CN113453695A - 用嵌合体诱饵治疗脊柱病症 - Google Patents

用嵌合体诱饵治疗脊柱病症 Download PDF

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Abstract

本文提供用于治疗脊柱病症的方法和组合物。具体而言，能够结合于两种转录因子(NF‑κB和STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵用于治疗椎间盘退化、再生软骨细胞细胞外基质、脊柱疼痛和促进椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成的用途。

Description

用嵌合体诱饵治疗脊柱病症
相关申请的交叉参考
本申请要求2018年12月24日提交的美国临时申请号62/784,599的优先权益处，该申请通过参考结合至本文中。
技术领域
本发明总体上涉及寡核苷酸诱饵，并且更具体地讲涉及能够结合于两种转录因子的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵用于治疗脊柱疼痛的用途。
背景技术
腰痛(LBP)为当今美国导致残疾的主要原因。在3年的时间里，15-20%的美国人需要对背痛进行医学护理。由于生产力丧失和医学护理费用，背痛给社会造成的损失超过五百(500)亿美元。LBP可由腰椎的许多组件引起，特别是椎间盘 (IVD)、椎旁肌和椎骨关节突或小平面关节。
最近的研究表明，多达30%的LBP由小平面关节产生。尽管最近提出小平面关节病理学会引起LBP，但从历史上看，IVD的退化与背痛有关，并且认为IVD退化先于小平面关节骨关节炎(OA)。然而，小平面关节与IVD的退行性改变之间的关系在很大程度上是未知的。
目前，大多数小平面关节OA的治疗仅限于物理疗法、内侧支阻滞、关节内局部麻醉、类固醇注射或射频去神经。基于美国预防服务工作组(US Preventive Service TaskForce) (USPSTF)标准，内侧支阻滞的证据等级为I~II-1。关节内小平面关节阻滞和射频去神经的证据等级分别为II-1~2和II-2~II-3。偶尔也会进行手术，尽管没有明确的证据支持手术干预。最近，研究了透明质酸对小平面关节关节病的作用，但这种治疗的功效仍然存在争议。
已知炎症特征在小平面关节退化的进展和疼痛产生中起着关键作用[2,3]。使用腰椎小平面关节神经阻滞治疗小平面关节中产生的慢性LBP的双盲、对照临床试验的一年随访表明，非手术疗法可用于管理这些患者。小平面关节注射为一种常用的微创手术，涉及注射皮质类固醇；然而，已知类固醇具有副作用，比如抑制软骨细胞的基质合成[4]和感染。
因此，需要一种无创性疗法来治疗LBP，比如小平面关节疼痛。
发明概述
本发明基于以下发现：将嵌合体诱饵寡脱氧核苷酸注射到小平面关节中在改善大鼠中由凝血酶诱发的小平面关节疼痛方面显示出与地塞米松相似或更好的功效。因此，本发明提供一种用于治疗脊柱疼痛的方法。方法包括给予需要它的受试者有效量的能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而治疗受试者的脊柱疼痛。在各种实施方案中，诱饵具有13聚体-15聚体的大小。在各种实施方案中，诱饵具有由SEQ ID NO: 1或6表示的序列。在各种实施方案中，双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。在各种实施方案中，双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。在各种实施方案中，诱饵的5’末端经接头或直接结合于PLGA纳米颗粒。在各种实施方案中，将诱饵直接给予受试者的小平面关节中。在各种实施方案中，诱饵经椎间盘内注射或硬膜外注射给予。在类似的方面，本发明提供一种用于脊柱疼痛的治疗剂，其包含能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵；以及能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的用于治疗脊柱疼痛的双链寡核苷酸诱饵。以上关于用于治疗脊柱疼痛的方法的描述同样适用于这些类似的方面。
在另一方面，本发明提供一种治疗受试者的椎间盘退化的方法。方法包括给予需要它的受试者有效量的能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6(STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而治疗受试者的椎间盘退化。在各种实施方案中，诱饵具有13聚体-15聚体的大小。在各种实施方案中，诱饵具有由SEQ ID NO: 1或6表示的序列。在各种实施方案中，双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。在各种实施方案中，双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。在各种实施方案中，诱饵的5’末端经接头或直接结合于PLGA纳米颗粒。在各种实施方案中，将诱饵直接给予受试者的小平面关节中。在各种实施方案中，诱饵经椎间盘内注射或硬膜外注射给予。在类似的方面，本发明提供一种用于椎间盘退化的治疗剂，其包含能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵；以及能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的用于治疗椎间盘退化的双链寡核苷酸诱饵。以上关于治疗椎间盘退化的方法的描述同样适用于这些类似的方面。
