CN105705510B - Hcv聚合酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供式：(I)的化合物，其中B为选自基团(a)至(d)的核碱基，并且其他变量在权利要求中定义，其用于治疗或预防丙型肝炎病毒感染，以及相关的方面。

Description

HCV聚合酶抑制剂
技术领域
本发明涉及核苷衍生物，所述核苷衍生物为丙型肝炎病毒(HCV)的聚合酶抑制剂。本发明还涉及核苷衍生物的前药，包含其的组合物，以及其用于治疗或预防HCV感染的方法。
发明背景
HCV是单链正义RNA病毒，属于病毒的黄病毒(Flaviviridae)科、肝炎病毒属。RNA多基因的NS5B区域编码RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，其对于病毒复制是至关重要的。在最初的急性感染后，由于HCV优先在肝细胞中复制而不直接引起细胞病变，大多数感染的个体发展为慢性肝炎。特别地，缺乏有力的T淋巴细胞响应和高病毒突变倾向似乎促进了高比率的慢性感染。慢性肝炎可以进展为肝纤维化，导致肝硬化、晚期肝病和HCC(肝细胞癌)，使其成为肝移植的主要原因。
存在六种主要的HCV基因型和超过50种的亚型，其地理分布不同。 HCV基因型1是欧洲和美国的主要基因型。HCV的广泛的遗传异质性有重要的诊断和临床含义，也许可以解释在疫苗开发中的困难和对目前的治疗缺乏响应。
HCV的传播可通过与受污染的血液或血液制品接触，例如在输血或使用静脉药物后发生。用于血液筛选的诊断测试的引入导致输血后HCV发生率呈下降的趋势。然而，鉴于向晚期肝病的缓慢进展，现有的感染在数十年内将持续呈现严重的医学和经济负担。
第一代HCV治疗基于(聚乙二醇化)干扰素-α(IFN-α)与利巴韦林的联合。该联合治疗在超过40％的基因型1病毒感染的患者和约80％的基因型 2和3感染的患者中产生持续的病毒学响应。除对HCV基因型1有限的效力以外，联合治疗有明显的副作用，在许多患者中耐受性差。主要副作用包括流感样症状、血液学异常和神经精神病症状。第二代HCV治疗增加了HCV 蛋白酶抑制剂特立拉韦(telepravir)或波普瑞韦(boceprevir)，使得治疗时间缩短，但产生明显更多的严重副作用。通过引入蛋白酶抑制剂西米普韦 (simeprevir)和HCV聚合酶抑制剂索非布韦(sofosbuvir)能够在治疗中取得重要改进。这些最初与干扰素和利巴韦林共同给予，但最近西米普韦 (WO2007/014926)和索非布韦(WO2008/121634)的共给予已经实现无干扰素和无利巴韦林的HCV治疗，其具有进一步减少的治疗时间和显著减少的副作用。
核苷/核苷酸HCV聚合酶抑制剂如索非布韦的优点是其倾向于针对几种 HCV基因型都有活性。例如，索非布韦已经由FDA和EMA批准用于治疗 HCV基因型1和4。然而，在Lawitz等人，N.Eng.J.Med.2013；368:1878-87 报导的分裂生殖期III临床试验中，注意到“在索非布韦–利巴韦林组中的响应速率在具有基因型3感染的患者中比在具有基因型2感染的患者中更低 (56％相对于97％)”。因此，需要更有效、方便和更好耐受的治疗。
HIV药物，特别是HIV蛋白酶抑制剂的经验已教导次优的药代动力学和复合给药策略快速导致意外的依从失败(compliance failure)。这进而意味着在HIV策略中的各种药物的24小时谷浓度(最低血浆浓度)在白天的大部分时间频繁地降至IC90或ED90阈值以下。认为至少IC50，和更实际的是 IC90或ED90的24小时谷水平对减缓药物逃逸突变体(drugescape mutant) 的发展是必要的。实现必需的药代动力学和药物代谢以得到这样的谷水平对药物设计提出了严峻的挑战。
NS5B RdRp对单链正义HCV RNA基因组的复制是绝对必要的，这使其成为抗病毒化合物开发的有吸引力的靶标。有两大类NS5B抑制剂：非核苷抑制剂(NNI)和核苷类似物。NNI结合到蛋白的变构区域，而核苷抑制剂合成代谢为(anabolize)相应的核苷酸并充当聚合酶的供选择的底物。随后形成的核苷酸掺入新生RNA聚合物链并且可以终止该聚合物链的生长。目前，NS5B的核苷和非核苷抑制剂均是已知的。
如上所述，核苷抑制剂的抑制机制涉及将核苷磷酸化为相应的三磷酸酯。磷酸化通常由宿主细胞激酶介导，并且对具有作为NS5B聚合酶的供选择的底物的活性的核苷是绝对必要条件。通常，第一磷酸化步骤，即核苷转化为核苷5’-单磷酸酯是限速步骤。随后的单磷酸酯转化为二-和三-磷酸酯通常容易进行并且通常不限制速率。提高核苷三磷酸酯生产的策略是使用单磷酸酯的细胞可透过的核苷前药，即携带掩蔽的磷酸酯部分，“前药部分”的核苷，该前药易受细胞内的酶活化的影响，产生核苷单磷酸酯。随后如此形成的单磷酸酯通过细胞激酶转化为活性三磷酸酯。
提供潜在的前药的活性化合物的化学修饰产生全新的分子实体，其可能显示不希望的物理、化学和生物特性，因此，最佳前药的确定仍然是不确定的和挑战性的任务。
需要这样的HCV抑制剂，其可以克服目前HCV疗法的缺点，如副作用，例如毒性，有限的功效，缺少泛基因型覆盖，出现耐药性和依从失败，以及提高持续的病毒响应。
本发明提供新的HCV抑制化合物，其具有涉及以下参数中一个或多个的有用的特性：抗病毒功效；泛基因型覆盖；抗性发展的有利情况；无毒性和基因毒性；有利的药代动力学和药效学；和易于配制和给予。技术人员将理解本发明的HCV抑制化合物不需要在每方面证明比所有已知化合物都具有改进，而是可以提供特性的平衡，其组合的特性意味着HCV抑制化合物是有价值的供选择的药物。
本发明的化合物还可以由于其缺乏针对其他病毒，特别是针对HIV的活性，即是选择性的事实而吸引人。HIV感染的患者通常遭受如HCV的合并感染。使用也抑制HIV的HCV抑制剂治疗这样的患者可能导致出现耐药性 HIV菌株。
发明的描述
在一个方面，本发明提供了式I表示的化合物或其药学上可接受的盐和 /或溶剂化物：
其中：
B为选自基团(a)至(d)的核碱基：
其中Y为N或-C(R19)-；
R1为H、C(＝O)R30、C(＝O)CHR31NH2、CR32R32’OC(＝O)CHR33NH2，或 R1选自基团(i)至(vi)：
R2为H、C(＝O)R30、C(＝O)CHR31NH2、CR32R32’OC(＝O)CHR33NH2或 CR32R32’OC(＝O)R30；或R1和R2一起形成下式的二价连接基团：
R3为OH、C1-C6烷氧基、C3-C7环烷氧基、C3-C7环烷基C1-C3烷氧基、苄氧基、O-(C1-C6亚烷基)-T-R21或NHC(R15)(R15’)C(＝O)R16；
R4、R5、R7和R8各自独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟烷基、卤素、-OR18、-SR18或-N(R18)2；
R6、R9、R10、R11各自独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟烷基、卤素、OR18、SR18、 N(R18)2、-NHC(O)OR18、-NHC(O)N(R18)2、-CN、-NO2、-C(O)R18、 -C(O)OR18、-C(O)N(R18)2和-NHC(O)R18，其中所述C2-C6烯基和所述C2-C6炔基可以任选地被卤素或C3-C5环烷基取代；
R12为H或-(C1-C6亚烷基)-T-R21、苯基、吲哚基或萘基，其中苯基、吲哚基或萘基任选地被1、2或3个取代基取代，所述取代基各自独立地选自卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6卤代烷基、羟基C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷基羰基、C3-C6环烷基羰基C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷氧基、羟基和氨基；
R13为H或-(C1-C6亚烷基)-T-R21；或
R12和R13可以结合以在其连接的氧原子之间形成C2-C4亚烷基，其中所述C2-C4亚烷基任选地被一个C6-C10芳基取代；
R14为H或C1-C6烷基、苯基、萘基或包含1、2或3个杂原子的5至12 元单环或双环杂芳基，所述杂原子独立地选自N、O和S，所述苯基、萘基或杂芳基任选地被1、2或3个R22取代；
R15和R15’各自独立地选自H、C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷基 C1-C3烷基、苯基和苄基，或R15和R15’与其连接的碳原子一起形成C3-C7环亚烷基，其中每个C1-C6烷基任选地被选自卤素、OR18和SR18的基团取代，并且每个C3-C7环烷基、C3-C7环亚烷基、苯基和苄基任选地被一个或两个独立地选自C1-C3烷基、卤素和OR18的基团取代；或
R15’为H，并且R15和R24与其连接的原子一起形成5元环；
R16为H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷基C1-C3烷基、苄基、苯基或金刚烷基，其任一个任选地被1、2或3个各自独立地选自卤素、OR18和N(R18)2的基团取代；
每个R17独立地选自H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6卤代烷基、C3-C7环烷基、C3-C7环烯基、苯基和苄基；或
两个R17与其连接的氮原子形成3-7元杂环或5-6元杂芳基环，所述环任选地被一个或两个独立地选自以下的基团取代：C1-C3烷基、卤素、C1-C3卤代烷基、氨基、C1-C3烷基氨基、(C1-C3烷基)2氨基；
每个R18独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基或C3-C7环烷基；
R19为H、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟烷基、卤素、-OR18或N(R18)2；
每个R20独立地为H、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C3-C7环烷基、 C1-C6羟烷基或C3-C7环烷基C1-C3烷基；
每个R21独立地为H、C1-C24烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6羟烷基、 C2-C6烯基、C2-C6炔基、C3-C7环烷基或C3-C7环烯基；
每个R22独立地选自卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6卤代烷基、苯基、羟基C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C1-C6烷基羰基、C3-C6环烷基羰基、羧基C1-C6烷基、氧代基(需要构成黄酮)、OR20、SR20、N(R20)2、CN、NO2、 C(O)OR20、C(O)N(R20)2和NHC(O)R20，或连接到邻近环碳原子的任意两个 R22基团可以结合以形成-O-R23-O-；
R23为-[C(R33)2]n-；
R24为H，或R24和R15与其连接的原子一起形成5元环；
每个R30独立地选自C1-C6烷基和C1-C6烷氧基；
每个R31独立地选自H、C1-C6烷基、C3-C7环烷基和苄基；
每个R32和R32’独立地选自H和C1-C3烷基；
每个R33独立地选自H和C1-C6烷基；
U为O或S；
每个T独立地为-S-、-O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-SC(S)-、-C(S)S-、-OC(O)-、 -C(O)O-和-OC(O)O-。
式I的化合物可以任选地以药学上可接受的盐和/或溶剂化物的形式提供。在一个实施方案中，本发明的化合物以药学上可接受的盐的形式提供。在第二个实施方案中，本发明的化合物以药学上可接受的溶剂化物的形式提供。在第三个实施方案中，本发明的化合物以其游离形式提供。
在一个方面，本发明包括前药。在典型的构型中，前药基团位于糖部分的3’-和/或5’-位。出于该目的的适合的基团包括：酯，即式OC(＝O)R30的基团，其中R30通常为C1-C4烷基；和氨基酸酯，即式OC(＝O)CHR31NH2的基团，其中R31通常为C1-C6烷基。另外的适合的前药基团是磷酸酯前药，即在体内转化为磷酸酯的前药基团。
前药基团(多个前药基团)可以存在于核碱基B上。
在本发明的一个实施方案中，B为基团(a)。通常，在该实施方案中，基团B为式(a’)：
其中R5为H或F，并且R6为N(R18)2或NHCOC1-C6烷基。通常，R6为 NH2。
在本发明的另一个典型的实施方案中，B为基团(a”)：
其中R6为N(R18)2或NHCOC1-C6烷基。通常，R6为NH2。
在本发明的第二个实施方案中，B为基团(b)。通常，在该实施方案中，基团B为式b’：
其中R8为H或F。通常，R8为H。
在本发明的第三个实施方案中，B为基团(c’)。
其中R9为OH或C1-C6烷氧基，并且R10为NH2或NHCOC1-C6烷基。
在本发明的第四个实施方案中，B为基团(d)。
在本发明的一个实施方案中，R2为H。
在本发明的供选择的实施方案中，R2为C(＝O)R30、C(＝O)CHR31NH2或 OCR32R32’OC(＝O)CHR33NH2。
在本发明的实施方案中，其中R2为C(＝O)R30，R30通常为甲基、异丙基、异丁基或仲丁基，尤其是异丙基。在其中R2为C(＝O)CHR31NH2的本发明的实施方案中，R31适合地对应于天然或非天然氨基酸的侧链，如甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)或苯丙氨酸(Phe)的侧链，即R31分别为H、甲基、异丙基、异丁基或苄基，尤其是异丙基。特别关注的是氨基酸的酯部分，其中R31连接的不对称碳原子处的构型为L-氨基酸，特别是L-Ala、L-Val、L-Ile和L-Phe，尤其是L-缬氨酸的构型，即R31为异丙基。在其中R2为OCR32R32’OC(＝O)CHR33NH2的本发明的实施方案中，R32和R32’可以是相同或不同的，并且通常选自H和甲基，其中R33通常为C1-C3烷基。
在本发明的一个实施方案中，R1为H。
在本发明的供选择的实施方案中，R1为前药部分。适合地，根据这些实施方案，R1为C(＝O)R30、C(＝O)CHR31NH2或OCR32R32’OC(＝O)CHR33NH2。
在其中R1为C(＝O)R30的本发明的实施方案中，R30通常为甲基、异丙基、异丁基或仲丁基，尤其是异丙基。在其中R1为C(＝O)CHR31NH2的本发明的实施方案中，R31适合地对应于天然或非天然氨基酸的侧链，如甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)或苯丙氨酸(Phe)的侧链，即R31分别为H、甲基、异丙基、异丁基或苄基，尤其是异丙基。特别关注的是氨基酸的酯部分，其中R31连接的不对称碳原子处的构型为L-氨基酸，特别是L-Ala、L-Val、L-Ile和L-Phe，尤其是L-缬氨酸的构型，即R31为异丙基。R31还可以是仲丁基。在其中R1为OCR32R32’OC(＝O)CHR33NH2的本发明的实施方案中，R32和R32’可以相同或不同，并且通常选自H和甲基，其中R33通常为H或C1-C3烷基。
在本发明的一个实施方案中，R1和R2一起形成下式的二价连接基团：
其中R3如上定义，从而提供下式的化合物：
通常，根据该实施方案，U为O。
R3的代表性构型包括C1-C6烷氧基和NHC(R15)(R15’)C(＝O)R16。
通常，R3为C1-C3烷氧基，如异丙氧基或甲氧基。
R3的另一个典型构型为NHC(R15)(R15’)C(＝O)R16。
通常，在该构型中，R15和R15’各自独立地选自H、C1-C6烷基和苄基。通常，R15和R15’之一为H且另一个为氨基酸的侧链，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的侧链，即分别为甲基、异丙基、异丁基或1-甲基丙-1- 基。在优选的构型中，R15和R15’之一为H且另一个为甲基。
R16通常为直链或支链C1-C6烷基或C3-C7环烷基。通常，R16为异丙基。
R3的代表性值为NHCH(C1-C6烷基)C(＝O)C1-C3烷基。
R3的供选择的构型为O-(C1-C6亚烷基)-T-R21，其中C1-C6亚烷基部分为直链或支链的。
在式(I)的化合物的一个实施方案中，R1为基团(i)：
优选地，在根据该实施方案的化合物中，U为O。
在基团(i)的一个构型中，R13为H和R12为(C1-C6亚烷基)-T-R21，通常，在该构型中，R12为乙烯，T为O和R21为C12-C19，从而形成结构(i-a)：
其中n为11至23的整数，如11至18。优选地，n为15至16的整数。
通常，在基团(i-a)中，U为O。
通常，在式(I)的化合物中，其中R1为基团(i-a)，R2为H。
在基团(i)的供选择的构型中，R12和R13结合以在其连接的氧原子之间形成任选取代的C2-C4亚烷基，从而形成环状磷酸酯。通常，亚烷基为C3亚烷基，从而提供结构(i-b)：
通常，U为O并且Ar为苯基，其任选地被一个或两个独立地选自以下的取代基取代：卤素、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基和氰基，通常为卤素。Ar的代表性实例包括苯基和在间位被氯取代的苯基。
通常，在式(I)的化合物中，其中R1为基团(i-b)，R2为H。
在基团(i)的另一个构型中，R13为(C1-C6亚烷基)-T-R21，从而提供基团(i-c)：
其中C1-C6亚烷基部分为直链或支链的。在基团(i-c)中的C1-C6亚烷基部分的非限定性实例包括亚甲基、亚乙基、亚异丙基和二甲基亚甲基。
通常，在基团(i-c)中，U为O。
在基团(i-c)的典型的亚组中，U为O，C1-C6亚烷基为亚甲基且T为 -C(O)O-，或C1-C6亚烷基为亚乙基且T为-C(O)S-，从而提供分别具有部分结构(i-c1)或(i-c2)中的任一个的式I的化合物：
其中R21为C1-C6烷基，如叔丁基。在这些结构中，R12通常是与R13相同的基团，或供选择地，R12如上定义。
通常，在式(I)的化合物中，其中R1为基团(i-c)，R2为H。
在式(I)的化合物的另外的实施方案中，R1为基团(iii)，即R1与其连接的氧原子一起形成三磷酸酯或三硫代磷酸酯，从而提供具有以下结构的化合物或其药学上可接受的盐，如钾盐或钠盐：
在根据这些实施方案的优选的构型中，U为O。
通常，根据该实施方案，R2为H。
在式(I)的化合物的另外的实施方案中，R1为基团(iv)：
在式(I)的典型的化合物中，其中R1为基团(iv)且R15和R15’之一为 H，立体化学如以下部分式中所示：
U通常为O。
R24通常为H。
R14的代表性实例包括苯基，其任选地被一个或两个R22取代，其中每个 R22独立地选自卤素、C1-C6烷基、C2-C6烯基和OR20且R20为C1-C6烷基；或 R14为萘基。
通常，根据该实施方案，U为O，R24为H且R14为任选地被1、2或3 个R22取代的苯基，从而提供基团(iv-a)：
在基团(iv-a)的典型构型中，苯基被一个或两个卤素取代，如氯或氟。
在基团(iv-a)的另外的代表性构型中，苯基被一个R22取代，其选自 C3-C6环烷基、C1-C6烷基羰基或C3-C6环烷基羰基，该环烷基部分任选地被 C1-C3烷基取代。
在基团(iv-a)的另外的代表性构型中，苯基被两个R22取代，其中一个 R22选自C3-C6环烷基、C1-C6烷基羰基或C3-C6环烷基羰基，环烷基部分任选地被C1-C3烷基取代，并且另一个R22为甲基、环丙基、氟或氯。
R14的另一个代表性值为苯基，其被位于邻近碳原子上的两个R22取代，并且该两个R22结合以形成-O-CH2-O-，从而形成以下部分结构：
R14的另一个代表性构型为苯基，其被R22取代，且R22为羧基C1-C6烷基，以及R24为H。该构型的代表性实例示出在式(iv-b)中
通常，在基团(iv-b)中，U为O。
在基团(iv)的一个构型中，R14为与4元杂环稠合的苯基，所述环被酮基和苯基取代。这样的结构通常如以下部分式中所示：
如：
R14的另外的代表性值包括吲哚基，通常为5-吲哚基。
在一个实施方案中，R14为杂芳基，所述杂芳基为5至12元单环或双环芳环，其包含1、2或3个独立地选自N、O和S的杂原子，所述杂芳基任选地被1、2或3个R22取代。通常，在该实施方案中，每个R22独立地选自 C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷氧基、羟基和氨基。
根据该实施方案的R14的代表性值为任选地取代的吡啶基。
根据该实施方案的典型的化合物是其中U为O且R14为吡啶基的那些，所述吡啶基任选地被一个或两个各自独立地选自卤素、C1-C6卤代烷基、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C1-C6烷氧基、羟基、氨基的取代基取代。
通常在式(I)的化合物中，其中R1为基团(iv)或其任何亚组，部分 N(R24)C(R15)(R15')-C(＝O)OR16形成氨基酸酯残基，包括天然和非天然氨基酸残基。通常R15和R15'之一为氢，且另一个为氢或C1-C6烷基，如异丙基或异丁基。特别关注的是氨基酸残基，其中R15'为氢，实例为甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)和苯丙氨酸(Phe)残基，即 R15’为H且R15分别为甲基、异丙基、异丁基或苄基。在其中R15'为氢且R15不为氢的化合物中，在不对称碳原子处的构型通常为L-氨基酸，特别是 L-Ala、L-Val、L-Ile和L-Phe的构型。
在基团(iv)的典型构型中，R15和R15’之一为H且另一个为甲基。
在基团(iv)的另外的构型中，R15和R15'与其连接的碳原子一起形成 C3-C7环烷基，例如环丙基或环丁基。
在基团(iv)的典型构型中，R16为C1-C10烷基。
在基团(iv)的一个构型中，R16为C1-C3烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基，优选为异丙基。
在基团(iv)的另外的构型中，R16为C1-C8烷基，如2-乙基丁基、2-戊基、2-丁基、异丁基、叔戊基，优选为2-乙基丁基。
在基团(iv)的另外的构型中，R16为C3-C7环烷基，如环己基。
在式(I)的化合物的一个实施方案中，R1为基团(iv)，其中
U为O
R24为H，
R14为苯基，其被C3-C6环烷基、C1-C6烷基羰基或5-或6-元杂芳基取代，
R15为H，R15’为C1-C3烷基，如甲基、乙基或异丙基，和
R16为C1-C6烷基或C3-C7环烷基，如环丙基、环丁基或环戊基。
在式(I)的化合物的一个实施方案中，R1为基团(iv)，其中
