CN103316184A

CN103316184A - 一种中药萃取物的制备方法

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Publication number: CN103316184A
Application number: CN2013102339044A
Authority: CN
Inventors: 谷满仓; 童培建; 金红婷; 单乐天; 尹华; 吴承亮; 俞索静; 肖鲁伟
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Taiyuan Yusen Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2013-06-09
Filing date: 2013-06-09
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-06-09
Also published as: CN103316184B

Abstract

本发明公开了一种中药萃取物的制备方法，所述方法为：将熟地5～8份、杜仲2～5份、附子5～8份、枸杞2～5份、肉桂3～5份、山茱萸1～3份、桃仁3～5份、红花1～3份、山药2～5份和甘草3～5份分别粉碎后混合均匀，制成中药组合物粉末，将中药组合物粉末置于超临界流体萃取仪中，进行超临界流体萃取0.1～10小时，从分离器中得到萃取物；本发明提供了采用中药组合物为原料，以多元超临界流体萃取技术作为新制备方法得到了两种中药萃取物，两种萃取物促进成骨细胞活性的作用均显著强于醇-水方法提取中药提取物。

Description

一种中药萃取物的制备方法

（一）技术领域

本发明涉及一种采用多元超临界流体萃取技术制备中药补肾活血方药物的新方法，通过该方法所得萃取物具有明显的促进成骨细胞增殖活性的作用。

（二）背景技术

骨质疏松症(Osteoporosis，OP)是一种以单位体积内骨组织含量减少，骨密度降低，骨强度减弱，导致骨结构与骨脆性增加并易于发生骨折的全身性骨骼疾病，为骨科的常见病、多发病，其临床表现主要有骨折、疼痛及肌力低下等其他非特异性症状。随着中国人口老龄化的加速，OP已成为严重威胁中老年人健康的疾病。据调查2006年，我国已有骨质疏松患者约9000万人，约占总人口7.1%，预计到2050年将增加到2.21亿人，骨质疏松症已成为目前社会的主要健康问题之一。现代医学认为正常成人期骨代谢主要靠破骨细胞的骨吸收和成骨细胞的骨形成之间的协调平衡，从而形成体内骨转换的稳定状态；任何影响破骨细胞和成骨细胞数目和功能的因素，使骨吸收过多或骨形成不足，即可导致骨质疏松。目前治疗骨质疏松的药物主要可分为3大类：①抑制破骨细胞活性的药物，主要有雌激素、降钙素、双膦酸盐、异丙氧黄酮、选择性雌激素受体调节剂等，②促进成骨细胞生成的药物，主要有氯化物、甲状旁腺激素、蛋白合成激素；③促进骨化的药物，主要有钙剂和维生素D及其衍生物等。目前临床上对骨质疏松的治疗，以药物治疗为主，化学药物治疗骨质疏松症服药时间长，且易引起神经系统和消化系统等一系列不良反应，在一定程度上还会损害肝脏等脏器，如雌激素替代疗法可增加乳癌的危险性，氟化物可引起骨脆性增加。国内学者发挥传统中医药的优势,对利用补肾类方药,对治疗OP做了很多研究,并取得了一定的疗效，因此从传统中药复方中发现新型的抗OP药物，对于临床治疗OP具有重大意义。

补肾活血方为临床治疗骨质疏松的有效方剂，全方由仲景名方右归饮加桃仁、红花所组成，取右归饮补肾助阳之功，增桃仁、红花活血化瘀之力，全方补肾助阳，活血通络，与骨质疏松患者肾阳不足，瘀血内停的病机相符，所以此方为临床治疗骨质疏松症的有效方剂。发明专利《一种治疗骨质疏松症的中药组合物及补肾活血颗粒剂》表明由补肾活血方进一步制得的补肾活血颗粒能够有效提高大鼠骨密度、骨强度，通过降低尿脱氧吡啶酚、尿脱氧吡啶酚/尿肌酐水平以及破骨细胞整合素αVβ3的表达抑制骨吸收，从而达到治疗骨质疏松的目的。许应星等的研究亦表明补肾活血颗粒含药血清具有一定的促进成骨细胞活性与矿化能力的作用。

发明专利CN102145106A公开了一种以治疗骨质疏松的补肾活血方药物组合物为原料药制备补肾活血颗粒的方法。该发明主要采用传统的醇提加水煎煮乙醇沉淀方法。该制备方法虽然遵循了补肾活血方以汤剂给药的传统，但传统汤剂随煎随服，此时挥发油和其他亲脂性成分仍存在与汤剂中，因此可以保证疗效。而现代工艺制备补肾活血颗粒往往需要过滤、浓缩和干燥等步骤，其主要成分与传统汤剂相比可能已有较大差异；因此仅以右归饮水煎剂作为对象研究药效物质基础，存在一定的局限性。化学成分研究表明复方中作为君药的熟地黄因炮制的原因，其主要成分从亲水性的苷类（如，环烯醚帖苷类、紫罗兰酮苷类等）转变为亲脂性较强的苷元，水煎煮工艺可保证此类苷元有效溶出，目前都尚不清楚。处方中有肉桂，富含挥发油成分，且与疗效密切相关。传统给药方法采用全方水煎煮后立即服用，挥发油仍存于汤剂中，可以保证疗效。若按此工艺开发成成方制剂，则在提取、浓缩中挥发油成分必定损失殆尽。经改进后采用水蒸汽蒸馏或乙醇热回流提取等方式，但得率较低，仅2.3%，且肉桂中其他有效成分在长时间加热过程中容易损失。因此有必要采用新的提取技术于补肾活血方中促进成骨细胞活性的有效组分。

