CN106008444B - 一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素e、植物甾醇的方法 - Google Patents

一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素e、植物甾醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，步骤如下：1.提取；2.皂化：获得皂化后的茄尼醇等脂溶性活性成分浸膏；3.葡聚糖凝胶柱分离：分别获得茄尼醇、维生素E和植物甾醇(混合)、西松烷二萜粗提物；4.硅胶柱层析：通过硅胶柱层析后分别获得高纯茄尼醇、维生素E、植物甾醇；获得的西松烷二萜通过硅胶柱层析分别获得α‑4，8，13‑西柏三烯‑1，3‑二醇和β‑4，8，13‑西柏三烯‑1，3‑二醇。本发明不仅实现了烟草脂溶性活性成分的综合提取，提取脂溶性活性成分后的烟草残渣还可用于烟草蛋白质、绿原酸、芸香苷、多糖、烟碱的提取，实现了烟草活性成分的梯次利用，提高了烟草资源尤其是废弃烟草的利用价值。

Description

一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾 醇的方法
技术领域
本发明涉及从烟草中综合提取脂溶性活性物质的技术领域，特别是一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法。
背景技术
我国是世界第一烟叶生产大国，年种植面积达130-150万公顷，烟叶年产量达200-300万吨，一方面，在烟叶大田生产过程中，约有1/4的鲜烟叶(包括下部、上部)作为不适用烟叶被废弃，另一方面，在卷烟企业收购的烟叶中，还约有1/4的低等级烟叶、下脚料、烟末等不能用于卷烟原料，造成资源的极大浪费。
为充分利用废弃烟叶资源，烟草活性成分的提取技术尤其是多种活性成分的综合提取技术越来越受到重视。专利CN201310318077.9公开了一种从烟草中同时提取分离茄尼醇和烟碱的方法，CN201310035368.7公开了一种从废次烟叶中提取茄尼醇和绿原酸的方法，专利(CN201410330343.4)公开了一种通过对烟叶进行两次超声循环提取，综合提取茄尼醇、多糖、蛋白质、绿原酸、烟碱并有效分离纯化的方法；专利CN201410357463.3公开了一种通过两相提取，结合沉淀、液液分配、水蒸气蒸馏依次获得烟草茄尼醇、蛋白质、糖、绿原酸、烟碱的方法；专利CN104086425A公开了一种同时提取并分离烟草茄尼醇、烟碱、绿原酸、芸香苷的方法。
烟草是一种富含多种活性成分的植物资源，刘悍等(2010)报道，调制后烤烟维生素E含量一般在700μg/mg以上，与资料报道(杨波涛，2009)的维生素E含量较高的植物油——大豆油(1059.1μg/mg)、玉米油(886.5μg/mg)、葵花籽油(744.5μg/mg)接近。烟草中还含有丰富的植物甾醇，刘文慧等(2008)报道，烟草植物甾醇含量达1000～2500μg/mg，与黄豆中植物甾醇含量相当(大于1000μg/mg，韩军花等，2006)。另外，烟草中还含有丰富的西松烷二萜，烟草西松烷二萜具有抗肿瘤、杀虫、抑菌等多种生物活性。
烟草维生素E、甾醇、西松烷二萜与茄尼醇均是脂溶性活性成分，极易溶于正己烷、石油醚等非极性溶剂，在用脂溶性溶剂提取茄尼醇过程中，维生素E、甾醇、西松烷二萜也一起被提取出来，但是，目前虽然有较多烟草茄尼醇及其与多种活性成分综合提取技术研究报道，有关烟草茄尼醇与其他脂溶性活性成分同时提取并分离的研究还未见报道。
发明内容
为克服烟草茄尼醇提取过程其他脂溶性活性成分被废弃的问题，本发明的目的在于提供一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，且经脂溶性有机溶剂提取后剩余的烟草残渣，还可用于烟草蛋白质、绿原酸、芸香苷、多糖、烟碱的提取。
本发明采用的技术方案为：
一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，具体包括如下步骤：
(1)提取：将烟叶去筋、干燥、粉碎，用非极性有机溶剂提取，提取液合并，减压浓缩至浸膏状，获得烟草脂溶性粗提物浸膏，同时回收溶剂；
(2)皂化：将以上步骤获得的烟草脂溶性粗提物浸膏在碱性条件下进行皂化，皂化完成后，调pH值至中性并浓缩除去有机溶剂，然后加入一定量的水，用非极性有机溶剂萃取并浓缩至浸膏，获得茄尼醇脂溶性活性成分混合物；
(3)葡聚糖凝胶柱分离：将以上步骤获得的脂溶性活性成分混合物通过SephadexLH20凝胶柱分离，分别获得茄尼醇、维生素E和植物甾醇混合物、西松烷二萜粗提物；
(4)硅胶柱层析a：步骤(3)获得的茄尼醇粗品进一步通过硅胶柱层析，并通过结晶精制后获得高纯茄尼醇；
(5)硅胶柱层析b：步骤(3)获得的维生素E和植物甾醇混合物，通过硅胶柱层析，将维生素E与植物甾醇分离；
(6)硅胶柱层析c：步骤(3)获得的西松烷二萜粗提取物通过硅胶柱层析，分别获得抗肿瘤先导化合物——β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇和α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇。
