核酸(PNA)衍生物。在一些实施方案中，寡核苷酸由退火在一起的两个互补单链寡核苷酸组成。在一些实施方案中，寡核苷酸由形成分子内碱基对以产生基本上双链结构的一个单链寡核苷酸组成。
在一些实施方案中，本文公开的寡核苷酸诱饵通过本领域技术人员熟知的方法(例如，在核苷酸之间掺入硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、碳酸酯、硫醚、硅氧烷、乙酰胺酯或羧甲基酯键联)来修饰，以防止被细胞内和/或细胞外流体(例如血清、脑脊液)中的核酸酶降解。在一些实施方案中，寡核苷酸诱饵被设计来形成发夹结构和哑铃结构，其还可防止或阻碍核酸酶降解。在具体实施方案中，将寡核苷酸诱饵作为能够在靶细胞中附加型维持或组成型复制的较大质粒的一部分插入，以提供对诱饵序列的更长期的增强的细胞内暴露和/或减少其降解。因此，本领域已知的增强寡核苷酸稳定性的任何化学修饰或结构改变在本公开的范围内。在一些实施方案中，可将本文公开的寡核苷酸诱饵例如连接于改善寡核苷酸诱饵的治疗效果的聚乙二醇聚合物、肽(例如，蛋白质易位结构域)或蛋白质。此类修饰的寡核苷酸诱饵可优先穿过细胞膜。
本文所述的寡核苷酸诱饵通常可以用作游离酸或游离碱。或者，寡核苷酸诱饵可以以酸或碱加成盐的形式使用。本发明的游离氨基化合物的酸加成盐可以通过本领域熟知的方法制备，并且可以由有机和无机酸形成。合适的有机酸包括马来酸、富马酸、苯甲酸、抗坏血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水杨酸、柠檬酸、葡糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕榈酸、乙醇酸、谷氨酸和苯磺酸。
合适的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。碱加成盐包括与羧酸盐阴离子形成的那些盐，包括与有机和无机阳离子，诸如选自碱金属和碱土金属(例如，锂、钠、钙、钾、镁、钡和钙)，以及铵离子及其取代的衍生物(例如，二苄基铵、苄基铵、2-羟基乙基铵等)形成的盐。因此，术语“药学上可接受的盐”旨在包括任何和所有可接受的盐形式。
还包括前药。前药是当将向患者施用此类前药时在体内释放化合物的任何共价键合的载体。前药通常通过以使得修饰通过常规操作或在体内裂解而产生母体化合物的方式修饰官能团来制备。前药包括例如本发明的化合物，其中羟基、胺或巯基被键合于任何基团，当向患者施用时，其裂解以形成羟基、胺或巯基。因此，前药的代表性实例包括(但不限于)本文所述的寡核苷酸诱饵的醇和胺官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。此外，在羧酸(-COOH)的情况下，可以使用酯，诸如甲酯、乙酯等。
在某些实施方案中，将寡核苷酸诱饵作为盐、水合物、溶剂合物或N-氧化物衍生物提供。在某些实施方案中，在溶液(例如，具有生理pH的盐溶液)中或以冻干形式中提供寡核苷酸诱饵。在一些实施方案中，在脂质体中提供寡核苷酸诱饵。
本文所述的寡核苷酸诱饵可通过本领域已知的常规方法制备，因此完全在本领域技术人员的知识范围内。寡核苷酸诱饵及其变体的活性可按照本领域的常规技术(参见实施例)来测定。在具体实施方案中，寡核苷酸诱饵是合成寡核苷酸(即，化学合成的、非天然存在的寡核苷酸)。
还包括非基于寡核苷酸的治疗剂，包括例如通过特异性结合KLF转录因子，或通过特异性结合其内源性转录因子结合位点(例如，通过模拟KLF转录因子结合位点)来抑制转录因子与其内源转录结合位点结合的那些治疗剂。治疗剂的实例包括结合剂诸如抗体、例如抗体、小分子、肽、adnectin、anticalin、锚蛋白重复蛋白(Darpin)、anaphone和适体，所述结合剂表现出对KLF转录因子例如KLF因子转录因子结合位点结构域的结合特异性，或表现出对内源KLF转录因子结合位点的结合特异性。
如果结合剂以可检测的水平(在例如ELISA测定中)与多肽或核酸反应，并且在相似条件下不以显著(例如，统计学显著的)方式与无关结构可检测地反应，则结合剂被认为对KLF多肽(例如，其转录因子结合结构域)或内源性KLF转录因子结合位点(例如，双链DNA序列)表现出“结合特异性”、“特异性结合”。
术语“抗体”涉及免疫球蛋白(无论是天然的还是部分或全部合成产生的)。该术语还涵盖具有为抗原结合结构域或与抗原结合结构域同源的结合结构域的任何多肽或蛋白质。该术语也涵盖CDR移植抗体。术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本发明中可互换使用，以包括一个或多个保留特异性结合抗原的能力的抗体的片段(参见例如Holliger等，Nature Biotech.23(9):1126-1129(2005))。
抗体可通过本领域普通技术人员已知的多种技术中的任一种制备。参见，例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。可使用Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976中的技术及其改进来制备对于目标多肽是特异的单克隆抗体。还包括利用转基因动物诸如小鼠来表达人抗体的方法。参见，例如，Neuberger等，Nature Biotechnology 14:826,1996；Lonberg等，Handbookof Experimental Pharmacology 113:49-101,1994；和Lonberg等，Internal Review ofImmunology 13:65-93,1995。具体实例包括由产生的平台(参见，例如，美国专利第6,596,541号)。还可通过使用噬菌体展示或酵母展示文库产生或鉴定抗体(参见，例如，美国专利第7,244,592号；Chao等，NatureProtocols.1:755-768,2006)。
如上所述，抑制KLF转录因子与其转录因子结合位点结合的“肽”被包括作为结合剂。术语肽通常是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。在某些实施方案中，术语“肽”是指相对短的多肽，包括由约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个(包括其间的所有整数和范围(例如，5-10个、8-12个、10-15个、15-20个、20-25个、25-30个、30-40个、40-50个))氨基酸组成，以及例如结合KLF转录因子的一个或多个区域，例如转录因子结合结构域，或通过结合其内源性转录因子结合位点的至少一个来模拟KLF转录因子的肽。肽可以由天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸组成。
如上所述，本发明包括抑制KLF转录因子与其转录因子结合位点结合的小分子。“小分子”是指合成或生物来源，但通常不是聚合物的有机或无机化合物。有机化合物包括其分子含有碳的一大类化合物，通常不包括仅包含碳酸盐、简单的碳氧化物或氰化物的那些化合物。“聚合物”通常是指由重复结构单元组成的大分子或高分子，其通常通过共价化学键连接。在某些实施方案中，小分子具有小于1000-2000道尔顿，通常在约300与700道尔顿之间，并且包括约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、500、650、600、750、700、850、800、950、1000或2000道尔顿的分子量。