在另一方面，本发明提供一种用于在受试者中再生软骨细胞细胞外基质的方法。方法包括给予需要它的受试者有效量的能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而在受试者中再生软骨细胞细胞外基质。在各种实施方案中，诱饵具有13聚体-15聚体的大小。在各种实施方案中，诱饵具有由SEQ ID NO: 1或6表示的序列。在各种实施方案中，双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。在各种实施方案中，双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。在各种实施方案中，诱饵的5’末端经接头或直接结合于PLGA纳米颗粒。在各种实施方案中，将诱饵直接给予受试者的小平面关节中。在各种实施方案中，诱饵经椎间盘内注射或硬膜外注射给予。在类似的方面，本发明提供一种用于再生软骨细胞细胞外基质的试剂，其包含能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵；以及能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的用于再生软骨细胞细胞外基质的双链寡核苷酸诱饵。以上关于用于在受试者中再生软骨细胞细胞外基质的方法的描述同样适用于这些类似的方面。
在另一方面，本发明提供一种用于促进受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成的方法。方法包括给予需要它的受试者有效量的能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而促进受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成。在各种实施方案中，诱饵具有13聚体-15聚体的大小。在各种实施方案中，诱饵具有由SEQ ID NO: 1或6表示的序列。在各种实施方案中，双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。在各种实施方案中，双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。在各种实施方案中，诱饵的5’末端经接头或直接结合于PLGA纳米颗粒。在各种实施方案中，将诱饵直接给予受试者的小平面关节中。在各种实施方案中，诱饵经椎间盘内注射或硬膜外注射给予。在类似的方面，本发明提供一种用于促进受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成的治疗剂，其包含能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵；以及能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的用于促进受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成的双链寡核苷酸诱饵。以上关于用于促进受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成的方法的描述同样适用于这些类似的方面。
附图简述
[图1]图1为图表，其显示使用经注射的和对侧的后爪两者对通过冯弗雷(vonFrey)毛细丝进行的机械刺激的50%缩爪阈值反应评估大鼠机械性痛觉超敏的结果。
[图2]图2A和2B为显示来自由小平面关节疼痛引起的一般状况和活动的行为评价的结果的图表。为评估大鼠的一般状况，分析了体重的变化(图2A)。为评价由小平面关节疼痛引起的一般活动的变化，在手术之前和手术之后1周(术前和术后)进行了由摄像机和行为分析软件(HOMECAGESCAN, Clever Sys Inc, Reston, VA)组成的市售设备(图 2B)。
[图3]图3A和3B为显示背根神经节对于Iba和CGRP的免疫组织化学数据(图3A)以及免疫组织化学染色和冯弗雷测试结果的相关性(图3B)的图表。
[图4]图4为显示由白细胞介素-1刺激的人类椎间盘细胞中蛋白聚糖周转结果的图表。
[图5]图5显示残留于组织中的S-PG (与对照的比率)。
[图6]图6显示椎间盘高度指数。
[图7]图7显示MRI T2自旋回波加权图像。
[图8]图8显示T2 MRI (L3/4对照、L2/3、L4/5注射)。
用于实施本发明的方式
本发明提供嵌合诱饵可用于各种实施方案以治疗椎间盘退化、再生软骨细胞细胞外基质、促进蛋白聚糖的合成和治疗脊柱疼痛。
在描述本组合物和方法之前，应当理解本发明不限于所描述的特定组合物、方法和实验条件，因为这类组合物、方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。
如本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指涉，除非上下文另外明确规定。因此，例如指涉“该方法”包括在阅读本公开等后对本领域技术人员将变得显而易见的本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤。
与“包括”、“含有”或“特征为”可互换使用的术语“包含”为包容性或开放式语言，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。短语“由……组成”不包括权利要求中未规定的任何要素、步骤或成分。短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限于规定的材料或步骤以及不会实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。本公开考虑相应于这些短语中每一个的范围的本发明组合物和方法的实施方案。因此，包含所列举的要素或步骤的组合物或方法考虑其中组合物或方法基本上由那些要素或步骤组成或者由那些要素或步骤组成的特定实施方案。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。
本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请均通过参考结合至本文中至如同每个单个公开、专利或专利申请具体和单独地表明通过参考结合的相同程度。
如本文使用的术语“诱饵”是指类似于某种物质最初应结合或作用于的结构的结构。如本文提供的用于转录因子的诱饵可为具有与基因组基因上转录因子的结合区域相同的DNA序列的双链寡核苷酸。在存在这种寡核苷酸诱饵的情况下，一些转录因子分子结合于诱饵寡核苷酸，而不是结合于基因组基因上其本应结合的结合区域。这导致结合于基因组基因上其本应结合的结合区域的转录因子分子的数量减少，从而导致转录因子的活性降低。嵌合诱饵含有用于结合多于一个转录因子的DNA序列。