R24为H，
R14为任选地取代的苯基或萘基；
R15和R15’各自独立地为H或C1-C6烷基，和
R16为C1-C8烷基或C3-C7环烷基。
在根据该实施方案的R1的典型构型中，
R24为H，
R14是任选取代的苯基；
R15和R15’之一为H，且另一个为C1-C3烷基，和
R16为C1-C8烷基。
在基团(iv)的供选择的构型中，R15为H，且R15'和R24与其连接的原子一起形成吡咯烷环，从而提供基团(iv-c)：
通常，在该构型中，U为O，R14为任选取代的苯基且R16为C1-C6烷基或C3-C6环烷基。
通常，在式(I)的化合物中，其中R1为基团(iv)或其任何亚组，R2为H。
在式(I)的化合物的另一个实施方案中，R1为基团(v)：
通常，在基团(v)中，U为O。
根据该实施方案，连接到P原子的两个N-连接的取代基是相同的，即两个R15部分是相同的，两个R15’部分是相同的，并且两个R16部分是相同的。
在基团(v)的典型构型中，两个R15为H或C1-C6烷基(如乙基、正丙基、异丙基、正丁基或异丁基)，两个R15’为H，并且两个R16为C1-C6烷基 (如甲基、乙基或异丙基)或C3-C7环烷基(如环丙基、环丁基或环戊基)。
在基团(v)的一个构型中，R16为C1-C3烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基，优选为异丙基。
在基团(v)的另一个构型中，R16为C1-C8烷基，如2-乙基丁基、2-戊基、2-丁基、异丁基、叔戊基，优选为2-乙基丁基。
在基团(v)的另一个构型中，R16为C3-C7环烷基，如环己基。
在式(I)的化合物的另外的实施方案中，R1为基团(vi)：
通常，在基团(vi)中，U为O。
在基团(vi)的一个构型中，R13为-(C1-C6亚烷基)-T-R21，从而提供结构 (vi-a)：
其中C1-C6亚烷基部分是直链或支链的。基团(vi-a)中的C1-C6亚烷基部分的非限定性实例包括亚甲基、亚乙基、亚异丙基和二甲基亚甲基。
在亚组vi-a的一个构型中，R21为1-羟基-2-甲基丙烷-2-基，即下式的基团：
通常，在基团(vi-a)中，U为O。
在基团(vi-a)的典型亚组中，C1-C6亚烷基是任选地被一个或两个C1-C3烷基取代的亚甲基，并且T为-OC(O)O-，从而提供具有部分结构(vi-b)的式I的化合物：
其中R32和R32’独立地为H或C1-C3烷基。通常，R32和R32’之一为H并且另一个为H、甲基或异丙基。供选择地，R32和R32’均为甲基。
通常，在基团(vi-b)中，U为O。
R21的典型实例包括任选地取代的C1-C6烷基，如甲基、乙基、丙基和异丙基。
通常，R17和R17’之一为H并且另一个为苯基或苄基，优选为苄基。
通常，在式(I)的化合物中，其中R1为基团(vi)或其任何亚组，R2为H。
在基团(vi-a)的另外的亚组中，U为O，C1-C6亚烷基为亚乙基且T为 -C(O)S-，从而提供具有以下部分结构的式I的化合物：
R21的典型实例包括任选取代的C1-C6烷基，尤其是支链C1-C6烷基和 C1-C6羟烷基。
通常，R17和R17’之一为H且另一个为苯基或苄基，优选为苄基。
通常，在式(I)的化合物中，其中R1为基团(vi)或其任何亚组，R2为H。
因此，提供了用作为药物的式I的化合物，特别是用于治疗或预防HCV 感染，尤其是治疗HCV感染。
另外提供了式I的化合物在制备药物中的用途，特别是用于治疗或预防 HCV感染的药物，尤其是用于治疗HCV感染的药物。
另外，提供了用于治疗或预防HCV感染的方法，包括给予式I的化合物，特别是用于治疗HCV感染的方法，包括给予式I的化合物。
在另外的方面，本发明涉及本发明的化合物用于抑制HCV的用途。
另外，提供了式I的化合物用于治疗或预防HCV感染，如治疗或预防人的HCV感染的用途。在一个优选的方面，本发明提供了式I的化合物用于治疗HCV感染，如治疗人的HCV感染的用途。
此外，本发明涉及用于制备式I的化合物的方法，涉及在制备式I的化合物中使用的新的中间体和涉及这样的中间体的制备。
在另外的方面，本发明提供了药物组合物，其包含式I的化合物连同药学上可接受的佐剂、稀释剂、赋形剂或载体。药物组合物将通常包含抗病毒有效量(例如，对于人)的式I的化合物，但是当预期与其他药剂组合或以多剂量使用时，亚治疗量的式I的化合物仍然可以是有价值的。
技术人员将认识到提及的式I的化合物将包括本文所述的式I的化合物的任何亚组。
在根据本发明的治疗或预防的上下文中，HCV基因型包括主要的HCV 基因型，即基因型1a、1b、2a、3a、4a、5a和6a。本发明还提供了用于治疗或预防HCV感染的方法。通常，本发明提供了用于治疗HCV感染的方法。
在根据本发明的治疗或预防的上下文中，代表性的HCV基因型包括基因型1b(在欧洲流行)和1a(在北美流行)。本发明还提供了用于治疗或预防HCV感染，特别是基因型1a或1b感染的方法。通常，本发明提供用于治疗HCV感染的方法，特别是基因型1a或1b感染的方法。
在根据本发明的治疗或预防的上下文中，另外的代表性基因型包括基因型3a，如野生型基因型3a和基因型3a的突变株，例如S282T和L159/320F 突变体。通常，本发明提供了用于治疗HCV感染，特别是基因型3a，如野生型基因型3a和基因型3a的突变株，例如S282T和L159/320F突变体感染的方法。
本发明还涉及由基因型2a、4a、5a、6a引起的HCV感染的治疗或预防。本发明还提供了用于治疗或预防基因型2a、4a、5a、6a的HCV感染的方法。
考虑到前几代核苷酸的性能较差，本发明的化合物针对基因型3的良好活性是值得注意的。优选地，本发明的组合物具有针对6种基因型中每种的泛基因型覆盖，也就是说本发明的化合物的EC50在基因型之间没有明显差异，从而简化了治疗。
本发明的化合物具有几个手性中心，并且可以以光学活性和外消旋形式存在并被分离。一些化合物可以显示多晶型。应理解本文提供的化合物的任何外消旋、光学活性、非对映异构、多晶型或立体异构形式或其混合物在本发明的范围内。这样的化合物的绝对构型可以使用本领域已知的方法确定，例如X射线衍射或NMR和/或来自已知立体化学的起始原料的提示和/或立体选择性合成方法。根据本发明的药物组合物将优选地包含指定的立体异构体的基本上立体异构纯的制剂。
大多数氨基酸是手性的，并且可以作为单独的对映异构体存在。其被称为L-或D-氨基酸，其中L-对映异构体是天然存在的对映异构体。因此，氨基酸的纯对映异构体是易得的，并且当氨基酸用于本发明的化合物的合成时，手性氨基酸的使用将提供手性产物。
如本文所提及的化合物和中间体的纯立体异构形式定义为基本上不含所述化合物或中间体的相同基本分子结构的其他对映异构或非对映异构形式的异构体。具体地，术语“立体异构纯”涉及具有至少80％的立体异构过量(即最少90％的一种异构体和最多10％的其他可能的异构体)至高达100％的立体异构过量(即100％的一种异构体且没有另一种)的化合物或中间体，更具体地，具有90％至高达100％的立体异构过量的化合物或中间体，甚至更具体地具有94％至高达100％的立体异构过量，最具体地具有97％至高达 100％的立体异构过量的化合物或中间体。术语“对映异构纯”和“非对映异构纯”应以类似方式理解，但随后分别考虑到所关注的混合物的对映异构过量和非对映异构过量。
本发明的化合物和中间体的纯立体异构形式可以通过使用本领域熟知的过程获得。例如，对映异构体可以通过拆分外消旋混合物而彼此分离，即通过与光学活性酸或碱反应实现非对映异构盐的形成，随后对形成的非对映异构盐选择性结晶。这样的酸的实例为酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二甲苯酰酒石酸和樟脑磺酸。供选择地，对映异构体可以通过使用手性固定相的色谱技术来分离。纯立体化学异构形式还可以通过由立体化学纯形式的适合的起始原料合成来获得，只要通过手性合成或通过使用手性助剂立体特异性地发生反应。如果希望具体的立体异构体，则该化合物的制备优选使用立体特异性方法进行。这些方法将有利地采用对映异构纯的起始原料。
本发明的化合物的非对映异构外消旋体可以通过常规方法分离。可以有利地被采用的适当的物理分离方法为例如，选择性结晶和色谱，例如柱色谱。
当本发明的化合物中存在磷原子时，该磷原子可以代表手性中心。在该中心的手性根据Cahn–Ingold–Prelog优先规则被指定为“R”或“S”。当未指出手性时，考虑其意味着已包括R-和S-异构体两者，以及两者的混合物，即非对映异构混合物。
在本发明的优选的实施方案中，包括在磷原子处具有S-构型的立体异构体。这些立体异构体指定为SP。
在本发明的其他实施方案中，包括在磷原子处具有R-构型的立体异构体。这些立体异构体指定为RP。
在本发明的其他实施方案中，包括非对映异构混合物，即在磷原子处具有R-或S-构型的化合物的混合物。
本发明还包括同位素标记的式I的化合物或式I的任何亚组，其中一个或多个原子被该原子的同位素替代，即与通常天然存在的原子(多种原子) 具有相同的原子序数但具有不同的原子质量的原子。可以掺入式I的化合物或式I的任何亚组的同位素的实例包括但不限于氢的同位素，如2H和3H(分别地，氘还表示为D，氚还表示为T)，碳如11C、13C和14C，氮如13N和15N，氧如15O、17O和18O，磷如31P和32P，硫如35S，氟如18F，氯如36Cl，溴如75Br、76Br、77Br和82Br，以及碘如123I、124I、125I和131I。对同位素标记的化合物中包含的同位素的选择将取决于该化合物的具体应用。例如，对于药物或底物组织分布分析，其中掺入放射性同位素如3H或14C的化合物将通常是最有用的。对于放射性成像应用，例如，正电子发射断层摄影(PET)，正电子发射同位素如11C、18F、13N或15O将是有用的。更重的同位素，如氘(即2H)的掺入可以提供比式I的化合物或式I的任何亚组更高的代谢稳定性，这可以实现例如化合物的体内半衰期延长或剂量要求降低。
同位素标记的式I的化合物或式I的任何亚组可以通过使用合适的同位素标记的试剂或起始原料代替相应的非同位素标记的试剂或起始材料，通过与本文下文中的方案和/或实施例中描述的那些类似的方法制备，或通过本领域技术人员已知的常规技术制备。
药学上可接受的加成盐包括式I的化合物的有治疗活性的无毒酸和碱加成盐形式。关注的是式I的化合物的游离形式，即非盐形式。
药学上可接受的酸加成盐可以方便地通过使用这样的合适的酸处理碱形式获得。合适的酸包括例如，无机酸，如氢卤酸，例如，盐酸或氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸和类似的酸；或有机酸，例如，乙酸，丙酸，羟基乙酸，乳酸，丙酮酸，草酸(即乙二酸)，丙二酸，琥珀酸(即丁二酸)，马来酸，富马酸，苹果酸(即羟基丁二酸)，酒石酸，柠檬酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，对甲苯磺酸，环己基氨基磺酸，水杨酸，对氨基水杨酸，扑酸和类似的酸。相反地，所述盐形式可以通过使用合适的碱处理转化成游离碱形式。
包含酸质子的式I的化合物还可以通过使用合适的有机或无机碱处理转化成其无毒金属或胺加成盐形式。合适的碱盐形式包括，例如，铵盐，碱金属和碱土金属盐，例如，锂、钠、钾、镁、钙盐等，与有机碱的盐，例如苄星青霉素(benzathine)、N-甲基-D-葡胺、海巴明青霉素(hydrabamine)盐，和具有氨基酸，例如，精氨酸、赖氨酸等的盐。
一些式I的化合物还可以以其互变异构形式存在。例如，酰胺基 (-C(＝O)-NH-)的互变异构形式为亚氨基醇(-C(OH)＝N-)，其可以在具有芳香特征的环中变得稳定。这样的形式，虽然在本文表示的结构式中未明确表明，但要包括在本发明的范围内。
除非另有说明，本文所使用的贯穿摘要、说明书和权利要求的术语和措辞将解释为如下文定义的。每个术语的含义在每次出现时是独立的。无论术语单独使用还是与其他术语组合使用，这些定义均适用，除非另有说明。未明确定义的本文使用的术语或措辞将解释为具有本领域使用的其普通含义。化学名、通用名和化学结构可以互换使用以描述相同的结构。如果使用化学结构和化学名两者提及化学化合物并且在结构和名称之间存在分歧时，以结构为准。
“Cm-Cn烷基”本身或在复合表达如Cm-Cn卤代烷基、Cm-Cn烷基羰基、 Cm-Cn烷基胺等中，表示具有指定的碳原子数的直链或支链脂族烃基，例如， C1-C4烷基是指具有1至4个碳原子的烷基。C1-C6烷基具有相应的含义，还包括戊基和己基的所有直链和支链异构体。用于本发明的优选的烷基为 C1-C6烷基，包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基，尤其是C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、正丁基和异丁基。通常优选的是甲基和异丙基。烷基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代的，所述取代基可以相同或不同，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-O-C(＝O)-烷基、-O-C(＝O)-芳基、-O-C(＝O)-环烷基、-C(＝O)OH和 -C(＝O)O-烷基。一般优选的是烷基是未取代的，除非另外指明。
“C2-Cn烯基”表示包含至少一个碳碳双键并具有指定碳原子数的直链或支链脂族烃基，例如C2-C4烯基是指具有2至4个碳原子的烯基；C2-C6烯基是指具有2至6个碳原子的烯基。非限定的烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基和己烯基。烯基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基可以是相同或不同的，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、 -亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、 -O-C(＝O)-烷基、-O-C(＝O)-芳基、-O-C(＝O)-环烷基、-C(＝O)OH和-C(＝O)O- 烷基。一般优选的是烯基是未取代的，除非另外指明。
“C2-Cn炔基”表示包含至少一个碳碳三键且具有指定的碳原子数的直链或支链脂族烃基，例如C2-C4炔基是指具有2至4个碳原子的炔基；C2-C6炔基是指具有2至6个碳原子的炔基。非限定性炔基包括乙炔基、丙炔基、 2-丁炔基和3-甲基丁炔基、戊炔基和己炔基。炔基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基可以是相同或不同的，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、- 亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-O-C(O)- 烷基、-O-C(O)-芳基、-O-C(O)-环烷基、-C(O)OH和-C(O)O-烷基。一般优选的是炔基是未取代的，除非另外指说明。
本文使用的术语“Cm-Cn卤代烷基”表示其中至少一个C原子被卤素取代的Cm-Cn烷基(例如，Cm-Cn卤代烷基可以包含一至三个卤素原子)，优选地被氯或氟取代。典型的卤代烷基为C1-C2卤代烷基，其中卤素适合地表示氟。示例性的卤代烷基包括氟甲基、二氟甲基和三氟甲基。
如本文所使用的术语“Cm-Cn羟烷基”表示其中至少一个C原子被一个羟基取代的Cm-Cn烷基。典型的Cm-Cn羟烷基为其中一个C原子被一个羟基取代的Cm-Cn烷基。示例性的羟烷基包括羟甲基和羟基乙基。
如本文所使用的术语“Cm-Cn氨基烷基”表示其中至少一个C原子被一个氨基取代的Cm-Cn烷基。典型的Cm-Cn氨基烷基为其中一个C原子被一个氨基取代的Cm-Cn烷基。示例性的氨基烷基包括氨基甲基和氨基乙基。
如本文所使用的术语“Cm-Cn亚烷基”表示具有指明的碳原子数的直链或支链二价烷基。用于本发明的优选的Cm-Cn亚烷基是C1-C3亚烷基。亚烷基的非限定性实例包括-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、 -CH(CH3)-和-CH(CH(CH3)2)-。
术语“Me”是指甲基，并且“MeO”是指甲氧基。
术语“Cm-Cn烷基羰基”表示式Cm-Cn烷基-C(＝O)-的基团，其中Cm-Cn烷基部分如以上定义。通常，“Cm-Cn烷基羰基”是C1-C6烷基-C(＝O)-。
“Cm-Cn烷氧基”表示基团Cm-Cn烷基-O-，其中Cm-Cn烷基如上定义。特别关注的是C1-C4烷氧基，其包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、正丁氧基和异丁氧基。通常优选的是甲氧基和异丙氧基。C1-C6烷氧基具有相应的含义，扩展到包括戊氧基和己氧基的所有直链和支链异构体。
术语“Cm-Cn烷氧基羰基”表示式Cm-Cn烷氧基-C(＝O)-的基团，其中Cm-Cn烷氧基部分如上定义。通常，“Cm-Cn烷氧基羰基”是C1-C6烷氧基-C(＝O)-。
术语“氨基”表示基团-NH2。
术语“卤素”表示卤素基团，如氟、氯、溴或碘。通常，卤素基团为氟或氯。
术语“芳基”是指苯基、联苯基或萘基。
术语“杂环烷基”表示包含1-3个独立地选自O、S和N的杂原子的稳定的饱和3-7元单环。在一个实施方案中，稳定的饱和3-7元单环包含1个选自O、S和N的杂原子。在第二个实施方案中，稳定的饱和3-7元单环包含2个独立地选自O、S和N的杂原子。在第三个实施方案中，稳定的饱和 3-7元单环包含3个独立地选自O、S和N的杂原子。包含1-3个独立地选自O、S和N的杂原子的稳定的饱和3-7元单环可以通常为5-7元环，如5 或6元环。杂环烷基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基可以是相同或不同的，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、-亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、 -NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-O-C(O)-烷基、-O-C(O)-芳基、-O-C(O)-环烷基、-C(O)OH和-C(O)O-烷基。通常优选的是杂环烷基是未取代的，除非另外指明。
术语“杂芳基”表示包含1-4个独立地选自O、S和N的杂原子的稳定的单环或双环芳环系统，每个环具有5或6个环原子。在本发明的一个实施方案中，稳定的单环或双环芳环系统包含一个选自O、S和N的杂原子，每个环具有5或6个环原子。在本发明的第二个实施方案中，稳定的单环或双环芳环系统包含两个独立地选自O、S和N的杂原子，每个环具有5或6个环原子。在第三个实施方案中，稳定的单环或双环芳环系统包含三个独立地选自O、S和N的杂原子，每个环具有5或6个环原子。在第四个实施方案中，稳定的单环或双环芳环系统包含四个独立地选自O、S和N的杂原子，每个环具有5或6个环原子。杂芳基的一个实施方案包括黄酮。
术语“C3-Cn环烷基”表示具有指明的碳原子数的环状一价烷基，例如 C3-C7环烷基是指具有3至7个碳原子的环状一价烷基。用于本发明的优选的环烷基为C3-C4烷基，即环丙基和环丁基。环烷基可以是未取代的或被一个或多个取代基取代，所述取代基可以是相同或不同的，每个取代基独立地选自卤素、烯基、炔基、芳基、环烷基、氰基、羟基、-O-烷基、-O-芳基、- 亚烷基-O-烷基、烷硫基、-NH2、-NH(烷基)、-N(烷基)2、-NH(环烷基)、-O-C(O)- 烷基、-O-C(O)-芳基、-O-C(O)-环烷基、-C(O)OH和-C(O)O-烷基。通常优选的是环烷基是未取代的，除非另外指明。
术语“氨基Cm-Cn烷基”表示被氨基取代的如上定义的Cm-Cn烷基，即烷基部分的一个氢原子被NH2-基团替代。通常，“氨基Cm-Cn烷基”是氨基 C1-C6烷基。
术语“氨基Cm-Cn烷基羰基”表示其中烷基部分的一个氢原子被NH2- 基团替代的如上定义的Cm-Cn烷基羰基。通常，“氨基Cm-Cn烷基羰基”为氨基C1-C6烷基羰基。氨基Cm-Cn烷基羰基的实例包括但不限于甘氨酰基： C(＝O)CH2NH2，丙氨酰基：C(＝O)CH(NH2)CH3，缬氨酰基： C＝OCH(NH2)CH(CH3)2，亮氨酰基：C(＝O)CH(NH2)(CH2)3CH3，异亮氨酰基： C(＝O)CH(NH2)CH(CH3)(CH2CH3)和正亮氨酰基：C(＝O)CH(NH2)(CH2)3CH3等。该定义不限于天然存在的氨基酸。
相应地，相关的术语的解释将与以上提供的定义和本技术领域的习惯用法一致。
如本文所使用的，当连接到碳原子时，术语“(＝O)”形成羰基部分。应注意当该原子的原子价允许这样时，该原子可以仅携带氧代基。
术语“单磷酸、二磷酸和三磷酸酯”是指基团：
术语“硫代单磷酸、硫代二磷酸和硫代三磷酸酯”是指基团：
如本文所使用的，在定义中使用的任何分子部分上的基团位置可以在这样的部分的任何位置，只要其是化学稳定的。当存在的任何变量在任何部分中出现多于一次时，每个定义是独立的。
无论何时在本文中使用时，术语“式I的化合物”或“本发明的化合物”或类似术语旨在包括式I的化合物和式I的化合物的亚组，包括可能的立体化学异构形式，及其药学上可接受的盐和溶剂化物。
术语“溶剂化物”涵盖式I的化合物以及其盐能够形成的任何药学上可接受的溶剂化物。这样的溶剂化物例如为水合物，醇化物，例如乙醇化物、丙醇化物等，尤其是水合物。
一般地，用于本申请的化合物的名称使用ChemDraw Ultra 12.0生成。此外，如果结构或结构的部分的立体化学未使用例如粗体或虚线表示，则该结构或结构的部分应解释为包括其所有立体异构体。
通用合成方法
本发明的化合物可以通过各种方法制备，如在以下显示和描述的说明性合成方案中描绘的。使用的起始原料和试剂可得自商业供应商或可以使用本领域技术人员熟知的方法，根据在参考文献中列出的文献的步骤制备。
方案1说明了式I的化合物的合成路线，其中R1和R2为H，并且碱B 为尿嘧啶或衍生化的尿嘧啶，即B为式(b)的基团。
方案1