还包括抑制KLF转录因子与其转录因子结合位点结合的适体作为结合剂(参见，例如，Ellington等，Nature.346,818-22,1990；和Tuerk等，Science.249,505-10,1990)。适体的实例包括核酸适体(例如，DNA适体、RNA适体)和肽适体。核酸适体通常是指具有二级和三级结构以结合各种分子靶诸如小分子、蛋白质、核酸和甚至细胞、组织和生物体的核酸种类，其已通过重复轮的体外选择或等效方法诸如SELEX(通过指数富集的配体的系统演化)进行了工程化。参见例如美国专利第6,376,190号和第6,387,620号。因此，包括结合KLF转录因子的一个或多个区域(例如，转录因子结合结构域)或结合其内源性转录因子结合位点的至少一个的核酸适体。
肽适体通常包括在两个末端端附接于蛋白质支架的可变肽环、双重结构约束(其通常将肽适体的结合亲和力提高至与抗体的结合亲和力相当的水平(例如，在纳摩尔范围内))。在某些实施方案中，可变环长度可由约10-20个氨基酸(包括其间的所有整数)组成，并且支架可包括具有良好的溶解度和致密度性质的任何蛋白质。某些示例性实施方案可利用细菌蛋白硫氧还蛋白-A作为支架蛋白，可变环被插入在还原活性位点(野生蛋白中的-Cys-Gly-Pro-Cys-环)内，其中两个半胱氨酸侧链为能够形成二硫键。用于鉴定肽适体的方法描述于例如美国申请第2003/0108532号中。因此，包括结合KLF转录因子的一个或多个区域(例如，转录因子结合结构域)或结合其内源性转录因子结合位点的至少一个的肽适体。肽适体选择可使用本领域已知的不同系统(包括酵母双杂交系统)来进行。
还包括特异性结合KLF转录因子的ADNECTINSTM、AVIMERSTM和ANTICALINS。ADNECTINSTM是指一类源自人纤连蛋白的靶向生物制剂，所述纤连蛋白是与其它蛋白质天然结合的丰富的细胞外蛋白质。参见，例如美国申请第2007/0082365号；第2008/0139791号和第2008/0220049号。ADNECTINSTM通常由天然纤连蛋白主链，以及人纤连蛋白的特定部分的多个靶向结构域组成。可以工程化靶向结构域以使得AdnectinTM能够特异性识别目标治疗靶标，诸如KLF转录因子多肽或其片段，例如转录因子结合结构域，或其内源性转录因子结合位点的至少一个。
AVIMERSTM是指使用体外外显子改组和噬菌体展示工程化的多聚体结合蛋白或肽。连接多个结合结构域，从而导致与单表位免疫球蛋白结构域相比更大的亲和力和特异性。参见，例如，Silverman等，Nature Biotechnology.23:1556-1561,2005；美国专利第7,166,697号；和美国申请第2004/0175756号、第2005/0048512号、第2005/0053973号、第2005/0089932号和第2005/0221384号。
还包括设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，其包括一类非免疫球蛋白蛋白，所述非免疫球蛋白蛋白可在药物发现和药物开发中提供优于抗体的靶结合的优点。在其它用途中，DARPin由于其有利的分子性质，包括小尺寸和高稳定性，理想地适合于体内成像或毒素或其它治疗有效载荷的递送。在细菌中的低成本生产和许多靶特异性DARPin的快速产生使得DARPin法可用于药物发现。另外，DARPin可以容易地以多特异性形式产生，提供将效应子DARPin靶向特定器官或用一个由几个DARPin组成的分子靶向多个多肽/核酸的潜力。参见，例如，Stumpp等，Curr Opin Drug Discov Devel.10:153-159,2007；美国申请第2009/0082274号；和PCT/EP2001/10454。
某些实施方案包括“单体”，其通常利用人纤连蛋白(FNfn10)的第10纤连蛋白III型结构域作为支架来展示用于靶结合的多个表面环。FNfn10是具有类似于免疫球蛋白折叠的β-夹心结构的小(94个残基)蛋白质。其是高度稳定的，无二硫键或金属离子，其可在细菌中以正确折叠形式高水平表达。FNfn10支架与实际上任何展示技术兼容。参见，例如，Batori等，Protein Eng.15:1015-20,2002；和Wojcik等，Nat Struct Mol Biol.,2010和美国专利第6,673,901号。
Anticalin是指一类抗体模拟物，其通常由人脂质运载蛋白(具有由结构上刚性的框架支持的高变环区域的结合蛋白的家族)合成。参见，例如，美国申请第2006/0058510号。Anticalin通常具有约20kDa的大小。Anticalin可通过由八个反向平行的β-链(稳定的β-桶支架)形成的桶结构来表征，所述反向平行的β-链由四个肽环和附接的α-螺旋成对连接。在某些方面，在高变环区域中产生实现特异性结合的构象偏差。参见，例如，Skerra，FEBSJ.275：2677-83,2008，通过引用并入本文。
治疗剂，例如本文所述的抑制KLF转录因子与其内源性转录因子结合位点结合的结合剂可用于本文所述的任何方法和组合物。
使用方法
本发明的实施方案包括使用本文所述的治疗剂(例如寡核苷酸诱饵、结合剂)和相关组合物调节一种或多种KLF转录因子的活性的方法，所述治疗剂抑制或以其它方式减少一种或多种KLF转录因子与其内源性转录结合位点的结合。在具体实施方案中，所述一种或多种转录因子选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组。
所述方法可用于例如治疗受试者的疼痛，以调节存在于细胞中的参与感受伤害的信号传导的基因的转录，调节存在于细胞中的参与受试者疼痛的感知的基因的转录，和/或调节例如受试者的细胞中的感受伤害的信号传导。此类方法可以在体外实施，例如通过将细胞与治疗剂(例如，寡核苷酸诱饵)或相关组合物接触，或在体内实施，例如通过向有此需要的受试者施用治疗剂(例如，寡核苷酸诱饵)或相关组合物。在具体实施方案中，治疗剂是如本文所述的寡核苷酸诱饵或寡核苷酸诱饵的群体。
因此，某些实施方案包括用于治疗受试者的疼痛的方法，包括向受试者施用治疗有效量的治疗剂，其中所述治疗剂抑制转录因子与其转录结合位点的结合，并且其中所述转录因子来自由KLF1，KLF2，KLF3，KLF4，KLF5，KLF6，KLF8，KLF9，KLF10，KLF11，KLF12，KLF13，KLF14，KLF15，KLF16和KLF17组成的组。还包括治疗有此需要的受试者的疼痛的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的一种或多种寡核苷酸诱饵。在一些实施方案中，提供了预防受试者的疼痛的方法，例如治疗或控制疼痛的预防性方法。此类方法包括向有此需要的受试者(例如，可能发展疼痛，例如手术后疼痛的患者)施用治疗有效量的本文所述的寡核苷酸诱饵。
因此，在某些实施方案中，向遭受疼痛或预期遭受疼痛的有此需要的受试者(例如，诸如动物(例如，鸟、哺乳动物、灵长类动物、人患者)施用寡核苷酸诱饵和/或包含其的药物组合物。疼痛的具体实例包括但不限于机械性疼痛(例如，机械痛觉过敏和/或异常性疼痛)、化学疼痛、温度疼痛、慢性疼痛、亚慢性疼痛、急性疼痛、亚急性疼痛、炎性疼痛、神经性疼痛、肌肉疼痛、骨骼疼痛、手术后疼痛、神经根疼痛、背痛、关节炎疼痛和/或糖尿病疼痛。在某些实施方案中，向患者诸如动物施用寡核苷酸诱饵和/或其药物组合物，作为针对疼痛的预防措施，所述疼痛包括但不限于前述疼痛实例中的任何一种或多种。在一些实施方案中，疼痛是手术后疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛、神经性疼痛、肌肉疼痛和/或骨骼痛。在某些实施方案中，寡核苷酸诱饵和/或其药物组合物可用于预防疼痛的一个方面，同时治疗另一种疼痛症状。