如本文使用的术语“痛觉超敏”是指在通常无痛的、经常重复的刺激后的中枢性疼痛敏化(神经元的反应增加)。痛觉超敏可导致由通常不会引起疼痛的刺激触发疼痛反应。
如本文使用的“椎间盘源性疼痛”是指源自受损的椎间盘(特别是由于退行性椎间盘疾病)的疼痛。
脊柱的椎间盘(IVD)由富含胶原蛋白的外部纤维环(AF) (导致其抗拉强度)和内部髓核(NP) (含有大蛋白聚糖(PG)，可保持水分以抵抗压缩负荷)组成。在生物学上，AF和NP两者中的椎间盘细胞保持在其细胞外基质(ECM)的合成代谢和分解代谢之间的平衡或稳态代谢，并受到多种物质的调节，所述物质包括细胞因子、酶、其抑制剂和生长因子，比如胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子β (TGF-β)和骨形态发生蛋白(BMP)。各种酶比如基质金属蛋白酶(MMP)和细胞因子介导基质的分解代谢过程或分解。IVD的退化被认为是由于正常椎间盘中保持的合成代谢和分解代谢过程之间的失衡或稳态代谢的丧失造成的。
如本文使用的“小平面关节”是指脊柱中的关节，其使背部灵活并使得受试者能够弯曲和扭转。神经在其通往身体其他部位的途中通过这些关节离开脊髓。健康的小平面关节具有软骨，其允许椎骨相互平滑地移动而不会磨削。
如本文使用的术语“受试者”或“宿主生物体”是指对其进行主题方法的任何个体或患者。通常受试者为人，尽管如本领域技术人员将意识到的，受试者可为动物。因此，其他动物，包括哺乳动物(比如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪等)以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)，均包括在受试者的定义中。
术语“治疗有效量”或“有效量”意指引起研究人员、兽医、医生或其他临床医师正在探寻的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的化合物或药用组合物的量。因此，术语“治疗有效量”在本文中用于表示当在一段时间内反复施用于受影响的区域时引起疾病状况显著改善的制剂的任何量。该量随所治疗的病症、病症的发展阶段以及所施用制剂的类型和浓度而变化。在任何给定情况下的适当量对本领域技术人员而言为易于显而易见的或者能够通过常规实验确定。
如本文使用的术语“减少”和“抑制”一起使用，因为认识到在某些情况下可将减少减少至低于特定测定的检测水平。因此，可能并不总是明确表达水平或活性是“降低至”低于测定的检测水平还是完全“被抑制”。然而，在根据本方法进行治疗后，其将是可明确确定的。
如本文使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指将组合物给予患有不期望的病症的受试者或系统。病症可包括病症、疾病或障碍。“预防(Prevention)”或“预防(preventing)”意指将组合物给予处于病症风险下的受试者或系统。病症可包括易患疾病或障碍。将组合物给予受试者的效果(治疗和/或预防)可为(但不限于)病症的一种或多种症状的停止、病症的一种或多种症状的减轻或预防、病症严重程度的降低、病症的完全消融、特定事件或特征的发展或进展的稳定或延迟、或者特定事件或特征将发生的机会的最小化。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、α-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即结合于氢、羧基、氨基和R基团的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
氨基酸在本文中可通过其通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的一字母符号来指涉。同样，核苷酸可通过其通常接受的单字母代码来指涉。
如本文使用的术语“基因”意指包含结构基因编码区的脱氧核糖核苷酸序列。“基因”还可包括位于5’和3’末端两者上的编码区附近的非翻译序列，使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5’并且存在于mRNA上的序列称为5’非翻译序列。位于编码区3’或下游且存在于mRNA上的序列称为3’非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式两者。基因的基因组形式或克隆含有以称为“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子为转录成异质性核RNA (hnRNA)的基因区段；内含子可含有调控元件，比如增强子。内含子从核或初级转录物中被移除或“剪除”；因此信使RNA (mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在翻译期间发挥作用，以指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序。
核酸的“序列”是指核酸中核苷酸的顺序和身份。序列一般地以5’到3’方向读取。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一的”或“同一性”百分比是指当比较和比对最大对应性时，例如如使用技术人员可用的序列比较算法之一或通过目视检查测量的，相同的两个或更多个序列或子序列或者具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的示例性算法为BLAST程序，其描述于例如Altschul等人(1990) “Basic local alignment search tool” J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish等人(1993) “Identification of protein coding regions by databasesimilarity search” Nature Genet. 3:266-272, Madden等人(1996) “Applications ofnetwork BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul等人(1997)” GappedBLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 和Zhang等人(1997) “PowerBLAST: A new networkBLAST application for interactive or automated sequence analysis andannotation” Genome Res. 7:649-656中，其每一个均通过参考结合。许多其他最佳比对算法也是本领域已知的，并且任选地用于确定序列同一性百分比。