使用例如三异丙基甲硅烷基(TIPS)基团保护(4S,5R)-4-羟基-5-(羟甲基) 二氢呋喃-2(3H)-酮的羟基，其通过使用TIPS-氯在碱如咪唑等的存在下处理来实现，或可以使用任意其他适合的保护基团如酰基，如乙酰基、苯甲酰基或对氯苯甲酰基或三苯甲基。供选择地，为了使羟基之一能稍后选择性脱保护而不接触另一个，可以采用正交保护基团策略。通常随后使用三苯甲基、甲氧基三苯甲基或甲硅烷基保护5’-羟基，接着使用例如酰基保护3’-羟基。随后通过使用N-氟代苯磺酰亚胺(NFSI)在碱如双(三甲基甲硅烷基)酰胺的存在下处理使如此保护的衍生物经历亲电子的α-氟化，提供氟内酯(1b)。随后通过在碱如双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂等的存在下与N-氯代琥珀酰亚胺反应而方便地引入α-氯代取代基。随后使用任何适合的还原剂如DIBAL 等还原酮官能团，接着将得到的羟基转化为离去基团，例如磺酸、卤化物或磷酸酯的衍生物，提供糖基供体(1e)。通常通过在碱如Et3N的存在下使用甲磺酰氯或等同物处理来制备磺酸的衍生物，如甲基砜；通常经由异头乙酸酯通过使用乙酸酐或类似物乙酰化羟基，接着使用溴化氢的乙酸溶液处理来制备溴代糖。随后通过使用核苷化学领域中熟知的标准条件与希望的碱基或其保护的衍生物缩合来形成核苷(1f)，所述标准条件如在六甲基二硅氮烷 (HDMS)和路易斯酸如TMS三氟甲磺酸酯，或四氯化锡等的存在下。在溴代糖用作糖基供体的情况下，适当使用糖基化反应的助催化剂(promotor) 如四氯化锡或银盐如三氟甲磺酸银或类似物。根据本领域熟知的标准方法采用的基团，使用合适方法除去羟基保护基团和如果存在的在碱基上的保护基团，随后提供核苷(1g)。如果希望，得到的核苷(1g)可以随后转化为5’- 单、二-或三磷酸酯，5’-硫代单-、硫代二-或硫代三磷酸酯，或使用本文下文描述的任何方法或根据文献的过程转化为前药。
携带将3’-位和5’-位连接在一起的环状磷酸酯前药部分，即R1和R2与其连接的氧原子一起形成环状磷酸酯的本发明的化合物，可以例如根据 WO2010/075554中描述的方法制备。方案2A中描绘了这样的化合物的合成路线，其中R3为OR3’且R3’为H、C1-C6烷基、C3-C7环烷基、C3-C7环烷基 C1-C3烷基或苄基，并且磷(III)-试剂用于引入磷部分。
方案2A
如上所述制备的二醇(2a)与携带希望的基团R3’的磷(III)-试剂，如氨基磷酸-烷基-N,N,N’,N’-四异丙酯在活化剂如四唑或二氰基咪唑等的存在下的反应提供环状亚磷酸酯(2b)。随后使用本领域已知的任何方便的氧化方法进行亚磷酸酯随后氧化成磷酸酯(2c)的氧化，例如，使用过氧化物试剂如间氯过氧化苯甲酸、叔丁基过氧化氢、过氧化氢等的氧化。供选择地，可以使用基于TEMPO-氧化或碘-THF-吡啶-水的氧化或任意其他适合的氧化方法。
类似地，携带3’,5’-环状前药部分的本发明的化合物(2d)中的相应的环状硫代磷酸酯前药，即U为S是通过亚磷酸酯衍生物(2b)的硫化获得的。适合的硫化剂包括但不限于元素硫、劳森试剂(Lawesson’s agent)、环八硫、双(三乙氧基甲硅烷基)丙基-四硫化物(TEST)。
环状磷酸酯(2c)可以供选择地通过二醇与P(V)-试剂，如二氯磷酸烷基酯的反应直接一步制备，从而避免了单独的氧化步骤。
在环状亚磷酸酯和磷酸酯的形成中分别使用的磷(III)和磷(V)试剂可以如WO2010/075554中所描述地制备。简言之，市售氯-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺与希望的醇R3’-OH在叔胺如Et3N的存在下的反应提供磷(III) 试剂，而三氯氧磷(POCl3)与希望的醇R3’-OH在Et3N或类似物的存在下的反应提供磷(V)试剂。
其中U为O，R3为NHC(R15)(R15’)C(＝O)R16的本发明的环状磷酸酯前药可以如方案2B中描绘的制备。
方案2B
环状磷酸酯(2Ab)的形成例如通过使用溶剂如MeCN等，在碱如DBU 或等同物的存在下，使二醇(2a)与携带希望的氨基酸酯和两个离去基团的磷酰化剂(2Aa)反应来实现，所述两个离去基团例如两个对硝基苯酚基团。
在类似的方式中，将通过使用相应的硫代氨基磷酸酯作为磷酰化剂获得在携带3’,5’-环状前药部分的本发明的化合物中的相应的环状硫代磷酸酯前药，即U为S。
对于其中R2为H和R1为氨基磷酸酯的本发明的化合物，即式(iv)的前药部分的制备而言，可以利用主要的5’-羟基比次要的3’-羟基更高的反应性，并且氨基磷酸酯可以直接引入到3’,5-二醇上，而无需任何特殊的保护基团策略。该方法在方案3中示出。
方案3
将如上所述制备的核苷衍生物(3a)与希望的氯代磷酰胺酯在惰性溶剂中在碱的存在下缩合，提供氨基磷酸酯衍生物(3b)，所述惰性溶剂如醚，例如，二乙醚或THF，或卤代烃，例如二氯甲烷，所述碱如N-甲基咪唑(NMI) 等。
类似地，通过使糖(3a)与硫代氯代磷酰胺酯反应获得本发明的化合物，其中R2为H且R1为硫代氨基磷酸酯，即式(iv)的前药部分，其中U为S。
在以上方案中使用的氯代磷酰胺酯可以从氯氧磷(POCl3)开始，在两步反应中制备。方案4示出了用于制备式I的化合物的氯代磷酰胺酯的制备，其中R1为式(iv)的基团，其中U为O且R24为H，以及用于制备式I的化合物的氯代磷酰胺酯，其中R1为式(iv-c)的基团，其中U为O，且R24和 R15’与其连接的原子一起形成吡咯烷环。
方案4
POCl3与希望的醇R14OH在惰性溶剂如Et2O中缩合提供了烷氧基或芳氧基二氯磷酸酯(4a)。随后的与氨基酸衍生物(4b)或(4b’)的反应分别提供了氯代磷酰胺酯(4c)或(4c’)。如果希望，获得的氯代磷酰胺酯(4c) 和(4c’)可以转化成相应的具有活化苯酚作为离去基团的磷酰化剂，例如分别由4d和4e一般地示出的五氟苯酚或对-NO2-苯酚。该转化通过氯代衍生物(4c)或(4c’)与希望的活化的苯酚在碱如三乙胺或类似物的存在下的反应而方便地进行。
可以使用如以上一般概述的类似策略制备用于制备式(I)的化合物的硫代氯代磷酰胺酯，即磷酰化试剂，其中R1为式(iv)的基团且U为S，如方案5中示出的。
方案5
硫代磷酰氯与希望的醇R14OH在碱如Et3N等的存在下的反应提供了烷氧基或芳氧基硫代二氯磷酸酯(5a)。随后的与氨基酸衍生物(4b)或(4b’) 的反应分别提供了硫代氯代磷酰胺酯(5b)或(5b’)。
方案6中描绘了用于制备式(I)的化合物的磷酰化剂的合成路线，其中R1为基团(v)且U为O。
方案6
磷酰化剂如4-硝基苯基磷酰二氯、三氯氧磷等与适合的胺在Et3N等的存在下在溶剂如DCM中反应，提供了希望的氯代磷二酰胺酯。
可以根据文献的过程制备式(I)的化合物，其中R1为基团(i)的前药部分，R12和R13均为R21(＝O)S-(C1-C6亚烷基)-且U为O。例如，Bioorg.&Med. Chem.Let.,Vol.3,No 12,1993,p.2521-2526中所述的方法，如方案7A中一般示出的。
方案7A
通过在活化剂如特戊酰氯的存在下在吡啶中使用膦酸处理实现5’-羟基化合物(7a)转化为相应的膦酸氢酯(7b)，接着是与S-(2-羟烷基)烷烃硫醇酯和特戊酰氯在吡啶中反应，以及随后使用例如碘于吡啶/水中的条件氧化，提供了磷酸三酯。最后使用标准方法去除保护基团，提供了核苷酸前药(7c)。
供选择地，可以通过使用已经携带合适的取代基的磷酰化剂使核苷(7a) 磷酸化来制备核苷酸前药(7c)。该方法描述于WO2013/096679并示出在方案7B中。
方案7B
在5-乙基硫代四唑(ETT)的存在下，核苷(7a)与磷酰化剂反应，接着使用例如mCPBA氧化，提供了希望的前药(7c)。磷酰化剂适合根据文献的过程制备，如一般地在方案8中概述的。
方案8
希望的酰氯R21C(＝O)Cl与希望构型的巯基醇在叔胺如三乙胺或等同物的存在下反应，接着使用1,1-二氯-N,N-二异丙基亚膦酰胺处理得到的酰基硫代烷醇衍生物(8a)，提供了磷酰化剂(8b)。
可以根据例如WO2013/096679和其中引用的参考文献所描述的方法制备式I的化合物，其中R1为基团(i)的前药部分，且R12和R13具有式 R21C(＝O)O-C1-C6亚烷基-或R21OC(＝O)O-C1-C6亚烷基-。在方案9A中简要地示出方法。
方案9A
在溶剂如THF中，使用适合的偶联条件如BOP-Cl和3-硝基-1,2,4-三唑，使用适合的二磷酸9b或9b’，优选地以铵盐如三乙基铵盐等的形式，在DIEA 等的存在下，偶联任选地已保护的核苷9a，分别提供了前药9c和9c’。
在式I的化合物的供选择的方法中，其中R1为基团(i)的前药部分且 R12和R13具有式R21C(＝O)O-C1-C6亚烷基-或R21OC(＝O)O-C1-C6亚烷基-，核苷9a与氯氧磷在第一步中反应并随后进一步与希望的已经取代的磷酰化剂反应，如方案9B中示出。
方案9B
通过使用溶剂如磷酸三乙酯使核苷9a与氯氧磷反应，接着在升高的温度下在DIEA的存在下与希望的氯代碳酸烷基酯(9b”)或酯(9b’”)反应，获得磷酸酯9c和9c’。
可以根据在例如J.Med.Chem.,2006,49,6,p.2010-2013和 WO2009/085267和其中引用的参考文献中描述的方法制备式I的化合物，其中R1为基团(i)的前药部分，其中U为O，R12为H且R13具有式R21-O-C1-C6亚烷基-且R21为C1-C24烷基。一般方法示出在方案10A中。
方案10A
通过使用如二乙醚等作为溶剂，使合适的烷氧基醇(10a)与氯化磷在三乙胺的存在下反应形成磷酰化剂(10b)，接着磷酸化任选地已保护的核苷并且最后脱保护，提供蛋白质族化合物(protide)(10c)。
在式I的化合物的供选择的方法中，其中R1为基团(i)的前药部分，其中U为O，R12为H且R13具有式R21-O-C1-C6亚烷基-且R21为C1-C24烷基，可以使用磷(III)-试剂作为磷酰化剂，如方案10B中示出。
方案10B
通过在叔胺如DIEA或类似物的存在下，使烷氧基醇(10a)与亚膦酰胺(10d)反应制备磷(III)试剂。随后使用获得的亚磷酰胺衍生物(10e)磷酸化核苷，接着使用例如过氧化物如叔丁氧基过氧化物等氧化，提供核苷酸 (10f)。水解氰基乙基部分并除去保护基团，如果存在的话，提供希望的核苷酸(10c)。
可以根据例如WO2013/039920和其中引用的参考文献中描述的方法制备式I的化合物，其中R1为基团(vi)的前药部分且R13为R21C(＝O)O-CH2- 或R21OC(＝O)O-CH2-。方法简要地示出在方案11A中。
方案11A
通过使核苷11a与氯氧磷在磷酸三乙酯中反应，接着与希望的胺 NHR17R17’在DIEA的存在下反应，最后在升高的温度下与氯代碳酸烷基酯 (11b)或酯(11b’)在DIEA的存在下反应，获得氨基磷酰胺酯11c和11c’。
可以根据WO2008/082601和其中引用的参考文献中描述的方法制备式I 的化合物，其中R1为基团(vi)的前药部分且R13为R21C(＝O)S-CH2CH2-。该方法简要示出在方案12A中。
方案12A
使用希望的膦酸氢酯的适合的四烷基铵盐例如四乙基铵盐，磷酸化5’- 羟基化合物(12a)，该磷酸化通过使用特戊酰氯的吡啶溶液活化实现，提供了膦酸氢酯(12b)。随后通过在无水条件下，在四氯化碳中与希望的胺反应引入氨基NR17R17接着去除保护基团，从而产生磷酰胺酯(12c)。
作为供选择的方案，可以由方案7A的H-膦酸酯(7b)获得磷酰胺酯 (12c)，即使方案7A的H-膦酸酯(7b)与希望的S-(2-羟基乙基)烷烃硫醇 R21C(C＝O)SCH2CH2OH在偶联剂如PyBOP等的存在下反应，接着通过如上所述胺化并脱保护。该路线在方案12B中示出。
方案12B
如技术人员将认识到的，在方案12A和12B的示出的过程将不仅适用于S-酰基硫代乙醇衍生物的制备，还适用于在硫和氧原子之间具有其他亚烷基构型的衍生物的制备。
通过使适当地3’-保护的化合物经历适合的酰化条件，可以获得在5’-位和任选地还在3’-位具有酰基前药部分的本发明的化合物，即R1和任选地还有R2为C(O＝)R30或C(＝O)R31NH2，如方案13中示出的。
方案13
通过使用标准方法，如在吡啶存在下使用烷基酸酐R30C(＝O)OC(＝O)R30，或烷基酰氯R30C(＝O)Cl等，使5’-羟基化合物(9a)与合适的酰化剂反应获得核苷(13b)，其中5’-位中的前药基团为酯，即式OC(＝O)R10的基团，而在5’-位携带氨基酸酯的核苷(13d)将通过5’-羟基化合物(13a)与N-保护的脂族氨基酸在适合的肽偶联试剂如EDAC等的存在下反应获得。去除3’- 羟基保护基团后产生本发明的化合物，其中R2为H。另一方面，使3’-羟基化合物(13b)和(13c)经历以上刚描述的酰化条件，分别产生二酰基衍生物(13d)和(13e)。
在5’-和/或3’-位携带酯或氨基酸酯前药部分的本发明的化合物可以如方案14中示出的制备。
方案14
由于二醇(14a)的主要5’-位的较高反应性，该位置可以与适合的酰化剂选择性地反应以获得5’-酰基衍生物(14b)和(14c)，或其可以使用适合的保护基团保护以实现3’-位随后的酰化。通过与酰化剂如在吡啶存在下的烷基酸酐，或酰氯等反应方便地获得核苷(14b)，其中5’-位的前药基团为酯，即式OC(＝O)R30的基团，而在5’-位携带氨基酸酯的核苷(14c)将通过二醇(14a)与N-保护的脂族氨基酸在适合的肽偶联试剂如EDAC等的存在下反应获得。如果希望酰基前药基团在3’-位，则保护-酰化-脱保护顺序将是合适的，以在产率下降的情况下得到洁净反应。通常，保护基团如甲硅烷基、三苯甲基或单甲氧基三苯甲基(MMT)将适用于保护5’-羟基。这些基团的使用在文献中广泛描述，通常，其引入使用条件如在溶剂如吡啶中与相应卤化物如氯化物反应。随后的酰化如上所述进行，接着去除5’-O-保护基团，在氨基酸酯作为N-保护的氨基酸被引入的情况下为N-保护基团，使用根据所使用的保护基团的合适条件，如在三苯甲基或甲氧基三苯甲基保护基团的情况下进行酸处理，然后提供3’-酰基化衍生物(14d)和(14e)。如果希望，可以例如使用本文上文描述的过程将磷酰胺酯引入提供的5’-羟基衍生物 (14d)和(14e)的5’-位，或可以使用标准文献的磷酸化过程引入单-、二- 或三-磷酸酯，或可以使用针对3’-位的酰化的上述方法酰化5’-位。
可以使用例如Bioorg.Med.Chem.11(2003)2453-2461中所述的方法由 5’-羟基化合物制备在5’-位或在5’-和3’-位两者具有乙缩醛前药部分的本发明的化合物，即其中R1，或R1和R2两者为CR32R32’OC(＝O)CHR33NH2的式 I的化合物。
可以根据J.Am.Chem.Soc.,Vol.126,No.16,2004,p.5154-5163中描述的方法制备在5’-位携带“HepDirect”前药部分的本发明的化合物，即其中 R1为基团(i)且R12和R13结合以在其连接的氧原子之间形成亚丙基的式I 的化合物。
方案15中示出了式I的化合物的合成路线，其中B为基团(a)或(b)，R2为H且R1为三磷酸酯，即式(iii)的基团，其中U为O。
方案15
用于制备其中B为基团(a)或(b)的式(I)的化合物的三磷酸酯的适合的磷酰化剂为5-硝基环赛尔格烯基氯代亚磷酸酯(5-nitrocyclosalgenylchlorophosphite)(I-6)，其通过三氯化磷和2-羟基-5- 硝基苄基醇的反应制备，如本文下文的实验部分中详述的。
本发明的核苷的适合的3’-O-保护的衍生物(15a)与硝基环赛尔格烯基氯代亚磷酸酯(I-1)在Et3N的存在下在惰性溶剂如DCM或MeCN中反应，接着使用例如氧化，提供了环状磷酸三酯(15b)。然后通过与焦磷酸酯例如三丁胺焦磷酸酯反应接着使用氨水处理获得三磷酸酯(15c)。为了得到希望的盐形式，使三磷酸酯经受合适的离子交换过程，例如，如果希望钾盐形式，则使残留物通过柱
方案16中示出了式I的化合物的合成路线，其中B为尿嘧啶，R2为H 且R1为硫代三磷酸酯，即式(iii)的基团，其中U为S。
方案16
用于在式(I)的化合物的U-核苷的硫代三磷酸酯的制备中引入第一磷酸酯基团的适合的试剂为2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮，其根据文献的过程制备。
因此适合的3’-O-保护的核苷与2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮在溶剂如吡啶/THF或等同物中反应，接着使用焦磷酸三丁基铵在三丁胺的存在下在溶剂如DMF中处理。提供的中间体随后通过使用硫的DMF溶液处理转化为硫代三磷酸酯。为了得到希望的盐形式，使三磷酸酯经历合适的离子交换过程，例如，如果希望锂盐形式，则使残留物通过柱
在方案17中示出硫代三磷酸酯的供选择的合成路线。
方案17
在该方法中，在磷酸化步骤中使用硫代磷酸酯试剂。通过PSCl3和三唑在溶剂如MeCN或类似物中反应制备试剂。如此形成的试剂随后偶联到 3’-O-保护的核苷13a，随后进行与焦磷酸酯如三(四丁基铵)氢焦磷酸酯的反应，从而提供硫代三磷酸酯(17b)。
在以上方案中使用的各种保护基团(PG)的应用为技术人员已知，并且其效用和另外的供选择的方案在文献中广泛描述，参见例如Greene T.W., Wuts P.G.M.Protectivegroups in organic synthesis,第二版,New York:Wiley； 1995。
如本文所使用的术语“N-保护基团”或“N-保护的”是指旨在保护氨基酸或肽的N-末端，或保护氨基在合成过程期间避免不希望的反应的那些基团。通常使用的N-保护基团公开于Greene中。N-保护基团包括酰基，如甲酰基、乙酰基、丙酰基、特戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、酞酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基等；磺酰基，如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯形成基团，如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基-4,5- 二甲氧基苄氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧羰基、叔丁氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9 甲氧基羰基、环戊基氧羰基、金刚烷基氧羰基、环己基氧羰基、苯基硫代羰基等；烷基，如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基等；和甲硅烷基，如三甲基甲硅烷基等。优选的N-保护基团包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、特戊酰基、叔丁基乙酰基、苯基磺酰基、苄基(Bz)、叔丁氧基羰基(BOC)和苄氧基羰基(Cbz)。
羟基和/或羧基保护基团还广泛地在如上的Greene中综述，并且包括醚，如甲基、取代的甲基醚，如甲氧基甲基、二甲基硫醚、苄基甲基醚、叔丁基甲醚、2-甲氧基乙基甲基醚等，甲硅烷基醚，如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三苄基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基等，取代的乙基醚，如甲基1-乙基醚、1-甲基-1-甲基乙醚、叔丁基、烯丙基、苄基、对甲基苄基醚、二苯基甲基、三苯基甲基等，芳烷基，如三苯甲基，和pixyl(9-羟基-9-苯基呫吨衍生物，尤其是氯化物)。酯羟基保护基团包括酯，如甲酸酯、苄基甲酸酯、氯乙酸酯、甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、新戊酸酯、金刚烷酸酯、菜酸酯、苯甲酸酯等。碳酸酯羟基保护基团包括甲基乙烯基、烯丙基、肉桂基、苄基等。
在一个方面，本发明涉及包含治疗有效量的式I的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在该上下文中的治疗有效量是足以稳定或减少感染的受试者(例如，人)的病毒感染，特别是HCV感染的量。“治疗有效量”将根据在每种具体情况下的个体需要变化。影响剂量的特征为例如，待治疗的疾病的严重程度，待治疗的受试者的年龄、重量、一般健康状况等，给予途径和形式。
在一个方面，本发明涉及式I的化合物用于治疗“未经治疗的”患者的用途，所述“未经治疗的”患者即感染HCV且先前未针对感染进行治疗的患者。
在另一个方面，本发明涉及式I的化合物用于治疗“经过治疗的”患者的用途，所述“经过治疗的”患者即感染HCV且先前针对感染进行治疗并且随后复发的患者。
在另一个方面，本发明涉及式I的化合物用于治疗“无响应者”的用途，所述“无响应者”即感染HCV且先前进行治疗但未响应治疗的患者。
在另外的方面，本发明涉及包含预防有效量的如本文限定的式I的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在该上下文中，预防有效量是在处于被感染的风险的受试者中针对HCV感染足以以预防方式起作用的量。
还在另外的方面，本发明涉及制备本文限定的药物组合物的方法，其包括将药学上可接受的载体与治疗或预防有效量的如本文限定的式I的化合物紧密混合。
因此，本发明的化合物可以配制成用于给予目的的各种药物形式。作为合适的组合物，可以引用通常用于全身给予药物的所有组合物。为了制备本发明的药物组合物，作为活性成分的有效量的具体化合物，优选地以加成盐形式或溶剂化物的形式，作为在紧密混合物中与药学上可接受的载体组合，所述载体可以根据希望用于给予的制剂形式而呈现多种形式。这些药物组合物在特别适用于口服、经直肠、经皮肤或通过胃肠外注射的单一剂型中是期望的。例如，在制备口服剂型的组合物时，在口服液体制剂，如混悬剂、糖浆、酏剂、乳剂和溶液的情况下，可以采用任何普通的药物介质，例如，水、二醇、油、醇等；或在粉末、丸剂、胶囊和片剂的情况下采用固体载体，如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于片剂和胶囊易于给予，其代表最有利的口服剂量单位形式，在所述情况下显然采用固体药物载体。对于胃肠外组合物，载体将通常包括至少大部分的无菌水，但可以包括其它成分，例如以有助于溶解度。例如，可以制备可注射的溶液，其中载体包括盐溶液、葡萄糖溶液或盐溶液和葡萄糖溶液的混合物。还可以制备可注射的混悬剂，在该情况下可以采用合适的液体载体、助悬剂等。还包括的是预期在使用之前不久转化成液体形式制剂的固体形式制剂。在适用于经皮肤给予的组合物中，载体任选地包括渗透增强剂和/或适合的润湿剂，任选地以较小比例与任何性质的适合的添加剂组合，所述添加剂没有引入对皮肤显著有害的作用。还可以使用任何本领域已知的递送系统，以溶液、混悬剂或干粉的形式经由口服吸入或吹入给予本发明的化合物。
尤其有利的是以单位剂型配制前述药物组合物，以易于给予和剂量一致性。如本文所使用的单位剂型是指适用作单一剂量的物理上离散的单位，每个单位包含经计算产生希望的治疗效果的预定量的活性成分连同需要的药物载体。这样的单位剂型的实例为片剂(包括刻痕片或包衣片)、胶囊、丸剂、栓剂、粉末包、板片、可注射的溶液或混悬剂等，及其分离的多剂型。
式I的化合物显示针对HCV的活性，并且可以用于治疗和/或预防HCV 感染或与HCV相关的疾病。通常，式I的化合物可以用于治疗HCV感染或与HCV相关的疾病。与HCV相关的疾病包括进行性肝纤维化，炎症和导致肝硬化的坏死，晚期肝病和HCC。本发明的许多化合物可以具有针对HCV 的突变株的活性。此外，许多本发明的化合物可以显示有利的药代动力学曲线并且就生物利用度而言具有吸引力的特性，包括可接受的半衰期、AUC(曲线下面积)和峰值，并且不存在不利的现象，如不充分的快速发作和组织保留。