超临界流体萃取技术（Supercritical fluid extraction，SFE）为一种较为先进的物理萃取方法，主要以CO₂作为萃取介质，具有对环境友好无污染、提取温度低、对有效成分破坏少等优点，已成为一种理想的现代中药提取技术，广泛应用于单味或复方药味中脂肪油与挥发油的等脂溶性小分子物质的萃取中。然而由于中药复方成分复杂，除了脂溶性小分子外，还有存在大量中等极性甚至强极性的有效成分，使得以CO₂作为萃取介质的传统SFE在应用于萃取复方中药全方有效组分时收到极大限制。通过向CO₂中添加乙醇等极性夹带剂可使SFE适用于萃取生物碱、香豆素、木脂素、黄酮类、醌类、皂苷类等亲脂性成分，但也增大的萃取物中杂质的含量，降低了SFE的选择性。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种采用超临界流体萃取技术作为新的制备方法从中药组合物（即补肾活血方药物）中富集得到具有促进成骨细胞活性作用的萃取物；该萃取物与中药组合物（即补肾活血方药物）醇-水提取物相比具有更为显著的促进成骨细胞活性的作用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种中药萃取物的制备方法，所述方法为：将熟地5～8份、杜仲2～5份、附子5～8份、枸杞2～5份、肉桂3～5份、山茱萸1～3份、桃仁3～5份、红花1～3份、山药2～5份和甘草3～5份分别粉碎后混合均匀，制成中药组合物粉末，将中药组合物粉末置于超临界流体萃取仪中，在萃取釜压力1～100Mpa、萃取釜温度1～100℃、分离器压力1～100Mpa、分离器温度1～100℃的条件下，以二氧化碳为介质进行超临界流体萃取0.1～10小时，从分离器中得到中药萃取物SFEI；然后再在萃取釜压力1～100Mpa、萃取釜温度1～100℃、分离器压力1～100Mpa、分离器温度1～100℃的条件下，以二氧化碳与无水乙醇混合物为介质进行超临界流体萃取0.1～10小时，从分离器中得到中药萃取物SFEII；所述二氧化碳与无水乙醇混合物中无水乙醇质量终浓度为0.1～10%。

进一步，所述萃取物SFEI制备过程中，萃取釜压力23～38Mpa、萃取釜温度38～44℃、分离器压力7～12Mpa、分离器温度50～65℃，萃取时间为2～4小时。

更进一步，优选所述中药萃取物SFEI制备过程中，萃取釜压力23Mpa、萃取釜温度38℃、分离器压力7Mpa、分离器温度50℃，萃取时间为4小时。

进一步，所述中药萃取物SFEII制备过程中，萃取釜压力25～40Mpa、萃取釜温度38～45℃、分离器压力6～15Mpa、分离器温度45～55℃，萃取时间为4～6小时，以二氧化碳与无水乙醇的混合物为介质，所述二氧化碳与无水乙醇混合物中无水乙醇质量终浓度为0.1～10%。

更进一步，所述中药萃取物SFEII制备过程中，萃取釜压力25Mpa、萃取釜温度38℃、分离器压力6Mpa、分离器温度45℃，萃取时间为4小时，以二氧化碳与无水乙醇的混合物为介质，所述二氧化碳与无水乙醇混合物中无水乙醇质量终浓度为2%。

进一步，优选所述中药组合物粉末是将熟地6份、杜仲4份、附子6份、枸杞4份、肉桂4份、山茱萸2份、桃仁4份、红花2份、山药4份和甘草4份分别粉碎后混合而制成。

本发明所述中药组合物为补肾活血方药物，参见发明专利CN102145106A。所述中药组合物由经典古方右归饮添加桃仁、红花两味活血中药组成，具有补肾益精、活血化瘀、散寒止痛之疗效，临床用于治疗骨质疏松症。方中熟地益髓填精，杜仲补肝肾、壮筋骨，为君药；附子、肉桂补肾阳，山茱萸、枸杞养肝血，助君药以滋肾养肝，是为臣药；桃仁、红花活血以散瘀止痛，为佐药；山药、甘草补中养脾，为使药；诸药合用，共奏补肾益精、活血化瘀、散寒止痛之功效。

