CN106536538A - 用于治疗黄病毒家族病毒和癌症的2’‑双取代核苷类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗或预防人类受试者或其他动物宿主中的黄病毒科病毒(包括HCV、黄热病、登革热、基孔肯雅和西尼罗病毒)、RSV和流感感染和癌症的化合物、组合物和方法。所述化合物也是其药学上可接受的盐、前药和其它衍生物，作为用于治疗或预防HCV感染的药物组合物和方法。

Description

用于治疗黄病毒家族病毒和癌症的2’-双取代核苷类似物
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染以及其他黄病毒，RSV、流感和癌症的化合物、方法及组合物。更具体地说，本发明描述某些核苷和核苷酸类似物、其药学上可接受的盐或其它衍生物，以及其在治疗黄病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感和癌症中的用途。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)在全世界已经感染了超过一亿七千万人口。据估计每年有三至四百万人被新感染，其中70％的人将发展为慢性肝炎。HCV导致所有的肝癌病例的50-76％，以及发达国家中所有肝移植的三分之二。护理标准(SOC)疗法[聚乙二醇化干扰素α+病毒唑(核苷类似物)]仅在50-60％的患者中有效且与明显的副作用有关。类似地，向SOC中添加第一代HCV蛋白酶抑制剂(例如brocepravir或特拉匹韦)改善了结果和治愈率，但副作用通常是严重的。因此，迫切需要有效和安全的新HCV药物。
丙型肝炎病毒基因组包含包封在核衣壳和脂质包膜中的正链RNA并且由9.6kb核糖核苷酸组成，并具有编码约3000个氨基酸的大多肽的单一的开放阅读框(ORP)(Dymock等人Antiviral Chemistry&Chemotherapy 2000,11,79)。成熟之后，此多肽通过细胞和病毒蛋白酶被切割成至少10个蛋白，以产生结构和非结构(NS)蛋白。在HCV的情况下，成熟非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)的产生受到两种病毒蛋白酶的影响：1)金属蛋白酶，其在NS2-NS3接合处裂解；和2)包含在NS3的N-末端区域内的丝氨酸蛋白酶(NS3蛋白酶)，其介导在NS3的下游的所有随后裂解。NS4A蛋白似乎具有多种功能，包括NS4A/NS3复合体形成，这似乎增强NS3蛋白的蛋白水解效率。NS5B(本文中也称为HCV聚合酶)具有聚合酶活性并参与从充当模板的单链病毒RNA基因组合成双链RNA。NS5A是非结构56-58kDa蛋白，其作为复制复合体的组分调制HCV复制。NS5A由细胞蛋白激酶高度磷酸化并且磷酸化位点在HCV基因型之间是保守的(Katze等人，2001；Kim等人，1999)
对于选择性地抑制HCV复制的新型抗病毒策略的开发由于缺乏用于HCV增殖的便利的细胞培养模型而长期受到阻碍(“Recent Advances in Nucleoside MonophosphateProdrugs as Anti-hepatitis C Virus Agents"Bobeck,D.R.；Coats,S.J.；Schinazi,R.F.Antivir.Ther.2010；书籍章节:"Approaches for the Development of AntiviralCompounds:The Case of Hepatitis C Virus."Raymond F.Schinazi,Steven J.Coats,Leda C.Bassit,Johan Lennerstrand,James H.Nettles和Selwyn J.Hurwitz在Handbookof Experimental Pharmacology,vol.189,25-51中:Antiviral Strategies；由以下编辑:Hans-Georg和RalfSpringer-Verlag Berlin Heidelberg2009”)。这个障碍首先在1999年通过建立HCV复制子系统而被克服(Bartenschlager,R.,Nat.Rev.Drug Discov.2002,1,911-916及Bartenschlager,R.,J.Hepatol.2005,43,210-216)，并且在2005年，通过开发稳健的HCV细胞培养模型而得以解决(Wakita,T.,等人,Nat.Med.2005,11,791-6；Zhong,J.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,9294-9；Lindenbach,B.D.,等人,Science2005,309,623-6)。