在具体实施方案中，疼痛是慢性疼痛。在一些实施方案中，疼痛是神经性疼痛，例如慢性神经性疼痛和/或与炎症(例如，神经炎症)相关的(慢性)神经性疼痛。在某些实施方案中，疼痛与炎症相关，例如与炎症相关的慢性疼痛、与炎症相关的慢性神经性疼痛。在一些实施方案中，疼痛与中枢神经系统和/或内脏病症相关。在一些实施方案中，疼痛是手术后疼痛。
在一些实施方案中，被施用来治疗、控制和/或预防疼痛的治疗剂(例如，寡核苷酸诱饵、寡核苷酸诱饵的群体、结合剂)或组合物提供等于或小于约0.8或等于或高于约1.0(基于标准ELISA测定(参见上文)中的OD450值(或等效的标准ELISA测量单位))的KLF15/KLF9的结合比率。在具体实施方案中，前述治疗剂用于治疗神经性疼痛。
在具体实施方案中，被施用来治疗、控制和/或预防疼痛的治疗剂(例如，寡核苷酸诱饵、寡核苷酸诱饵的群体、结合剂)或组合物在标准ELISA测定(参见上文)中提供与预定量，例如约0.2OD450(或使用等效的标准ELISA测量单位的相当结合水平)的光密度值相等或高于其的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。在一些实施方案中，KLF6和KLF9的总转录因子结合能力(如由1/(KLF6+KLF9)所指示的)等于或小于约5、4、3、2、1、0.5、0.1或更小(包括其间的所有范围和整数)(基于来自标准ELISA测定的OD450值(或等效的标准ELISA测量单位，例如，荧光))。在具体实施方案中，前述治疗剂用于治疗与炎症相关的疼痛或神经性疼痛。
还包括用于调节存在于细胞中的参与受试者的感受伤害的信号传导和/或疼痛感知的基因的转录的方法，所述方法包括向所述细胞施用治疗有效量的治疗剂，其中所述治疗剂抑制转录因子与其转录因子结合位点的结合，其中所述转录因子选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组。在一些实施方案中，所述治疗剂包括本文所述的一种或多种寡核苷酸诱饵。在某些实施方案中，转录的调节包括抑制或阻遏基因表达。在一些实施方案中，转录的调节包括稳定基因表达。在具体实施方案中，转录的调节包括活化或诱导基因表达。在某些实施方案中，所述基因参与感受伤害的信号传导。涉及感受伤害的信号传导的基因包括但不限于编码膜蛋白(例如，离子通道、膜受体等)、可溶性信号传导分子(例如，细胞内信号传导分子或神经递质)、合成酶(例如，神经递质合成酶)和转录因子的基因。此类蛋白质的具体实例包括但不限于BDNF(由KLF9调节)、TGFB1(由KLF6调节)、CDKN1A、JUN、GFAP(由KLF15调节)；和其它蛋白质诸如BDKRB2、HTR3A、SCN9A、GRM5、NOS1、GCH1、CDK5R1、CACNA1B、P2XR3和PNMT。
一些实施方案包括用于调节细胞中感受伤害的信号传导的方法，其包括向所述细胞施用治疗有效量的治疗剂，其中治疗剂抑制转录因子与其转录因子结合位点的结合，其中转录因子选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组。在一些实施方案中，治疗剂包括本文所述的一种或多种寡核苷酸诱饵。在某些实施方案中，感受伤害的信号传导的调节包括抑制或阻遏感受伤害的信号传导。在一些实施方案中，感受伤害的信号传导的调节包括活化感受伤害的信号传导的抑制剂。在具体实施方案中，感受伤害的信号传导的调节包括增加参与细胞中感受伤害的信号传导的蛋白质的蛋白水解降解。在某些实施方案中，蛋白质降解的调节包括刺激蛋白酶体功能。在某些实施方案中，蛋白质参与感受伤害的信号传导。参与感受伤害的信号传导的蛋白质包括但不限于膜蛋白(例如，离子通道、膜受体等)、可溶性信号传导分子(例如，细胞内信号传导分子或神经递质)、合成酶(例如，神经递质合成酶)和转录因子。此类蛋白质的具体实例包括但不限于BDNF(由KLF9调节)、TGFB1(由KLF6调节)、CDKN1A、JUN、GFAP(由KLF15调节)；和其它蛋白质诸如BDKRB2、HTR3A、SCN9A、GRM5、NOS1、GCH1、CDK5R1、CACNA1B、P2XR3和PNMT。
在某些实施方案中，在体内(例如，在遭受疼痛或可能遭受疼痛的受试者中)提供各种方法的细胞。体内提供的细胞可位于不同位置，包括但不限于背根神经节和/或脊髓。在其它实施方案中，在体外(例如，在陪替氏培养皿中)提供各种方法的细胞。细胞可以是参与感受伤害的信号传导的任何细胞，包括但不限于神经元(例如，来自背根神经节和/或脊髓或来自交感神经系统的疼痛神经元)、神经胶质细胞、组织支持性细胞(例如，成纤维细胞)、免疫细胞或来自细胞系的细胞(例如，PC12细胞)。
在一些实施方案中，寡核苷酸诱饵和/或其药物组合物用于与至少一种其它治疗剂的组合治疗。其它治疗剂的实例包括但不限于一种或多种另外的寡核苷酸诱饵。寡核苷酸诱饵和/或其药物组合物和治疗剂可累加地或更优选协同地起作用。在一些实施方案中，将寡核苷酸诱饵和/或其药物组合物与另一治疗剂(包括另一寡核苷酸诱饵)的施用同时施用。在其它实施方案中，在施用另一治疗剂(包括另一寡核苷酸诱饵)之前或之后施用寡核苷酸诱饵或其药物组合物。
对于向有此需要的受试者施用，可通过任何方便的途径施用本文所述的寡核苷酸诱饵和/或药物组合物。具体实例包括通过输注或推注注射，通过经上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收以及通过口服施用的施用。施用可以是全身性的或局部的。各种递送系统是本领域已知的，包括例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中，其可用于施用化合物和/或其药物组合物。施用方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外(epidural)/硬膜外(peridural)、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、经直肠、通过吸入或局部(特别地至耳、鼻、眼或皮肤)施用。在某些实施方案中，神经周、硬膜外/硬膜外、鞘内或皮内施用寡核苷酸诱饵。在某些实施方案中，向患者施用多于一种寡核苷酸诱饵。优选的施用模式由医生决定，并且将部分地取决于医学病况的部位。
在具体实施方案中，可能需要向需要治疗的区域局部施用一种或多种寡核苷酸诱饵。这可以例如但不限于通过在手术期间局部输注、局部敷贴(例如，与手术后的伤口敷料结合)、通过注射、通过导管、通过栓剂，或通过植入物(所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜，诸如硅橡胶膜或纤维)来实现。在一些实施方案中，施用可以是通过在疼痛部位(例如，先前、现在或预期的部位)直接注射。
在某些实施方案中，可能需要通过任何合适的途径(包括但不限于脑室内、鞘内、神经周和/或硬膜外/硬膜外注射)将一种或多种寡核苷酸诱饵导入神经系统。脑室内注射可以通过脑室内导管(例如，附接于储器诸如Ommaya储器的)来促进。