式I的化合物针对HCV的体外抗病毒活性可以基于Lohmann等人. (1999)Science285:110-113在细胞HCV复制子系统中测试，另外的修改描述于Krieger等人.(2001)Journal of Virology 75:4614-4624(通过引用并入本文)，其进一步在实施例部分中示例。该模型，虽然不是HCV的完全感染模型，也广泛被接受为目前可用的最稳健和有效的自主HCV RNA复制。将理解重要的是区分特异性干扰HCV功能的化合物与在HCV复制子模型中发挥细胞毒性或细胞抑制作用的那些，因此导致HCV RNA或连接的报告基因酶浓度降低。基于例如线粒体酶的活性，使用荧光氧化还原染料如刃天青，用于评价细胞的细胞毒性的分析是本领域已知的。此外，存在用于评价连接报告基因活性的非选择性抑制，如萤火虫荧光素酶的细胞计数屏。可以通过使用荧光素酶报告基因转染来准备合适的细胞类型，所述荧光素酶报告基因的表达取决于构成性活性基因启动子，并且该细胞可以用作计数屏来去除非选择性抑制剂。
由于其抗病毒特性，特别是其抗HCV特性，式I的化合物包括任意可能的立体异构体、药学上可接受的加成盐或其溶剂化物，用于治疗感染HCV 的温血动物，特别是人。式I的化合物进一步用于预防HCV感染。本发明还涉及治疗感染HCV或处于被HCV感染的风险中的温血动物，特别是人的方法，所述方法包括给予抗HCV有效量的式I的化合物。
因此，本发明的化合物可以用作药物，特别是抗HCV药物。所述作为药物的用途或治疗方法包括全身给予感染HCV的受试者或易受HCV感染的受试者有效对抗与HCV感染相关的病症的量。
本发明还涉及本化合物在制备用于治疗或预防HCV感染的药物中的用途。
在优选的实施方案中，本发明涉及式I的化合物在制备用于治疗HCV 感染的药物中的用途。
通常可以预期，抗病毒有效日剂量将为约0.01至约700mg/kg，或约0.5 至约400mg/kg，或约1至约250mg/kg，或约2至约200mg/kg，或约10至约150mg/kg体重。合适的是在全天以合适的间隔给予作为两次、三次、四次或更多次亚剂量的需要剂量。所述亚剂量可以配制为单位剂型，例如，每单位剂型包含约1至约5000mg，或约50至约3000mg，或约100至约1000 mg，或约200至约600mg，或约100至约400mg的活性成分。
本发明还涉及式I的化合物、其药学上可接受的盐或溶剂化物和另一种抗病毒化合物，特别是另一种抗HCV化合物的组合。术语“组合”可以涉及包含以下的产品：(a)式I的化合物和(b)任选的另一种抗HCV化合物，作为组合制剂用于在HCV感染的治疗中同时、单独或顺序使用。
可以用于该组合的抗HCV化合物包括HCV聚合酶抑制剂、HCV蛋白酶抑制剂、在HCV寿命周期中的其他靶标的抑制剂，和免疫调节剂及其组合。HCV聚合酶抑制剂包括NM283(瓦洛他滨)、R803、JTK-109、JTK-003、 HCV-371、HCV-086、HCV-796和R-1479、R-7128、MK-0608、VCH-759、 PF-868554、GS9190、XTL-2125、NM-107、GSK625433、R-1626、BILB-1941、 ANA-598、IDX-184、IDX-375、INX-189、MK-3281、MK-1220、ABT-333、 PSI-7851、PSI-6130、GS-7977(索非布韦)、VCH-916。HCV蛋白酶的抑制剂(NS2-NS3抑制剂和NS3-NS4A抑制剂)包括BILN-2061、VX-950(特拉匹韦)、GS-9132(ACH-806)、SCH-503034(波普瑞韦)、TMC435350(西米普韦)、TMC493706、ITMN-191、MK-7009、BI-12202、BILN-2065、 BI-201335、BMS-605339、R-7227、VX-500、BMS650032、VBY-376、VX-813、 SCH-6、PHX-1766、ACH-1625、IDX-136、IDX-316。HCV NS5A抑制剂的实例是BMS790052、A-831、A-689、NIM-811并且DEBIO-025为NS5B亲环蛋白抑制剂的实例。
在HCV寿命周期中的其他靶标的抑制剂，包括NS3解旋酶；金属蛋白酶抑制剂；反义寡核苷酸抑制剂，如ISIS-14803和AVI-4065；siRNA如 SIRPLEX-140-N；载体编码的短发夹RNA(shRNA)；DNA酶；HCV特异性核酶，如heptazyme、RPI.13919；侵入抑制剂如HepeX-C、HuMax-HepC；α-葡糖苷酶抑制剂，如西戈斯韦、UT-231B等；KPE-02003002；和BIVN 401。
免疫调节剂包括天然和重组干扰素同种型化合物，包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素和ω-干扰素，如 Sumiferon 和聚乙二醇衍生的(聚乙二醇化的)干扰素化合物，如 PEG干扰素-α-2aPEG干扰素-α-2b和聚乙二醇化的IFN-α-con1；干扰素化合物的长效制剂和衍生物如白蛋白融合的干扰素albuferonα；刺激细胞中干扰素的合成的化合物，如瑞喹莫德；白介素；提高1型辅助T细胞应答形成的化合物，如SCV-07；TOLL样受体激动剂如CpG-10101(actilon)，和艾沙托立宾；胸腺素α-1；ANA-245；ANA-246；组胺二盐酸盐；丙帕锗；四氯十氧化物；安普利近；IMP-321；KRN-7000；抗体，如civacir和XTL-6865；和预防和治疗疫苗如InnoVac C和HCV E1E2/MF59。
其它抗病毒剂包括利巴韦林、金刚烷胺、韦拉米定、硝唑尼特；替比夫定；NOV-205；塔利韦林；内部核糖体进入的抑制剂；广谱病毒抑制剂，如 IMPDH抑制剂，和霉酚酸及其衍生物，并且包括但不限于VX-497 (merimepodib)、VX-148和/或VX-944；或以上任意的组合。
用于所述组合中的具体试剂包括干扰素-α(IFN-α)，聚乙二醇化的干扰素-α或利巴韦林以及基于针对HCV表位靶向的抗体的治疗剂，小干扰RNA (Si RNA)，核糖酶，DNA酶，反义RNA，例如NS3蛋白酶、NS3解旋酶和NS5B聚合酶的小分子拮抗剂。
在另一个方面，提供了如本文限定的式I的化合物和抗HIV化合物的组合。后者优选为对药物代谢和/或药代动力学具有改善生物利用度的积极作用的那些HIV抑制剂。这样的HIV抑制剂的实例为利托那韦。因此，本发明还提供了包括以下的组合：(a)式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物；和(b)利托那韦或其药学上可接受的盐。化合物利托那韦、其药学上可接受的盐及其制备方法描述于WO 94/14436中。US 6,037,157和其中引用的参考文献：US 5,484,801、US 08/402,690、WO 95/07696和WO 95/09614，公开了利托那韦的优选的剂型。
本发明还涉及用于制备如本文所述的组合的方法，所述方法包括将式I 的化合物和其他药剂，如抗病毒剂，包括抗HCV或抗HIV剂，特别是以上提及的那些组合的步骤。
发现所述组合可以用于制备用于治疗感染其的哺乳动物的HCV感染的药物，所述组合特别包括如上限定的式I的化合物和干扰素-α(IFN-α)、聚乙二醇化的干扰素-α或利巴韦林。或本发明提供了治疗感染HCV的哺乳动物，特别是人的方法，其包括给予所述哺乳动物有效量的本文限定的组合。具体地，所述治疗包括所述组合物的全身给药，并且有效量为有效治疗与 HCV感染相关的临床病症的量。在一个实施方案中，将以上提及的组合配制成药物组合物的形式，所述药物组合物包括上述的活性成分和载体，如上所述。每种活性成分可以单独配制并且制剂可以共给予，或可以提供包含两者且如果希望的话包含另外的活性成分的一种制剂。在前者情况下，组合还可以配制为组合制剂用于在HCV治疗中同时、单独或顺序使用。所述组合物可以呈上述的任何形式。在一个实施方案中，两种成分配制在一种剂型中，如固定剂量组合。在具体的实施方案中，本发明提供了包含以下的药物组合物：(a)治疗有效量的式I的化合物，包括其可能的立体异构形式，或其药学上可接受的盐，或其药学上可接受的溶剂化物，和(b)治疗有效量的利托那韦或其药学上可接受的盐，和(c)载体。
本发明的组合的单一组分可以在治疗过程期间在不同的时间分开给予或以分开或单个的组合形式同时给予。本发明旨在包含所有这样的同时或交替治疗的方案，并且相应地解释术语“给予”。在优选的实施方案中，同时给予单独的剂型。
在一个实施方案中，本发明的组合包含一定量的利托那韦，或其药学上可接受的盐，相对于单独给予所述式I的化合物时的生物利用度，其足以在临床上改善式I的化合物的生物利用度。或本发明的组合包含一定量的利托那韦或其药学上可接受的盐，相对于当单独给予所述式I的化合物时的所述至少一个药代动力学变量，所述量足以提高选自以下的式I的化合物的至少一个药代动力学变量：t1/2、Cmin、Cmax、Css、12小时的AUC或24小时的AUC。
本发明的组合可以以所述组合中包含的每种组分特定的剂量范围给予人，例如，如以上限定的式I的化合物，和利托那韦或药学上可接受的盐，可以具有0.02至5.0g/天的剂量水平。
式I的化合物与利托那韦的重量比可以为约30:1至约1:15，或约15:1 至约1:10，或约15:1至约1:1，或约10:1至约1:1，或约8:1至约1:1，或约5:1至约1:1，或约3:1至约1:1，或约2:1至1:1。化合物式I和利托那韦可以每日共给予一次或两次，优选经口服给予，其中每次给药的式I的化合物的量如上所述；并且每次给药的利托那韦的量为1至约2500mg，或约50至约1500mg，或约100至约800mg，或约100至约400mg，或40 至约100mg的利托那韦。
实施方案详述
因此，现在将通过以下实施例说明本发明的各种实施方案和中间体。该实施例仅旨在进一步说明本发明，且绝不限定本发明的范围。化合物名称由 ChemDraw Ultra软件，Cambridgesoft,12.0.2版生成。
除了以上定义，以下缩写用于以下的实施例和合成方案中。如果本文使用的缩写未定义，则其具有一般可接受的含义。
Bn 苄基
Bz 苯甲酰基
BOP-Cl 双(2-氧代-3-噁唑烷基)氯化膦
Bz 苯甲酰基
DCC 二环己基碳二亚胺
DCM 二氯甲烷
DIEA 二异丙基乙胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMPU 1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-嘧啶酮
EDC 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
ES 电喷雾
Et3N 三乙胺
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
Et2O 二乙醚
LC 液相色谱
HOAc 乙酸
HPLC 高效液相色谱
MeCN 乙腈
MeOH 甲醇
MS 质谱
NT 3-硝基-1,2,4-三唑
NTP 核苷三磷酸
Pg 保护基团
Ph 苯基
SEM 平均值标准误差
TEST 双(三乙氧基甲硅烷基)丙基-四硫化物
THF 四氢呋喃
TFA 三氟乙酸
TFAA 三氟乙酸酐
TIPS 三异丙基甲硅烷基
制备以下苯酚并用于制备本发明的化合物的中间体：
苯酚1
步骤a)1-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)乙酮(Ph1-a)
将咪唑(4.46g，65.5mmol)添加到3-羟基苯乙酮(4.46g，32.8mmol) 在DMF(6mL)的溶液。5min后，添加TBDMS-Cl(4.69g，31.1mmol) 在DMF(4mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物90min，随后倾倒至包含5％EtOAc(200mL)的己烷中并用1M HCl(60mL)、水(60mL)、饱和碳酸氢钠(2×60mL)、水(60mL)和盐水(60mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层，过滤并浓缩，并在硅胶上通过快速色谱纯化得到的残留物，使用己烷/EtOAc洗脱，得到题述化合物(5.7g，69％)。
步骤b)叔丁基二甲基(3-(丙-1-烯-2-基)苯氧基)硅烷(Ph1-b)
在氮气下将溴化甲基(三苯基膦)(10.2g，28.4mmol)悬浮在干燥THF (30mL)中，并且将悬浮液冷却至0℃。将正丁基锂(17.8mL，28.4mmol) 滴加至混合物并且将得到的溶液在室温下搅拌30min。将Ph1-a(5.7g，22.8 mmol)添加到混合物并且使反应在室温下进行60min。使用碳酸氢钠水溶液终止反应并使用二乙醚(50mL)萃取。使用碳酸氢钠溶液洗涤有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过硅胶塞纯化得到的残留物，使用乙烷洗脱，得到题述化合物(3.9g，69％)。
步骤c)叔丁基二甲基(3-(1-甲基环丙基)苯氧基)硅烷(Ph1-c)
在氮气下在10分钟内将在己烷中的二乙基锌(439.2mmol)滴加到冷的(0℃)烯烃Ph1-b(3.9g，15.7mmol)在1,2-二氯乙烷(60mL)的溶液。滴加二碘甲烷(6.32mL，78.5mmol)，并在0℃下搅拌产生的混合物30min，然后使其保持室温过夜。将混合物倒入氯化铵的冰冷的溶液中并使用二乙醚萃取。使用饱和碳酸氢钠洗涤有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。使粗产物进入己烷中并丢弃剩余的二碘甲烷。将己烷层浓缩成粗产物，不经进一步纯化而使之进入下一步。
步骤d)3-(1-甲基环丙基)苯酚(苯酚1)
使Ph1-c(3.45g，13.1mmol)进入1M的四丁基氟化铵在THF的溶液 (20mL，20mmol)中并在室温下搅拌产生的溶液过夜。使用1M HCl(50mL) 终止反应并使用乙酸乙酯(100mL)萃取。使用盐水(2×50mL)洗涤有机层，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。在硅胶上通过快速色谱纯化残留物，使用2-丙醇、EtOAc和己烷的混合物洗脱，得到题述化合物(0.56g，29％)。 MS147.1[M-H]-。
苯酚2
使用所述的用于苯酚1的制备的方法，由4-羟基苯乙酮(6.0g，44.1 mmol)制备题述化合物。产率53％。
苯酚3
步骤a)1-(3-(苄氧基)苯基)环戊醇(Ph3-a)
将使用镁加热的碘添加到镁屑(magnesium tunings)(1.29g，52.8mmol) 在干燥THF(50mL)的悬浮液。回流混合物并添加约5％的3-溴苯酚的溶液(13.9g，52.8mmol)。当反应开始时，滴加溴化物的溶液并且随后使混合物继续回流一个多小时。将混合物冷却至约5℃并滴加环戊酮(4.44g，52.8 mmol)在THF(50mL)中的溶液。在室温下搅拌混合物72h，然后使用冷的饱和氯化铵溶液终止反应并使用二乙醚(×3)萃取。使用盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过硅胶色谱(异己烷/EtOAc)纯化产物，得到题述化合物(8.5g，54％)。
步骤b)1-(苄氧基)-3-(环戊-1-烯-1-基)苯(Ph3-b)
将对甲苯磺酸添加到Ph3-a(8.4g，28.2mmol)在苯(100mL)的溶液。使用DMF分离器(trap)回流混合物三小时，然后冷却至室温，使用二乙醚稀释并使用碳酸氢钠的饱和溶液和盐水洗涤。干燥有机相(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过硅胶色谱(异己烷/EtOAc)纯化产物，得到题述化合物(6.45 g，91％)。MS 249.4[M-H]-。
步骤c)3-环戊基苯酚(苯酚3)
在Parr中，在22℃和40PSI下，在10％钯碳(1.5g)的存在下，氢化 Ph3-b(6.4g，26mmol)在EtOAc(75mL)和EtOH(75mL)中的溶液过夜。滤除催化剂并使用EtOAc和EtOH洗涤。在减压下蒸发溶剂并通过硅胶色谱(异己烷/EtOAc)分离产物，得到题述化合物(3.6g，82％)。MS 161.2 [M-H]-。
苯酚4
步骤a)叔丁基(3-环丙基苯氧基)二甲基硅烷(Ph4-a)
(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷(5.46g，19mmol)、环丙基硼酸(2.12 g，24.7mmol)、磷酸钾(14.1g，66.5mmol)、三环己基膦(0.53g，1.9mmol) 和Pd(OAc)2(0.21g，0.95mmol)在甲苯(80mL)和水(4mL)中的悬浮液在110℃下搅拌过夜。用二乙醚稀释浆液并使用水和盐水洗涤。干燥 (MgSO4)有机相，过滤并和浓缩。粗产物通过快速柱色谱(EtOAc/己烷) 纯化，得到题述化合物(1.94g，41％)。
步骤b)3-环丙基苯酚(苯酚4)
将1M四丁基氟化铵(10.1ml，10,1mmol)添加到Ph4-a(1.94g，7,81 mmol)在THF(25ml)中的溶液。溶液搅拌2小时，随后蒸发溶剂并将残留物溶于EtOAc中并使用浓NH4Cl(水溶液)洗涤两次并使用盐水洗涤一次。干燥(MgSO4)有机相，过滤并浓缩。通过快速柱色谱(己烷/乙酸乙酯9:1，与1％异丙醇)纯化粗产物，得到略不纯的题述化合物(1.24g，119％)。
苯酚5
步骤a)2-(4-溴苯氧基)四氢-2H-吡喃(Ph5-a)
将4-溴苯酚(3.75g，21.7mmol)溶于3,4-二氢-2H-吡喃(16ml，175 mmol)，添加催化量的对甲苯磺酸(15mg，0,09mmol)并在22℃下搅拌混合物45min。使用二乙醚稀释混合物并使用1M NaOH(水溶液)×2、水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到题述化合物(5.57g，99％)。
步骤b)2-(4-环丙基苯氧基)四氢-2H-吡喃(Ph5-b)
将0.5M环丙基溴化镁在THF(6,5ml，3.25mmol)中的溶液在15min 内添加到Ph5-a(552,5mg，2,15mmol)、ZnBr(144mg，0.64mmol)、三叔丁基膦四氟硼酸盐(35.6mg，0.12mmol)和Pd(OAc)2(29.5mg，0.13mmol) 在THF(4ml)中的溶液。在22℃下搅拌混合物90min，然后在冰浴上冷却并添加冰水(10ml)。使用EtOAc×3萃取混合物，用盐水洗涤萃取液，然后干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。在硅胶上通过柱色谱(石油醚/EtOAc)纯化残留物，得到题述化合物(292mg，62％)。
步骤c)4-环丙基苯酚(苯酚5)
将对甲苯磺酸一水合物(18.9mg，0.1mmol)添加到Ph5-b(2.28g，10.45 mmol)在MeOH(15ml)中的溶液。在微波反应器中在120℃下加热混合物5min，然后浓缩并在硅胶上通过柱色谱(石油醚/EtOAc)纯化。由石油醚结晶得到的固体，得到题述化合物(1.08g，77％)。
苯酚6
步骤a)1-(3-甲氧基苯基)环丁醇(Ph6-a)
在0至10℃之间将1M 3-甲氧基苯基溴化镁在THF(2.11g，99.8mmol) 中的溶液滴加到环丁酮(6.66g，95mmol)在二乙醚(65mL)中的搅拌的溶液。在0-10℃下搅拌混合物三小时，然后将混合物添加到饱和NH4Cl(300 mL)和水(300mL)的冰冷的溶液。搅拌混合物10min，然后使用二乙醚萃取三次。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并浓缩。通过硅胶色谱(异己烷/EtOAc) 纯化得到的粗产物，得到题述化合物(16.9g，86％)。
步骤b)1-环丁基-3-甲氧基苯(Ph6-b)
将10％的钯碳(2.5g)添加到Ph6-a(15.4g，86.1mmol)在乙醇(200 mL)中的溶液，并在Parr中在60psi下氢化混合物。18h后，添加另外的 10％的钯碳(1.5g)并在60psi下继续氢化混合物18小时。滤除催化剂并使用EtOH和EtOAc洗涤。在减压下浓缩溶液并通过硅胶色谱(异己烷/EtOAc) 分离粗产物，得到题述化合物(14.0g，77％)。
步骤c)3-环丁基苯酚(苯酚6)
在0℃下将1M三溴化硼(18.1g，72.2mmol)在DCM中的溶液滴加到Ph6-b(10.6g，65.6mmol)在干燥DCM(65mL)中的溶液。在-5℃下搅拌混合物2.5小时，然后使用冷的饱和NH4Cl溶液终止反应，并使用DCM 萃取三次。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并浓缩。通过硅胶色谱(异己烷/EtOAc) 纯化得到的粗产物，得到题述化合物(9.73g，88％)。
苯酚7
步骤a)1-(4-(苄氧基)苯基)环丁醇(Ph7-a)
将1-(苄氧基)-4-溴苯(2.63g，100mmol)在二乙醚：THF 1：1(100mL) 中的溶液在回流下在≈1h内滴加到镁屑(2.43g)和痕量碘在二乙醚(50mL) 中的悬浮液。当完成添加时，回流混合物四小时，然后冷却至≈0℃。添加干燥THF(50ml)，接着缓慢添加环丁酮(7.01g，100mmol)在二乙醚(50mL) 中的溶液，并使混合物静置达到室温。在搅拌两小时后，添加NH4Cl(500ml) 的冷的饱和溶液并搅拌混合物15分钟，然后使用EtOAc萃取两次。使用盐水洗涤有机相，使用硫酸钠干燥并在减压下干燥。通过硅胶柱色谱纯化产物，得到题述化合物(12.5g，42％)。
步骤b)4-环丁基苯酚(苯酚7)
在氩气下将10％的钯碳(2.55g，21.5mmol)添加到Ph7-a(12.4g，41.4 mmol)在无水EtOH(110mL)中的溶液，并在45psi下在室温下氢化混合物18h。滤除催化剂，使用乙醇洗涤并浓缩溶液。通过硅胶色谱(异己烷 -EtOAc)纯化产物。收集合适的组分并浓缩，由石油醚结晶残留物，得到题述化合物(3.15g，51％)。
苯酚8
4-(1-甲基环戊基)苯酚(Ph-8)
将1-甲基环戊醇(2.00g，20.0mmol)和苯酚(2.07g，22.0mmol)在戊烷(50mL)中的溶液在30min内滴加到新鲜的AlCl3(1.33g，10mmol) 在戊烷(100mL)中的悬浮液。在室温下在N2下搅拌产生的混合物72h，然后将反应混合物倒入水/冰和HCl(12M，20mmol，1.66mL)中。使用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤有机相，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱(MeOH-DCM)纯化粗产物，得到题述化合物(426mg， 12％)。