进一步的，所述步骤(1)中烟叶为烤烟、晾晒烟、香料烟、白肋烟中的任意一种，烟叶提取后的残渣用于蛋白质、烟碱、绿原酸、芸香苷、糖的提取。
进一步的，所述步骤(1)中烟叶的干燥温度设置为55-65℃，非极性有机溶剂为正己烷或石油醚，样品和提取剂的料液比为1:6-1:10。
进一步的，所述步骤(2)中的皂化过程采用氢氧化钠和95％乙醇按照质液比g/v为1:60组成的皂化液，在60℃条件下加热回流皂化1h，所述非极性有机溶剂为正己烷或石油醚。
进一步的，所述步骤(2)中获得的脂溶性活性成分混合物在分离过程中，以体积比二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合液作为溶解液和洗脱剂，收集洗脱液，通过薄层色谱或液相、气质联用检测不同馏分活性成分。
进一步的，所述步骤(3)中获得的维生素E和植物甾醇混合物直接用于饲料添加剂或化妆品生产。
进一步的，所述步骤(3)获得的西松烷二萜提取物直接用于烟草香料。
进一步的，所述步骤(4)中的茄尼醇粗品采用石油醚溶解，以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱。
进一步的，所述步骤(5)中的维生素E和植物甾醇混合物用石油醚溶解，以体积比为石油醚:乙酸乙酯＝15:1的混合溶剂为为洗脱剂进行梯度洗脱，分离得到的维生素E与植物甾醇分别通过结晶获得高纯维生素E、植物甾醇。
进一步的，所述步骤(6)中西松烷二萜粗提取物先用体积比石油醚：乙酸乙酯＝5:1的混合溶剂洗脱，至无馏分流出，再用体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1的混合溶剂洗脱，收集第二馏分合并、浓缩，浓缩物进一步通过200-300目的硅胶柱层析，以体积比氯仿：丙酮＝5:1的洗脱剂进行分离洗脱。
本发明的有益效果为：
(1)本发明克服了烟草茄尼醇提取过程其他脂溶性活性成分被废弃的问题，建立了同时提取烟草茄尼醇、甾醇、维生素E、西柏三烯二醇的技术，提高了烟草脂溶性活性成分的利用效率。
(2)本发明提取烟草脂溶性活性成分后的残渣还可用于烟草蛋白质、绿原酸、芸香苷、多糖、烟碱的提取，实现了烟草活性成分的梯次利用，提高了烟草资源尤其是废弃烟草的利用价值。
附图说明
图1为本发明的烟草中综合提取脂溶性活性物质的方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。
实施例1
如图1所示，一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，具体包括如下步骤：
(1)提取：取调制后低等级烤烟烟叶，60℃烘干，粉碎，称取粉碎后烟末200g，以正己烷为提取剂，料液比为1:10，45℃超声提取30min，离心或过滤，残渣再用提取液洗涤两次(两次的料液比分别为1:8、1:6)，将提取液合并，减压浓缩并回收溶剂，获得12.5g浸膏；
(2)皂化：将以上步骤获得的浸膏，加入95％乙醇120mL，氢氧化钠2g，60℃条件下加热回流皂化1h，皂化完成后，调pH值至中性并浓缩除去有机溶剂，加入100mL水，用100mL正己烷或石油醚萃取3次，将正己烷相合并，45℃减压浓缩，获得11.3g茄尼醇等脂溶性活性成分混合物浸膏；
(3)葡聚糖凝胶柱分离：将以上步骤获得的脂溶性活性成分混合物浸膏用二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合溶剂溶解，过Sephadex LH20凝胶柱，以体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合溶剂为洗脱剂，收集洗脱液，通过薄层色谱或液相、气质联用检测不同馏分活性成分，将含有茄尼醇、维生素E和植物甾醇、西松烷二萜的馏分合并后减压浓缩，分别获得5.3g茄尼醇(纯度34％)、0.2g维生素E和植物甾醇(纯度15％)、0.5g西松烷二萜(纯度40％)粗取物，该步骤获得的维生素E和植物甾醇混合物可直接用于饲料添加剂或化妆品生产；获得的西松烷二萜提取物可直接用于烟草加香；
(4)硅胶柱层析a：步骤三获得的茄尼醇提取物用石油醚溶解，过硅胶柱(200-300目)层析，以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，收集茄尼醇馏分，混合后浓缩得2.6g茄尼醇提取物，纯度为70％，进一步通过结晶可获得高纯茄尼醇；
(5)硅胶柱层析b：步骤三获得的维生素E、甾醇混合物用石油醚溶解，过硅胶柱(200-300目)层析，以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，在石油醚:乙酸乙酯＝15:1条件下，收集维生素E馏分，混合后浓缩得13mg维生素E提取物，纯度为68％，在石油醚:乙酸乙酯＝10:1条件下，收集甾醇馏分，混合后浓缩得15mg甾醇提取物，纯度为40％，进一步通过结晶，可分别获得高纯维生素E、甾醇；