所述多元超临界流体萃取技术方案所得中药萃取物SFEI，得率为（0.4～8.9）%，含有桂皮醛（0.2～11.0）%，亚油酸(17.7～52.3)%，油酸(11.1～32.9)%。中药萃取物SFEII，得率为（0.8～15.9）%，含有桂皮醛（0.8～12.0）%，亚油酸（11.3～27.5）%，油酸（6.6%～16.1）%。

本发明所述的超临界流体方法获得的中药萃取物SFEI与萃取物SFEII经体外细胞学实验证明，其含药血清能够促进原代培养大鼠颅成骨细胞及小鼠成骨细胞前体MC3T3E1的增殖活性，提高其碱性磷酸酶表达。本发明的中药萃取物SFEI与中药萃取物SFEII促进成骨细胞活性的效果明显优于相同中药醇-水提取物。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了采用中药组合物为原料，以多元超临界流体萃取技术作为新制备方法得到了两种中药萃取物，两种萃取物促进成骨细胞活性的作用均显著强于醇-水方法获得的中药提取物。

（四）附图说明

图1为桂皮醛、油酸甲酯、亚油酸甲酯对照品气相色谱图：A为桂皮醛对照品气相色谱图；B为油酸甲酯对照品气相色谱图；C为亚油酸甲酯对照品气相色谱图；D为十七烷酸甲酯（内标）气相色谱图。

图2为实施例1制备的SFEI、SFEII气相色谱检测结果图：A为SFEI中桂皮醛气相色谱检测结果图；B为SFEI中脂肪酸甲酯化气相色谱检测结果图；C为SFEII中桂皮醛气相色谱检测结果图；D为SFEII中脂肪酸甲酯化气相色谱检测结果图。

图3为实施例7制备的中药醇-水提取物气相色谱检测结果图：A为醇-水提取物中桂皮醛气相色谱检测结果图，B为醇-水提取物中脂肪酸甲酯化气相色谱检测结果图。

图4不同给药剂量SFEI与SFEII含药血清促进原代培养颅成骨细胞增殖活性图。

图5不同给药剂量SFEI与SFEII含药血清促进MC3T3E1E1细胞增殖活性图。

图6不同给药剂量SFEI与SFEII含药血清促进MC3T3E1E1细胞碱性磷酸酶活性图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1中药萃取物的制备

处方：熟地6份，杜仲4份，附子6份，枸杞4份，肉桂4份，山茱萸2份，桃仁4份，红花2份，山药4份，甘草4份；

取上述各味药材，采用小型植物粉碎机（FZ102，北京中兴伟业仪器有限公司）粉碎成粒径为30目～60目的粗粉后置于超临界流体萃取仪（HA220-40-11，南通市华安超临界萃取有限公司）的萃取釜中，用二氧化碳为介质进行超临界流体萃取，萃取釜压力23Mpa，萃取釜温度38℃，分离器压力7Mpa，分离器温度50℃，萃取4小时，从分离器中得到萃取物SFEI。然后再在萃取釜压力25Mpa，萃取釜温度38℃，分离器压力6Mpa，分离器温度45℃，以二氧化碳与无水乙醇混合物（混合物中无水乙醇质量终浓度为2%）为介质进行超临界流体萃取4小时，从分离器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI，为澄黄色透明油状液体，得率为5.1%，每g萃取物SFEI相当于中药组合物生药量19.5g，萃取物SFEII为棕色浸膏状半固体，得率为9.5%，每g萃取物SFEII相当于中药组合物生药量10.5g。采用气相色谱法对SFEI和SFEII进行成分分析（测试方法见实施例2），结果见图1、图2所示，SFEI含有桂皮醛3.7%，亚油酸48.9%，油酸30.8%；SFEII含有桂皮醛9.0%，亚油酸16.2%，油酸9.5%。

实施例2中药萃取物成分分析方法

1）桂皮醛含量测定方法：

（1）气相色谱条件与系统适应性：色谱柱:DB-5毛细管气相色谱柱（30m×250μm，0.25μm），载气N₂，流速1.0ml/min，进样口温度230℃，程序升温条件：100℃，20℃/min升温至140℃，2℃/min升温至160℃，保持2min，FID检测器，检测器温度：230℃，分流比：20：1，进样量：1.0μl，分离度应大于1.5，理论板数以桂皮醛峰计应大于3000。

（2）对照品供试液制备：精密称取桂皮醛对照品（购自中国食品药品检定研究院，货号110710-201217）约50mg，置于50ml容量瓶中，无水甲醇溶解后定容至50ml，即为桂皮醛对照品贮备液，精密移取该对照品贮备液0.2ml、1.8ml置于2ml容量瓶，无水甲醇定容，即得桂皮醛对照品供试液a（0.1mg/ml）与b（0.9mg/ml），4℃保存。

（3）SFEI供试液制备：精密称取SFEI200mg，加3.0ml无水甲醇，超声提取10min，静置待分层，取上层清液a置于5ml容量瓶，取残渣用无水甲醇洗涤2次，每次无水甲醇1.0ml，静置待分层，将两次洗涤获得的上层液并入上层清液a中，无水甲醇定容至5.0ml，即得SFEI供试液，4℃保存。