也可以使用肺施用，例如通过使用吸入器或雾化器，以及具有雾化剂的制剂，或通过在碳氟化合物或合成肺表面活性剂中的灌注。
在治疗或预防患者疼痛中将是有效的寡核苷酸诱饵的量将取决于病况的具体性质，并且可通过本领域已知的标准临床技术来确定。另外，可任选地使用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。所施用的寡核苷酸诱饵的量当然将取决于受治疗的受试者、受试者的体重、痛苦的严重程度、施用方式和处方医师的判断等因素。在某些实施方案中，单剂量的寡核苷酸诱饵包含约5μg至约15mg、约50μg至约7.5mg、约100μg至约1mg、约250μg至约750μg，或约500μg的寡核苷酸诱饵/千克(kg)体重。
在一些实施方案中，剂型适于不超过每日两次，更优选每日仅一次向患者施用。给药可以单独提供或与其它药物组合提供，并且可持续长至有效治疗或预防疼痛所需的时间。
组合物和试剂盒
某些实施方案包括组合物，例如药物或治疗组合物，其包含任选与一种或多种药学上可接受的载体(例如，药物级载体)组合的本文所述的一种或多种治疗剂(例如，寡核苷酸诱饵、结合剂)。
本文公开的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种治疗剂(例如，寡核苷酸诱饵)，优选以纯化形式与合适量的药学上可接受的载体一起，以提供用于向患者的适当施用的形式。当向患者施用时，治疗剂诸如寡核苷酸诱饵和药学上可接受的载体优选是无菌的。药学上可接受的载体的实例包括但不限于盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、tris缓冲液、水、含水乙醇、乳液诸如油/水乳液或甘油三酯乳液、片剂和胶囊。当静脉内施用寡核苷酸诱饵时，水是优选的媒介物。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体媒介物，特别是用于可注射溶液。合适的药学上可接受的载体还包括赋形剂诸如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙烯、乙醇、水、乙醇等。如果需要，药物组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。另外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。
药物组合物可通过常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法制备。可以以常规方式使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂配制药物组合物，其有利于将本文公开的化合物加工成可在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。
药物组合物可采取溶液、混悬剂、乳液、片剂、丸剂、丹剂、胶囊、含有液体的胶囊、粉剂、持续释放制剂、栓剂、气雾剂、喷雾剂、混悬剂或适合使用的任何其它形式的形式。合适的药物媒介物的其它实例已经在本领域中进行了描述(参见Remington’sPharmaceutical Sciences,Philadelphia College of Pharmacy and Science，第19版，1995)。
用于口服递送的药物组合物可呈片剂、锭剂、水性或油性混悬剂、颗粒剂、粉剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂或酏剂形式。口服施用的组合物可含有一种或多种任选的试剂，例如甜味剂诸如果糖、阿斯帕坦或糖精、调味剂诸如薄荷、冬青油或樱桃着色剂和防腐剂，以提供药学上可口的制剂。此外，当呈片剂或丸剂形式时，可包被组合物以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在延长的时段内提供持续的作用。口服组合物可包括标准媒介物诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。此类媒介物优选是药物级的。
对于口服液体制剂诸如例如混悬剂、酏剂和溶液剂，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、盐水、亚烷基二醇(例如，丙二醇)、聚亚烷基二醇(例如，聚乙二醇)、油、醇、pH 4与pH 6之间的微酸性缓冲液(例如，在约5mM至约50mM之间的乙酸盐、柠檬酸盐或抗坏血酸盐)等。另外，可以加入调味剂、防腐剂、着色剂、胆汁盐、酰基肉碱等。
对于颊部施用，组合物可采取以常规方式配制的片剂、锭剂等形式。适合与喷雾器和液体喷雾装置和EHD气溶胶装置一起使用的液体药物制剂通常包括化合物与药学上可接受的媒介物。在一些方面，药学上可接受的媒介物是液体，诸如醇、水、聚乙二醇或全氟化碳。任选地，可添加另一种材料以改变化合物的溶液或混悬剂的气溶胶性质。在一些方面，所述材料是液体诸如醇、二醇、聚乙二醇或脂肪酸。配制适用于气溶胶装置的液体药物溶液或混悬剂的其它方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Biesalski，美国专利第5,112,598号；Biesalski，美国专利第5,556,611号)。还可将化合物配制成直肠或阴道组合物，诸如例如含常规栓剂基质诸如可可脂或其它甘油酯的栓剂或保留灌肠剂。除了先前描述的制剂以外，还可将化合物配制为贮库型制剂(depot preparation)。此类长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射进行施用。因此，例如，化合物可用合适的聚合物或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物，例如配制为微溶盐。
可将寡核苷酸诱饵作为药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物包含在任何本文所述的制剂中，或者任何其它合适的制剂中。药学上可接受的盐大体上保留母体化合物的活性，并且可通过与适当的碱或酸反应来制备，并且倾向于比相应的母体形式更易溶于水性和其它质子溶剂中。
在一些情况下，可将脂质体用于促进寡核苷酸诱饵至细胞中的摄取，例如在体外或在受试者中(参见，例如，Williams,S.A.,Leukemia10(12):1980-1989,1996；Lappalainen等，Antiviral Res.23:119,1994；Uhlmann等，Chemical Reviews，第90卷，No.4,25，第544-584页，1990；Gregoriadis,G.，第14章，Liposomes,Drug Carriers inBiology and Medicine，第287-341页，Academic Press,1979)。水凝胶也可以用作用于寡核苷酸诱饵施用的媒介物，例如，如WO 93/01286中所述的。或者，可将寡核苷酸诱饵在微球或微粒中施用。(参见，例如Wu,G.Y.和Wu,C.H.,J.Biol.Chem.262:4429-4432,30 1987)。或者，使用与寡核苷酸诱饵复合的充气微泡可增强向靶组织的递送，如美国专利第6,245,747号中所述的。也可使用持续释放组合物。这些可包括以成型制品形式存在的半透性聚合物基质，诸如膜或微胶囊。