如本文使用的术语“功能连接”和“可操作地连接”可互换使用，并且是指两个或更多个DNA区段，特别是待表达的基因序列和控制其表达的那些序列之间的功能关系。例如，如果启动子/增强子序列(包括顺式作用转录控制元件的任何组合)刺激或调节编码序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中的转录，则其可操作地连接于编码序列。可操作地连接于转录基因序列的启动子调控序列在物理上与转录序列为连续的。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码子指定的每个位置处，密码子可改变为所描述的任何相应密码子而不改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，其为其中一种保守修饰的变异。本文编码多肽的每个核酸序列还描述核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将会认识到，核酸中的每个密码子(除AUG(其通常为甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG (其通常为色氨酸的唯一密码子)之外)可经改变以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异均隐含在每个描述的序列中。
对于氨基酸序列，技术人员将认识到改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个别取代、缺失或添加，为其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代的“保守修饰的变体”。提供功能相似的氨基酸的保守取代表为本领域众所周知的。这种保守修饰的变体为对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的附加并且不排除本发明的多态变体、种间同源物和等位基因。
如本文使用的“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，比如磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂，比如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂。
已知显示对转录因子具有结合亲和力的各种双链寡核苷酸诱饵通过给予转录因子诱饵以降低目标转录因子的活性来治疗或预防由转录因子引起的疾病。最近，已经描述了包括第一转录因子的第一结合位点和第二转录因子的第二结合位点的双链寡核苷酸诱饵(参见例如美国公开号2018/0298381和国际公布WO2017/043639，其两者均通过参考结合至本文中)。简而言之，包括第一结合位点的有义链的第一链和包括第二结合位点的有义链的第二链杂交以形成双链。进一步地，第一结合位点的有义链和第二结合位点的有义链至少部分地杂交。
美国公开号2018/0298381中描述的示例性双链寡核苷酸诱饵为NF-κB/STAT6-15mer-B诱饵，其由以下式I (SEQ ID NO: 1)表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
因此，对于具有由式[I]表示的结构的NF-κB/STAT6-15mer-B，第一转录因子为NF-κB，和第二转录因子为STAT6。第一和第二链为互补的，并因此第二链为第一链的互补链。在第一链中由大写字母标示的序列GGGATTTCCT (SEQ ID NO: 2)为NF-κB的结合位点，和在第二链中由大写字母标示的序列TTCCCAGGAAA (SEQ ID NO: 3) (由于该序列为互补链，所以其在式[I]中以其3’末端在左侧书写；并因此该序列与式[I]中表示的序列实际上相同，尽管它们以相反方向书写)为STAT6的结合位点。
转录因子的共有序列通常用通式表示。NF-κB的共有序列为GGGRHTYYHC (SEQ IDNO: 4) (其中R代表A或G，Y代表C或T，和H代表A、C或T)，和STAT6的共有序列为TTCNNNNGAA(SEQ ID NO: 5) (其中N代表A、G、T或C)。因此，第一链中NF-κB的结合位点GGGATTTCCT(SEQ ID NO: 2)与NF-κB的共有序列相同，除3’末端唯一一个碱基与NF-κB的共有序列错配之外。第二链中STAT6的结合位点TTCCCAGGAAA (SEQ ID NO: 3)含有STAT6的整个共有序列。当描述碱基序列时，描述的是有义链的碱基序列，尽管转录因子的结合位点和共有序列为双链的。因此，如上所述的结合位点和共有序列的碱基序列均为有义链的碱基序列。因此，第一链含有NF-κB结合位点的有义链，和第二链含有STAT6结合位点的有义链。
另一种示例性寡核苷酸诱饵NF-κB/STAT6-15mer-A)提供为式 II (SEQ ID NO:6)：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
因此，对于具有由式[II]表示的结构的NF-κB/STAT6-15mer-B，第一转录因子为NF-κB，和第二转录因子为STAT6。第一和第二链为互补的，并因此第二链为第一链的互补链。在第一链中用大写字母标示的序列GGGACTTCCC (SEQ ID NO: 7)为NF-κB的结合位点，和在第二链中用大写字母标示的序列TTCATGGGAAG (SEQ ID NO: 8) (由于该序列为互补链，所以其在式[II]中以其3’末端在左侧书写；并因此该序列与式[II]中表示的序列实际上相同，尽管它们以相反方向书写)为STAT6的结合位点。