（4）测定法：分别精密吸取对照品供试液a与b各1.0μL、SFEI供试液1.0μL，分别注入气相色谱仪进行色谱分析，对照品供试液的气相色谱图见图1中A所示，SFEI供试液的气相色谱图见图2中A所示。以桂皮醛对照品峰面积对桂皮醛对照品浓度做线性回归，得回归方程y=0.003x+0.0106，（r=0.9998），x为桂皮醛浓度，y为桂皮醛对照品峰面积，将SFEI供试液中桂皮醛峰面积代入该回归方程计算，即得SFEI供试液中桂皮醛的含量。

SFEII供试液和醇-水提取物供试液的制备方法同SFEI供试液的制备，不同的是精密称取SFEII500mg，或者醇-水提取物1.0g，SFEII供试液的气相色谱图见图2中C所示，醇-水提取物供试液的气相色谱图见图3中A所示。

2）油酸与亚油酸含量测定方法：

（1）气相色谱条件与系统适应性：色谱柱:HP-INNOWax PEG毛细管气相色谱柱（30m×250μm，0.32μm），载气N2，流速1.0ml/min，进样口温度210℃，柱温190℃，保持25min，FID检测器，检测器温度：210℃，分流比：20：1，进样量：0.2μl，分离度应大于1.5，理论板数以油酸甲酯和亚油酸甲酯峰计应大于3000。

（2）对照品贮备液制备：精密称取油酸甲酯和亚油酸甲酯对照品各约100mg，分别置于25ml容量瓶中，正己烷溶解后定容至25ml，即得油酸甲酯对照品贮备液和亚油酸甲酯对照品贮备液，4℃保存。

（3）内标贮备液制备：精密称取十七烷酸甲酯对照品约50mg，置于25ml容量瓶中，正己烷溶解后定容至50ml，即得内标贮备液，4℃保存。

（4）对照品供试液制备：精密移取油酸甲酯对照品贮备液0.1ml、1.6ml分别置于2ml容量瓶，每个容量瓶加入内标贮备液0.25ml，分别用正己烷定容，即得油酸甲酯对照品供试液a（0.2mg/ml）与b（3.2mg/ml），4℃保存。精密移取亚油酸甲酯对照品贮备液0.1ml、1.6ml分别置于2ml容量瓶，每个容量瓶加入内标贮备液0.25ml，分别用正己烷定容，即得亚油酸甲酯对照品供试液a（0.2mg/ml）与b（3.2mg/ml），4℃保存。

（5）SFEI供试液制备：精密移取内标贮备液0.5ml，置10ml容量瓶中，N₂气吹干溶剂，再精密加入SFEI30mg，加0.5mol/L氢氧化钾甲醇溶液2ml，充氮气，密塞，在65℃水浴中皂化约15min，待油珠溶解后，放冷，加2.0mol/L三氟化硼甲醇溶液2ml，充氮气，在65℃中甲酯化2min，放冷，精密加入正己烷4ml，振摇，加入饱和氯化钠溶液至刻度，充氮气，静置待分层，吸取上层清液1.0ml，即得SFEI供试液，4℃保存。

（6）测定法：精密吸取油酸甲酯对照品供试液a与b各0.2μL、亚油酸甲酯对照品供试液a与b各0.2μL、SFEI供试液0.2μL，分别注入气相色谱仪进行色谱分析，油酸甲酯对照品气相色谱图见图1中B所示，亚油酸甲酯对照品气相色谱图见图1中C所示，SFEI供试液气相色谱图见图2中B所示。以油酸甲酯或亚油酸甲酯对照品峰面积与内标峰面积比值对油酸甲酯对照品或亚油酸甲酯对照品浓度做线性回归，得油酸甲酯回归方程y=4.5809x-0.2303（r=0.9991），x为油酸甲酯对照品浓度，y为油酸甲酯对照品峰面积与内标峰面积比值；亚油酸甲酯回归方程y=3.9658x-0.2535（r=0.9993），x为亚油酸甲酯对照品浓度，y为亚油酸甲酯对照品峰面积与内标峰面积比值，将SFEI供试液中油酸甲酯或亚油酸甲酯峰面积与内标峰面积比值代入该回归方程计算，即得SFEI中油酸和亚油酸含量。

SFEII供试液、醇-水提取物供试液的制备同SFEI供试液，不同的是精密称取SFEII30mg，或者精密加入醇-水提取物200mg，SFEII供试液气相色谱图见图2中D所示，醇-水提取物供试品气相色谱图见图3中B所示。