可使用本领域公认的技术(例如，转染、电穿孔、融合、脂质体、胶体聚合物颗粒和病毒及非病毒载体以及本领域已知的其它方法)将寡核苷酸诱饵引入细胞。所选择的递送方法将至少取决于寡核苷酸化学、待处理的细胞和细胞的位置，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。例如，可以通过在表面上具有导向脂质体的特异性标志物的脂质体、直接注射至含有靶细胞的组织中、特异性受体介导的摄取等来实现定位。
如本领域中已知的，寡核苷酸诱饵可使用例如牵涉脂质体介导的摄取、脂质缀合物、聚赖氨酸介导的摄取、纳米颗粒介导的摄取和受体介导的内吞作用的方法，以及另外的非内吞递送模式诸如显微注射、透化(例如，链球菌溶血素-O透化作用、阴离子肽透化作用)、电穿孔和本领域已知的各种非侵入性非内吞递送方法(参见，例如，Dokka和Rojanasakul,Advanced Drug Delivery Reviews 44:35-49，通过引用整体并入)来进行递送。
在某些实施方案中，在试剂盒中提供一种或多种寡核苷酸诱饵。在某些实施方案中，试剂盒包括例如用于使用所述一种或多种寡核苷酸诱饵的说明书。在某些实施方案中，所述说明书描述了本发明的一种或多种方法，例如用于预防或治疗疼痛的方法，调节细胞中基因表达的方法，调节细胞中感受伤害的信号传导的方法，调节细胞中的蛋白质降解等的方法。在某些实施方案中，试剂盒中提供的寡核苷酸诱饵以冻干形式提供。在某些相关实施方案中，包含一种或多种冻干的寡核苷酸诱饵的试剂盒还包含可用于重悬浮一种或多种寡核苷酸诱饵的溶液(例如，药学上可接受的盐水溶液)。
以下实施例旨在说明而非限制本发明。本文提及的每个专利和非专利参考文献通过引用整体并入。
实施例
实施例1
靶向KLF家族用于治疗疼痛
设计针对转录因子(KLF)的Krüppel样家族成员的寡核苷酸诱饵，其特征在于KLF结合，并在神经性疼痛和神经炎性疼痛的动物模型中对其测试。
跨两个单独的神经性和神经炎性疼痛模型(如下所述的)的KLF结合模式、功效幅度和持续时间的交叉分析显示，寡核苷酸诱饵TF D16(GATCCTTTGCCTCCTTCGATCCTTTGCCTCCTTCAAG；SEQ ID NO:37)和TFD17(GGTGTTTGGGAGAGCTTTGGGAGGATACG；SEQ ID NO:38)在两种模型中均有效，并通过抑制KLF6,9和/或15起作用(数据未显示)。这些数据表明，通过KLF9和KLF15的组合抑制，减轻慢性神经性疼痛的功效是有效的，通过KLF6和KLF9的组合抑制，减轻慢性神经炎性疼痛的功效是有效的。
因此，选择TFD16和TFD17作为序列矩阵来产生具有互补KLF6、9和15结合模式的另外的寡核苷酸诱饵序列。基于该分析，制备表2(上文)中的寡核苷酸诱饵，测试其的KLF结合，并且如下所述，在疼痛的动物模型中进一步测试表E1(下文)中的那些寡核苷酸诱饵。
ELISA测定。使用定制版本的SP1商业ELISA试剂盒(SP1ELISA试剂盒，目录号EK-1090，Affymetrix)测量寡核苷酸诱饵的KLF结合。简言之，将生物素-诱饵探针(12.8皮摩尔/孔)与15μg的含有KLF转录因子的核蛋白提取物一起孵育，所述提取物来自(a)HELA细胞：用于KLF1-6、8-14和16-17检测(目录#36010，活性基序，CA)，或(b)HEK290：用于KLF15检测(目录#36033，活性基序，CA)。对于KLF 7检测，使用0.5和1μg重组人KLF7蛋白(Novus，CA，目录号NBP2-23176)。
根据ELISA试剂盒供应商进行诱饵探针-蛋白质混合物的加工：将混合物加载在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板上，并在微量板读数器(OD450nm)中用基于抗体的比色检测(缀合于HRP的抗-兔第二抗体)测量捕获的KLF的量。当将递增浓度的竞争性非生物素化诱饵添加至结合混合反应时，结合至生物素化探针的转录因子的减少是结合特异性的证明。针对内部测量的每一个ELISA运行的本底信号对所有数据进行标准化，并根据试剂盒供应商的推荐标准化所有测试步骤和测试条件，包括利用检测缓冲液的检测时间(即，对于该测定，5.2分钟被测定为最佳的)，以确保ELISA运行之间的强力(brute)OD450结合值的适当比较。
对于ELISA测定，每种诱饵的单链由Invitrogen(CA)制造，将其重悬于100μM的TEpH 8，NaCl 50μM中的原液中，并如下在4μM工作溶液中退火：(a)诱饵混合物(100μL)：4μL反义链(100μM)+4μl反义链(100μM)+89.5μl TE pH 8+2.5μl NaCl(1.94M)；(b)退火：在95°下7分钟，随后在使用或于-20℃下贮存之前在室温下缓慢冷却1小时。
通过测量结合信号线性、与游离竞争剂KLF诱饵的结合的减少，以及通过缺乏与突变型诱饵结合的KLF来评估结合特异性(参见下表E2)。
兔第一KLF抗体从商购可得来源获得，并且用于KLF测定的缀合于HRP的第二抗兔抗体是ELISA试剂盒中提供的抗体(稀释度1:200)。
体内功效研究。下面提供了用于疼痛动物模型的材料和方法。
动物。Sprague-Dawley大鼠，250-300g，雄性，Harlan Industries(Livermore，CA)。
测试和对照用品。对于动物测试，寡核苷酸诱饵由Trilink Biotechnologies(CA)制造并被配制为10mM或15mM原液(Tris-pH 7.5，CaCl2)。对于选定的剂量递送，以适当浓度制备用于20μL注射的每种诱饵。以盲法方式和在即用型小瓶中将供寡核苷酸诱饵和媒介物对照(Tris-10mM，140mM NaCl，pH 7.5)提供至测试部位。
保留性神经损伤(SNI)模型。以2L/分钟用2％的O2中的异氟烷诱导麻醉，并用0.5％的O2中的异氟烷来维持麻醉。然后剃刮大鼠并且将其无菌地准备用于手术。基于由Decosterd等描述的方法(Decosterd和Woolf，2000)进行保留性神经损伤。简言之，切开左大腿的皮肤和筋膜，股二肌(m.biceps femoris)的两头扩展，暴露坐骨神经的3个末端分支。紧密结扎胫骨和腓总神经，远端解剖以结扎，去除2-3mm的神经干。腓肠分支完好无损。以分层方式封闭伤口。
慢性压迫性损伤(CCI)模型。根据慢性压迫性损伤模型(Bennett和Xie，1988)，通过经过股二头肌的钝性解剖在大腿中部的水平暴露右侧共同坐骨神经。在坐骨三叉分枝附近，约12mm的神经没有粘附组织，并且四个结扎线以约1mm的间距松弛地围绕所述神经。所受影响的神经的长度为约6-8mm长。注意绑扎结扎线，以使得当用40倍放大倍数观察时，看到神经的直径恰好几乎不缢缩。期望的缢缩程度延迟但不阻止通过表面神经脉管系统的循环，并且有时在暴露的周围的肌肉中产生小的短暂的颤搐。在层中封闭切口。
机械超敏性。使用重复von Frey细丝测试将疼痛测量为机械超敏性。简言之，使用von Frey细丝(1-4-6-8-10-10-26g)测试对后爪机械刺激的反应性。在测试前1小时，使动物习惯在网孔地板上，并且每个细丝应用五次。对于每个应用，用足以引起轻微弯曲的垂直于爪压靠毛发，并保持约1-2秒。如果爪急剧撤回，则注意到阳性反应。在除去毛发后立即退缩也被认为是阳性反应。按照上述模式连续提供刺激。在手术前和注射前后的确定的时间点在基线测试动物。
