CN105998219A - 黄牡丹（变种）乙酸乙酯提取物对口腔癌及癌前病变的干预作用 - Google Patents

黄牡丹（变种）乙酸乙酯提取物对口腔癌及癌前病变的干预作用 Download PDF

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Abstract

一种能显著抑制口腔癌及癌前病变的中药提取物，属于新型口腔癌中药研发领域。黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物，提取方法简单、快捷，可批量生产。选用CCK8法检测黄牡丹(变种)对口腔癌细胞株SCC15、CAL27和口腔癌前病变细胞株DOK细胞的增殖抑制作用。本发明为临床口腔癌防治新药的研发提供依据。

Description

黄牡丹（变种）乙酸乙酯提取物对口腔癌及癌前病变的干预作用
技术领域
本发明涉及一种干预口腔鳞状细胞癌细胞生长的药物，具体地说是以天然植物黄牡丹(变种)根为原料，经乙酸乙酯提取，即黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物(ethyl acetate extract，EA)。本发明还涉及该药物的制备方法。
背景技术
黄牡丹(变种)(Paeonia delavayi Franch.Var.lutea(Delavay ex Franch.)Finet&Gagnep.)，科属于毛莨科芍药属牡丹组，花黄色(有时边缘红色或基部有紫色斑块，与野牡丹以此区别)，羽状复叶，主要分布于云南、四川西南部及西藏东南部等地区，生于海拔2500-3000米的山地，是国家三级保护植物(1-2)。黄牡丹(变种)根可药用,根皮(赤丹皮)具有清热凉血、散瘀止痛的功效，去掉根皮的部分(“云白芍”)可治泄痢腹痛、自汗盗汗等症(3)。中医临床多用于腹痛、痛经、月经不调等疾病的诊治(4-5)。目前，尚未有学者报道黄牡丹(变种)的抗肿瘤作用，对其药用价值及其机制的研究较少。
参考文献
(1)王莲英.中国牡丹品种图志[M].北京：中国林业出版社，1997:2-7.
(2)中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].科学出版社，1979(27)47.
(3)云南省卫生厅主编.云南省药品标准(1996年版)[S].昆明：云南大学出版社，1998:55-56.
(4)李奎，王雁.黄牡丹研究现状与展望[J].林业科学研究，2014,27(2)：259-264.
(5)贾敏如，李星炜.中国民族药志要[M].中国医药科技出版社,2005
现有技术背景缺陷：目前，临床上口腔癌主要采用手术治疗、放射治疗及化学药物治疗为主的综合序列治疗，但治疗效果往往不佳。尽管近年来治疗手段有很大改进，但其5年生存率仍不足50％，严重影响了口腔癌患者的生存质量。口腔粘膜癌变是一个多阶段、多步骤的过程，口腔癌常由口腔癌前病变如白斑、扁平苔藓等发生恶变而来。至今尚无公认有效的防治口腔癌变的药物和治疗方法。现代药理研究表明许多传统中药具有抗肿瘤作用，且具有优效、低毒、低副作用等优点，人们开始逐步重视于传统中药的开发及应用。因此，寻找新型低毒高效的中草药治疗药物，延长患者的生命，提高其生存质量，对口腔癌综合治疗具有重要意义。
发明内容
本发明目的是根据黄牡丹(变种)在中医临床上具有清热凉血、散瘀止痛的功效，检测黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物具有抑制口腔癌及癌前病变细胞生长的作用，以期为口腔癌的临床药物治疗提供新的思路及实验依据，开拓黄牡丹(变种)的药用价值及新用途。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下。
具体包括以下步骤：
(1)黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物的制备
黄牡丹(变种)样品粉碎成粗粉，取粗粉500克，用80％乙醇湿润后，再用3倍量80％乙醇回流提取两次，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，用等体积乙酸乙酯萃取2次(上层液体)，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯至干燥，获得乙酸乙酯萃取物(EA)。
(2)黄牡丹(变种)EA对口腔癌及癌前病变细胞形态的影响
在倒置显微镜下观察，口腔癌细胞SCC15和CAL27细胞呈梭形，不规则多边形，CAL27细胞体积更小，口腔癌前病变DOK细胞呈长梭形，不规则多边形。不同浓度黄牡丹(变种)EA处理三种细胞24h、48h、72h，随着药物浓度的增高细胞形态变圆、变小及细胞膜不连续的程度加重。
(3)黄牡丹(变种)EA对口腔癌SCC15细胞增殖的影响
将10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml不同浓度的黄牡丹(变种)EA作用于SCC15细胞24h、48h、72h，SCC15细胞增殖受到不同程度的抑制。随着药物浓度的升高，SCC15细胞增殖抑制率亦随之升高。黄牡丹(变种)EA作用SCC15细胞24h,48h的IC50分别为65±0.48μg/ml,22.72±0.51μg/ml，提示黄牡丹(变种)EA对口腔癌SCC15细胞增殖具有抑制作用，抑制作用呈浓度和时间依赖性。
(4)黄牡丹(变种)EA对口腔癌CAL27细胞增殖的影响
将12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml不同浓度的黄牡丹(变种)EA作用于口腔癌细胞CAL27细胞24h、48h、72h，CAL27细胞增殖受到抑制。随着药物浓度的升高，CAL27细胞增殖抑制率亦随着升高。黄牡丹(变种)EA作用CAL27细胞24h,48h,72h的IC50分别为36.5±0.73μg/ml,27.1±0.55μg/ml，39.3±0.89μg/ml，提示黄牡丹(变种)EA对口腔癌CAL27细胞增殖具有抑制作用，且抑制作用具有浓度依赖性。
(5)黄牡丹(变种)EA对口腔癌前病变DOK细胞增殖的影响
将12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml不同浓度的黄牡丹(变种)EA作用于DOK细胞24h、48h、72h，DOK细胞增殖受到不同程度的抑制。随着药物浓度的升高，DOK细胞增殖抑制率亦随着升高。黄牡丹(变种)EA作用DOK细胞24h,48h,72h的IC50分别为68.51±0.73μg/ml,22.86±0.55μg/ml，40.41±0.89μg/ml，提示黄牡丹(变种)EA对口腔癌前病变DOK细胞增殖具有抑制作用，且抑制作用具有浓度依赖性。
附图说明
图1.黄牡丹(变种)EA对SCC15细胞增殖的影响；
图2.黄牡丹(变种)EA对CAL27细胞增殖的影响；
图3.黄牡丹(变种)EA对DOK细胞增殖的影响；
具体实施方式
CCK-8法：
采用CCK-8法分别检测黄牡丹(变种)EA对口腔癌细胞株SCC15、CAL27及癌前病变细胞株DOK细胞增殖的影响。实验设置实验组和对照组，实验组设置梯度浓度黄牡丹(变种)EA组；对照组为与实验组同剂量的溶剂DMSO组。取对数生长期细胞，用含0.25％EDTA胰酶消化，离心，弃上清。用含有10％血清的培养基调整细胞浓度为2.5×104个/ml。每孔接种200μl细胞悬液入96孔培养板内，每组4个复孔。贴壁过夜后，吸弃上清，按组加入含有不同浓度黄牡丹(变种)EA的培养液(血清含量为10％)，并设溶剂对照组。继续培养不同时间(24h、48h、72h)。每孔加190μl培养基和10μl CCK8试剂，置于37℃、5％CO2饱和湿度孵箱内培养2.5h后终止培养。在酶标仪上测定各孔吸光度(A值)，选择450nm波长，记录结果，并按以下公式计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％。实验重复3次。