本发明的嵌合诱饵可为简单的双链，或者可为其中每条链的一个或两个末端经间隔物结合的发夹或哑铃(U形钉)诱饵。发夹和哑铃诱饵为优选的，因为其具有更高的稳定性。在综合评估与转录因子的结合活性和稳定性时，发夹诱饵为最优选的。制备这种发夹双链嵌合诱饵和其他核酸酶抗性修饰的方法为众所周知的，如美国公开号2018/0298381中所述。
尽管软骨研究中已经认识到细胞因子对软骨基质代谢和软骨退化的作用，但初步研究表明，非手术样品中的小平面关节软骨细胞可产生大量的细胞因子IL-1和TNF-α；这可能是小平面关节特有的现象。有趣的是，细胞因子的存在在退化的早期阶段(2/3级)高于退化的晚期阶段(4/5级)；这可能表明细胞因子参与小平面关节软骨退化的进展(2/3→4/5)。此外，细胞因子阻断研究表明，前列腺素(PG)的合成受到组成型表达的细胞因子的抑制(参见例如美国专利号7,585,848，通过参考结合至本文中)。
体外研究表明嵌合体诱饵(NF-κB/STAT6)显著抑制来自骨关节炎患者膝关节的滑膜外植体对细胞因子的基因表达。另外的结果表明，在大鼠凝血酶诱导的小平面关节关节炎模型中，向小平面关节关节内注射初始诱饵(AMG0101，式I)减轻了痛觉超敏。这些结果表明嵌合体诱饵可逆转小平面软骨稳态的负平衡并抑制由细胞因子途径诱发的疼痛。
因此，本发明提供一种用于治疗脊柱疼痛的方法。方法包括给予需要它的受试者有效量的能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而治疗受试者的脊柱疼痛。
如本文所证实的，显示被开发为结合于NF-kB 和信号转导及转录激活蛋白6(STAT6)结合位点两者的嵌合体诱饵寡脱氧核苷酸(嵌合体诱饵)，降低滑膜组织的促炎细胞因子和疼痛相关分子的基因表达[5]和减缓IL-1β加速的蛋白聚糖周转[6]。由于这种嵌合体诱饵不会抑制基质合成或增加感染风险，因此嵌合体诱饵为小平面关节疼痛的新型局部治疗剂。嵌合体诱饵对细胞因子途径的抑制将通过阻断几种NF-κB驱动的细胞因子途径(比如IL-1和TNF)来减少疼痛的产生。在最近开发的大鼠凝血酶诱导的小平面关节疼痛模型[7]中，本发明描述了与地塞米松的功效数据进行比较，嵌合体诱饵对小平面关节疼痛影响的临床相关功效数据。
如本文所述，嵌合体诱饵和地塞米松对机械性痛觉超敏显示出类似的显著镇痛作用；这些疼痛结果测量得到了DRG中疼痛相关分子的IHC数据的支持。重要的是，只有嵌合体诱饵对术后一般活动(即行进距离和体重变化(已知为术后疼痛的灵敏指标[10]))显示显著影响。发现即使在高活动性期间体重也会显著增加，这进一步支持嵌合体诱饵的安全性和功效。从冯弗雷测试获得的疼痛状态结果与IHC染色之间的强相关性表明DRG中的疼痛标志物分析作为对功效结果的另外确认对于传入神经疼痛产生的重要性。因此，通过凝血酶注射诱发的小平面疼痛产生可通过注射嵌合体诱饵来改善，这可用作用于小平面关节疼痛的新治疗方法。
本发明的嵌合诱饵可按原样给予，或者也可在与构成适当药物递送系统(DDS)的物质缀合之后给予。用于寡核苷酸的DDS的实例包括含有阳离子物质的脂质体、细胞膜渗透性肽、含有它们的聚合物和去端肽胶原蛋白。除这些之外，嵌合诱饵也可缀合于PLGA (聚乳酸/乙醇酸共聚物)纳米颗粒用于给予。PLGA纳米颗粒为由PLGA组成的直径为数十纳米至数百纳米的颗粒。当嵌合诱饵缀合于PLGA纳米颗粒时，嵌合诱饵第一链的5’末端优选地经二硫化物接头和氨基接头缀合于PLGA纳米颗粒。这可例如通过使PLGA-NHS酯与嵌合诱饵反应以获得PLGA-缀合的嵌合诱饵并通过利用马朗戈尼(Marangoni)效应进一步将其制成纳米级颗粒来进行。
在给予诱饵后，为了确定治疗的功效，本方法包括确定或测量LBP的水平。在一些实施方案中，方法可包括在治疗之前确定或测量椎间障碍的水平，以便确定充分治疗受试者的LBP所需的诱饵量。在各种实施方案中，可测量纤维软骨降解因子或其前体(例如酶原、mRNA等)的水平以确定纤维软骨降解的量。通常，纤维软骨降解因子包括当存在时将导致椎间盘中纤维软骨组织降解的任何化合物。纤维软骨降解因子可直接作用于纤维软骨细胞或纤维软骨组织以引起降解，影响直接降解纤维软骨组织的化合物，或影响降解纤维软骨组织的化合物的调节剂。纤维软骨降解因子包括直接降解软骨基质的酶以及刺激软骨降解的其他化学物质，包括细胞因子，比如IL-1。IL-1似乎通过至少上调基质金属蛋白酶活性间接地引起纤维软骨降解。测量纤维软骨降解因子的方法的非限制性实例包括测量一氧化氮(NO)产生、蛋白酶检测或两者。
在正常和病理性椎间盘中均可检测到占据特定的纤维软骨降解因子组的蛋白酶。这些蛋白酶包括(但不限于)基质金属蛋白酶(MMP)和ADAMTS家族的成员。可通过本领域已知的任何方法检测包括蛋白酶在内的纤维软骨降解因子。这些方法包括Western印迹分析、免疫组织化学、RNA转录物检测和酶谱分析。在测量纤维软骨降解因子之前，可用纤维软骨保护剂处理来自椎间盘的纤维软骨或纤维软骨细胞。也可在接触纤维软骨降解因子之前、之后或两者均进行检测。在各种实施方案中，纤维软骨降解因子将为天然因子。
嵌合诱饵的给予途径没有特别限制，但可优选地为胃肠外给予，比如静脉内给予、肌内给予、皮下给予、皮肤给予或直接给予靶器官或组织。根据例如靶疾病、患者的症状和给予途径适当地选择剂量，但通常对于成人可给予每天0.1-10000 nmol，优选1-1000nmol，和更优选10-100 nmol。
转录因子抑制化合物比如嵌合体诱饵的药用组合物，可通过将一种或多种转录因子抑制化合物与药学上可接受的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合来制备，以治疗性治疗、逆转或改善多种椎间盘障碍和/或LBP。治疗有效剂量是指足以导致改善椎间盘障碍症状的一种或多种转录因子抑制化合物的量。有效剂量还可指足以导致预防椎间盘障碍和/或LBP的一种或多种转录因子抑制化合物的量。在一些实施方案中，有效剂量将仅部分地预防椎间盘障碍和/或LBP。在这些情况下，椎间盘的障碍尽管可能仍然存在，但将会小于如果没有给予治疗的话预期的椎间盘障碍。
药用组合物可通过本领域众所周知的方法制造，所述方法比如常规制粒、混合、溶解、包囊、冻干、乳化或磨细过程等。在某些实施方案中，转录因子抑制化合物可以局部而非全身方式给予，比如作为持续释放制剂注射。在一些实施方案中，有效量的转录因子抑制化合物可在任何令人满意的生理缓冲液比如磷酸盐缓冲溶液(PBS)中或在5%乳糖溶液中给予病理性椎间盘。本说明书中公开的剂型作为实例给出，并且不应解释为限制本发明。