盲法和随机化。所有实验都是盲法进行的。测试地点接受盲法小瓶，并且盲测代码在测试完成后破裂。
在基线疼痛测试后和给药前在POD14进行随机化。对于每个测试的组群，将动物分布在2至3只大鼠的组中，以使得平均POD14von Frey值尽可能接近测试组，如果值允许，靶向彼此的15％内。一旦动物被分成组，针对组的溶液处理的性质是由实验者自行决定的。
预定义的纳入与排除标准。从结果分析排除在第一次注射当天(即，POD14)具有≤5的von Frey值的动物。为5的von Frey值基于跨多个测试部位的内部历史数据，其中大鼠可在基础条件下，手术前达到该值，因此是模型诱导的超敏反应的不存在/存在的阈值。如果在注射后的第一周期间，媒介物处理的机超敏性值的平均值减小50％或更多，则基于疼痛模型没有适当地执行的理由排除该组群。
鞘内递送。鞘内递送寡核苷酸诱饵。将Sprague-Dawley大鼠用2％异氟烷麻醉，将其背部剃毛并用聚维酮碘(Betadine)来制备。然后将大鼠放在瓶上以保持背部拱起。将17G1/2针沿着L6椎骨水平横突的左侧向嘴侧滑动，直至其达到L5椎骨水平。然后将针插入L5与L6之间，直至达到鞘内空间，如通过尾部颤搐所指示的。然后鞘内(IT)注射20μL的诱饵或媒介物。取决于研究，大鼠在手术后于POD14，或在POD14和在POD17接受单次IT注射一次。
统计分析。使用非参数学生T检验，随后通过不均匀方差校正的T-Welsh分析来分析个体时间点和实验条件之间的数据分布比较。
来自KLF结合ELISA分析以及利用单一剂量水平的诱饵的疼痛的CCI和SNI动物模型的结果示于图1-3B中。图1显示来自表2和E1的寡核苷酸诱饵相对于独立对照KLF诱饵(以灰色突出显示；参见，例如Shields和Yang，1998；Matsumuto等，1998)的KLF结合特征。针对KLF6、KLF9和KLF15的结合值表示为来自实施例1中描述的体外ELISA结合测定的平均值和SEM OD450值。还列出了相应的N。治疗神经性疼痛和/或神经炎性疼痛的功效表示为在相应动物研究的测试期间相对于对照的疼痛减轻的百分比(％)。
图2A-B显示了测试的寡核苷酸诱饵在慢性神经性疼痛的SNI模型中的功效，图3A-B显示了测试的寡核苷酸诱饵在慢性神经炎性疼痛的CCI模型中的功效。
进行体内测试的所有寡核苷酸诱饵的组合体内功效和体外结合结果的详细荟萃分析，以表征KLF结合模式与寡核苷酸诱饵的功效之间的关系。图4A-C显示与它们的KLF15/KLF9结合比率相关的用于治疗慢性神经性疼痛的寡核苷酸诱饵的功效水平(4A)，用于治疗慢性神经性疼痛的功效与对KLF6、KLF9和KLF15的结合参数之间的线性相关系数(4B)，以及与KLF15/KLF9结合比率相关的功效水平的线性回归(4C)。
类似地，图5A-C显示与它们的对KLF6、KLF9和KLF15的组合结合相关的用于治疗慢性神经炎性疼痛的寡核苷酸诱饵的功效水平(5A)，治疗慢性神经炎性疼痛的功效与对KLF6、KLF9和KLF15的结合参数之间的线性相关系数(5B)，和与对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力相关的功效水平(如通过1/(KLF6+KLF9)结合比率指示的)的线性回归(5C)。
图6显示跨补充性病原性疼痛(从神经性疼痛(Y-轴)至包括炎性组分的疼痛(X-轴))的来自本发明的诱饵相对于来自文献的对照KLF共有诱饵(TFDC1、TFDC2和TFD3)的功效的差异和优异模式。
图7显示表2中的寡核苷酸诱饵的1/(KLF6+KLF9)结合比率(其表示治疗神经炎性疼痛的功效)(越低，则功效越强)和KLF15/KLF9结合比率(其指示治疗神经性疼痛的功效)(越高，则功效越强))的曲线图。X轴中的每个数字对应于个体诱饵。
为了进一步表征16.6.5寡核苷酸诱饵的治疗特征，在SNI和CCI动物模型中进行剂量反应研究。图8A-B显示了在这两种疼痛动物模型中从50至300纳摩尔的递增剂量水平的稳固和持久的功效。
总之，这些研究不仅鉴定将KLF转录因子的家族鉴定为用于治疗疼痛的治疗相关性靶标，而且还相对于先前描述的KLF序列鉴定了一组寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列对KLF转录因子具有独特的结合特征，所述结合特征与用于治疗跨多个病因的体内疼痛的独特和强劲的潜力相关。
序列表
<110> Adynxx, Inc.
Mamet, Julien
Orr, Rick
Manning, Don
Harris, Scott
Martin, William
<120> 用于疼痛治疗的寡核苷酸诱饵
<130> ADDY-003/01WO
<150> US 62/037,996
<151> 2014-08-15
<160> 42
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> 核苷酸1-4可以存在或可以不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(24)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(32)
<223> 核苷酸19-32可以存在或可以不存在
<400> 1
atccttygmm tyykycnhhn nvnnymhwbv aw 32
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 核苷酸1-5可以存在或可以不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> n为a, c, g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(28)
<223> 核苷酸19-28可以存在或可以不存在
<400> 2
tgtkbkkddv dnsdnbnndv mbvmhrma 28
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 3
tttgcctcct tcgatccc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 4
atcctttgcc tccttcga 18
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 5
atcctttgcc tccttccctt tgcctccttc aa 32
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 6
cctttgcctc cttccctttg cctccttc 28
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 7
atcctttgcc tccttcgaag gaggcaaagg at 32
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 8
atcctttgcc tccttccttt gcctccttca a 31
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 9
atcctttgcc tccttcgcct ccttcaa 27
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 10