Claims (6)

1.一种黄牡丹(变种)的提取物，该提取物为乙酸乙酯，对口腔癌及癌前病变的干预作用。
2.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述黄牡丹(变种)的乙酸乙酯提取物由以下方法制备：黄牡丹(变种)用石油醚浸泡18-36h，渗滤提取至3-8倍药材量，回收残渣，挥干残渣中的石油醚，用70％-90％乙醇提取，提取液浓缩得乙醇浓缩液，相对密度为1.15-1.20，用乙酸乙酯萃取，倒出上层，即得乙酸乙酯提取物。
3.根据权利1所述的对口腔癌的干预作用，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)首先CCK-8法检测黄牡丹(变种)乙酸乙酯对口腔癌细胞SCC15的增殖抑制作用，效果明显，且随时间及药物浓度增加抑制作用增强。
(2)CCK-8法检测黄牡丹(变种)乙酸乙酯对口腔癌细胞CAL27的增殖抑制作用，效果明显，且随时间及药物浓度增加抑制作用增强。
(3)CCK-8法检测黄牡丹(变种)乙酸乙酯对口腔癌前病变细胞DOK的增殖抑制作用，效果明显，且随时间及药物浓度增加抑制作用增强。
4.含权利要求1和2所述提取物的制剂，其特征在于，所述制剂为由黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述制剂为片剂、糖衣丸、胶囊、注射剂、溶液、乳液、油膏、乳膏、吸入剂、气雾剂或栓剂。
6.权利要求1所述的提取物或权利要求4、5中所述的含黄牡丹(变种)乙酸乙酯提取物的制剂在制备防治口腔癌的药物中的应用。
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CN104984081A (zh) * 2015-07-16 2015-10-21 冯冬梅 一种治疗口腔癌喷雾及其制备方法
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赵建茹 等: "《基础化学教程第2版》", 28 February 2014, 西安交通大学出版社 *

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