苯酚9
步骤a)2-(4-溴-3-甲基苯氧基)四氢-2H-吡喃(Ph9-a)
将pTs(16mg，0.086mmol)添加到4-溴-3-甲基苯酚(4.0g，21.4mmol) 在3,4-二氢-2-H-吡喃(16mL，175mmol)的溶液。反应混合物在室温下搅拌1h，然后用二乙醚稀释并使用1M NaOH(水溶液)和水洗涤。干燥 (Na2SO4)有机相，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱(EtOAc/庚烷)纯化粗产物，得到题述化合物(3.32g，57％)。
步骤b)2-(4-环丙基-3-甲基苯氧基)四氢-2H-吡喃(Ph9-b)
将Ph9-a(3.12g，11.5mmol)、ZnBr2(2.59g，11.5mmol)、三叔丁基膦四氟硼酸盐(0.2g，0.69mmol)和Pd(OAc)2(258mg，1.15mmol)放置在烧瓶中，并且用N2充注烧瓶数次。在搅拌的同时添加THF(10mL)，接着在5分钟内滴加在THF(35mL，17.4mmol)中的0.5M环丙基溴化镁。在室温下搅拌混合物，然后通过硅藻土塞过滤，使用MeOH洗脱。浓缩溶液并通过硅胶柱色谱(EtOAc/庚烷)纯化粗产物，得到题述化合物(1.69g， 57％)。
步骤c)4-环丙基-3-甲基苯酚(苯酚9)
将Ph9-b(1.70g，7.30mmol)溶于MeOH(20ml)并添加pTsxH2O(318 mg，1.67mmol)。在22℃下搅拌混合物30分钟，然后浓缩。通过柱色谱(EtOAc/庚烷)纯化粗产物，得到题述化合物(704mg，65％)。
苯酚10
步骤a)4-环丙基-1-甲氧基-2-甲基苯(Ph10-a)
根据Ph9步骤b中描述的过程，将4-溴-1-甲氧基-2-甲基苯(4.39g，21.9 mmol)与环丙基溴化镁反应，得到题述化合物(1.54g，43％)。
步骤b)4-环丙基-2-甲基苯酚(苯酚10)
在N2下在0℃下将BBr3(5mL，5mmol)添加到Ph10-a(1.54g，9.49 mmol)在DCM(7.5mL)中的溶液。搅拌反应2h，然后使用MeOH(3mL) 终止并浓缩。将粗产物溶于EtOAc中并使用盐水洗涤。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化粗产物，得到题述化合物(826mg， 59％)。MS 147.11[M-H]-。
苯酚11
4-环丙基-3-甲氧基苯酚(苯酚11)
根据针对苯酚9的制备描述的过程，由4-溴-3-甲氧基苯酚(1.11g，5.49 mmol)制备题述化合物。产率40％。
苯酚12
步骤a)3-(二甲基氨基)-1-(3-羟基苯基)丙-1-酮(Ph12-a)
将数滴HCl添加到3-羟基苯乙酮(4.08g，30mmol)、多聚甲醛(4.05g， 45mmol)和二甲胺盐酸盐(2.69g，33mmol)在无水EtOH(100mL)的溶液，并回流反应混合物18h。添加另外的二甲胺盐酸盐(0.55当量，1.22g)、多聚甲醛(0.5当量，1.35g)和HCl(0.5mL)，再继续回流反应混合物4h，然后冷却至室温。收集沉淀的白色固体并使用冷EtOH(50mL)和冷丙酮(10mL)洗涤，然后冻干，得到题述化合物(2.59g，38％)，不经进一步纯化用于下一步。
步骤b)环丙基(3-羟基苯基)甲酮(苯酚12)
在室温下，将NaH(60％矿物油分散体)(1.13g，28.2mmol)按份添加到搅拌过的三甲基碘化亚砜(6.20g，28.2mmol)在DMSO(100mL)中的悬浮液。1h后，在搅拌和冷却下按份添加固体Ph12-a(2.59g，11.3mmol)。在室温下搅拌反应混合物40h，然后倾倒至冷水(200mL)中并使用DCM (3×100mL)萃取。使用饱和NH4Cl水溶液(2×100mL)洗涤有机相，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱(MeOH/DCM)纯化得到的粗产物，得到题述化合物(883mg，48％)。
苯酚13
步骤a)环丙基(4-羟基苯基)甲酮(Ph13)
在约30min内将对羟基-γ-氯苯丁酮(4.95g)按份添加到NaOH(8mL，水溶液，50％w/w)的溶液，然后添加NaOH(35mL，水溶液，25％w/w)，接着按一份添加对羟基-γ-氯苯丁酮(4.95g)。将温度降至140℃并添加NaOH (8g)。90min后，添加H2O(10ml)，并且在60min后冷却反应混合物，用H2O稀释并使用HOAc(≈27-30ml)中和至pH≈7。过滤形成的沉淀，使用H2O洗涤并在真空下干燥。在10min内在40℃下在CHCl3(200ml)中研磨固体，然后在室温下过夜。在30min内将浆液加热至40℃，然后过滤。干燥(MgSO4)滤液，过滤并浓缩至≈70ml。添加己烷，形成油，该油最后变成晶体。过滤浆液，使用CHCl3/己烷洗涤固体并干燥，得到题述化合物 (4.15g，51％)。
苯酚14
步骤a)3-(1-羟基-2,2-二甲基丙基)苯酚(Ph14-a)
在30分钟内将t.Bu-MgBr(1.5当量)滴加到3-羟基苯甲醛(2.00g，16.4 mmol)在二乙醚(20mL)中的冷(-10℃)混合物。在添加过程中添加THF (20mL)。使混合物达到23℃并搅拌6小时。添加更多的t.Bu-MgBr(0.7 当量)并使混合物持续搅拌过夜，然后冷却并使用饱和NH4Cl水溶液终止反应。将EtOAc添加到混合物，接着添加1M HCl水溶液，直到获得均质混合物。分离相并且使用盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过柱色谱纯化得到的粗产物，得到题述化合物(1.1g，37％)。
步骤b)1-(3-羟基苯基)-2,2-二甲基丙-1-酮(Ph14)
向烘干的圆底烧瓶中添加MS和氯铬酸吡啶(PCC)(1.97g，9.15 mmol)，接着添加干燥DCM(5mL)。在20℃下搅拌混合物5分钟，之后缓慢添加AA8019(1.10g，6.10mmol)在DCM(5mL)中的混合物。在完全氧化后，通过硅藻土垫过滤混合物，使用二乙醚洗涤垫。浓缩滤液。通过柱色谱纯化粗产物，得到题述化合物(402mg，37％)。MS 179.25[M+H]+。
苯酚15
1-(4-羟基苯基)-2,2-二甲基丙-1-酮(Ph15)
将4-羟基苯甲醛(3g，24.6mmol)根据针对苯酚14的制备描述的过程反应，得到题述化合物(538mg，17％)。
氨基酸1
步骤a)(S)-(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸仲丁酯(AA1-a)
将L-Boc-丙氨酸(2.18g，11.5mmol)溶于干燥DCM(40mL)中并添加醇(R)-丁-2-醇(938mg，12.6mmol)。将混合物冷却至约5℃并按一份添加EDC(3.31g，17.2mmol)，接着按份添加DMAP(140mg，1.15mmol)。使混合物达到室温并搅拌过夜，然后使用乙酸乙酯(～300ml)稀释，并且使用饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相三次，并使用盐水洗涤一次。用硫酸钠干燥有机相并在减压下浓缩。通过硅胶色谱分离产物，以异己烷和10％乙酸乙酯洗脱，得到题述化合物(2.78g，98％)。
步骤b)(S)-(S)-2-氨基丙酸仲丁酯(AA1-b)
在65℃下搅拌AA1-a(2.77g，11.3mmol)和对甲苯磺酸一水合物(2.15 g，11.3mmol)在EtOAc(45mL)中的混合物16h，然后在减压下浓缩。由二乙醚结晶得到的残留物，得到题述化合物(3.20g，89％)。
氨基酸2
(S)-(R)-2-氨基丙酸戊-2-酯(AA2)
按照针对AA1的制备描述的过程，但使用(R)-戊-2-醇代替(R)-丁-2-醇，得到题述化合物(4.6g)。
氨基酸3
(S)-(S)-2-氨基丙酸戊-2-酯(AA3)
按照针对AA1的制备描述的过程，但使用(S)-戊-2-醇代替(R)-丁-2-醇，得到题述化合物(8.3g)。
制备以下中间体并且所述中间体可以用于制备本发明的化合物：
中间体1
步骤a)(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸-4-氟苄酯(I-1a)
将Boc-L-AlaOH(19.92mmol)、DMAP(1.99mmol)和(4-氟苯基)甲醇 (23.9mmol)溶于CH2Cl2(100mL)中。向该溶液中添加三乙胺(23.9mmol)，接着添加EDC(23.9mmol)，并且在N2下在室温下搅拌所产生的反应混合物过夜。使用CH2Cl2(100mL)稀释反应混合物，使用饱和NaHCO3水溶液(2×50mL)、饱和NaCl水溶液(2×50mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化得到的残留物，使用正己烷-EtOAc(95:5至60:40) 洗脱，得到题述化合物(4.44g)，为白色蜡状固体。MS:296[M-H]-。
步骤b)(R)-2-氨基丙酸-4-氟苄酯(I-1b)
将化合物I-1a(14.93mmol)溶于4M HCl/二氧六环(40mL)中，在室温下搅拌30分钟并蒸发至干燥，得到题述化合物的盐酸盐(3.4g)，为白色粉末。MS:198[M+H]+。
步骤c)(2R)-2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸-4-氟苄酯(I-1)
在-78℃下，将PhOPOCl2(4.28mmol)滴加到化合物I-5b(4.28mmol) 在CH2Cl2中的溶液，接着滴加三乙胺(8.56mmol)。在Ar下在-78℃下搅拌所产生的反应混合物并使其达到室温过夜。在硅胶上蒸发反应混合物并通过色谱纯化(正己烷/EtOAc(88:12)-(0:100))，得到题述化合物(769mg)。31P-NMR(CDCl3)δ:7.85(s)和7.54(s)(RP和SP非对映异构体)。
中间体2
步骤a)(S)-(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸仲丁酯(I-2a)
将L-Boc-丙氨酸(2.18g，11.5mmol)溶于干燥DCM(40mL)中并添加醇(R)-丁-2-醇(938mg，12.6mmol)。将混合物冷却至约5℃并按一份添加EDC(3.31g，17.2mmol)，接着按份添加DMAP(140mg，1.15mmol)。使混合物达到室温并搅拌过夜，然后使用乙酸乙酯(～300ml)稀释，使用饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机相三次以及用盐水洗涤一次。使用硫酸钠干燥有机相并在减压下浓缩。通过硅胶色谱分离产物，以异己烷和10％乙酸乙酯洗脱，得到题述化合物(2.78g，98％)。
步骤b)(S)-(R)-2-氨基丙酸仲丁酯(I-2b)
在65℃下搅拌I-10a(2.77g，11.3mmol)和对甲苯磺酸一水合物(2.15 g，11.3mmol)在EtOAc(45mL)中的混合物16h，然后在减压下浓缩。由二乙醚结晶得到的残留物，得到题述化合物(3.20g，89％)。
步骤c)(2S)-(R)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸仲丁酯(I-2)
在氮气下在-30℃下将二氯磷酸苯酯(1当量)添加到化合物I-10b(3.15 g，9.92mmol)在DCM(75ml)中的溶液，接着滴加三乙胺(2当量)。使混合物达到室温并搅拌过夜，然后冷却至约5℃并添加固体4-硝基苯酚(1 当量，15mmol)，接着滴加三乙胺(1当量g，15mmol)并在室温下搅拌混合物4小时，然后在减压下浓缩，使用乙酸乙酯(40ml)和醚(40ml) 稀释并在室温下静置过夜。滤除三乙胺-HCl盐并在减压下浓缩滤液。在硅胶上通过柱色谱纯化得到的残留物，使用异己烷-乙酸乙酯洗脱，得到题述化合物(4.19g，79％)。
使用合适的醇，根据针对I-2的制备描述的过程制备以下化合物：
中间体7
步骤a)(S)-2-氨基丙酸环辛酯(I-7a)
将对甲苯磺酸一水合物(3.6g，19.1mmol)添加到L-丙氨酸(1.7g， 19.1mmol)和环辛醇(25ml，191mmol)在甲苯(100ml)中的浆液。在回流温度下加热反应混合物25小时，并使用Dean-Stark分离器从反应除去水。在减压下浓缩混合物并将残留物保持在真空下过夜。向残留物(27g) 添加二乙醚(100ml)。通过过滤收集白色沉淀，使用二乙醚(3×50ml)洗涤并在真空下干燥，得到题述化合物(4.84g，68％)。
步骤b)(2S)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸环辛酯(I-7)
根据用于制备I-2步骤c所描述的方法反应化合物I-7a，得到题述化合物(4.7g，76％)。
中间体8
(2S)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸环庚酯(I-22)
按照用于制备化合物I-7所述的过程，但使用环庚醇(27ml，224mmol) 代替环辛醇，得到题述化合物(5.72g，55％)。
中间体9
(2S)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸环己酯(I-23)
按照用于制备I-2步骤c所述的过程，但使用(S)-2-氨基丙酸环己酯代替 (S)-2-氨基丙酸-3,3-二甲基丁基酯，得到题述化合物(10.6g，82％)。
中间体10
(S)-2-((双(4-硝基苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸-2-乙基丁酯(I-10)
将(S)-2-氨基丙酸2-乙基丁基酯(5g，14.49mmol)添加到双(4-硝基苯基)氯磷酸酯(6.14g，17.1mmol)在DCM(50ml)中的溶液，在冰浴中冷却混合物并滴加Et3N(4,77mL，34,2mmol)。15min后除去冷却并在23℃下搅拌反应混合物，直到根据TLC完全反应。然后添加二乙醚，过滤混合物并浓缩滤液，在硅胶上通过柱色谱纯化，得到题述化合物(2.05g，82％)。
中间体11
步骤a)(S)-2-氨基丙酸异丙酯(I-11a)
在0℃下，将SOCl2(29mL，400mmol)滴加到L-丙氨酸的HCl盐(17.8 g，200mmol)在异丙醇(700mL)中的悬浮液。该悬浮液在室温下搅拌过夜，随后浓缩，得到题述化合物(29.2g，87％)。
步骤b)(2S)-2-(((((S)-1-异丙氧基-1-氧代丙-2-基)氨基)(4-硝基苯氧基)磷酰 基)-氨基)丙酸异丙酯(I-11)
在-60℃下，将二氯磷酸4-硝基苯酯(1.8g 7mmol)在DCM中的溶液滴加到胺I-11a(2.35g，14mmol)和三乙胺(7.7mL，56mmol)在DCM 中的溶液。使反应混合物达到室温，搅拌过夜，浓缩然后使用乙酸乙酯和醚稀释，并在室温下静置过夜。滤除三乙胺-HCl盐，在减压下浓缩滤液，并在硅胶上通过色谱纯化得到的残留物，使用异己烷-乙酸乙酯洗脱，得到题述化合物(1.6g，50％)。
中间体12
步骤a)(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸新戊酯(I-12a)
在-5℃下，将EDAC和DMAP按份添加到Boc-丙氨酸(18.9g，100mmol) 和新戊基醇(13.0mL，120mmol)在DCM(200mL)中的溶液。使反应混合物达到室温并搅拌72小时。添加EtOAc(700mL)并使用饱和NaHCO3溶液洗涤有机相三次以及用盐水洗涤一次，然后浓缩。通过柱色谱纯化得到的残留物，使用己烷-EtOAc 90/10至80/20洗脱，得到题述化合物(21g，81％)。
步骤b)(S)-2-氨基丙酸新戊酯(I-12b)
在-65℃下，将对甲苯磺酸(15.6g，82.0mmol)添加到Boc保护的胺 I-12a(21.1g，82.0mmol)在EtOAc(330mL)中的溶液。在-65℃下搅拌反应混合物8小时，然后静置以达到室温过夜。然后过滤并浓缩混合物，得到题述化合物(21g，78％)。
(2S)-2-(((((S)-1-(新戊基氧基)-1-氧代丙-2-基)氨基)(4-硝基苯氧基)-磷酰 基)氨基)丙酸新戊酯(I-12)
在-50℃下，在1小时内将4-硝基苯酚二氯磷酸酯滴加到胺I-12b(3.90g，24.5mmol)在DCM(100mL)中的溶液。使反应混合物达到室温，搅拌过夜，浓缩然后用二乙醚稀释，在室温下静置过夜。过滤混合物，在减压下浓缩滤液并通过硅胶色谱纯化得到的残留物，以异己烷-乙酸乙酯洗脱，得到题述化合物(4.8g，77％)。
中间体13
(2S)-2-((氯(苯氧基)磷硫酰基)氨基)丙酸乙酯(I-13)
在N2下在-35℃下，将硫代磷酰氯(0.27mL，2.62mmol)添加到苯酚 (247mg，2.62mmol)在干燥DCM(8.8mL)和干燥THF(4.4mL)的混合物中的溶液。5min后，滴加三乙胺(365μL，2.62mmol)并在-35℃下搅拌反应混合物3h。添加丙氨酸乙酯×HCl(403mg，2.62mmol)并在-35℃下搅拌反应混合物5min，之后滴加三乙胺(731μL，5.24mmol)。使温度缓慢达到室温过夜(17h)。使用Et2O稀释反应混合物，过滤并在减压下浓缩。将得到的粗产物进行快速色谱(己烷：EtOAc 8：1)，得到题述化合物(659 mg，82％)，为澄清油状物。MS306.18[M-H]-。
中间体14
(2S)-2-((氯(4-氯苯氧基)磷硫酰基)氨基)丙酸新戊酯(I-14)
在氮气下，将4-氯苯酚(381μL，3.87mmol)按一份添加到在30℃下的硫代磷酰氯(400μL，3.87mmol)在DCM中的溶液，接着滴加三乙胺(1.62 mL，11.6mmol)。搅拌反应2h，同时使温度达到+5℃。添加(S)-2-氨基丙酸新戊酯(1.28g，3.87mmol)的pTs盐，并将混合物冷却至-30℃。滴加三乙胺(1.62L，11.6mmol)并使反应达到室温并搅拌过周末。将混合物浓缩到硅胶上并使用己烷/乙酸乙酯:7/1通过快速色谱纯化残留物，得到题述化合物(807mg，54％)。MS 368.34[M+H]+。
中间体15
(2S)-2-((氯(萘-1-基氧基)磷硫酰基)氨基)丙酸甲酯(I-15)
在N2下在-35℃下，将硫代磷酰氯(1当量)添加到萘酚(1当量)在干燥DCM(10mL)和干燥THF(5mL)的混合物中的溶液。5min后，滴加三乙胺(1当量)并在-35℃下搅拌反应混合物3h。添加(S)-2-氨基丙酸甲酯 (1当量)并在-35℃下搅拌反应混合物5min，之后滴加三乙胺(2当量)。使温度缓慢达到室温过夜。使用Et2O稀释反应混合物，过滤并在减压下浓缩。将得到的粗产物进行快速色谱(己烷：EtOAc 8：1)，以8.0％的收率得到题述化合物。MS564.24[M+H]+。
使用合适的苯酚和氨基酸酯，根据用于制备中间体13所述的方法制备以下中间体。
中间体32
(2S)-(R)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸仲丁酯(I-32)
在氮气下在-70℃下在15分钟内，将Et3N(10.9mL，78.1mmol)滴加到(S)-(R)-2-氨基丙酸仲丁酯(12.0g，37.7mmol)的pTs盐在DCM(50mL) 中的搅拌的溶液。在1小时内，向该混合物添加二氯磷酸苯酯(5.61mL， 37.7mmol)在DCM(50mL)中的溶液。在-70℃下再搅拌反应混合物30分钟，然后使其在2小时内升温至0℃，并搅拌1小时。将五氟苯酚(6.94g，37.7mmol)和Et3N(5.73mL，41.1mmol)在DCM(30mL)中的溶液在 20分钟内添加到混合物。使粗混合物在0℃下搅拌18小时，然后浓缩。使残留物进入THF(100mL)中，滤除不溶物并使用THF洗涤数次。蒸发溶剂并使用叔丁基甲基醚研磨残留物。滤除不溶物并使用叔丁基甲基醚洗涤。浓缩合并的滤液并使用正己烷/EtOAc(80:20；100mL)超声处理粗品固体。过滤固体，使用正己烷/EtOAc(80:20)洗涤，得到纯的题述化合物的P-立体异构体(2,3g，13％)，为白色固体。
中间体33
(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸乙酯(I-33)
根据用于I-32所述的方法制备题述化合物，但从(S)-2-氨基丙酸乙酯的 HCl盐(11.0g，71.1mmol)起始。产量8.56g，27％。
中间体34
(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸-2-乙基丁酯(I-34)
根据用于I-32所述的方法制备题述化合物，但由(S)-2-氨基丙酸-2-乙基丁酯的pTs盐(18.8g，54.4mmol)起始。产量27.0g，99％。LC-MS 496.44 [M+H]+。
中间体35
(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸丁酯(I-35)
将二氯磷酸苯酯(12.4mL，83.1mmol)添加到(S)-2-氨基丙酸丁酯(26.4 g，83.1mmol)在DCM(200mL)中的冷的(-20℃)浆液。搅拌混合物10 min然后在15min内滴加Et3N(25.5mL，183mmol)。在-20℃下搅拌混合物1小时，然后在0℃下搅拌30min。将混合物在冰浴中保持冷却并添加五氟苯酚(15.3g，0,08mol)，接着滴加Et3N(11.6mL，0.08mol)。混合物搅拌过夜并缓慢升至20℃。添加二乙醚并通过硅藻土过滤混合物，浓缩并在硅胶上通过柱色谱纯化，使用石油醚/EtOAc(9:1->8:2)洗脱。合并合适的组分，浓缩并由石油醚/EtOAc结晶，得到题述化合物的纯的P-立体异构体(2.23 g，5.8％)，为白色固体。
中间体36
(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸环己酯(I-36)
在-15℃下，将二氯磷酸苯酯(11.1mL，74.4mmol)按一份添加到L- 丙氨酸环己酯(25.5g，74.4mmol)在DCM(250mL)中的溶液。产生的混合物搅拌10min，然后在10min的时间内添加三乙胺(2.2当量)，并使反应在-15℃下进行冷却30min，并随后在室温下进行72小时。在冰上冷却反应并添加五氟苯酚(13.7g，74.4mmol)，接着在10min内添加三乙胺(1 当量)。使反应达到室温并搅拌30min。通过硅藻土垫滤除不溶性物质并使用DCM(100mL)洗涤滤饼。蒸发溶剂并在真空中干燥残留物，然后使之进入EtOAc(200mL)中并搅拌20min。通过硅藻土垫滤除不溶性物质并使用EtOAc(75mL)洗涤滤饼，并使溶液在5℃下静置过夜。将形成的晶体溶于EtOAc并使用2M NaOH(×1)、2M HCl(×1)洗涤溶液，干燥(Na2SO4) 并浓缩，得到题述化合物的几乎纯的非对映异构体(2.37g，6％)(de＝～90％)。
