CN106367432A - 发酵生产l‑赖氨酸的方法及改造的棒杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了发酵生产L‑赖氨酸的方法，其包括改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低；和，用改造而得到的细菌发酵生产l‑赖氨酸。另外，本发明还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的细菌等。

Description

发酵生产L-赖氨酸的方法及改造的棒杆菌
技术领域
本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产L-赖氨酸的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的细菌等。
背景技术
通过产L-赖氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产L-赖氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。
产L-赖氨酸的细菌包括棒杆菌属的细菌。例如，中国专利CN1017906B公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含合成二氢二吡啶羧酸合成酶和/或琥珀酰四氢吡啶羧酸合成酶的重组DNA的棒状杆菌属细菌来发酵的步骤。
中国专利申请CN1187539A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含编码天冬氨酸激酶和编码二氨基庚二酸脱羧酶的重组DNA的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。
中国专利申请CN1310234A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含α－酮戊二酸脱氢酶的基因的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。
中国专利申请CN1890372A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用果糖-1，6-二磷酸酶活性增加谷氨酸棒杆菌来发酵的步骤。
中国专利申请CN101065484A公开了具有产生Ｌ－氨基酸的能力的棒菌属细菌，其被修饰使得乙酰辅酶Ａ水解酶活性减少。
中国专利申请CN101855357A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用在编码果糖-PTS酶的ptsF基因上具有突变的谷氨酸棒杆菌来发酵的步骤。
中国专利申请CN104245921A公开了生产L-赖氨酸的方法，包括使用含编码木糖异构酶和木酮糖激酶的基因的棒杆菌属细菌来发酵的步骤。
上述生产L-赖氨酸的文献都是基于已知生物学功能的酶或基因。
在已经测序完成的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的全基因组（可参见NCBI参考序列：NC_003450.3）中，有约3057个基因。然而，在这些基因中，除了生物学功能明确的基因外，有约1196个基因编码生物学功能不清楚的“假设的蛋白质”。在这些“假设的蛋白质”中，有约236个基因编码的蛋白质被通过生物信息学方法注释以表明它们与某些蛋白质或酶相似，或包含某些结构域。然而，仍旧有约960个基因编码的蛋白质的生物学功能没有被启示生物学功能，也不清楚它们在发酵生产L-赖氨酸中的效用。
本发明人经过长期研究和实践，经历了众多的失败，凭借了一些运气，偶然发现在棒杆菌的染色体中对两个编码“假设的蛋白质”的基因的改造能够有助于提高L-赖氨酸的产量。该方法与现有改造的大量高产L-赖氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于多种细菌发酵生产L-赖氨酸。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产L-赖氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高L-赖氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括：
（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低；和，
（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。
在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。改造位于染色体上的基因使得该基因的核苷酸序列被添加、缺失或替换一个或多个核苷酸，例如可以在该基因中插入无义密码子，也可以敲除该基因。也可以通过改造该基因的调控序列来间接改造该基因，从而使其编码的蛋白质的活性和/或表达量降低。
这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，可以采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，也可以采用pK18mobsacB质粒系统来进行改造。因此，在本文中，改造优选是通过同源重组进行的改造，更优选是通过同源重组进行的敲除。
在本文中，NCBI参考序列NP_601029.1（简称为NP_601029.1）是一种“假设的蛋白质”，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示（也可获取自网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov，NP_601029.1）。编码NP_601029.1的基因的（互补）核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示（也可获取自网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov，NCgl1751）。尽管NP_601029.1的具体活性还未知，但是在本发明的具体实施方式中，NCgl1751基因被敲除后（即，它的活性和/或表达量消失），赖氨酸的产量提高了。因此，在本文中，NP_601029.1的活性和/或表达量优选消失。
在本文中，NCBI参考序列NP_599350.1（简称为NP_599350.1）是一种“假设的蛋白质”，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示（也可获取自网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov，NP_599350.1）。编码NP_599350.1的基因的（互补）核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示（也可获取自网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov，NCgl0097）。尽管NP_599350.1的具体活性还未知，但是在本发明的具体实施方式中，NCgl0097基因被敲除后（即，它的活性和/或表达量消失），赖氨酸的产量提高了。因此，在本文中，NP_599350.1的活性和/或表达量优选消失。