实施例3

处方：熟地5份，杜仲3份，附子5份，枸杞3份，肉桂3份，山茱萸2份，桃仁3份，红花2份，山药3份，甘草3份；

取上述各味药材，采用小型植物粉碎机（FZ102，北京中兴伟业仪器有限公司）粉碎成粒径为30目～60目的粗粉后置于超临界流体萃取仪的萃取釜中，用二氧化碳为介质进行超临界流体萃取，萃取釜压力38Mpa，萃取釜温度44℃，分离器压力12Mpa，分离器温度65℃，萃取2小时，从分离器中得到萃取物SFEI。再在萃取釜压力40Mpa，萃取釜温度45℃，分离器压力15Mpa，分离器温度55℃，以二氧化碳与无水乙醇混合物（混合物中无水乙醇质量终浓度4%）为介质进行超临界流体萃取6小时，从分离器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI为澄黄色透明油状液体，得率为1.9%，每g萃取物SFEI相当于中药组合物生药量52.5g，萃取物SFEII为棕色浸膏状半固体物质，得率为2.6%，每g萃取物SFEII相当于中药组合物生药量38.4g。根据实施例2方法测试得到SFEI含有桂皮醛6.1%，亚油酸51.4%，油酸32.4%。SFEII含有桂皮醛11.6%，亚油酸27.5%，油酸16.1%。

实施例4

处方：熟地6.5份，杜仲4.5份，附子6.5份，枸杞4.5份，肉桂4.5份，山茱萸1.8份，桃仁4.5份，红花1.8份，山药4.5份，甘草4.5份；

取上述各味药材，粉碎后置于超临界流体萃取仪的萃取釜中，用二氧化碳为介质进行超临界流体萃取，萃取釜压力1Mpa，萃取釜温度90℃，分离器压力1Mpa，分离器温度95℃，萃取10小时，从分离器中得到萃取物SFEI。然后再在萃取釜压力2Mpa，萃取釜温度90℃，分离器压力1Mpa，分离器温度95℃，以二氧化碳与无水乙醇混合物（混合物中无水乙醇质量终浓度0.1%）为介质进行超临界流体萃取10小时，从分离器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI为澄黄色浑浊油状液体，得率为1.2%，每g萃取物SFEI相当于中药组合物生药量83.3g，萃取物SFEII为浅棕黄色流浸膏半固体物质，得率为1.5%，每g萃取物SFEII相当于中药组合物生药量66.7g。

根据实施例2方法可知，萃取物SFEI含有桂皮醛11.0%，亚油酸36.2%，油酸21.0%。萃取物SFEII含有桂皮醛12.0%，亚油酸11.8%，油酸6.9%。

实施例5

取上述各味药材，粉碎后置于超临界流体萃取仪的萃取釜中，用二氧化碳为介质进行超临界流体萃取，萃取釜压力100Mpa，萃取釜温度32℃，分离器压力12Mpa，分离器温度65℃，萃取2小时，从分离器中得到萃取物SFEI。再在萃取釜压力1Mpa，萃取釜温度80℃，分离器压力100Mpa，分离器温度85℃，以二氧化碳与乙醇混合物为介质（混合物中无水乙醇质量终浓度10%）超临界流体萃取0.1小时，从分离器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI为澄黄色透明油状液体，得率为8.9%，每g萃取物SFEI相当于中药组合物生药量11.2g，萃取物SFEII为浅棕黄色流浸膏状半固体物质，得率为0.8%，每g萃取物SFEII相当于中药组合物生药量125g。

根据实施例2方法可知，萃取物SFEI含有桂皮醛1.6%，亚油酸52.3%，油酸32.9%。上述实例所得萃取物SFEII含有桂皮醛0.8%，亚油酸11.3%，油酸6.6%。

实施例6

取上述各味药材，粉碎后置于超临界流体萃取仪的萃取釜中，用二氧化碳为介质进行超临界流体萃取，萃取釜压力1Mpa，萃取釜温度90℃，分离器压力100Mpa，分离器温度95℃，萃取0.1小时，从分离器中得到萃取物SFEI。再在萃取釜压力100Mpa，萃取釜温度32℃，分离器压力6Mpa，分离器温度75℃，以二氧化碳与无水乙醇混合物（混合物中无水乙醇质量终浓度2%）为介质进行超临界流体萃取2小时，从分离器中得到萃取物SFEII。萃取物SFEI为澄黄色透明油状液体，得率为0.4%，每g萃取物SFEI相当于中药组合物生药量250g，萃取物SFEII为棕色浸膏状半固体物质，得率为15.9%，每g萃取物SFEII相当于中药组合物生药量6.3g。

根据实施例2方法可知，萃取物SFEI含有桂皮醛8.8%，亚油酸17.7%，油酸11.1%；萃取物SFEII含有桂皮醛2.3%，亚油酸24.9%，油酸14.6%。

实施例7中药醇-水提取物的制备（即补肾活血方药物提取物）

处方：处方：熟地6份，杜仲4份，附子6份，枸杞4份，肉桂4份，山茱萸2份，桃仁4份，红花2份，山药4份，甘草4份；

制备方法：

杜仲、熟地、附子、山茱萸、等8味药水提，肉桂、桃仁2味药醇提。

(1)水提物：取配方量的熟地、杜仲、附子、枸杞、山茱萸、红花、山药和甘草中药饮片，加入12质量倍的水，浸泡1～2h后，回流提取3次，每次1.5h，合并水提取液、减压浓缩至相对密度为1.05，再加入体积浓度95%乙醇水溶液使乙醇水溶液体积浓度为60%，4℃下醇沉24h，回收乙醇并浓缩至相当于1g药液相当于中药组合物生药量4.0g，药液相对密度为1.45，得到水提物；