cctttgcctc cttcgcctcc ttc 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 11
atcctttgcc tccttctcct tcaa 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 12
atcctttgcc tttgcctcct tcaa 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 13
cctttgcctt tgcctccttc 20
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 14
tgtttgggag agctt 15
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 15
gctttgggag gatac 15
<210> 16
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 16
tgggagagct ttggga 16
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 17
tgtttgggag atttgggagg atac 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 18
tttgggagat ttgggaggat 20
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 19
tgtttgggag aatcctccca aagc 24
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 20
tttgggagaa tcctcccaaa 20
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 21
tgtttgggag agctatcctc ccaaagc 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 22
tttgggagag ctatcctccc aaa 23
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 23
tgtttgggag agggaggata c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 24
tgtttgggtt tgggaggata c 21
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 25
cctttgcctc cttcgcctcc ttcaa 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 26
tcctttgcct ccttcgcctc cttca 25
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 27
cctttgcctc cttcgcctcc ttca 24
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 28
atccttcgcc tccttcaa 18
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 29
atccttcgcc ttcgcctcct tcaa 24
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 30
atccttcgcc tccttcgcct ccttcaa 27
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 31
tgtttgggag aatcctccca aa 22
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 32
tttgggagaa tcctcccaaa gc 22
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 33
gtttgggaga atcctcccaa ag 22
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 34
atccttcgcc tccttctccc aaagc 25
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 35
atccttcgaa tccttccaaa gc 22
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 36
gcgcacccca gcctggctca cccacgcg 28
<210> 37
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 37
gatcctttgc ctccttcgat cctttgcctc cttcaag 37
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KLF诱饵寡核苷酸
<400> 38
ggtgtttggg agagctttgg gaggatacg 29
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 游离竞争剂KLF诱饵寡核苷酸
<400> 39
atgcaggaga aagattggcg tagtatctac tag 33
<210> 40
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 游离竞争剂KLF诱饵寡核苷酸
<400> 40
cttcatgatt ttattgcttt caaaatccaa aat 33
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 游离竞争剂 KLF诱饵寡核苷酸
<400> 41
gttatgcgtt tgtagatgct ttcgttatag 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 游离竞争剂KLF诱饵寡核苷酸
<400> 42
ctatttcgaa acgatctaca ttggcataac 30

Claims (31)

1.一种包含至少两个转录因子结合位点的组合的寡核苷酸诱饵，其中每个转录因子结合位点结合选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组的转录因子。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸诱饵，其中所述寡核苷酸诱饵的长度为约15至约35个碱基对。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸诱饵，其中所述寡核苷酸诱饵包含第一转录因子结合位点和第二转录因子结合位点，并且其中所述第一和所述第二转录结合位点重叠。