中间体37
(2S)-2-(((苯并[d][1,3]二氧代-5-基氧基)(全氟苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异 丙酯(I-37)
在-78℃下在N2下，将POCl3(1.79ml，19.2mmol)添加到芝麻酚(2.65 g，19.2mmol)在DCM(60mL)中的溶液，接着滴加Et3N(2.67ml，19.2 mmol)。在-20至-30℃下搅拌混合物4小时。将混合物冷却至-78℃并滴加 (S)-2-氨基丙酸异丙酯(3.22g，19.2mmol)在DCM(10mL)中的溶液，接着在15min内添加Et3N(5.62ml，40.3mmol)。使反应混合物达到室温并搅拌过夜。然后将反应混合物的温度降至0℃并按一份加入五氟苯酚(3.53 g，19.2mmol)，接着滴加Et3N(2.67ml，19.2mmol)。在0℃下搅拌获得的浆液。当通过LC-MS判断反应完成后，过滤混合物并使用冷DCM洗涤固体。浓缩滤液并重新溶于叔丁基醚中，再次过滤然后浓缩。添加EtOAc：己烷20：80并温和加热获得的浆液直到获得澄清溶液。使溶液达到室温，然后在-20℃下静置。1小时后形成晶体，滤除，使用己烷洗涤数次，然后在真空下干燥，产量：1.8g。浓缩母液，滤除形成的晶体并在真空下干燥，产量： 5.5g。总产量：7.3g，69％。MS ES+498.06[M+H]+。
使用合适的苯酚和氨基酸酯，根据用于中间体37所述的方法制备以下中间体。
1在-78℃下添加五氟苯酚而不是如在I-37中在0℃下添加
中间体41
(2S)-(S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸仲丁酯(I-41)
根据用于I-32所述的方法制备题述化合物，但从(S)-(S)-2-氨基丙酸仲丁酯(12.0g，37.8mmol)起始而不是从(S)-(R)-2-氨基丙酸仲丁酯起始。产量： 3.33g，19％。
中间体42
(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸丙酯(I-42)
根据针对I-35所述的方法制备题述化合物，但从(S)-2-氨基丙酸丙酯 (5.62g，33.53mmol)的HCl盐起始而不是从(S)-(R)-2-氨基丙酸仲丁酯的 pTs盐起始。由异丙基醚重结晶产物。产量：5.8g(38％)。LC-MS ES+454.1 [M+H]+。
中间体46
步骤a)(S)-(R)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸-1-甲氧基丙-2-酯(I-46a)
在0℃下，将EDC(6.08g，0.03mol)和4-(二甲基氨基)吡啶(0.48g， 0.004mol)添加到Boc-L-丙氨酸(5g，0.03mol)和(R)-(-)-1-甲氧基-2-丙醇 (2.59ml，0.03mol)的溶液。在融化的冰水浴上持续搅拌反应混合物，然后在室温下搅拌72h。
将反应混合物浓缩至～1/2体积，使用乙酸乙酯(400mL)稀释，并使用饱和NH4Cl(200ml)水溶液、10％柠檬酸水溶液(50mL)和饱和NaHCO3水溶液(200mL)洗涤。干燥(Na2SO4)有机层，过滤并浓缩。
通过硅胶柱色谱(Biotage SNAP ultra 100g，梯度为5-30％的乙酸乙酯的庚烷溶液)纯化粗产物，得到题述化合物(5.90g，85％)，为澄清的油状物。
步骤b)(S)-(R)-2-氨基丙酸-1-甲氧基丙-2-酯(I-46b)
将I-46a(5.88g)在4M HCl的二氧六环溶液(50mL)中的溶液搅拌 90min，然后浓缩并由二氧六环(25mL)冻干残留物，得到题述化合物(5.19 g，99％)，为盐酸盐。
步骤c)(2S)-(R)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)-丙酸-1-甲氧基丙- 2-酯(I-46)
将三乙胺(9.25mL，66.4mmol)滴加到(S)-(R)-2-氨基丙酸-1-甲氧基丙-2-酯盐酸盐(5.18g，22.1mmol)在DCM(35mL)中的冷的(0℃)溶液。将混合物冷却至-78℃并添加二氯磷酸苯酯(3.29mL，22.1mmol)在 DCM(20mL)中的溶液。搅拌混合物10min，然后滴加Et3N(25.5mL， 183mmol)15min。在-78℃下搅拌混合物5min，然后在0℃下搅拌2h。滴加在DCM(20mL)中的五氟苯酚(4.07g，22.1mmol)和Et3N(3.39mL，23.3mmol)，然后使反应混合物缓慢放置达到室温并搅拌过夜。浓缩混合物并添加THF(50mL)。滤除固体并使用THF(3×25mL)洗涤。浓缩滤液并在超声帮助下将残留物溶于叔丁基甲基醚(50ml)中。添加庚烷(50ml) 并且在室温下静置1小时后，产物从溶液析出。添加更多庚烷(50ml)并通过过滤除去固体。使用叔丁基甲基醚/庚烷1：2(50ml)和庚烷(50ml) 洗涤沉淀。在真空下干燥沉淀，得到题述化合物，根据NMR为纯异构体。 (4.32g，40％)。LC-MS ES+484.34[M+H]+。
中间体47
步骤a)(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸-1,3-二甲氧基丙-2-酯(I-47-a)
将EDC(2.79g，14.5mmol)、结晶4-(二甲基氨基)吡啶(229mg，1.88 mmol)和Et3N(5.27ml，37.8mmol)添加到Boc-L-丙氨酸(2.42g，12.8 mmol)和1,3-二甲氧基丙-2-醇(1.52g，12,6mmol)的溶液。反应混合物在室温下搅拌72h，然后使用EtOAc稀释并使用NaHCO3(水溶液，×2)、0.1M HCl(水溶液，×2)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。得到的粗产物不经处理用于下一步。
步骤b)(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)-氨基)丙酸-1,3-二甲氧基丙- 2-酯(I-47)
在22℃下，将I-47a(3.g，10.8mmol)在4M HCl的THF溶液(15mL， 60mmol)中搅拌2h，然后浓缩并与甲苯共蒸发两次。将得到的油溶于DCM (40ml)并添加二氯磷酸苯酯(1.62mL，10.8mmol)。在冰浴上冷却混合物，并在15min后缓慢添加Et3N(3.32mL，23.8mmol)。在4℃下搅拌混合物18h，然后缓慢升至22℃。再次将混合物冷却至0℃，并添加五氟苯酚 (2.01g，10.9mmol)，接着滴加Et3N(1.51mL，10.8mmol)。在0℃下搅拌混合物1小时，然后在22℃下搅拌5h。过滤混合物，并且使用EtOAc×3 (共150mL)洗涤固体。使用NaHCO3(水溶液，×2)和盐水洗涤合并的有机相，然后干燥(Na2SO4)。使溶液通过短硅胶柱，使用石油醚/EtOAc(8:2) 洗脱，收集合适的组分并浓缩，将得到的油溶于二异丙基醚并使用庚烷处理得到轻微浑浊的溶液，该溶液在静置后凝固。在4℃下使混合物静置72h，随后通过过滤收集固体，得到题述化合物(333mg，6％)。LC ES+514.0 [M+H]+。
中间体48
(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸-戊-3-酯(I-48)
根据针对I-32所述的方法制备题述化合物，但从(S)-2-氨基丙酸戊-3-酯的HCl盐(3.25g，16.6mmol)起始而不是从(S)-(R)-2-氨基丙酸仲丁酯的 pTs盐起始。产量：8.0g(18％)。LC-MS ES+482.4[M+H]+。
中间体49
根据WO2014078427中所述的过程制备题述化合物。
中间体50
(2S)-2-(((全氟苯氧基)(喹啉-6-基氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(I-50)
将氯氧磷(1.5mL，16.4mmol)添加到DCM(40ml)并且在干冰/EtOH 浴中冷却混合物。添加6-羟基喹啉(2.38g，16.4mmol)，接着滴加在DCM (5mL)中的Et3N(2.28mL，16.4mmol)。冷却并搅拌混合物3小时，然后添加异丙基丙氨酸(2.75g，16.4mmol)，接着滴加Et3N(4.57ml，32.8 mmol)。冷却并搅拌混合物5小时。添加五氟苯酚(3.02g，16.4mmol)，接着添加Et3N(2,28ml，16.4mmol)并搅拌混合物72h。使用EtOAc(200mL) 稀释混合物并使用0.1M HCl(水溶液)×2洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。使用石油醚/EtOAc(1:1)通过硅胶纯化残留物，得到米黄色溶液，该溶液在EtOAc/石油醚中凝固。通过过滤收集固体，得到题述化合物(787mg， 9.5％。
中间体51
(2S)-(S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸-1-甲氧基丙-2-酯(I-51)
根据针对I-46所述的方法制备题述化合物，但从(S)-(+)-1-甲氧基-2-丙醇(0.87mL，8.89mmol)起始而不是从(R)-(-)-1-甲氧基-2-丙醇起始。产量604 mg，14％。LC-MS ES-481.5[M-H]-。
实施例1
步骤a)(4S,5R)-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-5-(((三异丙基甲硅烷基)氧基) 甲基)二氢呋喃-2(3H)-酮(1a)
将TIPS-氯化物(16.4g，85mmol)滴加到冰冷的搅拌的(4S,5R)-4-羟基 -5-(羟甲基)二氢呋喃-2(3H)-酮(3.30g，25.0mmol)和咪唑(10.2g,150mmol) 在DMF(35mL)中的溶液。在0℃下搅拌混合物1小时，然后在室温下搅拌40小时。使用水终止反应并使用EtOAc萃取混合物三次。干燥(Na2SO4) 有机相，过滤并浓缩，通过硅胶柱色谱分离产物，使用异己烷和0至10％ EtOAc的梯度洗脱。通过硅胶柱色谱再次纯化混合的馏分，以甲苯洗脱，得到题述化合物(11.1g，94％)。
步骤b)(3S,4R,5R)-3-氟-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-5-(((三异丙基甲硅烷 基)氧基)甲基)-二氢呋喃-2(3H)-酮(1b)
在10min内将1M双(三甲基甲硅烷基)氨基锂的溶液(2.18g，13.0mmol) 滴加到在-70℃下的1a(4.45g，10.0mmol)和NFSI(4.73g，15.0mmol) 在干燥THF(50mL)中的溶液。在-70℃下搅拌混合物90min，然后添加到氯化铵和碎冰的饱和溶液。使用EtOAc萃取混合物三次，干燥(Na2SO4) 有机相，过滤并浓缩，通过硅胶色谱分离产物，使用异己烷和0至5％EtOAc的梯度洗脱。产量4.63g，67％。
步骤c)(3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-5-(((三异丙基甲 硅烷基)氧基)甲基)-二氢呋喃-2(3H)-酮(1c)
在10min内，将1M双(三甲基甲硅烷基)氨基锂的溶液滴加到在-70℃下的1b(3.08g，6.65mmol)和N-氯丁二酰亚胺(1.07g，7.99mmol)在干燥THF(25mL)中的溶液。在-70℃下搅拌混合物90min，然后添加到氯化铵和碎冰的饱和溶液。使用EtOAc萃取混合物三次，干燥(Na2SO4)有机相，过滤并浓缩，通过硅胶色谱分离产物，使用异己烷和0至5％EtOAc的梯度洗脱。产量2.40g，73％。
步骤d)(3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-5-(((三异丙基甲 硅烷基)氧基)甲基)-四氢呋喃-2-醇(1d)
在氩气下，将1M的DIBAL(2.23g，15.7mmol)在DCM中的溶液滴加到在-70℃下的1c(5.20g，10.5mmol)在干燥甲苯(50mL)中的溶液。在-70℃下搅拌混合物2小时，然后将温度升至-30℃并使用2mL MeOH终止反应，然后添加到罗谢尔盐和碎冰的混合物。搅拌混合物30分钟然后使用 EtOAc萃取三次。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱分离产物，使用异己烷和0至10％EtOAc的梯度洗脱。产量5.22g， 85％。
步骤e)甲磺酸-(2S,3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-5- (((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-酯(1e)
将甲磺酰氯(688mg，6.00mmol)缓慢添加到1d(2.00g，4.01mmol) 和TEA(608mg，6.00mmol)在DCM(20mL)中的冷却的溶液。在室温下搅拌混合物三小时，然后使用EtOAc(80mL)稀释，用饱和NaHCO3(水溶液)、HCl、水和用盐水洗涤。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并浓缩。在真空中干燥粗产物，然后不经纯化用于下一步。
步骤f)1-((2R,3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-5-(((三异 丙基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(1f)
将尿嘧啶(699mg，6.24mmol)和硫酸铵(25.8mg,0.195mmol)在六甲基二硅氮烷(HDMS)(40mL)中的悬浮液回流过夜。在真空中去除溶剂并将残留物溶于DCM(60mL)。在氩气下添加1e(2.25g，3.90mmol)，然后缓慢添加TMS三氟甲磺酸酯。在室温下搅拌混合物10分钟，然后回流4 小时。将混合物添加到冷却的碳酸氢钠溶液中并使用EtOAc萃取三次。使用盐水洗涤有机相并用硫酸钠干燥。在减压下蒸发溶液并使用异己烷和20至 50％乙酸乙酯，通过硅胶色谱纯化混合物，得到两种化合物二TIPS(1.29g， 56％)和单TIPS(390mg，23％)。
步骤g)1-((2R,3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶- 2,4(1H,3H)-二酮(1g)
在80℃下搅拌1f(1.27g，2.14mmol)在80％乙酸中的溶液18小时，然后浓缩并与甲苯一起共蒸发。将残留物溶于干燥THF(10mL)中，添加三乙胺三氢氟酸盐(1.38g，8.56mmol)，并将混合物蒸发到硅胶上并通过硅胶柱色谱纯化，使用包括0至10％MeOH的DCM洗脱。通过HPLC在 Hypercarb柱上纯化混合的组分，使用10至20％乙腈和10mmol乙酸铵洗脱，得到题述化合物(19mg，3.2％)。MS 281.2[M+H]+。
1H NMR(500MHz，DMSO)δ10.39(s,1H),7.87(d,J＝8.1Hz,1H),6.74 (s,1H),6.22(d,J＝16.1Hz,1H,7),5.73(d,J＝8.1Hz,1H),5.52(s,1H),4.21 (dd,J＝19.6,9.2Hz,1H),3.87–3.77(m,2H),3.64(dd,J＝12.7,2.8Hz,1H)。
13C NMR(126MHz,DMSO)δ162.76,150.26,139.06,115.71,113.71, 102.28,86.98,86.69,81.01,73.28,73.14,58.19。
实施例2
(2S)-2-(((((2R,3R,4S,5R)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4- 氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(2)
在氩气下，将1M叔丁基氯化镁的溶液(0.22mL，0.22mmol)缓慢添加到糖1g(28mg，0.1mmol)在THF(1.5mL)中的溶液。在0℃下搅拌悬浮液1小时，然后添加DMPU(0.5mL)，接着在～5min内在0℃下添加(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(57mg，0.12mmol) (如WO2011/123672中所述制备)在THF(0.5mL)的溶液。在0℃下搅拌混合物5h，然后使其达到室温并使用饱和氯化铵溶液终止。使用EtOAc萃取混合物三次。干燥(Na2SO4)有机相，在减压下浓缩并通过HPLC分离产物。(Gemini NX 30mm 20至60％乙腈10mmol乙酸铵梯度17分钟，流速 40ml每分钟)。产量22mg，40％。
实施例3
步骤a)乙酸-(2R,3R,4S,5R)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4- 氟-2-(羟甲基)四氢呋喃-3-酯(3a)
将4-甲氧基三苯甲基氯化物(133mg，0.43mmol)添加到化合物1f(81 mg，0.29mmol)在吡啶(25mL)中的溶液。在室温下搅拌产生的混合物 40小时，使用DCM稀释并使用NaHCO3洗涤。浓缩有机相并在硅胶上通过柱色谱纯化残留物，得到题述化合物(144mg，90％)。
将得到的化合物溶于干燥吡啶(1.4mL)，添加Ac2O(29μL，0.31mmol) 并在室温下搅拌溶液。2h后，添加MeOH，浓缩混合物并使用DCM(×3) 萃取，使用饱和NaHCO3水溶液洗涤合并的有机层，Na2SO4，浓缩并与THF 共蒸发一次。
将残留物分散在80％的HOAc(35mL)中，并在45℃下搅拌3h，然后浓缩。在硅胶上通过柱色谱纯化残留物，得到题述化合物(69mg，33％)。
步骤b)((2R,3R,4S,5R)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟- 3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基三磷酸锂(3b)
在氮气下，将新鲜制备的2-氯-1,3,2-苯并二氧杂膦-4-酮(64mg，0.31 mmol)在无水THF(280μL)中的溶液添加到搅拌的化合物3a(78mg，0.24 mmol)在无水吡啶(560μL)和无水THF(560μL)的混合物中的溶液。在氮气下在室温下搅拌混合物15分钟，然后在氮气下添加先前制备的三丁基铵P2O7(146mg，0.27mmol)和三丁基胺(127μL，0.53mmol)在无水 DMF(560μL)的溶液。在室温下在氮气下再搅拌得到的溶液15分钟，然后添加作为在吡啶/水中的溶液(98/2，v/v)(1.1mL)的I2(123mg，0.48 mmol)，并且搅拌反应混合物15分钟。通过添加～19滴5％的Na2SO3的水溶液破坏过量的碘，并浓缩反应溶液。将残留物分散在水/乙腈(95:5)(5mL) 中并在室温下保持振摇30分钟。添加浓氨水(10mL)并在室温下搅拌反应混合物11/2h，然后浓缩并将残留物溶于水/乙腈(95:5，5mL)中并冻干。
将粗材料～430mg，溶于10％MeCN/水(3mL)中，过滤并通过HPLC 在Gilson仪器上使用Phenomenex Luna 5μNH2(150×21.2mm)柱纯化，
溶剂A：95％水:5％乙腈:0.05M碳酸氢铵
溶剂B：95％水:5％乙腈:0.8M碳酸氢铵
梯度：在30min内从0％B到50％B
收集NTP组分并浓缩，将残留物溶于10％MeCN/水中并冻干。将得到的固体分散在10％MeCN/水中，通过0.45μm烧结滤器滤除不溶物并将澄清滤液蒸发至干，溶于水/乙腈(95:5)，通过Dowex-Li+并冻干，得到题述化合物(39.3mg，28％)。
1H NMR(500MHz,D2O)δ7.87(d,J＝8.2Hz,1H),6.41(d,J＝15.9Hz, 1H,1),5.98(d,J＝8.2Hz,1H),4.56(dd,J＝19.1,9.4Hz,1H,5),4.35(dddd,J ＝42.1,12.3,5.1,2.2Hz,3H),4.19(d,J＝9.4Hz,1H,8)。
13C NMR(126MHz,D2O)δ165.94,151.67,140.78,114.54,112.55,103.12, 87.95,87.62,79.45,79.38,73.16,73.02,62.60,62.56。
实施例4
(2S)-2-(((((2R,3R,4S,5R)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4- 氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸环己酯(4)
在N2下在0℃下，将t.BuMgCl(13.7mg，0.12mmol)添加到核苷1g (15mg，0.053mmol)在干燥THF(2mL)的溶液。在0℃下搅拌产生的悬浮液1h，然后添加DMPU(0.5ml)，接着滴加(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸环己酯(33mg，0.067mmol)在THF(0.5mL)中的溶液，同时将温度保持在0℃下。4h后，添加NH4Cl(饱和水溶液)并使用EtOAc萃取混合物三次。使用水和盐水洗涤合并的有机萃取液，然后干燥 (Na2SO4)并在减压下浓缩。使用Biotage(SNAP 25g)使用DCM/MeOH 梯度纯化得到的残留物，接着使用WatersGemini nx C18柱，pH 7进一步纯化。收集合适的组分，浓缩并由水共蒸发，然后由MeCN和水冻干，得到题述化合物(9.9mg，31.4％)，为白色粉末。LC-MS 590.09[M+H]+。
使用实施例4的过程，使用所示的磷酰化剂通过核苷1g的磷酸化合成以下化合物：
实施例18
步骤a)1-((2R,3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(((6-硝基-2-氧化-4H-苯并[d] [1,3,2]二氧杂膦-2-基)氧基)甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(18a)