如下所述，转录因子抑制化合物的制剂可设计为短效、快速释放、长效和持续释放。因此，药用制剂也可配制成控制释放或缓慢释放，比如包含在可生物降解的基质或载体中。
本组合物中的转录因子抑制剂/诱饵也可以胶束或脂质体或一些其他包囊形式存在，或者可以延长释放形式给予以提供延长的储存和/或递送效果。因此，可将药用制剂压缩成丸粒或圆柱体并作为定量植入。这种植入物可采用已知的惰性材料，比如硅酮和可生物降解的聚合物。
转录因子抑制剂的治疗有效剂量可根据给予途径和剂型而变化。确切剂量由医师鉴于待治疗患者的状况进行选择。调整剂量和给予以提供足够水平的活性部分或保持期望的效果。具体剂量可根据疾病状况、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、剂量间隔、给予途径、排泄速率和药物组合进行调整。根据具体制剂的半衰期和清除速率，持续作用药用组合物可在一定间隔内反复给予，比如每3-4天、每周或每两周一次(每月两次)。在本领域已知的出版物中提供了对具体剂量和递送方法的指导。含有有效量的任何以上剂型均很好地处于常规实验的范围内，并因此很好地处于本发明的范围内。
本发明还提供用于实施本文所述方法的试剂盒。本试剂盒还可包括一种或多种试剂、缓冲剂、培养基、蛋白、分析物、标签、细胞、用于分析结果的计算机程序和/或一次性实验室设备，比如培养皿或多孔板，以便易于促进本方法的实施。固体支持物可包括珠粒、培养皿、多孔板等。
以下实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例1
大鼠凝血酶诱导的小平面关节关节炎模型
在该项研究中，开发了凝血酶诱导的小平面关节关节炎的大鼠模型。凝血酶为凝血级联必不可少的蛋白，但其也具有切割PG以及产生纤连蛋白和其他基质成分的片段的能力。还显示凝血酶刺激细胞因子和蛋白酶。凝血酶的注射诱导软骨退化，这既是由于直接酶作用引起的PG丧失，也是由于基质片段驱动的炎性过程引起的损伤。重要的是，已显示这种大鼠小平面关节关节炎模型与感觉运动功能障碍、痛觉超敏和步态变化有关。
该项研究使用了80只雌性Sprague-Dawley大鼠(11周，~220 g)。在全身麻醉下，小心地暴露右侧L4/5小平面关节而不损伤关节囊。为了诱发小平面关节疼痛并测试治疗剂的功效，将牛凝血酶(20 U/2 μL盐水) (凝血酶组)或凝血酶+地塞米松(地塞米松组) (20 U/5 μg/2 μl盐水)或凝血酶+嵌合体诱饵(嵌合体组) (20 U/10 μg/2 μl盐水)使用具有33/28G双规格针头的MS05 (5 μl)注射器 (Ito Corporation, Japan)缓慢注入到小平面关节间隙中。一半的大鼠在第10 天(D10)处死，并且另一半在4周(4W)时处死。
所有数据均表示为平均值±标准误差(SE)。使用双因素重复方差分析(ANOVA)进行总体分析或使用单因素ANOVA在每个时间点进行比较，对数据进行统计分析。Pearson相关系数用于评估冯弗雷测试结果与IHC染色之间的关系。P值小于0.05视为有统计学差异。
实施例2
机械性痛觉超敏的行为评价
据信，小平面关节损伤会导致DRG和/或脊柱功能的变化，从而产生敏化和事件，其构成疼痛处理的促进状态的基础。使用经注射的和对侧的后爪两者对通过冯弗雷毛细丝进行的机械刺激的50%缩爪阈值反应，评估大鼠的机械性痛觉超敏[8]。以足够的力垂直于趾面呈现冯弗雷毛以引起爪的轻微屈曲，并保持约6-8秒(sec)。缩爪和退缩被认为是阳性反应。注入侧的冯弗雷测试结果用于分析。
(图1)：
双因素重复ANOVA揭示了时间和治疗的显著影响。尽管所有组的缩爪阈值均显著降低直至手术之后第10天(P<0.01)，但嵌合体和地塞米松组的数值显著高于凝血酶组的数值(P<0.01)。第10天，地塞米松(11.83 g)和嵌合体(11.91 g)组的缩爪阈值均显著高于凝血酶组的缩爪阈值(8.60 g) (P<0.01)。在第10天至第28天的大多数时间点均观察到这些显著差异(P<0.05，单因素ANOVA)。
为了评价热伤害性反应，辐射热源集中于后爪的趾面。测量从开始辐射热直至缩爪的时间(PWL)。在开始实验之前，大鼠至少连续3天适应环境(基线行为测试)。行为测试在每天的同一时间于安静的专用房间中进行。每只爪子测试4次，在爪子之间交替进行，测试之间间隔至少1分钟。在同一爪子上两次试验之间的间隔为至少5分钟。PWL的显著降低定义为热痛觉过敏。采用20秒的截止值来避免组织损伤。
实施例3
一般状况和活动
为了评估大鼠的一般状况，分析了体重的变化。为了评价由小平面关节疼痛引起的一般活动的变化，在手术之前和手术之后1周(术前和术后)利用由摄像机和行为分析软件(HOMECAGESCAN, Clever Sys Inc, Reston, VA)组成的市售设备。
摄像机用于拍摄步态影片，使用镜子系统拍摄大鼠行走时每只脚的位置。在开始项目之前，使大鼠适应装置一周。在此期间，它们被训练在移动的踏车上以15 cm/sec的恒定速度行走20秒。高速数码相机置于踏车下方以监测大鼠的移动，记录速度为100帧/sec。一旦大鼠习惯于踏车，它们就会以15 cm/sec行走20秒，在研究持续时间的期间之间休息60秒。使用Clever Sys. Inc.软件分析结果，查看超过35个步态测量。该系统已在评价各种疾病状态(包括OA大鼠模型)下的步态异常时得到验证。
(图2A和2B)：
第10天，嵌合体组的体重增加(+9.66%)显著高于凝血酶组(6.72%, P<0.05)。手术后1周时，所有组的行进距离均显著减少(P<0.01)。嵌合体组的相对行进距离(术后/术前)显著高于于凝血酶组(0.84相对于0.73, P<0.05)。
实施例4
DRG的免疫组织化学
处死之后，分析每组中至少6只大鼠的DRG神经元中的离子钙结合衔接分子-1(Iba-1；一种小胶质细胞/巨噬细胞特异性钙结合蛋白)和降钙素基因相关肽(CGRP，一种疼痛相关神经肽)的表达。半定量分析如先前发表地进行[9]。还评价了冯弗雷测试结果与IHC染色之间的相关性。