尽管可利用疫苗(Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.2004,41,391-427)，但黄热病病毒(YFV)仍然是一种严重的人类健康问题，每年造成大约30,000人死亡。YFV是最致命性的人类病毒感染之一(Expert Rev.Vaccines 2005,4,553-574.)。在受感染的个体中，大约15％将发展成严重的疾病，在那些个体中有20至50％的病死率。没有被批准的对于治疗YFV有特异性的疗法。治疗是症状停止性(symptomatic-rest)流体，并且布洛芬、萘普生、醋氨酚或扑热息痛可减轻发热和疼痛症状。应当避免阿斯匹林。虽然病毒流行至非洲和南美洲，但YFV也可能在这些地区之外的地方爆发且已有这种输入病例的报道(J.Travel Med.2005,12(增刊1),S3-S11)。
西尼罗病毒(WNV)来自黄病毒科且主要引起蚊传播的疾病。它首先在1937年于乌干达的西尼罗河地区被发现。根据来自疾病控制和预防中心的报道，已在非洲、中东、欧洲、大洋洲、西亚和中亚以及北美洲发现WNV。其在北美洲的首次出现是在1999年纽约市的大都市地区。它在北美洲是季节性流行的，一般在夏季爆发且持续到秋季，呈现出对环境卫生的威胁。它的自然循环是鸟-蚊-鸟和哺乳动物。蚊子、特别是尖音库蚊物种当以受感染的鸟为食时变得受感染。受感染的蚊子然后当其叮咬时将WNV传播给其它鸟和包括人的哺乳动物。在人和马中，致命性脑炎是WNV感染最严重的表现。WNV还可在一些受感染的鸟中引起死亡。没有用于WNV感染的特异性治疗。在具有轻度症状的病例中，人们经受在其自身传递的如发热和疼痛的症状，尽管甚至健康的人也会患病几周。在更严重的病例中，人们通常需要去医院，在那里他们可以接受支持治疗。
登革热感染也来自黄病毒科并且是新加坡最重要的虫媒传播感染(EpidemiolNews Bull 2006,32,62-6)。在全球，每年估计有5千万至1亿登革热(DF)病例以及几十万登革热出血热(DHF)病例且平均病死率是5％。许多患者从具有最少或没有残余疾病的登革热感染中痊愈。登革热感染通常是无症状的，但可表现出典型的登革热、登革出血热或登革热休克综合征。甚至对于门诊患者，对维持足够的水合的需要也是非常重要的。登革热感染可通过静脉内补液疗法得到有效的控制，并且如果及早诊断，病死率可保持低于1％。为了控制疼痛和发热，疑似具有登革热感染的患者都应给予醋氨酚制剂。阿斯匹林和非甾族抗炎药疗法可加重与一些登革热感染有关的出血倾向。然而，先前所述的登革热感染的一些表现包括肝功能衰竭(Dig Dis Sci 2005,50,1146-7)、脑病(J Trop Med Public Health1987,18,398-406)、以及格林-巴利综合征(Intern Med2006,45,563-4)。
增殖性病症是一种严重危急生命的疾病并且几十年来已进行了深入的研究。癌症现在是美国的第二主要死亡原因，且超过500,000人每年死于此增殖性病症。肿瘤是细胞生长不受调控的混乱的增殖。肿瘤是恶性的或癌性的，如果它具有侵袭性和转移特性的话。侵袭性是指肿瘤进入周围组织，穿透限定组织边界的基底层，进而常常进入身体的循环系统中的倾向。转移是指肿瘤迁移到身体其它区域并且确立远离初始出现部位的增殖区域的倾向。
癌症在分子水平上还没有被完全理解。众所周知，细胞向致癌物如某些病毒、某些化学品或辐射的暴露导致DNA改变，这种改变使“抑制”基因失活或“致癌基因”激活。抑制基因是生长调控基因，其一旦突变，便不再能控制细胞生长。致癌基因最初是正常基因(称为前致癌基因)，其通过突变或表达环境的改变而变为转化基因。转化基因的产物造成不适当的细胞生长。超过二十种不同的正常细胞基因可通过遗传变化变为致癌基因。转化的细胞在许多方面不同于正常细胞，包括细胞形态、细胞与细胞的相互作用、膜含量、细胞骨架结构、蛋白质分泌、基因表达以及死亡(转化的细胞可无限生长)。
身体的所有不同的细胞类型均可转变成良性或恶性肿瘤细胞。最常见的肿瘤部位是肺，其次是结肠直肠、乳腺、前列腺、膀胱、胰腺以及卵巢。其它常见的癌症类型包括白血病、中枢神经系统癌症，包括脑癌、黑素瘤、淋巴瘤、红白血病、子宫癌以及头颈癌。
癌症目前主要用以下三种方式的疗法中的一种或组合来治疗：手术、辐射及化疗。手术涉及患病组织的整体摘除。虽然手术有时在摘除位于某些部位(例如乳腺、结肠和皮肤)的肿瘤中是有效的，但其不能用于治疗位于其它区域如脊椎中的肿瘤或治疗扩散性肿瘤病况如白血病。
化疗涉及细胞复制或细胞代谢的破环。它最常用于治疗白血病以及乳腺癌、肺癌和睾丸癌。目前存在五种主要类别的化疗剂用于治疗癌症：天然产物及其衍生物；蒽环霉素类；烷化剂；抗增殖剂(又称为抗代谢物)；以及激素剂。化疗剂经常被称为抗肿瘤剂。
已经鉴定展现抗癌活性的若干合成核苷如5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶已在临床上用于治疗恶性肿瘤，包括例如癌瘤、肉瘤、皮肤癌、消化器官癌以及乳腺癌。然而，5-氟尿嘧啶引起严重的不良反应，如恶心、脱发、腹泻、口炎、白细胞血小板减少、厌食、色素沉着及浮肿。
有利的是，提供新的抗病毒剂和抗癌剂、包含这些试剂的组合物以及使用这些试剂的治疗方法，特别是用于治疗黄病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感和癌症，以及预防耐药黄病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感和癌症出现。本发明提供这种试剂、组合物及方法。