(6)硅胶柱层析c：步骤三获得的西松烷粗品，进行硅胶(200-300目)柱层析，先用石油醚/乙酸乙酯-(体积比5:1)洗脱，至无馏分流出，再用石油醚/乙酸乙酯(体积比3:1)洗脱，收集第二馏分合并、浓缩，浓缩物进一步通过硅胶(200-300目)柱层析，以氯仿/丙酮(体积比5:1)作为洗脱剂进行分离洗脱，分别获得β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇和α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇，纯度达95％以上。
实施实例2
如图1所示，一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，具体包括如下步骤：
(1)提取：取烤烟大田成熟期下部或上部废弃不适用烟叶，60℃烘干，粉碎，称取粉碎后烟末200g，以石油醚为提取剂，其余步骤同实施实例1；
(2)皂化：该皂化过程中皂化完成后萃取脂溶性活性成分所用的提取溶剂为石油醚，其余步骤同实施实例1。
以下分离步骤同实施实例1。
实施实例3
如图1所示，一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，具体包括如下步骤：
(1)提取：取成熟期晒烟烟叶，60℃烘干，粉碎，称取粉碎后烟末200g，以石油醚为提取剂，以下步骤同实施实例1。
以上所述并非是对本发明的限制，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)提取：将烟叶去筋、干燥、粉碎，用非极性有机溶剂提取，非极性有机溶剂为正己烷或石油醚，提取液合并，减压浓缩至浸膏状，获得烟草脂溶性粗提物浸膏，同时回收溶剂；
(2)皂化：将以上步骤获得的烟草脂溶性粗提物浸膏在碱性条件下进行皂化，皂化过程采用氢氧化钠和95％乙醇按照质液比g/ml为1:60组成的皂化液，皂化完成后，调pH值至中性并浓缩除去有机溶剂，然后加入一定量的水，用非极性有机溶剂萃取并浓缩至浸膏，所述非极性有机溶剂为正己烷或石油醚，获得茄尼醇脂溶性活性成分混合物；
(3)葡聚糖凝胶柱分离：将以上步骤获得的脂溶性活性成分混合物以体积比二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合液作为溶解液和洗脱剂通过Sephadex LH20凝胶柱分离，收集洗脱液，分别获得茄尼醇粗品、维生素E和植物甾醇混合物、西松烷二萜粗提物；
(4)硅胶柱层析a：步骤(3)获得的茄尼醇粗品采用石油醚溶解，以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂进一步通过硅胶柱层析进行梯度洗脱，并通过结晶精制后获得茄尼醇；
(5)硅胶柱层析b：步骤(3)获得的维生素E和植物甾醇混合物用石油醚溶解，通过硅胶柱层析，以石油醚和乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，在石油醚:乙酸乙酯＝15:1条件下，收集维生素E馏分；在石油醚:乙酸乙酯＝10:1条件下，收集植物甾醇馏分；
(6)硅胶柱层析c：步骤(3)获得的西松烷二萜粗提取物通过硅胶柱层析，先用体积比石油醚：乙酸乙酯＝5:1的混合溶剂洗脱，至无馏分流出，再用体积比石油醚：乙酸乙酯＝3:1的混合溶剂洗脱，收集第二馏分合并、浓缩，浓缩物进一步通过200-300目的硅胶柱层析，以体积比氯仿：丙酮＝5:1的洗脱剂进行分离洗脱，分别获得抗肿瘤先导化合物——β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇和α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇；
烟叶提取后的残渣用于蛋白质、烟碱、绿原酸、芸香苷、糖的提取。
2.根据权利要求1所述一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，其特征在于，所述步骤(1)中烟叶为烤烟、晾晒烟、香料烟、白肋烟中的任意一种。
3.根据权利要求1所述一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，其特征在于，所述步骤(1)中烟叶的干燥温度设置为55-65℃，样品和提取剂的料液比为1:6-1:10。
4.根据权利要求1所述一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的皂化过程在60℃条件下加热回流皂化1h。
5.根据权利要求1所述一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，其特征在于，所述步骤(3)中通过薄层色谱或液相、气质联用检测不同馏分活性成分。
6.根据权利要求1所述一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，其特征在于，所述步骤(3)中获得的维生素E和植物甾醇混合物直接用于饲料添加剂或化妆品生产。
7.根据权利要求1所述一种从烟草中同时提取茄尼醇、西松烷二萜、维生素E、植物甾醇的方法，其特征在于，所述步骤(3)获得的西松烷二萜粗提物直接用于烟草香料。
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