4.根据权利要求1所述的寡核苷酸诱饵，其中所述寡核苷酸诱饵具有第一转录因子结合位点、第二转录因子结合位点和第三转录因子结合位点，并且其中所述第一、第二和第三转录因子结合位点重叠。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸诱饵，其中所述第一转录因子结合位点结合KLF6，所述第二转录因子结合位点结合KLF9，且所述第三转录因子结合位点结合KLF15。
6.根据权利要求3所述的寡核苷酸诱饵，其中所述第一转录因子结合位点结合KLF9，且所述第二转录因子结合位点结合KLF15。
7.根据权利要求3所述的寡核苷酸诱饵，其中所述第一转录因子结合位点结合KLF9，且所述第二转录因子结合位点结合KLF6。
8.根据权利要求1所述的寡核苷酸诱饵的群体，其中所述寡核苷酸诱饵的群体在标准ELISA测定中提供等于或小于约0.8或等于或高于约1.0的KLF15/KLF9的转录因子结合比率。
9.根据权利要求1所述的寡核苷酸诱饵的群体，其中所述寡核苷酸诱饵的群体在标准ELISA测定中提供等于或高于约0.2OD450的光密度值的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。
10.根据权利要求1所述的寡核苷酸诱饵，其中所述诱饵包含由式1或式2表示的序列：
a1t2c3c4T5T6Y7G8M9M10T11Y12Y13K14Y15C16N17H18h19n20n21v22n23n24y25m26h27w28b29v30a31w32(式1；SEQ ID NO:1)
t1g2t3k4b5K6K7D8D9V10D11N12S13D14N15B16N17N18d19v20m21b22v23m24h25r26m27a28(式2；SEQ IDNO:2)
其中S为G或C；W为A或T；Y为T或C；D为A、G或T；B为C、G或T；K为T或G；M为C或A；H为C、T或A；V为C、G或A；R为A或G；并且N为任何核苷酸，其中小写字母可以存在或不存在，并且其中下标中的所述数字表示核苷酸在所述序列中的位置。
11.根据权利要求1所述的寡核苷酸诱饵，其中所述诱饵包含选自由SEQ ID NO：3-35组成的组的序列。
12.根据权利要求1所述的寡核苷酸诱饵，其中所述诱饵包含与SEQ ID NO:28(16.6.5)、SEQ ID NO:25(16.6.2)、SEQ ID NO:19(17.5)、SEQ ID NO:34(T16.6-T17.5Fu1)或SEQ ID NO:35(T16.6-T17.5Fu2)的序列具有至少70％同一性的序列。
13.一种寡核苷酸诱饵，其包含由式1或式2表示的序列:
a1t2c3c4T5T6Y7G8M9M10T11Y12Y13K14Y15C16N17H18h19n20n21v22n23n24y25m26h27w28b29v30a31w32(式1；SEQ ID NO:1)
t1g2t3k4b5K6K7D8D9V10D11N12S13D14N15B16N17N18d19v20m21b22v23m24h25r26m27a28(式2；SEQ IDNO:2)
其中S为G或C；W为A或T；Y为T或C；D为A、G或T；B为C、G或T；K为T或G；M为C或A；H为C、T或A；V为C、G或A；R为A或G；并且N为任何核苷酸，其中小写字母可以存在或不存在，并且其中下标中的所述数字表示核苷酸在所述序列中的位置。
14.根据权利要求13所述的寡核苷酸诱饵，其中所述诱饵包含选自由SEQ ID NO：3-35组成的组的序列。
15.根据权利要求13所述的寡核苷酸诱饵，其中所述诱饵包含与SEQ ID NO:28(16.6.5)、SEQ ID NO:25(16.6.2)、SEQ ID NO:19(17.5)、SEQ ID NO:34(T16.6-T17.5Fu1)或SEQ ID NO:35(T16.6-T17.5Fu2)的所述序列具有至少70％同一性的序列。
16.一种药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸诱饵或群体和药学上可接受的载体。
17.一种试剂盒，其包含权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸诱饵或群体，任选地使用所述寡核苷酸诱饵的说明书。
18.一种用于调节存在于细胞中的参与感受伤害的信号传导的基因的转录的方法，所述方法包括对所述细胞施用有效量的权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸诱饵或群体。
19.一种用于调节细胞中的感受伤害的信号传导的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸诱饵或群体。
20.一种治疗受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-15中任一项所述的寡核苷酸诱饵或群体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述疼痛是慢性疼痛。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述疼痛与炎症相关。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述疼痛与所述中枢神经系统或内脏病症相关。
25.一种用于调节细胞中的感受伤害的信号传导的方法，所述方法包括向所述细胞施用治疗有效量的所述治疗剂，其中所述治疗剂抑制转录因子与其转录因子结合位点的结合，其中所述转录因子选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗剂在标准ELISA测定中提供等于或小于约0.8或等于或高于约1.0的KLF15/KLF9的结合比率。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述治疗剂在标准ELISA测定中提供等于或高于约0.2OD450的光密度值的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。
28.一种用于治疗受试者的疼痛的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述治疗剂，其中所述治疗剂抑制转录因子与其转录结合位点的结合，其中所述转录因子选自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17组成的组。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述治疗剂在标准ELISA测定中提供等于或小于约0.8或等于或高于约1.0的KLF15/KLF9的结合比率。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述治疗剂在标准ELISA测定中提供等于或高于约0.2OD450的光密度值的对KLF6和KLF9的总转录因子结合能力。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛。
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