发明内容
本发明提供用于治疗或预防宿主中的HCV感染的化合物、方法及组合物。所述方法涉及施用治疗或预防有效量的至少一种如本文所述的化合物来治疗或预防感染或施用足以降低HCV感染的生物活性的量。药物组合物包含与药学上可接受的载体或赋形剂组合的一种或多种本文所述的化合物，所述化合物用于治疗感染了HCV的宿主。这些化合物可以与HCV的核苷和非核苷抑制剂组合使用。所述制剂还可包含至少一种其它治疗剂。另外，本发明包括用于制备这种化合物的方法。
在一个实施方案中，活性化合物是具有式1A或1B的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，R5是O、CH2、S、Se、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基、C(O)(C1-8)芳基、C(O)NH(C1-8)芳基组成的组，或者当OR8出现在式1A或1B中时其为从α氨基酸衍生的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，以及其中苯基和吡啶基任选地由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0- 6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(c)L-氨基酸的酯其中R17限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R6和R7可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(e)R6和R7可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基，或
(f)R6和R7和与其所连接的P(O)结合形成二磷酸酯或三磷酸酯。
碱基选自由以下组成的组：
在一个实施方案中，选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3)环烷基NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2。
这些化合物可以以β-D或β-L构型存在，尽管β-D是优选的实施方案。
以下提供式1A或式1B的化合物的子集：
其中R4和碱基如上所定义。
这些化合物也可以是β-D或β-L构型。
这些式的代表性化合物如下所示：
或其药学上可接受的盐。
一种代表性化合物具有下式：
或其药学上可接受的盐。
这些化合物可在联合疗法中使用，例如，使用常规的利巴韦林/派罗欣疗法或与其它核苷抗HCV剂或NS4A抑制剂或NS5A抑制剂一起。用于联合疗法的代表性抗HCV药剂包括，但不限于，聚乙二醇化干扰素(派罗欣)和利巴韦林的联合，聚合酶抑制剂例如IDX-375和IDX-184(Idenix公司)，PSI-7851和索非布韦(也称为Sovaldi，由Pharmasset/Gilead销售)，丹诺普韦(danoprevir)(InterMune/Genentech)，RG7128(Pharmasset/Genentech)，IANA598(Anadys制药公司)，TMN-191(R7227)，RG7128和RG7227(Genentech，Pharmasset和Intermune)的联合，ABT-072(雅培)，VX-916，VX-759，VX-222以及VX-500(Vertex)，非利布韦(Filibuvir)(PF-00868554)(Pfizer)，GS 9190(Gilead)，单独或具有增强剂如利托那韦，以及丝氨酸蛋白酶抑制剂如博赛泼维(Boceprevir)(SCH 503034)(Schering Plough)，BILN-2061，特拉泼维(Telaprevir)(Vertex)，ACH-1625(Achillion)，GS-9256(Gilead)，BI201335(Boehringer Ingelheim Pharma)，Vaniprevir(MK-7009)(Merck)，Ledispavir(Gilead)，Daclastavir(BMS)，GS-5816(Gilead)SCH900518(Narlaprevir)(Schering/Merck)，TMC435(Medivir/Tibotec)。提供丝氨酸蛋白酶抑制剂的另外的例子，例如，在Reiser和Timm中，“Serine protease inhibitors as anti-hepatitis C virus agents，”Expert Review of Anti-infective Therapy,7(5):537-547(June2009)，其内容在此通过引用并入本文。优选的组合可以是与其他泛基因型核苷(pan-genotypic nucleoside)、蛋白酶抑制剂、NS4A抑制剂、NS5A抑制剂和/或NS5B抑制剂一起。代表性的试剂描述于例如PCT/US11/49426、PCT/US10/23563、PCT/US12/38165、PCT/US13/67309和PCT/US11/58404中。
参照下面的详细描述将更好地理解本发明。