相应地，本发明还提供了其他的应用或方法。例如，在第二方面，本发明提供了提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：
（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低，优选消失；和，
（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。
又如，在第三方面，本发明提供了改造获得的细菌在发酵生产L-赖氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低，优选消失。
还如，在第四方面，本发明提供了改造获得的细菌在提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低，优选消失。
在本文中，如无特别限定（如未以“改造获得”来限定），术语“细菌”或“棒杆菌属细菌”是未改造或改造前的细菌或棒杆菌属细菌，其染色体具有野生型的编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因。
L-赖氨酸作为细菌的重要代谢产物，大多数棒杆菌属细菌或多或少都能够发酵产生一定量的L-赖氨酸。现有技术没有在赖氨酸生产/发酵中关注过编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，因此现有技术中的产L-赖氨酸的棒杆菌属细菌通常都带有野生型的编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因基本上都可以采用本发明的方法进行改造，提高L-赖氨酸的发酵量。在本文中，棒杆菌属细菌包括谷氨酸棒杆菌或北京棒杆菌，优选是谷氨酸棒杆菌。
更本质地，在第五方面，本发明提供了改造细菌的方法，其包括改造棒杆菌属细菌的方法，其包括改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低，优选消失。
本发明第五方面的方法改造而获得的细菌能够用于发酵生产或产生l-赖氨酸。因此，在第六方面，本发明提供了本发明第五方面的方法改造而获得的细菌。本发明第六方面的细菌是棒杆菌属细菌，其染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因座位的核苷酸序列不同于编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因的核苷酸序列，优选其染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因被敲除。
在第七方面，本发明提供了NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1和/或其编码基因在棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸中的应用。尽管可能增加NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量能够用于降低棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸的产量，但是优选所述应用为NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低（优选消失，如将其编码基因敲除）的应用，用于提高棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸的产量。其中，NCBI参考序列NP_601029.1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1，其编码基因的（互补）核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；NCBI参考序列NP_599350.1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的（互补）核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在第八方面，本发明提供了筛选对棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸有影响的基因的方法，其包括：
（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码“假设的蛋白质”的基因，使“假设的蛋白质”的活性和/或表达量上升或降低；
（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸；和，
（3）将步骤（2）得到的L-赖氨酸产量同未改造的棒杆菌属细菌的L-赖氨酸产量进行比较。
优选在本发明第八方面的方法中，影响是增强，而且使“假设的蛋白质”的活性和/或表达量降低，优选消失，如将编码“假设的蛋白质”的基因敲除。
本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-赖氨酸的发酵量的方式，而且与现有改造的大量高产L-赖氨酸的棒杆菌属细菌的染色体改造位点没有冲突，从而在实践上可用于进一步提高L-赖氨酸的产量。
为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。
另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。
实施例1 NCgl1751基因表达下调实验
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增NCgl1751基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下（上海英俊公司合成）：
P1:5' CCCAAGCTTCGACAGGGCTTGGATTG 3'（Hind3）
P2:5' ATGGAGAAAT ACGTCAAGGT TTTTCCTGCT CTTTAACACC 3'
P3:5'GGTGTTAAAG AGCAGGAAAA ACCTTGACGT ATTTCTCCAT 3'
P4:5' CGGGATCCCGGTGGGTTTGTTGATGT 3' （BamH1）
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1/P2及P3/P4，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段660bp及下游同源臂片段780bp再用引物P1/P4进行OVER PCR得到整个同源臂片段1440bp，两端分别含有Hind3和BamH1酶切位点。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1400bp的DNA片段，并通过酶切回收连接，与穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡那霉素抗性标记。