(图3A和3B)：Iba-1：在4周时间点时，嵌合体组中Iba-1阳性小胶质细胞/mm2的平均数显著低于凝血酶组(-33%, P<0.05)。在第10天未观察到显著差异。CGRP：在第10天时，地塞米松和嵌合体组中CGRP阳性神经元的平均百分比显著低于凝血酶组(分别为-14.3%,P<0.05, -22.9%, P<0.01)。在4周时，这些差异得以保持。重要的是，Iba-和CGRP的IHC数据与冯弗雷测试结果呈负相关(P<0.05，参见图3B)。
实施例5
嵌合体诱饵调节人椎间盘细胞的退化
进行一项研究，以评估嵌合体诱饵是否能够调节由白细胞介素-1刺激的人椎间盘细胞中的蛋白聚糖(PG)周转。
如先前报道的那样[11]，来自16岁患者脊柱侧凸脊柱的人髓核(NP)细胞在单层培养中进行扩增、传代并嵌入藻酸盐珠粒中。将珠粒培养4周以获得软骨细胞表型。然后用35S预先标记嵌入藻酸盐珠粒中的人NP细胞的蛋白聚糖，洗涤并在存在IL-1β (5 ng/ml)的情况下和存在/不存在嵌合体诱饵(10 μM)或NF-κB诱饵的情况下进一步培养最多6天。测量收集的培养基(第2、4和6天)中的35S-PG和6天培养期之后残留于珠粒中的35S-PG，并计算总35S-PG (培养基+珠粒)的残留PG的百分比以揭示PG降解的程度。
使用脉冲追踪程序研究了嵌合体诱饵对蛋白聚糖从珠粒中丧失速率的影响。如图4所示，用IL-1β处理显著加速藻酸盐珠粒的PG周转(IL-1β，49%，第6天对照72%，P<0.05，双因素ANOVA)。另一方面，嵌合体诱饵组逆转了IL-1β的作用(嵌合体+IL1：第6天76%，P<0.05)并且与对照组相比较没有显示出显著差异。尽管NF-κB诱饵(10 μM)组显示出相似的趋势(NF-κB+IL-1诱饵；第6天69%)，但差异并未达到统计学显著水平。
结果表明，嵌合体诱饵可抵消以IL-1刺激的人椎间盘细胞中分解代谢的加速。这表明嵌合体诱饵可延迟或逆转椎间盘退化，并因此减轻椎间盘退化患者的疼痛。
该项研究的目的为研究嵌合体诱饵ODN对来自经受椎间盘切除术的患者的人纤维环(AF)组织中PG降解的影响。
实施例6
嵌合体诱饵寡脱氧核苷酸对人纤维环组织中蛋白聚糖降解的影响
材料和方法：
AF组织取自7名经受腰椎手术的患者[67±9岁；6名男性，1名女性]。将组织洗涤，切成3 mm的小块并作为外植体培养物进行温育(每组3-5块)。
PG周转
AF组织如先前所述用20 μCi/ml 35S预先标记16小时。在存在或不存在NFkB诱饵ODN (10 μM)或嵌合体诱饵ODN (10 μM)的情况下，将外植体在含有20% FBS的 DMEM/F-12培养基中培养长达6天。培养基每隔一天用相同的处理培养基更换并收集培养基。在温育期结束时收集组织并用木瓜蛋白酶消化。培养基和消化物中35S-PG的量通过快速阿尔新(Alcian)蓝过滤测定进行测量。评价了合成的总35S-PG中残留的35S-PG。数据也通过每名患者的对照组进行归一化。
统计分析：
具有Fisher PSLD检验的双因素ANOVA作为事后检验。结果表示为平均值±标准误差。
结果：
在这7名患者中，对照水平的PG丧失显著不同(表1，P<0.01)。与对照组相比较，嵌合体诱饵ODN组中的PG降解被显著抑制(p=0.025)。(对照、NFkB、嵌合体；第2天：1.00±0.01、1.00±0.02、1.04±0.02，第4天：1.00±0.02、1.04±0.05、1.15±0.07，第6天：1.00±0.05、1.18±0.12、1.34±0.13) (图5)。培养6天之后，与对照相比较，嵌合体组多保留了34%的蛋白聚糖。NFkB诱饵组与其他组之间的PG丧失没有显著差异。
结论：
与对照组相比较，向来自退化的椎间盘的人AF外植体培养物中添加嵌合体诱饵ODN显著抑制PG丧失。仅抑制NFkB途径的NFkB诱饵显示出抑制PG丧失的趋势，但在该实验中并不显著。
表1. 第6天残留的PG (标记的PG的百分比)
[表1]
Figure DEST_PATH_IMAGE006
实施例7
嵌合体诱饵在兔环状穿刺模型中对椎间盘退化的功效
在该模型中，将来自兔的退化的髓核(NP)作为异种移植组织移植到RNU裸大鼠的背根神经节(DRG)上，以确定这些组织是否会诱发功能和感觉功能障碍。
该实验的具体目的为确定(1) 嵌合体诱饵的椎间盘内注射是否抑制促炎细胞因子和基质降解酶的过度表达，以及(2) 使用不同剂量的嵌合体诱饵椎间盘内注射到兔椎间盘中是否在裸大鼠中减轻退化的椎间盘组织诱发的疼痛。
方法：
兔环状穿刺椎间盘退化模型和嵌合体诱饵的注射：该研究中使用雌性新西兰白兔(n = 80)。在全身麻醉下，用18规格针头在两个非连续的椎间盘(L2/3和L4/5)中将纤维环穿刺。初次穿刺之后4周，使用26规格针头将媒介物磷酸盐缓冲盐水(10 μl)、嵌合体诱饵(10 μl盐水中10、100 μg)或NFκB诱饵(10 μl盐水中100 μg)注入到髓核(NP)的中心。
椎间盘高度的射线照相分析：
椎间盘(IVD)高度从侧位射线照相获得，并表示为椎间盘高度指数(DHI)。将DHI针对术前DHI (%DHI)进行归一化，并进一步针对L3/4非穿刺椎间盘的DHI进行归一化。
MRI分析：
IVD的退化等级根据Pfirrman使用T2加权图像进行分类。
结果：
DHI (图6)：
重复的双因素ANOVA揭示治疗显著影响%DHI (P<0.05)。事后分析表明，嵌合体100ug组的%DHI显著高于PBS组。在第16周时，与PBS组相比较，嵌合体100 ug和诱饵100 μg组显示出在%DHI上的显著增加(分别为p<0.01和p<0.05)。
MRI T2自旋回波加权图像(图7)和 Pfirrmann等级(图 8)。
与PBS组相比较，嵌合体100 μg组的Pfirrmann等级往往较低(P<0.088)。
讨论：
在环状穿刺之后4周将嵌合体诱饵注入到NP中恢复了椎间盘高度，并略微提高了MRI等级。数据表明，嵌合体诱饵注射可在100 μg时诱导结构变化。
嵌合体注入到椎间盘中减少异种移植大鼠神经根病模型中的疼痛产生。这些结果表明，注射嵌合体诱饵改变退化的椎间盘的病理状态并减少疼痛的产生，并因此可用作退行性椎间盘疾病的新治疗方法。
尽管本发明已参考以上实例进行描述，但是应当理解，修改和变化包括在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以下权利要求的限制。
参考文献
[1] Sehgal,等人Pain Physician.2007; 213-28.