附图说明
图1是使用实施例8中概述的程序获得的显示抑制剂暂停位点的凝胶照片。
图2是化合物10-TP的剂量反应曲线，显示作为浓度(μM)的函数的产物百分比(％)。
图3是显示对于以50μM浓度施用并孵育4小时的化合物，在Huh-7细胞中12相对索非布韦的三磷酸酯产生(显示为pmol/106细胞)的图。
图4是化合物10-TP的质谱图。
图5是化合物26α的晶体结构。
具体实施方式
在细胞水平测定中，本文所述的化合物显示针对HCV的抑制活性。因此，所述化合物可用于治疗或预防宿主中的HCV或降低病毒的生物活性。宿主可以是感染了HCV的哺乳动物且特别是人。所述方法包括施用有效量的一种或多种本文所述的化合物。
本文还描述了包含与药学上可接受的载体或赋形剂组合的一种或多种本文所述的化合物的药物制剂。在一个实施方案中，所述制剂包含至少一种本文所述的化合物和至少一种其它治疗剂。
参考以下定义将更好地理解本发明：
I.定义
术语“独立地”在本文中用于指示独立地应用的变量在应用与应用之间独立地变化。因此，在如R"XYR"的化合物中，其中R"“独立地是碳或氮”，两个R"均可是碳，两个R"均可是氮，或一个R"可以是碳且另一个R"是氮。
如本文所用，术语“对映异构体纯的”是指包含至少大约95％且优选地大约97％、98％、99％或100％的化合物的单一对映异构体的化合物组合物。
如本文所用，术语“基本上不含”或“基本上在不存在下”是指包含至少85至90重量％、优选地95重量％至98重量％、且甚至更优选地99重量％至100重量％的化合物的指定对映异构体的化合物组合物。在一个优选实施方案中，本文所述的化合物基本上不含对映异构体。
类似地，术语“分离的”是指包含至少85至90重量％、优选地95重量％至98重量％、且甚至更优选地99重量％至100重量％的化合物且其余包含其它化学物种或对映异构体的化合物组合物。
除非另作说明，如本文所用的术语“烷基”是指饱和直链、支链或环状伯烃、仲烃或叔烃，包括取代的和未被取代的烷基。烷基可任选地被不另外干扰反应或提供过程中的改善的任何基团取代，包括但不限于卤基、卤代烷基、羟基、羧基、酰基、芳基、酰氧基、氨基、酰胺基、羧基衍生物、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫醇、亚胺、磺酰基(sulfonyl)、硫烷基(sulfanyl)、亚磺酰基(sulfmyl)、氨磺酰基(sulfamonyl)、酯、羧酸、酰胺、膦酰基(phosphonyl)、氧膦基、磷酰基、磷化氢、硫酯、硫醚、酰卤、酸酐、肟、肼、氨基甲酸酯、膦酸、膦酸酯，根据需要是未受保护或受保护的，如本领域技术人员已知，例如如在Greene,等人，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley和Sons，第二版，1991中所教导的，该文献据此以引用的方式并入。具体地包括CF3和CH2CF3。
在正文中，每当使用术语C(烷基范围)，该术语独立地包括那类中的每个成员，就如同具体地和单独地列出一般。术语“烷基”包括C1-22烷基，且术语“低级烷基”包括C1-6烷基。本领域技术人员应理解，有关烷基是通过用后缀“-基”取代后缀“-烷(ane)”来命名。
如本文所用，“桥接烷基”是指双环或三环烷烃，例如2:1:1双环己烷。
如本文所用，“螺环烷基”是指在单个(季)碳原子处连接的两个环。
术语“烯基”是指直链或支链的、程度以致其含有一个或多个双键的不饱和烃基。本文所公开的烯基可任选地被不会不利地影响反应过程的任何基团取代，包括但不限于针对烷基上的取代基所述的那些。烯基的非限制性实例包括乙烯、甲基乙烯、异亚丙基、1,2-乙烷-二基、1,1-乙烷-二基、1,3-丙烷-二基、1,2-丙烷-二基、1,3-丁烷-二基以及1,4-丁烷-二基。
术语“炔基”是指直链或支链的程度以致其含有一个或多个三键的不饱和无环烃基。炔基可任选地被不会不利地影响反应过程的任何基团取代，包括但不限于如上针对烷基所述的那些。适合的炔基的非限制性实例包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、戊炔-2-基、4-甲氧基戊炔-2-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-1-基、己炔-2-基以及己炔-3-基、3,3-二甲基丁炔-1-基。
术语“烷基氨基”或“芳基氨基”是指分别具有一个或两个烷基或芳基取代基的氨基。
如本文所用且除非另外指明，术语“受保护的”是指添加到氧、氮或磷原子中以防止它的进一步反应或出于其它目的的基团。广泛多种氧和氮保护基为有机合成领域的技术人员所知且描述于例如上述Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis中。