将核苷3a(69mg，0.21mmol)溶于乙腈/二氯甲烷:2.7/1.3(～4mL) 的混合物中，并在氮气下将溶液冷却至-20℃。向该溶液添加Et3N(77μL， 0.56mmol)，接着添加制备为在DCM中的溶液的2-氯-6-硝基-4H-苯并 [d][1,3,2]二氧杂膦(125mg，0.54mmol)(1.34mL；将2mmol稀释成5mL 以获得储备溶液)。移除冷浴并在室温下搅拌反应。11/2h后，将反应冷却至-5℃并添加过(0.855mmol)在水(4.0mL)中的溶液，并剧烈搅拌两相体系15min。然后使用EtOAc萃取混合物，分离相并使用冷水(2×)洗涤有机相，干燥(Na2SO4)，浓缩并从庚烷/DCM共蒸发，LCMS 536[M+H]。使该粗材料进入下一步。
步骤b)((2R,3R,4S,5R)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟- 3-羟基四氢呋喃-2-基)甲基三氢二磷酸(18b)
将化合物18a与干燥DMF共蒸发一次，然后溶于干燥DMF(2.2mL) 中，并在氮气下添加双-三丁基胺磷酸(0.25mmol，0.5mL，0.5M，在DMF 中)。在室温下搅拌溶液～17h，然后在真空中浓缩，并添加数毫升水，接着添加浓氨水(25-30mL)和THF(1-2mL)，并在室温下搅拌该混合物。2 小时后，通过蒸发去除大部分NH3并使用DCM(4x40mL)萃取残留物。浓缩水层并将残留物溶于10％MeCN/超纯水中。滤除不溶物并将滤液浓缩至干燥。
将得到的残留物溶于10％MeCN/水(1.5mL)，装载到活性炭柱 (0.85×3.00cm)上并用10％MeCN/超纯水洗脱。收集合适的组分，浓缩，与MeCN(×2)共蒸发并最后在冻干机上干燥。
将粗残留物(76mg)溶于10％MeCN/超纯水(1mL)中并通过半制备 HPLC在Luna NH2柱上在Gilson机器上在20min内使用0％B至30％B的梯度(30mL/min)(溶剂A:0.05M碳酸氢铵，5％乙腈；溶剂B:0.8M碳酸氢铵，5％乙腈)纯化。收集合适的组分并浓缩至干燥，将残留物溶于含有一些MeCN的超纯水中并冻干。将蓬松的残留物分散在10％MeCN在超纯水的溶液中，通过0.2μm滤器过滤悬浮液，收集澄清滤液并冻干，得到题述化合物(28.6mg，36％)。LCMS ES-438.8[M-H]-。
实施例19化合物1的供选择的合成路线
步骤a)(3S,4R,5R)-乙酸-3-氯-3-氟-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-5-(((三异 丙基甲硅烷基)氧基)甲基)-四氢呋喃-2-酯(19a)
在-35℃下在氩气中，将1M Li(O-t-Bu)3AlH在THF(39mL，39mmol) 中的溶液滴加到化合物1c(16.3g，32.8mmol)在THF(120mL)中的溶液。在-35℃下搅拌混合物1h，然后在室温下搅拌1h。将混合物冷却至-25℃，添加DMAP(4.00g，32.8mmol)并搅拌混合物15分钟，然后滴加乙酸酐 (33.5g，328mmol)并搅拌混合物2h。使混合物达到0℃，并添加EtOAc(200mL)和水(200mL)。分离相并使用EtOAc(×2)萃取水相。使用水(×2)和盐水(×1)洗涤合并的有机相。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并在减压下浓缩。残留物与甲苯共蒸发两次，并且在硅胶上通过色谱纯化产物，使用异己烷和2至6％EtOAc洗脱，得到题述化合物(17.1g，96％)。
步骤b)(3S,4R,5R)-乙酸-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-酯(19b)
将三乙胺三氢氟酸盐(20.5g，126mmol)添加到化合物19a(17.0g， 31.4mmol)在乙腈(115mL)和THF(23mL)中的搅拌的溶液。在室温下搅拌混合物72小时，在50℃下搅拌20小时，然后在室温下过夜。在硅胶(60 g)上浓缩溶液并通过硅胶色谱纯化，使用异己烷和EtOAc的梯度洗脱，得到题述化合物(68.0g，85％)。
步骤c)(2R,3R,4S)-苯甲酸-5-乙酰氧基-2-((苯甲酰基氧基)甲基)-4-氯-4-氟四 氢呋喃-3-酯(19c)
在冰冷却下将三乙胺(10.8g，107mmol)添加到化合物19b(6.80g， 26.8mmol)的搅拌的溶液，接着滴加苯甲酰氯(9.41g，66.9mmol)。使混合物达到室温并搅拌过夜。添加EtOH(5mL)并搅拌混合物30分钟，然后在真空下浓缩。添加水并使用EtOAc(×3)萃取混合物。使用水和盐水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)、过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱纯化产物，使用异己烷和EtOAc的梯度洗脱，得到题述化合物(10.1g，86％)。
步骤d)((2R,3R,4S)-3-(苯甲酰基氧基)-4-氯-4-氟-5-羟基四氢呋喃-2-基)甲基 苯甲酸酯(19d)
将乙醇胺(1.55g，25.4mmol)添加到化合物19c(10.1g，23.0mmol) 在EtOAc(100mL)和DMSO(50mL)中的搅拌的溶液。在室温下搅拌混合物72小时，然后使用二乙醚(300mL)和EtOAc(300mL)稀释并用水 (×4)洗涤。使用EtOAc萃取合并的水相，然后使用盐水(×2)洗涤EtOAc 相。干燥(Na2SO4)合并的有机相、过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱纯化产物，使用DCM和EtOAc的梯度洗脱，得到题述化合物(7.50g，82％)。
步骤e)((2R,3R,4S)-苯甲酸-3-(苯甲酰基氧基)-4-氯-4-氟-5-((甲基磺酰基)氧 基)四氢呋喃-2-基)甲酯(19e)
在N2下在-15℃下，将Et3N(3.54mL，25.4mmol)添加到化合物19d (8.36g，21.2mmol)在干燥DCM(100mL)中的溶液，接着添加MsCl (1.97mL，25.4mmol)。在-15℃下搅拌反应混合物2小时，然后倒入HCl (80mL，1M，水溶液)。分离相并使用DCM萃取水层。使用NH4Cl(饱和水溶液)洗涤合并的有机萃取液，干燥(MgSO4)并在减压下浓缩，以得到题述化合物(9.86g，98％)，为澄清油状物。
步骤f)((2R,3R,4S,5R)-苯甲酸-3-(苯甲酰基氧基)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4- 二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟四氢呋喃-2-基)甲酯(19f)
在N2下在HMDS(49.3mL，236mmol)中将尿嘧啶(3.09g，27.5mmol) 和硫酸铵(48.5mg，0.367mmol)加热至回流16小时。将反应混合物冷却至室温，在减压下浓缩并在真空中干燥。在N2下将在干燥DCE(50mL) 中的残留物添加到化合物19e(8.68g，18.4mmol)在干燥DCE(75mL) 的溶液。在N2下将TMSOTf(6.12g，27.5mmol)缓慢添加到溶液。在添加后，将反应混合物加热至80℃达5小时，然后在65℃下加热16小时。将反应混合物冷却至室温，使用NaHCO3(饱和水溶液)终止，过滤并使用DCM 萃取两次。干燥(MgSO4)合并的有机萃取液并在减压下浓缩。添加EtOAc 和DCM并且通过过滤收集形成的沉淀，得到纯β-异构体(660mg，7.4％)。将滤液蒸发到硅胶上并通过快速色谱(hex:EtOAc 2:1-1:1)纯化，得到题述化合物，其为与α-异构体的混合物，α:β>5:95(942mg，11％)。
步骤e)1-((2R,3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶- 2,4(1H,3H)-二酮(19e)
将化合物19f(670mg，1.37mmol)悬浮在NH3(7N，在MeOH中) 中。30min后，添加EtOH(5mL)并在室温下搅拌悬浮液。又过了一个小时后，悬浮液变成溶液，并且在室温下搅拌反应混合物15小时。在减压下蒸发溶剂并通过快速色谱(DCM:MeOH 10:1)纯化得到的残留物，得到题述化合物(380mg，99％)，为白色固体。LC-MS ES-279.31[M-H]-。
使用实施例4的过程，使用所示的磷酰化剂通过核苷1g的磷酸化合成以下化合物：
1反应混合物中不存在DMPU
218h后，添加另外的0.8当量的磷酰化剂(I-49)
实施例26
步骤a)(2R,3R,4S,5R)-4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-2- (((4-甲基苯甲酰基)氧基)甲基)四氢呋喃-3-基4-甲基苯甲酸酯(26a)
将核苷1g(253mg，0,9mmol)溶于吡啶(5ml)和DCM(5ml)中。添加三乙胺(630μl，4,52mmol)并在冰浴上冷却混合物。15min后，添加 4-甲基苯甲酰氯(300μl，2,27mmol)，并冷却并搅拌混合物10min，然后在22℃下搅拌90min。添加NaHCO3(水溶液)，使用DCM稀释混合物并使用1M HCl(水溶液)×3洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。在硅胶上通过柱色谱纯化残留物，以石油醚/EtOAc(3:1)洗脱，得到题述化合物(279.2mg， 60％)。LC-MS
步骤b)4-氨基-1-((2R,3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)-四氢呋喃-2- 基)嘧啶-2(1H)-酮(26b)
将化合物26a(279mg，0.54mmol)溶于吡啶(5mL)中，添加分子筛 (半勺)并在冰浴上搅拌混合物15min。添加氯氧磷(200μl，2.18 mmol)，5min后，添加1,2,4-1H-三唑(373mg，5,4mmol)。边冷却边搅拌混合物15min，然后在22℃下搅拌5h。
添加氨水(32％，10mL，82.2mmol)并在22℃下搅拌混合物过夜。浓缩混合物，溶于水并使用EtOAc×2洗涤。使用水萃取合并的有机层，浓缩合并的水萃取液，并且在硅胶上，通过柱色谱纯化残留物，以DCM/MeOH (8:2)洗脱，得到题述化合物(139mg，83％)。MS ES+279.9[M+H]+。
步骤c)(2S)-2-(((((2R,3R,4S,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氯-4- 氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(26c)
将化合物26b(27.4mg，0.1mmol)溶于含有分子筛的干燥THF(6mL) 中，并且在22℃下搅拌混合物30min，然后添加在THF(0.11ml)中的2M 叔丁基氯化镁，并且再搅拌混合物30min。添加(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(51.4mg，0,11mmol)并搅拌混合物15小时，然后使用EtOAc稀释，使用NaHCO3(水溶液)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。通过YMC-硅胶纯化残留物，使用DCM:MeOH(95:5→90:10) 的梯度洗脱。收集合适的组分并浓缩。使用Gemini C18柱，以乙腈/水(pH 7，0.01M NH4OAc，20-40％)的梯度洗脱，通过制备HPLC纯化残留物。浓缩产物，然后在氟苯基柱上纯化，以MeOH/水(pH7，0.01M NH4OAc， 33-50％)的梯度洗脱。收集产物，溶于乙腈/水(1:4)并冻干，得到题述化合物(13mg，24％)LC-MS 548.9[M+H]+。
实施例27
步骤a)N-(1-((2R,3S,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)- 2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基)异丁酰胺(27a)
在58℃下，将异丁酸酐(118mg，0.746mmol)添加到核苷26b(139mg， 0.497mmol)在二氧六环(1.7mL)和水(0.19mL)中的溶液。在58℃下搅拌溶液3h，然后浓缩。将残留物溶于在DCM中的20％EtOH中，并使用饱和NaHCO3水溶液/盐水30:70v/v洗涤(×4)，干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩。通过硅胶柱色谱纯化残留物，使用EtOH/DCM(2→8％)的梯度洗脱，得到题述化合物，为固体(62mg)。
步骤b)(2R,3R,4S,5R)-4-氯-4-氟-5-(4-异丁酰胺-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-2- (((4-甲氧基苯基)二苯基甲氧基)甲基)四氢呋喃-3-基异丁酸酯(27b)
将4-甲氧基三苯甲基氯化物(65.7mg，0.177mmol)添加到化合物27a (62mg，0.177mmol)在吡啶(1.1mL)中的溶液，并且所产生的混合物在室温下振摇约6h，然后添加另外的4-甲氧基三苯甲基氯化物(16mg，0.3 当量)，并再振摇混合物18h。添加异丁酸酐(33.6mg，0.212mmol)并在室温下振摇溶液4h。使用MeOH终止反应，然后浓缩并使用DCM(×3)/ 饱和NaHCO3水溶液萃取。干燥(Na2SO4)有机相，过滤并浓缩，残留物与甲苯共蒸发两次并与THF共蒸发两次。使得到的固体残留物直接进入下一步。
步骤c)(2R,3R,4S,5R-4-氯-4-氟-2-(羟甲基)-5-(4-异丁酰胺基-2-氧代嘧啶-1 (2H)-基)四氢呋喃-3-基-异丁酸酯(27c)
将化合物27b(123mg，0.177mmol)溶于80％AcOH(25mL)和THF (5mL)中，并在45℃下搅拌溶液2h，然后浓缩并与THF(×3)和甲苯(×1) 共蒸发。在硅胶上通过柱色谱纯化残留物，使用0→4％EtOH的DCM中的溶液的梯度洗脱，得到题述化合物(36mg，经过3步48.5％)。LC-MS 420.0 [M+H]+。
步骤d)(((2R,3R,4S,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-4-氯-4-氟-3-羟基 四氢呋喃-2-基)甲基)三磷酸(27d)
将化合物27c(36.0mg，0.086mmol)溶于MeCN/DCM:1.06/0.54(～1.6 mL)的混合物中，并在氮气下将溶液冷却至-20℃。将Et3N(31.1μL，0.223 mmol)添加到溶液，接着添加2-氯-6-硝基-4H-苯并[d][1,3,2]二氧杂膦(50.1 mg，0.214mmol)在DCM(0.71mL)中的溶液。移除冷浴并在室温下搅拌反应11/2h。将反应冷却至-5℃并添加过在水(1.73mL)中的溶液 (0.343mmol)，并剧烈搅拌两相体系15min。使用乙酸乙酯萃取混合物，使用冷水(2×)洗涤有机相，干燥(Na2SO4)并浓缩。将残留物与甲苯共蒸发一次并与干燥DMF共蒸发一次，然后溶于干燥DMF(1mL)中。在氮气下添加焦磷酸三丁基胺(0.1mmol，54.6mg)并且溶液在室温下振摇～18h，然后浓缩。将30％MeCN/H2O(～20mL)添加到残留物并且在室温下振摇溶液20-25min。蒸发挥发物，将残留的油-固体混合物溶于浓氨水(10-15mL) 并在室温下振摇约5小时。
通过蒸发去除大部分NH3，然后使用DCM(4×40mL)萃取残留物。丢弃有机萃取液并浓缩水层。将残留物溶于5％MeCN的水溶液(1.5-2.0mL) 中并装载到活性炭柱(0.85×2.5)上。使用5％MeCN的水溶液冲洗柱，收集 6-7mL洗脱液，并浓缩和冻干。将残留物溶于5％MeCN/水(1.6mL)中，在Gilson机器上使用Phenomenex Luna 5μNH2柱通过半制备HPLC纯化，在30min内以0％B至40％B的梯度(30mL/min)洗脱(溶剂A:0.05M碳酸氢铵，5％乙腈；溶剂B:0.8M碳酸氢铵，5％乙腈)。收集合适的NTP组分并浓缩至干燥，将残留物溶于具有5％MeCN的MQ水中并冻干。将残留物分散在5％MeCN的MQ水溶液(4-5mL)中，通过0.45μm滤器过滤悬浮液，并浓缩滤液。将残留物溶于5％MeCN的水溶液(0.5mL)中，施加到短Li+Dowex柱(6×1cm)上并使用5％MeCN的水溶液洗涤。收集前～10 mL，浓缩并冻干，得到题述化合物(11.7mg，30％)，纯度为89％，根据 PI分析包含6.6％NDP。MS ES+519.9[M+H]+。
选择的示例性化合物的NMR数据：
化合物9
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.55(d,J＝7.8Hz,1H),6.87(d,J＝8.4 Hz,1H),6.84(d,J＝1.7Hz,1H),6.76-6.60(m,2H),6.32-6.19(m,1H),6.10- 6.01(m,1H),6.02(s,2H),5.62(d,J＝8.1Hz,1H),4.86(p,J＝6.3Hz,1H), 4.37-4.15(m,4H),4.07-3.97(m,1H),3.79(tq,J＝10.1,7.1Hz,2H),1.23(d,J ＝7.1Hz,3H),1.16(d,J＝6.3Hz,5H)。
13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ172.50,147.46,144.86,144.81,143.91, 115.06,115.05,113.05,113.05,112.41,112.40,112.37,112.37,107.88,102.36, 102.34,101.52,78.74,74.44,74.30,67.90,64.28,49.65,40.63,40.40,40.34, 40.27,39.99,39.90,39.83,39.73,39.66,39.57,39.40,39.23,39.07,38.90,21.28, 21.26,19.72,19.67,-0.00。
化合物10
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.58(d,J＝8.1Hz,1H),7.28(d,J＝8.0 Hz,1H),7.20–7.05(m,2H),6.90(td,J＝7.9,1.6Hz,1H),5.60(d,J＝8.1Hz, 1H),4.87(dq,J＝12.5,6.2Hz,1H),4.41–4.20(m,5H),4.09–3.99(m,1H), 4.00–3.77(m,2H),3.79(s,3H),1.79(s,1H),1.22(d,J＝7.1Hz,3H),1.16(d,J ＝6.3Hz,5H)。
13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ172.59,172.55,162.64,150.28,150.24, 150.09,139.37,139.32,125.29,120.90,120.88,120.25,115.03,113.02,112.85, 102.25,78.82,74.38,74.24,67.85,64.26,55.59,49.57,40.26,40.20,40.17, 39.99,39.90,39.82,39.73,39.66,39.57,39.40,39.23,39.07,38.90,21.30,21.26, 19.63,19.58。
化合物11
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.57(d,J＝8.1Hz,1H),7.13(d,J＝8.3 Hz,2H),6.98–6.86(m,3H),6.25(t,J＝16.6Hz,1H),5.62(d,J＝8.1Hz,1H), 4.86(hept,J＝6.2Hz,1H),4.37–4.15(m,4H),4.07–3.97(m,1H),3.78(tq,J ＝10.2,7.1Hz,1H),3.72(s,2H),1.23(d,J＝7.1Hz,3H),1.22–1.11(m,8H)。
13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ172.52,172.48,162.65,155.91,150.08, 143.96,143.91,120.95,120.92,114.99,114.42,112.98,102.27,78.77,74.44, 74.30,67.86,64.21,55.29,49.65,40.25,40.15,39.99,39.90,39.83,39.74,39.66, 39.57,39.40,39.24,39.07,38.90,21.30,21.27,19.69,19.64。
化合物13
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.82(t,3H),1.12(d,3H),1.25(d,3H), 1.49(m,2H),3.83(dtd,1H),4.02(m,1H),4.26(dt,2H),4.34(m,1H),4.72(h, 1H),5.58(d,1H),6.12(dd,1H),6.26(m,1H),7.20(m,3H),7.37(t,2H),7.53(d, 1H)。
13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ9.35,19.05,19.77(d),28.00,40.08, 49.72,64.32,72.27,74.35(d),78.72(m),102.36,114.08(d),119.95(d),124.49, 129.54,150.53(d),163.41(m),172.62(d)。
化合物15
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.16(d,6H),1.24(d,3H),1.80(m,1H), 1.96(m,1H),2.05(pdd,2H),2.26(m,2H),3.49(p,1H),3.81(tq,1H),4.04(m, 1H),4.30(m,3H),4.86(hept,1H),5.60(d,1H),6.07(dd,1H),6.24(d,1H),6.68 (d,1H),7.03(m,3H),7.28(t,1H),7.58(d,1H).