将敲除质粒电转化入赖氨酸生产专利菌株YP97136（其构建方法可参见WO2014121669A1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的NCgl1751基因），对培养产生的单菌落分别通过如下引物（上海英俊公司合成）进行PCR鉴定：
P5:5' GGTAGTCCCACATCATCTCT 3'
P6:5' ATGCCCTGGTTGGTTCT 3'
上述PCR扩增出大小1000bp及740bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出1000bp条带的菌株为原菌。阳性菌株分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P5/P6引物进行PCR鉴定，扩增出大小为740bp条带的菌株为Ncgl1751基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPL-1-001。
实施例2 NCgl0097基因表达下调实验
根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组序列，合成两对扩增NCgl0097基因编码区两端片段的引物，作为上下游同源臂片段。引物设计如下（上海英俊公司合成）：
P11:5' CCCAAGCTTCGCAGCAGGTATGTAGTCAC 3'（Hind3）
P12:5' CACTTCATAG GGTTGAATAC AGCACGCGCA CGGAAAGCCA 3'
P13:5' TGGCTTTCCG TGCGCGTGCT GTATTCAACC CTATGAAGTG 3'
P14:5' GCTCTAGAGCGGGCATCCACAATCAT 3' （Xba1）
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P11/P12及P13/P14，进行PCR扩增，获得上游同源臂片段740bp及下游同源臂片段640bp再用引物P11/P14进行OVER PCR得到整个同源臂片段1380bp，两端分别含有Hind3和BamH1酶切位点。PCR反应结束后，对扩增的产物进行电泳回收，采用柱式DNA凝胶回收试剂盒进行回收所需要的1380bp的DNA片段，并通过酶切回收连接，与穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得敲除质粒。该质粒上含有卡纳抗性标记，可以通过卡纳筛选获得质粒整合到基因组上的重组子。
将敲除质粒电转化入赖氨酸生产专利菌株YP97136（经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的NCgl0097基因），对培养产生的单菌落分别通过如下引物（上海英俊公司合成）进行PCR鉴定：
P15:5' AACTGGGCTCTTGTTACTG 3'
P16:5' CGCTGCCGCTTCACGAT 3'
上述PCR扩增出大小1195bp及645bp的条带的菌株为阳性菌株，只扩增出1195bp条带的菌株为原菌。阳性菌株分别在含有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用P15/P16引物进行PCR鉴定，扩增出大小为645bp的菌为Ncgl0097基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPL-1-002。
实施例3 NCgl1751和NCgl0097基因双表达下调实验
以YPL-1-001菌株为基础，对基因组上的Ncgl0097基因编码区进行敲除，具体过程与上述Ncgl0097基因编码区的敲除相同，通过用鉴定引物P5/P6、P11/P12对菌株进行PCR验证，分别获得大小为740bp 和645bp的片段（原始菌株PCR大小分别为1000bp和1195bp），NCgl1751和NCgl0097基因编码区被敲除的基因工程菌株，其被命名为YPL-1-003，其为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum），于2016年8月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.12856。
实施例4 赖氨酸发酵实验
将实施例1-3构建的菌株和原始菌株在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵罐（购自上海百仑生物科技有限公司）中以表1所示的培养基和表2所示的过程进行发酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。
表1发酵培养基配方
品名 配比
淀粉水解糖 30g/l
硫酸铵 12g/L
硫酸镁 0.87g/l
糖蜜 20g/l
酸化玉米浆 3ml/l
磷酸 0.4ml/l
氯化钾 0.53g/l
消泡剂（2%泡敌） 4ml/L
硫酸亚铁 120mg/l
硫酸锰 120mg/l
烟酰胺 42mg/l
泛酸钙 6.3mg/l
VB1 6.3mg/l
铜、锌盐溶液 0.6g/L
生物素 0.88mg/L
表2发酵过程
表3赖氨酸发酵实验结果
菌种 赖氨酸产量（%） 转化率（%）
YPL-1-001 20.0 64.9
YPL-1-001 20.1 64.8
YPL-1-001 20.2 65.1
均值 20.1 64.9
YPL-1-002 20.5 65.2
YPL-1-002 20.6 65.3
YPL-1-002 20.8 65.5
均值 20.6 65.3
YPL-1-003 21.8 66.7
YPL-1-003 22.2 66.9
YPL-1-003 22.1 66.9
均值 22.0 66.8
对照 18.8 64.1
对照 18.6 63.9
对照 18.8 63.7
均值 18.8 63.9
结果如表3所示，在棒杆菌中下调NCgl1751和/或NCgl0097基因的表达，都有助于L-赖氨酸产量的提高，其中同时下调NCgl1751和NCgl0097基因的表达，L-赖氨酸产量得到了最大的提高。
<110> 宁夏伊品生物科技股份有限公司
<120> 发酵生产L-赖氨酸的方法及改造的棒杆菌
<130> CN
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 84
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 1
Met Ser Gln Ala Arg Arg Tyr Leu Val Gln Asp Arg Gly Val Ser Leu
1 5 10 15
Ser Asp Ala Asp Gly Val Leu Val Asp Leu Asn Phe Thr Cys Thr Gln
20 25 30
Val Asn Glu Ser Asn Asp Thr Asp Asp Leu Ser Val Phe Cys Ser Thr
35 40 45
Ala Ile Ala Gly Lys Asp Pro Ser Glu Leu Arg Lys Glu Leu Glu Ala
50 55 60
Glu Phe Tyr Phe Leu Pro Asp Gly Ala Asp Asp Ala Asp Asp Ala Asp