单独或组合的术语“芳基”意指含有一个、两个或三个环的碳环芳族体系，其中这种环可以悬挂方式连接在一起或可以被稠合。芳基的非限制性实例包括苯基、联苯或萘基、或在从芳族环上除去氢之后剩余的其它芳族基团。术语芳基包括取代的和未被取代的基团。芳基可任选地被不会不利地影响过程的任何基团取代，包括但不限于如上针对烷基所述的那些。取代的芳基的非限制性实例包括杂芳基氨基、N-芳基-N-烷基氨基、N-杂芳基氨基-N-烷基氨基、杂芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳硫基、单芳基酰氨基磺酰基、芳基磺酰氨基(arylsulfonamido)、二芳基酰氨基磺酰基、单芳基酰氨基磺酰基、芳基亚磺酰基、芳基磺酰基、杂芳硫基、杂芳基亚硫酰基、杂芳基磺酰基、芳酰基、杂芳酰基、芳烷酰基(aralkanoyl)、杂芳烷酰基、羟基芳烷基、羟基杂芳烷基、卤代烷氧基烷基、芳基、芳烷基、芳氧基、芳烷氧基、芳氧基烷基、饱和杂环基、部分饱和杂环基、杂芳基、杂芳氧基、杂芳氧基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、芳基烯基以及杂芳基烯基、芳烷氧羰基(carboaralkoxy)。
术语“烷芳基”或“烷基芳基”是指具有芳基取代基的烷基。术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指具有烷基取代基的芳基。
如本文所用的术语“卤基”包括氯、溴、碘及氟。
术语“酰基”是指羧酸酯，其中酯基的非羰基部分选自由直链、支链或环状烷基或低级烷基、烷氧基烷基，包括但不限于甲氧基甲基组成的组；芳烷基，包括但不限于苄基；芳氧基烷基如苯氧基甲基；芳基，包括但不限于苯基，任选地被卤素(F、Cl、Br、I)取代；烷基(包括但不限于C1、C2、C3及C4)；烷氧基(包括但不限于C1、C2、C3及C4)；磺酸酯，如烷基或芳烷基磺酰基，包括但不限于甲磺酰基；单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯；三苯甲基或单甲氧基三苯甲基、取代的苄基、三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最适合包括苯基。术语“低级酰基”是指其中非羰基部分是低级烷基的酰基。
术语“烷氧基”和“烷氧基烷基”包含具有烷基部分的直链或支链含氧基团，如甲氧基。术语“烷氧基烷基”还包括具有一个或多个连接至烷基上以形成单烷氧基烷基和二烷氧基烷基的烷氧基的烷基。“烷氧基”可进一步被一个或多个卤原子如氟、氯或溴取代以提供“卤烷氧基”。这种基团的实例包括氟甲氧基、氯甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟乙氧基、氟乙氧基、四氟乙氧基、五氟乙氧基及氟丙氧基。
术语“烷基氨基”表示分别含有连接至氨基上的一个或两个烷基的“单烷基氨基”和“二烷基氨基”。术语“芳基氨基”表示分别含有连接至氨基上的一个或两个芳基的“单芳基氨基”和“二芳基氨基”。术语“芳烷基氨基”包括连接至氨基上的芳烷基。术语芳烷基氨基表示分别含有连接至氨基上的一个或两个芳烷基的“单芳烷基氨基”和“二芳烷基氨基”。术语芳烷基氨基进一步表示含有连接至氨基上的一个芳烷基和一个烷基的“单芳烷基单烷基氨基”。
如本文所用的术语“杂原子”是指氧、硫、氮及磷。
如本文所用的术语“杂芳基”或“杂芳族”是指在芳族环中包含至少一个硫、氧、氮或磷的芳族。
术语“杂环”、“杂环基”及“环杂烷基”是指在环中存在至少一个杂原子如氧、硫、氮或磷的非芳族环状基团。
杂芳基和杂环基团的非限制性实例包括呋喃基(furyl)、呋喃基(furanyl)、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1,2,4-噻二唑基、异噁唑基、吡咯基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、噻吩、呋喃、吡咯、异吡咯、吡唑、咪唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、嘧啶或哒嗪，及蝶啶基、氮丙啶、噻唑、异噻唑、1,2,3-噁二唑、噻嗪、吡啶、吡嗪、哌嗪、吡咯烷、噁嗪烷(oxazirane)、吩嗪、吩噻嗪、吗啉基、吡唑基、哒嗪基、吡嗪基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基、蝶啶基、5-氮杂胞苷基、5-氮杂尿嘧啶基、三唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-苄基嘌呤、N6-卤代嘌呤、N6-乙烯嘌呤、N6-炔属嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羟烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、6-氮杂嘧啶、2-巯基嘧啶、尿嘧啶、N5-烷基嘧啶、N5-苄基嘧啶、N5-卤代嘧啶、N5-乙烯基嘧啶、N5-炔属嘧啶、N5-酰基嘧啶、N5-羟烷基嘌呤及N6-硫代烷基嘌呤以及异噁唑基。杂芳族基团可如上针对芳基所述任选地被取代。杂环或杂芳族基团可任选地被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、卤烷基、烷基、烷氧基、羟基、羧基衍生物、酰胺基、氨基、烷基氨基及二烷基氨基。杂芳族可根据需要被部分或全部氢化。作为非限制性实例，二氢吡啶可代替吡啶来使用。在杂环或杂芳基上的官能性氧和氮基团可根据需要或希望被保护。适合的保护基是本领域技术人员所熟知的且包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基、酰基如乙酰基和丙酰基、甲磺酰基以及对甲苯磺酰基。杂环或杂芳族基团可被不会不利地影响反应的任何基团取代，包括但不限于如上针对芳基所述的那些。