(2)醇提物：取配方量的肉桂和桃仁的中药饮片，加入10质量倍的体积浓度60%乙醇水溶液浸泡1h后，85℃浸提3次，每次1.5h；合并醇提取液、减压浓缩至相当于1g药液相当于中药组合物生药量4.0g，药液相对密度为1.45，得到醇提物；

(3)将全部水提物与全部醇提物混合均匀，即得中药醇-水提取物，该提取物1g药液相当于中药组合物生药量4.0g，药液相对密度为1.45，含有桂皮醛0.42%。

实施例8中药萃取物含药血清制备方法

（1）实验动物：SD大鼠66只，清洁级，雌雄各半、体重约200±20g，购自浙江中医药大学动物实验中心，实验在浙江中医药大学动物实验中心进行，室温20～23℃，相对湿度60%～70%，12小时交替光照。

（2）给药方案与血清制备方法：所有动物按体重随机分为11组，每组6只，分别为：空白对照组（组1），阳性药物（仙灵骨葆胶囊，贵州同济堂制药有限公司生产，取仙灵骨葆胶囊内容物溶于适量纯化水，制成0.019g/ml溶液）对照组（组2），实施例1制备的SFEI低剂量组（0.033g/ml萃取物SFEI水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物生药量6.25g/kg体重·天，组3）、中剂量组（0.13g/ml萃取物SFEI水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物生药量25g/kg体重·天，组4）、高剂量组（0.38g/ml萃取物SFEI水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物75g/kg体重·天，组5），实施例1制备SFEII低剂量组（0.060g/ml萃取物SFEII水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物生药量6.25g/kg体重·天，组6）、中剂量组（0.24g/ml萃取物SFEII水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物生药量25g/kg体重·天，组7）、高剂量组（0.71g/ml萃取物SFEII水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物生药量75g/kg体重·天，组8），中药醇-水提物低剂量组（0.16g/ml醇-水提取物水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物6.25g/kg体重·天，组9）、中剂量组（0.62g/ml醇-水提取物水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物生药量25g/kg体重·天，组10）、高剂量组（1.87g/ml醇-水提取物水溶液1.0ml/100g体重，相当于给予中药组合物生药量75g/kg体重·天，组11）。各给药组灌胃给药1.0ml/100g体重，1次/天，共3天，空白对照组灌胃给予蒸馏水1.0ml/100g体重，其余同给药组；末次给药45min后腹腔注射30mg/g戊巴比妥溶液（0.15ml/100g体重）麻醉，15min后大鼠心脏取血约8～10ml置于预先标记组号的15ml离心管中，置于4℃冰箱0.5小时，离心3000rpm、10min，小心吸取上层血清于预先标记组号的离心管中，置于56℃水浴中灭活30min，-80℃保存，临用前过0.22μm滤膜滤过除菌，即为空白血清（组1）和含药血清（组2～组11）。

实施例9中药萃取物、中药醇-水提取物含药血清促原代培养大鼠颅成骨细胞增殖实验

（1）大鼠颅成骨细胞原代培养：取出生48h的SD大鼠乳鼠处死放于体积浓度75%乙醇水溶液中2min，放入无菌操作箱在无菌条件下取出颅盖骨，PBS液（pH值为7.4）漂洗2次，剪成大小约1mm×1mm的小块，置于离心管中加入5ml、2.5mg/ml胰蛋白酶/EDTA（购自Hyclone公司,货号SH30042.01B）消化，置于37℃恒温水浴20min，弃上清液，加5ml、1mg/ml I型胶原酶（取适量I型胶原酶粉末（购自Sigma公司，货号C0130，≥125CDU/mg）溶于D-Hank’s培养液），恒温振荡仪孵育1小时，吸取上清液，1000转/min离心15min，弃上清液，加入RPMI1640培养液（2000mg/L D-葡萄糖，300mg/L L-谷氨酰胺,2000mg/L碳酸氢钠。pH值7.0-7.4。杭州吉诺生物医药技术有限公司，货号GNM31800）制成细胞悬液；剩余骨片重复加入5ml I型胶原酶，重复前面操作，合并细胞悬液，按细胞数2×10⁵将上述细胞悬液直接接种于6孔培养板中，37℃、5%CO₂饱和湿度下培养，每3天换RPMI1640培养液1次，取对数生长期第3代大鼠颅成骨细胞进行药物干预及细胞增殖活性测定。