13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ17.58,19.65(d),21.26,21.29,29.13, 49.65,64.33,67.87,74.37(d),78.78,102.28,113.98(d),117.35(d),117.76(d), 122.45,129.25,139.49,147.50,150.05,150.56,162.56,172.48(d)。
化合物16
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ0.78(m,8H),1.15(d,12H),1.23(d,7H), 1.35(s,6H),3.80(tq,2H),4.03(m,2H),4.25(m,4H),4.34(m,2H),4.86(p, 2H),5.59(d,2H),6.07(dd,2H),6.24(d,2H),6.72(s,1H),7.01(m,6H),7.26(t, 2H),7.57(d,2H)。
13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ16.03,18.82,19.65(d),21.26,21.30, 24.42,49.63,64.29,67.87,74.35(d),78.78,87.51,102.30,114.00(d),116.92(d), 117.60(d),122.06,129.18,139.60(m),148.45,150.13,150.50(d),162.69, 172.47(d)。
化合物17
13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ15.52,18.66,19.65(d),21.25,21.30, 24.98,49.67,64.23,67.87,74.35(d),78.76,87.49,102.25,113.97(d),119.69(d), 127.19,139.65(d),142.69,148.17(d),150.02,162.52,172.46(d)。
化合物21
1H NMR(500MHz,DMSO)δ1.25(d,3H),3.23(m,6H),3.41(m,4H), 3.87(ddt,1H),4.04(m,1H),4.31(m,3H),5.02(p,1H),5.61(d,1H),6.20(m, 2H),7.21(m,3H),7.38(t,2H),7.57(d,1H)。
13C NMR(126MHz,DMSO)δ19.72(d),49.60,58.36,64.28,70.33,70.46, 71.53,74.38(d),78.81(d),102.26,114.00(d),119.99(d),124.53,129.55, 150.03,150.51(d),162.54,172.59(d)。
化合物24
1H NMR(500MHz,DMSO)δ1.15(dd,6H),1.22(d,3H),3.52(m,1H), 3.78(tq,1H),4.05(m,1H),4.16(m,1H),4.26(dt,1H),4.34(m,1H),4.86(hept, 1H),5.65(d,1H),6.14(dd,1H),6.23(s,1H),6.27(s,1H),7.21(m,3H),7.37(t, 2H),7.50(d,1H)。
13C NMR(126MHz,DMSO)δ19.62(d),21.25(d),49.61,63.83,67.92, 74.16(d),78.53,102.42,114.03(d),119.85(d),124.49,129.58,139.35(dd), 150.26,150.56(d),162.87,172.51(d)。
化合物26b
1H NMR(500MHz,DMSO)δ3.62(d,1H),3.80(m,2H),4.15(dd,1H), 5.26(s,1H),5.77(d,1H),6.31(d,1H),6.41(s,1H),7.33(s,1H),7.36(s,1H), 7.73(d,1H)。
13C NMR(126MHz,DMSO)δ58.50,58.62,73.62(d),80.48,87.01(m), 94.50,94.56,114.92(d),140.04,154.57,165.42。
化合物27d
1H NMR(500MHz,D2O)δ4.12(d,1H),4.24(ddd,1H),4.33(m,1H), 4.46(dd,1H),6.09(d,1H),6.39(d,1H),7.80(d,1H)。
13C NMR(126MHz,D2O)δ62.48(d),73.03(d),78.99(d),88.15(d), 97.04,113.71(d),140.63,157.39,166.21。
生物学实施例
复制子分析
可以在细胞分析中检查式I的化合物对HCV RNA复制的抑制的活性，所述细胞分析目的在于确定抑制HCV功能细胞复制细胞系，也被称为HCV 复制子的化合物。适合的细胞分析基于双顺反子表达构建体，如Lohmann 等人(1999),Science vol.285pp.110-113所述，其修改方案在Krieger等人 (2001),Journal of Virology 75:4614-4624中描述，涉及多靶点筛选策略。
该分析使用稳定转染的细胞系Huh-7luc/neo(下文称为Huh-Luc)。该细胞系包含(harbors)RNA编码的双顺反子表达构建体，所述构建体包括由来自脑心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)翻译的HCV 1b型的野生型NS3-NS5B区域，前面是报告基因部分(FfL-荧光素酶)和选择标记基因部分(neoR，新霉素磷酸转移酶)。构建体与来自HCV 1b型的 5’和3’NTR(非翻译区域)邻接。复制子细胞在G418(neoR)存在下的连续培养取决于HCVRNA的复制。表达HCV RNA的稳定转染的复制子细胞自动复制并以高水平编码尤其是编码荧光素酶，被用于筛选抗病毒化合物。
在以不同浓度添加的测试和对照化合物的存在下，将复制子细胞平铺于 384孔板中。在孵育三天后，通过分析荧光素酶活性(使用标准荧光素酶分析底物和试剂和PerkinElmer ViewLuxTM ultraHTS微板成像仪)测量HCV 复制。在对照培养物中的复制子细胞在缺乏任何抑制剂的情况下具有高荧光素表达。在Huh-Luc细胞上监测化合物对荧光素酶活性的抑制活性，得到每种测试化合物的剂量-响应曲线。然后计算EC50值，该值表示使检测的荧光素酶活性的水平降低50％所需的化合物的量，或更具体地，复制遗传相关的 HCV复制子RNA的能力。
酶分析
如复制子分析中可以证实的，本发明的化合物通过靶组织中的细胞激酶代谢成5'-三磷酸。该三磷酸被认为是抗病毒活性物质。此处描述的酶分析可以用于证实本发明的化合物与5'-三磷酸代谢物一样具有抗病毒活性。
酶分析测量三磷酸化合物在HCV NS5B-21(21-氨基酸C-末端截短版本) SPA分析(闪烁迫近分析)中的抑制作用。该分析通过评价放射性标记的 ATP进行，所述放射性标记的ATP使用异源生物素化的RNA模板通过HCV NS5B-21掺入新合成的RNA中。
为了测定IC50值，在不同浓度下在终体积为100μl的反应混合物中测试化合物。通过添加0.5M EDTA溶液停止反应。
将样品转移到预涂覆链霉亲和素的闪板中。使用闪烁计数器(Wallac MicrobetaTrilux)定量掺入的放射性活度。
材料&供应商
涂覆链霉亲和素的闪板 PerkinElmer Life Sciences
96孔聚丙烯板 Corning
生物素化的RNA模板：具有序列Medprobe
5′-UUU UUU UUU UAG UCA GUC
GGC CCG GUU UUC CGG GCC-3’并在
5′-引物末端生物素化，在10mM
Tris-HCl，100mM NaCl，pH＝8.0中配制
成83μM
酶：HCV NS5B-21，在水中配制成Replizyme
500μg/ml
核苷酸：GTP、CTP、UTP Invitrogen
放射性标记的3H-ATP(目录号TRK747) GE Healthcare
0.5M EDTA，pH＝8.0 Life Technologies
Tris-HCl Sigma
MnCl2 Sigma
乙酸铵 Sigma
DTT(二硫苏糖醇) Sigma
CHAPS Sigma
RNase Out(目录号10777-019) Invitrogen
DMSO Carlo Erba Reactifs – SDS
设备
Wallac Microbeta Trilux Perkin Elmer Life Sciences
方法
分析条件
分析应包括酶对照(约四种，包含1μl DMSO代替抑制剂)和包含除模板以外的所有成分的背景对照。
在单独的稀释板上在DMSO中连续稀释化合物到100×最终希望的分析浓度。
根据下表针对孔的数量制备足够的反应混合物，并以90μl/孔添加到96 孔聚丙烯板。除了在酶对照孔和背景对照孔中添加1μl DMSO，将来自稀释板的DMSO中的1μl化合物添加到每个孔。
反应混合物
组分 μl/孔
50mM tris-HCl pH＝7.5 40
1M乙酸铵 10
1M MnCl2 0.25
0.5M DTT 2
100mM CHAPS 2
RNase Out 0.2
1mM GTP 5
200μM CTP+UTP 2
NS5B-21 500μg/ml 0.4
模板：RNA-H3，83μM 0.1
模板缓冲液：10mM tris-HCl，100mM NaCl pH＝8.0 28.25
制备包含1.5μl/孔的3H-ATP(45Ci/mmol)、2.0μl/孔的100μM ATP和 6.5μl/孔的H2O的ATP混合物，并通过添加10μl/孔的该混合物开始反应。
在22℃下孵育120min。
通过添加100μl/孔的0.5M EDTA，pH＝8.0停止反应。
以185μl/孔转移至链霉亲和素闪板。
孵育板过夜并使用闪板H3方案在Microbeta Trilux中读取闪板。
结果的处理
计算抑制：
背景＝没有模板的反应缓冲液
使用Graphpad Prism确定IC50。绘制化合物浓度的对数与百分比抑制曲线。使用非线性回归将曲线拟合成Log(抑制剂)相对于响应的方程。
其中Y为抑制％，X为log(抑制剂)，顶部和底部是抑制％的上限和下限。
生物学实施例1
在上述复制子分析中，测试本发明的化合物显示的对HCV复制的抑制。化合物显示亚微摩尔活性，在Huh-Luc细胞系中的细胞毒性超过50μM。EC50值显示在表1中。
表1
生物学实施例2
在上述酶分析中测试实施例3和27的核苷酸，并且IC50值分别确定为 0.72μM和0.089μM。
比较例1
索非布韦在几个国家销售用于治疗HCV，主要针对基因型1和4。索非布韦的结构为：
如所见的，索非布韦与本实施例2的化合物不同之处在于其在2’-位具有β-甲基，而本发明的化合物在该位置具有β-氯取代基。在Lawitz等人,N. Eng.J.Med.,2013；368:1878-87报导的分裂生殖期III临床试验中，“索非布韦–利巴韦林组中的响应速率在具有基因型3感染的患者中比在具有基因型2感染的患者中更低(56％相对于97％)”。
在Kylefjord等人，J Virol.Methods 2014 195:156-63中描述的基因型3a 瞬态复制子分析中，比较市售索非布韦和实施例2的化合物的抗病毒活性。
索非布韦针对基因型3a的EC50为0.230μM+/-0.067，n＝11，相比之下实施例2的化合物的EC50为0.072μM+/-0.024，n＝9。本发明的化合物相对于索非布韦好三倍的效力预期显著提高临床的病毒响应速率。
本发明的化合物相对于索非布韦的效力的数倍提高在具有麻烦的S282T 突变(赋予对HCV核苷美西他滨(美西他滨)的抗性)的基因型3a的瞬态复制子中保持，其中索非布韦具有0.48μM(n＝1)的EC50并且实施例2的化合物具有0.13μM(n＝1)的EC50。类似地，在如以上Kylefjord等人(出处同上)描述的基因型3a瞬态复制子中通过暴露于核苷美西他滨并赋予对索非布韦的交叉抗性生成L159F/L320F双突变体(Tong等人2013J.Infect. Dis.,209(5),668-75)。在该双突变体中，索非布韦具有0.190(n＝1)的EC50，而实施例2的化合物显示0.062(n＝1)的EC50。
进一步评价实施例2的化合物以评估针对HCV基因型1-6，野生型和许多临床上相关的突变株两者的抗病毒活性。评价的结果以及基因型的平均 EC50和针对索非布韦的相应的值在表2和3中总结。
表2
EC50数据(均以μM计)作为几何平均数提供，除了AVG的EC50作为算术平均数+/-SEM提供。
*在con1背景中包含所述GT NS5B基因的嵌合体复制子。
参考文献：Con1(Lohmann等人2003)；H77(Blight等人2003)；GT2a (Wakita等人2005)；GT3a(Kylefjord等人2013)；GT4-6(Wong等人 2012)；L159F/L320F(Tong等人2013)。
表3
EC50数据(均以μM计)作为几何平均数提供，除了AVG的EC50作为算术平均数+/-SEM提供。
*在con1背景中包含所述GT NS5B基因的嵌合体复制子。
参考文献：Con1(Lohmann等人2003)；H77(Blight等人2003)；GT2a (Wakita等人2005)；GT3a(Kylefjord等人2013)；GT4-6(Wong等人 2012)；L159F/L320F(Tong等人2013)。
从这两个表中显而易见的是，本实施例2的化合物与索非布韦相比，具有针对在野生型菌株和两个临床相关突变株中的HCV GT3a的显著改进的效力，同时保持针对其他基因型的良好效力。
三磷酸形成分析
为了估算本发明的化合物生成抗病毒活性三磷酸物质的能力，进行三磷酸形成分析。在分析中一式三份地测试每种化合物。
使用在12孔板中平铺培养的新鲜的人肝细胞(Biopredic,France)。在每个孔中平铺0.76×106个细胞并在37℃在CO2孵育器中，在1mL孵育介质中与10μM化合物的DMSO溶液(0.1％DMSO)孵育6-8小时。通过使用 1mL冰冷的汉克平衡溶液(pH 7.2)洗涤每个孔两次停止孵育，接着添加 0.5mL冰冷的70％甲醇。添加甲醇后，紧接着通过细胞刮棒使细胞层与孔底部脱离，并使用自动移液管上下吸取5-6次。将细胞悬浮液转移至玻璃瓶并在-20℃下储存过夜。
随后涡旋震荡样品，所述样品各自由不同水平的蛋白质族化合物，游离核苷和单、二和三磷酸组成，并在Eppendorf离心机5417R中在10℃下以 14000rpm离心10分钟。通过插入物将上清液转移至2mL玻璃瓶中并进行生物分析。
生物分析
将内标(茚地那韦)添加到每种样品，并在偶联到QTRAP 5000质谱仪的双柱系统上分析样品(10μL注射体积)。双柱系统由两个二元泵X和Y、两个开关阀和自动进样器组成。使用的两个HPLC柱为Synergy POLAR-RP 50*4.6mm,4μm颗粒和BioBasic AX 50*2.1mm 5μm颗粒。LC流动速率为 0.4-0.6mL/min mL/min(在复原步骤中使用更高的流动速率)。
POLAR-RP柱的HPLC流动相由10mmol/L乙酸铵的2％乙腈溶液(流动相A)和10mmol/L乙酸铵的90％乙腈溶液(流动相B)组成，对于BioBasic AX柱，由10mmol/L乙酸铵的2％乙腈溶液(流动相C)和1％氢氧化铵的 2％乙腈溶液(流动相D)组成。泵Y的HPLC梯度在0％流动相B开始并保持2min。
在装载期，流动相穿过POLAR-RP和BioBasic AX柱，并且前药、核苷和内标留在POLAR-RP柱上；而核苷酸(单-、二-和三磷酸)洗脱到BioBasic AX柱上并截留在那里。
在下一步中，流动从POLAR-RP柱转换到MS并且流动相C从泵X转换到BioBasic AX柱。使用从0％B至高达100％B的梯度在约两分钟内洗脱POLAR-RP柱上的化合物，并使用多反应监测模式(MRM)以阳性或阴性模式分析。
在最后的步骤中，来自BioBasic AX柱的流动转换到MS并使用约7分钟达到50％D的梯度洗脱磷酸酯，并使用MRM以阳性或阴性模式分析。在最后的步骤期间，复原两根柱。
然后通过与标准曲线比较来确定每种化合物的三磷酸浓度。通过分析具有已知浓度的三磷酸标准样品制备标准曲线。在与测试样品相同的基质中操作标准品。由于磷酸化水平根据肝细胞供体变化，在分析的每次操作中需要内参化合物以实现来自彼此不同的操作的结果的排列。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有需要，单词“包括(comprise)”和变形如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将理解为意味着包括规定的整数、步骤、整数组或步骤组，但不排除任何其他的整数、步骤、整数组或步骤组。
将本文提及的所有文献，包括专利和专利申请的全部内容通过引用并入。

Claims (5)

1.以下化合物或其药学上可接受的盐，
2.根据权利要求1所述的化合物在制备药物中的用途。
3.根据权利要求1所述的化合物在制备用于治疗或预防丙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
4.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的化合物连同药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体。
5.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的化合物，还包含一种或多种另外的其他抗病毒剂。
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