如本文所用的术语“宿主”是指其中病毒可以复制的单细胞或多细胞有机体，包括但不限于细胞系和动物且优选是人。或者，宿主可携带一部分病毒基因组，其复制或功能可由本发明化合物改变。术语宿主具体是指受感染的细胞、被病毒基因组全部或一部分转染的细胞以及动物，特别是灵长类动物(包括但不限于黑猩猩)和人。在本发明的大多数动物应用中，宿主是人类。然而，在某些适应症中，本发明明确地考虑到了兽医应用(如用于治疗黑猩猩)。
术语“肽”是指含有由一个氨基酸的羧基连接到另一个的氨基上的二至一百个氨基酸的天然或合成化合物。
术语“药学上可接受的盐或前药”在本说明书通篇中用于描述化合物的任何药学上可接受的形式(如酯)，其一旦施用于患者便提供化合物。药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机碱和酸衍生的那些盐。适合的盐包括由碱金属如钾和钠、碱土金属如钙和镁与药学领域中熟知的许多其它酸衍生的那些盐。药学上可接受的前药是指在宿主中代谢，例如水解或氧化以形成本发明化合物的化合物。前药的典型实例包括在活性化合物的官能基团上具有生物学不稳定的保护基团的化合物。前药包括可被氧化、还原、胺化、脱氨基、羟基化、脱羟基化、水解、脱水、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化或去磷酸化以产生活性化合物的化合物。本发明化合物的前药形式可具有抗病毒活性，可被代谢形成展现这种活性的化合物，或两者。
活性化合物
在一个实施方案中，活性化合物是具有式1A或1B的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，R5是O、S、Se、CH2、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基、C(O)(C1-8)芳基、C(O)NH(C1-8)芳基组成的组，或当OR8出现在式1A或1B中时其为从α氨基酸衍生的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，以及其中苯基和吡啶基任选地由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0- 6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(c)L-氨基酸的酯其中R17限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R6和R7可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(e)R6和R7可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基，
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3)环烷基NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2，
和其药学上可接受的盐或前药。
这些化合物可以以β-D或β-L构型存在，但是β-D构型是优选的实施方案。
以下提供式1A或式1B的化合物的子集：
其中R4和碱基如上所定义。这些化合物也可以是β-D或β-L构型，但是β-D构型是优选的实施方案。
这些式的代表性化合物如下所示：
或其药学上可接受的盐或前药。
一种代表性化合物具有下式：
或其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，所述化合物是式1B或2B的化合物。
在另一个实施方案中，化合物中的碱基是下式的碱基：
在一个实施方案中，包括但不限于当碱基具有上面所示的结构时，R9定义为NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基或NHO(CO)NH(C1-20)烷基。
在另一个实施方案中，R1是Me，其中，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物，R2是N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；R3是CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基，R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2，或它们的任何组合。