（2）细胞增殖活性实验（MTT法）：取步骤（1）获得的对数生长期第3代大鼠颅成骨细胞，经2.5mg/ml胰蛋白酶/EDTA消化、RPMI1640培养液混悬，计数后按2×10⁴/ml将上述细胞悬液接种于96孔培养板，放回培养箱中37℃、5%CO₂饱和湿度下孵育过夜。将实施例8制备的各组含药血清（组2～组11）与空白对照组血清（组1）分别用无血清RPMI1640培养液稀释使每孔中血清体积终浓度为2%，同时设立不含细胞的RPMI1640培养液对照孔。将培养板放回培养箱中37℃、5%CO₂饱和湿度下孵育48h后弃去各孔培养液，小心用PBS（pH值为7.2）洗涤细胞一次，每孔加入100μL含0.5mg/ml噻唑兰的无血清RPMI1640培养液，放回培养箱中37℃、5%CO₂饱和湿度下孵育4h，4℃终止反应，小心弃去上层清液，每孔加150μL DMSO，振荡15min，490nm下测定吸光度（OD），根据公式（1）计算成骨细胞净增殖率，结果见图3所示。

成骨细胞净增殖率＝[（含药血清处理孔OD－培养液对照孔OD）－（空白血清处理孔OD－培养液对照孔OD）]/（空白血清处理孔OD－培养液对照孔OD）

（3）实验结果：由图4可知，本发明中药萃取物，即SFEI低、中、高剂量组含药血清促进原代成骨细胞增殖率分别为空白对照组的(110.62±5.61)%、（140.75±7.90）%与（110.15±4.97）%，各组与空白对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）。本发明中药萃取物，即SFEII低、中、高剂量组含药血清与空白对照组相比促进原代成骨细胞增殖率分别为(123.4±6.77)%、（119.63±5.89）%与（97.36±4.02）%，低剂量组和中剂量组与空白对照组相比具有显著性差异（P<0.05）。中药醇-水提取物低、中、高剂量组其中低剂量组与中剂量组促进原代成骨细胞增殖率分别为空白对照组的(106.02±7.42)%、（119.08±8.57）%与（106.35±6.91）%，中剂量组与空白对照组相比有显著性差异（P<0.05）。其中SFEI中剂量组、SFEII低剂量组含药血清促原代培养成骨细胞增殖作用显著强于中药醇-水提取物相应剂量组含药血清（P<0.05）。

实施例10中药萃取物、中药醇-水提取物含药血清促小鼠成骨前体细胞MC3T3E1增殖实验

（1）细胞培养：MC3T3E1细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）常规贴壁生长，传代培养于含10%胎牛血清、100Ku/L青霉素和100mg/L链霉素的α-MEM培养液中(含核糖核酸和脱氧核糖核酸，1000mg/L D-葡萄糖，292mg/L L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，2200mg/L碳酸氢钠，pH值7.0-7.4。杭州吉诺生物医药技术有限公司，货号GNM11900)，37℃、5%CO₂饱和湿度的细胞培养箱中孵育，2d换液，3d传代1次。

（2）细胞增殖活性实验（MTT法）：取对数生长期MC3T3E1细胞，经消化、培养液混悬，计数后按2×10⁴/ml接种于96孔培养板，放回培养箱中37℃、5%CO₂饱和湿度下孵育过夜。将实施例8制备的各组含药血清（组2～组11）与空白对照组血清（组1）分别用无血清α-MEM培养液稀释使每孔中血清体积终浓度为2%，同时设立不含细胞的α-MEM培养液对照孔。将培养板放回培养箱中37℃、5%CO₂饱和湿度下孵育48h后弃去各孔培养液，小心用PBS洗涤细胞一次，分别加入100μL含0.5mg/ml噻唑兰的无血清α-MEM培养液，放回培养箱中37℃、5%CO₂饱和湿度下孵育4h，4℃终止反应，小心弃去上层清液，每孔加150μL DMSO，振荡15min，490nm下测定吸光度（OD），根据公式（1）计算成骨细胞净增殖率。

（3）实验结果：由图5可知，本发明中药萃取物，即SFEI低、中、高剂量组含药血清促进MC3T3E1细胞增殖率分别为空白对照组的(101.72±4.88)%、（125.97±7.41）%与（113.67±6.04）%，中剂量和高剂量组与空白对照组相比具有显著性差异（P<0.05）。本发明中药萃取物，即SFEII低、中、高剂量组促进MC3T3E1细胞增殖率分别为空白对照组的(121.22±7.26)%、（116.09±6.38）%与（115.89±7.11）%，各剂量组与空白对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）。中药醇-水提取物低、中、高剂量组其中低剂量组与中剂量组与空白对照组相比促进原代成骨细胞增殖率分别为(107.42±5.98)%、（108.70±5.77）%与（111.82±6.23）%，高剂量组与空白对照组相比有显著性差异（P<0.05）。其中SFEI中剂量组、SFEII低剂量组含药血清促MC3T3E1细胞增殖作用显著强于中药醇-水提取物相应剂量组含药血清（P<0.05）。