[2] Kim,等人Osteoarthritis and Cartilage. 2015; 2242-51.
[3] Hemmad,等人Trans Orthop Res Soc. 2010; 933.
[4] Wernecke,等人Orthop J Sports Med. 2015; 2325967115581163.
[5] Miyazaki,等人Trans Orthop Res Soc. 2018; 0387.
[6] Kato,等人Trans Orthop Res Soc. 2017; 0175.
[7] Yamaguchi,等人The International Society for the Study of theLumbar Spine.2013; SP19.
[8] Chaplan,等人J Neurosci Methods.1994; 55-63.
[9] Miyazaki,等人Eur Spine J. 2018; 739-51.
[10] Brennan,等人Lab animal.2009; 87-93.
[11] Aota,等人Differential effects of fibronectin fragment onproteoglycan metabolism by intervertebral disc cells: a comparison witharticular chondrocytes. Spine (Phila Pa 1976). 2005;30(7):722-728.
[12] WO 2017/043639 A1。
Figure IDA0003130993690000011
Figure IDA0003130993690000021
Figure IDA0003130993690000031

Claims (36)

1.一种用于治疗椎间盘退化的方法，其包括给予需要它的受试者有效量的能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而治疗所述受试者的椎间盘退化。
2.权利要求1的方法，其中所述诱饵具有13聚体-15聚体的大小。
3.权利要求2的方法，其中所述诱饵具有由SEQ ID NO: 1或6表示的序列。
4.权利要求1的方法，其中所述双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。
5.权利要求1的方法，其中所述诱饵的5’末端经接头或直接结合于PLGA纳米颗粒。
6.权利要求1的方法，其中将所述诱饵直接给予所述受试者的小平面关节中。
7.权利要求1的方法，其中将所述诱饵经椎间盘内注射或硬膜外注射给予。
8.一种用于再生软骨细胞细胞外基质的方法，其包括给予需要它的受试者能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而在所述受试者中再生软骨细胞细胞外基质。
9.权利要求8的方法，其中所述软骨细胞细胞外基质为椎间盘细胞细胞外基质。
10.权利要求8的方法，其中所述诱饵具有13聚体-15聚体的大小。
11.权利要求10的方法，其中所述诱饵具有由SEQ ID NO: 1或6表示的序列。
12.权利要求8的方法，其中所述双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。
13.权利要求8的方法，其中将所述诱饵直接给予所述受试者的小平面关节中。
14.权利要求8的方法，其中将所述诱饵经椎间盘内注射或硬膜外注射给予。
15.一种用于促进受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成的方法，其包括给予需要它的受试者能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而促进所述受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成。
16.权利要求15的方法，其中所述椎间盘细胞包括髓核细胞和/或纤维环细胞。
17.权利要求15的方法，其中所述诱饵具有13聚体-15聚体的大小。
18.权利要求17的方法，其中所述诱饵具有由SEQ ID NO: 1或6表示的序列。
19.权利要求15的方法，其中所述双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。
20.权利要求15的方法，其中将所述诱饵直接给予所述受试者的小平面关节中。
21.权利要求15的方法，其中将所述诱饵经椎间盘内注射或硬膜外注射给予。
22.一种用于治疗脊柱疼痛的方法，其包括给予需要它的受试者能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，从而治疗所述受试者的脊柱疼痛。
23.权利要求22的方法，其中所述诱饵具有13聚体-15聚体的大小。
24.权利要求23的方法，其中所述诱饵具有由SEQ ID NO: 1或6表示的序列。
25.权利要求22的方法，其中所述双链寡核苷酸诱饵中各核苷酸之间的键的至少一部分包括硫代磷酸酯键。
26.权利要求22的方法，其中所述诱饵的5’末端经接头或直接结合于PLGA纳米颗粒。
27.权利要求22的方法，其中将所述诱饵直接给予所述受试者的小平面关节中。
28.权利要求1的方法，其中将所述诱饵经椎间盘内注射或硬膜外注射给予。
29.一种用于椎间盘退化的治疗剂，其包含能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵。
30.一种能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，其用于治疗椎间盘退化。
31.一种用于再生软骨细胞细胞外基质的试剂，其包含能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵。
32.一种能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，其用于再生软骨细胞细胞外基质。
33.一种用于促进受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成的试剂，其包含能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵。
34.一种能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，其用于促进受试者椎间盘细胞中的蛋白聚糖合成。
35.一种用于脊柱疼痛的治疗剂，其包含能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵。
36.一种能够结合于NF-κB的DNA结合位点和信号转导及转录激活蛋白6 (STAT6)的DNA结合位点的双链寡核苷酸诱饵，其用于治疗脊柱疼痛。
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