在另一个实施方案中，R6和R7定义为独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，以及其中苯基和吡啶基任选地由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0- 6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(c)L-氨基酸的酯其中R17限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R6和R7可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；
其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(e)R6和R7可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基。
III.立体异构现象和多晶型现象
本文所述的化合物可具有不对称中心并且作为外消旋体、外消旋混合物、个别非对映异构体或对映异构体存在，其中所有异构体形式都包括在本发明中。具有手性中心的本发明化合物可以光学活性和外消旋形式存在和分离。一些化合物可以展现多晶型现象。本发明包括本发明化合物的外消旋、光学活性、多晶型或立体异构形式或其混合物，其具有本文所述的有用的特性。光学活性形式可通过例如以下方式来制备：通过再结晶技术拆分外消旋形式，通过从光学活性起始材料来合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相进行色谱分离或通过酶促拆分。可纯化单独的化合物，然后衍生化所述化合物以形成本文所述的化合物，或纯化化合物本身。
化合物的光学活性形式可使用本领域中已知的任何方法来制备：包括但不限于通过再结晶技术拆分外消旋形式，通过从光学活性起始材料来合成，通过手性合成，或通过使用手性固定相进行色谱分离。
获得光学活性材料的方法的实例包括至少以下。
i)晶体的物理分离：该技术手工地分离各个对映异构体的肉眼可见晶体。如果存在单独的对映异构体的晶体，即所述材料是团聚体且晶体在视觉上是不同的，便可使用此技术；
ii)同时结晶：该技术将各个对映异构体从外消旋体溶液中单独结晶，可能只有当后者是呈固态的团聚体时才发生；
iii)酶促拆分：该技术在酶的作用下借助于针对对映异构体的不同反应速度部分或完全分离外消旋体；
iv)酶促不对称合成：在该合成技术中，合成的至少一个步骤使用酶促反应以获得所需对映异构体的对映异构纯的或富集的合成前体；
v)化学不对称合成：该合成技术在产物中产生不对称性(即手性)条件下从非手性前体合成所需对映异构体，所述合成可使用手性催化剂或手性助剂完成；
vi)非对映异构体分离：该技术通过外消旋化合物与对映异构纯的试剂(手性助剂)反应，将各个对映异构体转化为非对映异构体。所得非对映异构体然后通过色谱法或结晶借助于其现在更明显的结构差异被分离且手性助剂随后被除去以获得所需对映异构体；
vii)一级和二级不对称转化：该技术通过平衡来自外消旋体的非对映异构体，使得其在来自所需对映异构体的非对映异构体溶液中占一定优势，或者来自所需对映异构体的非对映异构体的优先结晶作用破坏这种平衡，这样使得所有的物质最终几乎都被转化为来自所需对映异构体的结晶型非对映异构体。所需对映异构体然后从非对映异构体中释放；
viii)动力学拆分：该技术是指利用在动力学条件下对映异构体和手性、非外消旋试剂或催化剂反应的不同反应速率，来获得对外消旋体的部分或完全的拆分(或对部分拆分的化合物的进一步拆分)；
ix)从非外消旋前体的对映体特异性合成：在该合成技术中，从非手性起始物质获得所需对映异构体，并且在合成过程中，其立体化学完整性未受到或仅仅受到最低程度的危害；
x)手性液相色谱法：在该技术中，外消旋体的对映异构体在液体流动相中借助于它们与固定相不同的相互作用(包括但不限于经由手性HPLC)而被分离。固定相可由手性材料制成，或者流动相可含有另外的手性材料以诱导不同的相互作用；
xi)手性气相色谱法：该技术通过将外消旋体挥发，然后借助于对映异构体在气态流动相中与含有固定的非外消旋手性吸附相的柱相互作用的程度不同而将对映异构体分离出来；
xii)用手性溶剂萃取：该技术借助于一种对映异构体可以优先溶解于特定的手性溶剂中，从而实现对映异构体的分离；
xiii)透过手性膜的转运：在该技术中将外消旋体与薄膜屏障接触。屏障通常分离两种互溶液体，一种含有外消旋体，并且驱动力如浓度或压差使得优先转运透过膜屏障。由于膜的非外消旋手性性质只允许外消旋体的一种对映异构体通过，从而实现分离。
在一个实施方案中使用包括但不限于模拟移动床色谱法的手性色谱法。广泛多种手性固定相可商购获得。
IV.盐或前药制剂
在化合物具有足够碱性或酸性以形成稳定的无毒酸或碱盐的情况下，施用作为药学上可接受的盐形式的化合物可为适当的。药学上可接受的盐的实例是与形成生理学上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、安息香酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐以及α-甘油磷酸盐。还可形成适合的无机盐，包括但不限于硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐及碳酸盐。对于某些透皮应用，可优选使用本文所述化合物的脂肪酸盐。脂肪酸盐可以帮助穿透角质层。合适的盐的实例包括带有硬脂酸、油酸、亚油酸(lineoleic acid)、棕榈酸、辛酸和癸酸的化合物的盐。