实施例11中药萃取物、中药醇-水提取物含药血清增强小鼠成骨前体细胞MC3T3E1碱性磷酸酶活性实验（pNPP法）

（1）实验方法：取对数生长期MC3T3E1细胞，经消化、培养液混悬，计数后按2×10⁴/ml接种于96孔培养板，放回培养箱中37℃、5%CO₂饱和湿度下孵育过夜。将实施例8制备的各组含药血清（组2～组11）与空白对照组（组1）血清分别用无血清α-MEM培养液稀释使每孔中血清体积终浓度为2%，同时设立不含细胞的α-MEM培养液对照孔。将培养板放回培养箱中分别于37℃、5%CO₂饱和湿度下孵育48h后弃去各孔培养液，小心用PBS洗涤细胞一次，按碱性磷酸酶检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，货号P0321）要求操作，同时按试剂盒要求制作对羟基硝基酚对照品孔，在405nm测定各孔吸光度。按对羟基硝基酚对照品浓度对吸光值做线性回归，得回归方程y=0.025x+0.0129（r=0.9998），x为对羟基硝基酚对照品浓度，y为吸光值。

将各测定孔吸光值代入回归方程，以产生1微摩尔对羟基硝基酚所需的碱性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位（IU）计算各孔碱性磷酸酶活性（IU）。

（2）实验结果：由图6可知，本发明中药萃取物，即SFEI低、中、高剂量组含药血清处理MC3T3E1细胞48hr后胞浆碱性磷酸酶活性分别为（8.56±1.03）IU、（24.41±2.68）IU与（13.37±1.60）IU，与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）。本发明中药萃取物，即SFEII低、中、高剂量组含药血清处理MC3T3E1细胞48hr后胞浆碱性磷酸酶活性分别为（24.38±3.71）IU、（16.65±1.67）IU与（14.27±1.57）IU，与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）。中药醇-水提取物低、中、高剂量组含药血清处理MC3T3E1细胞48hr后胞浆碱性磷酸酶活性分别为（9.97±1.10）IU、（14.15±1.70）IU与（11.80±1.30）IU，与对照组相比均具有显著性差异（P<0.05）。其中SFEI中、高剂量组及SFEII低、中、高剂量组含药血清促MC3T3E1细胞碱性磷酸酶活性作用显著强于中药醇-水提取物相应剂量组含药血清（P<0.05）。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种中药萃取物的制备方法，其特征在于所述方法为：将熟地5～8份、杜仲2～5份、附子5～8份、枸杞2～5份、肉桂3～5份、山茱萸1～3份、桃仁3～5份、红花1～3份、山药2～5份和甘草3～5份分别粉碎后混合均匀，制成中药组合物粉末，将中药组合物粉末置于超临界流体萃取仪中，在萃取釜压力1～100Mpa、萃取釜温度1～100℃、分离器压力1～100Mpa、分离器温度1～100℃的条件下，以二氧化碳为介质进行超临界流体萃取0.1～10小时，从分离器中得到中药萃取物SFEI；然后再在萃取釜压力1～100Mpa、萃取釜温度1～100℃、分离器压力1～100Mpa、分离器温度1～100℃的条件下，以二氧化碳与无水乙醇的混合物为介质进行超临界流体萃取0.1～10小时，从分离器中得到中药萃取物SFEII；所述混合物中无水乙醇质量终浓度为0.1～10%。

2.如权利要求1所述中药萃取物的制备方法，其特征在于，所述萃取物SFEI制备过程中，萃取釜压力23～38Mpa、萃取釜温度38～44℃、分离器压力7～12Mpa、分离器温度50～65℃，萃取时间为2～4小时。

3.如权利要求1或2所述中药萃取物的制备方法，其特征在于，所述中药萃取物SFEI制备过程中，萃取釜压力23Mpa、萃取釜温度38℃、分离器压力7Mpa、分离器温度50℃，萃取时间为4小时。

4.如权利要求1所述中药萃取物的制备方法，其特征在于，所述中药萃取物SFEII制备过程中，萃取釜压力25～40Mpa、萃取釜温度38～45℃、分离器压力6～15Mpa、分离器温度45～55℃，萃取时间为4～6小时，以二氧化碳与无水乙醇混合物为介质，所述混合物中无水乙醇质量终浓度为0.1～10%。

5.如权利要求1或4所述中药萃取物的制备方法，其特征在于，所述中药萃取物SFEII制备过程中，萃取釜压力25Mpa、萃取釜温度38℃、分离器压力6Mpa、分离器温度45℃，萃取时间为4小时，以二氧化碳与无水乙醇的混合物为介质，所述混合物中无水乙醇质量终浓度为2%。

6.如权利要求1所述中药萃取物的制备方法，其特征在于，所述中药组合物粉末是将熟地6份、杜仲4份、附子6份、枸杞4份、肉桂4份、山茱萸2份、桃仁4份、红花2份、山药4份和甘草4份分别粉碎后混合而制成。