65 70 75 80
Asp Ala Met Gly
<210> 2
<211> 255
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
ctagcccatt gcatcgtctg catcgtctgc atcgtctgca ccgtccggca aaaaatagaa 60
ttctgcttct agctctttcc gtaattcgga cggatctttt ccagcgatgg cggtactaca 120
gaaaacagat agatcatctg tgtcgttaga ctcattaacc tgggtgcatg tgaaattgag 180
atccactaaa acaccatcag catcgctgag ggaaacccct cgatcctgga caaggtatct 240
gcgcgcttga gacat 255
<210> 3
<211> 183
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 3
Met Lys Asn Ala Lys Leu Phe Leu Ala Leu Ile Ser Ala Pro Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Gly Cys Ser Ser Thr Asp Thr Gly Thr Ala Glu Ser Thr Ile
20 25 30
Ser Ser Glu Thr Ala Ser Ala Val Asp Ala Thr Thr Ser Thr Ser Ser
35 40 45
Ser Thr Ala Thr Ser Ala Val Ile Asp Asp Asp Pro Val Phe Asp Ile
50 55 60
Ile Asp Ile Val Leu Ala Gln Tyr Pro Asp Arg Ile Ile Thr Asp Ile
65 70 75 80
Asp Arg Glu Asp Ser Ser Asp Gln Tyr Glu Val Asp Val Val Val Gly
85 90 95
Gln Glu Val Leu Glu Leu Asp Val Thr Thr Ser Gly Gln Ile His Thr
100 105 110
Asp Asp Arg Asp Asn Asp Asp Asp Asp Asp Ile Arg Glu Ala His Ala
115 120 125
Ala Thr Val Thr Ala Ala Gln Ala Ile Gly Leu Ala Leu Asp Gln Tyr
130 135 140
Pro Asp Gly Ile Ile Asp Ser Val Glu Leu Asp Glu Asp Asp Gly Gln
145 150 155 160
Leu Lys Trp Lys Ile Asp Leu Asp Asp Thr Ser Gly Asn Asp Leu Ala
165 170 175
Asp Val Glu Ile Ala Ala Val
180
<210> 4
<211> 552
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 4
ttaaactgct gcgatttcaa cgtcagcaag atcattgccg gaagtgtcat cgaggtctat 60
tttccatttc agctggccgt cgtcttcgtc taattcaaca gaatcaataa ttccgtctgg 120
gtattgatcc agcgctaggc caatggcttg agctgcggtg actgtggctg cgtgagcttc 180
gcggatgtcg tcatcatcat cgttgtcgcg gtcgtcggta tggatctggc cactggtggt 240
gacatcaagt tcaaggactt cttggccaac cacaacatcg acttcgtatt gatcggagga 300
gtcttcgcgg tcaatgtcgg tgatgatcct gtcggggtat tgggcaagga cgatgtcgat 360
gatgtcgaat accggatcgt catcaatcac ggcagaggtg gcggtacttg aggaggtaga 420
agtggtggca tctactgcag aagcagtttc gctggaaatg gtggattctg ctgttccagt 480
atcggtggag ctgcagccag cgaggataag aggagcggat atgagcgcga ggaaaagttt 540
tgcgttcttc at 552

Claims (10)

1.发酵生产L-赖氨酸的方法或者提高L-赖氨酸的发酵量的方法，其包括：
（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低，优选消失；和，
（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸。
2.改造获得的细菌在发酵生产L-赖氨酸或者提高L-赖氨酸的发酵量中的应用，其中，所述改造获得是改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低，优选消失。
3.改造棒杆菌属细菌的方法，其包括改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因，使NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低，优选消失。
4.权利要求1-3之任一所述的方法或应用，其中，改造棒杆菌属细菌染色体上编码NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的基因是对所述基因的核苷酸序列进行添加、缺失或替换一个或多个核苷酸，优选敲除。
5.权利要求1-4之任一所述的方法或应用，其中，所述棒杆菌属细菌是谷氨酸棒杆菌。
6.权利要求3-5之任一所述的方法改造而得到的细菌。
7. NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1和/或其编码基因在棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸中的应用。
8.权利要求7的应用，其为NCBI参考序列NP_601029.1和/或NP_599350.1的活性和/或表达量降低（优选消失）的应用。
9.筛选对棒杆菌属细菌发酵生产L-赖氨酸有影响的基因的方法，其包括：
（1）改造棒杆菌属细菌染色体上编码“假设的蛋白质”的基因，使“假设的蛋白质”的活性和/或表达量上升或降低；
（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-赖氨酸；和，
（3）将步骤（2）得到的L-赖氨酸产量同未改造的棒杆菌属细菌的L-赖氨酸产量进行比较。
10.权利要求9的方法，其中，影响是增强，而且使“假设的蛋白质”的活性和/或表达量降低，优选消失。
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