可利用本领域公知的标准方法，例如将足够碱性的化合物，如胺与提供生理学可接受的阴离子的合适的酸进行反应来获得药学上可接受的盐。在化合物包括多个胺基的那些情况下，可以用任何数量的胺基形成盐。也可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
前药是以非活性(或显著低活性)形式给药，随后在体内代谢成活性代谢物的药理学物质。以较低的剂量将更多的药物送到所需的目标常常是使用前药的背后的基本原理，并通常归因于更好的吸收，分布，代谢和/或排泄(ADME)的属性。通常将前药设计成提高口服生物利用度，通常从胃肠道吸收差是限制因素。此外，使用前药策略可以提高药物对其预期目标的选择性从而降低偏离目标效应的可能性。
V.治疗方法
本文所述的化合物可用于治疗或预防丙型肝炎病毒(HCV)感染，以及其它黄病毒、RSV、流感和某些类型的癌症。
患有这些癌症之一，或感染了这些病毒之一，例如HCV或其基因片段的宿主(包括但不限于人)可通过在药学上可接受的载体或稀释剂存在下向所述患者施用有效量的活性化合物或其药学上可接受的前药或盐来治疗。活性物质可通过任何适当途径，例如口服、胃肠外、静脉内、皮内、透皮、皮下或局部，以液体或固体形式来施用。
VI.组合或交替疗法
在一个实施方案中，本发明化合物可与选自由以下组成的组的至少一种其它抗病毒剂一起使用：聚合酶抑制剂、IMPDH抑制剂、蛋白酶抑制剂以及基于免疫的治疗剂。
例如，当用于治疗或预防HCV感染时，活性化合物或其前药或药学上可接受的盐可与另一种抗HCV剂组合或交替施用，包括但不限于上式的那些物质。一般说来，在联合疗法中，有效剂量的两种或更多种试剂在一起施用，而在交替疗法期间，有效剂量的每种试剂被连续地施用。剂量将取决于药物的吸收、失活及排泄率以及本领域技术人员已知的其它因素。应注意，剂量值还将随有待缓解的病况的严重性而变化。进一步应理解的是对于任何具体的受试者、具体的给药方案和安排都应该根据个体的需要以及施用或监督组合物施用的人的专业判断并随着时间来调整。
可与本文所公开的化合物组合使用的抗病毒剂的非限制性实例包括在下表中的那些。
FDA批准的抗HCV化合物和目前II或III期临床开发中的化合物*
*改编自TAG管线报告：http://www.pipelinereport.org/sites/g/files/g575521/f/201306/HCV.pdf
1FDA批准的用于HCV感染的治疗
可用于联合治疗的其它化合物包括：
和Faldepravir：
西咪匹韦(Simeprevir)
和GS-9451。
所述化合物还可用于治疗癌症。可根据本发明方法用本文所述的化合物及这些化合物的药学上可接受的盐和前药治疗的患者包括例如已被诊断为具有以下疾病的患者：肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌或肛门癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、妇科肿瘤(例如子宫肉瘤、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌或外阴癌)、何杰金氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌(例如甲状腺癌、甲状旁腺癌或肾上腺癌)、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、儿童实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌(例如肾细胞癌、肾盂癌)、或中枢神经系统肿瘤(例如原发性CNS淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤)。
本发明还涉及用于抑制患者中的异常细胞增殖的方法和药物组合物，所述药物组合物包含一定量的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或前药、以及一定量的一种或多种选自抗血管生成剂、信号转导抑制剂及抗增殖剂的物质。当用于治疗癌症时，化合物可以与这些或其它类型的抗癌剂组合或交替施用。
抗血管生成剂，如MMP-2(基质-金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质-金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环加氧酶II)抑制剂可以与本文所述的式1的化合物和药物组合物联合使用。有用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREXTM(阿来考昔)、伐地考昔及罗非考昔。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述于WO 96/33172(公开于1996年10月24日)、WO 96/27583(公开于1996年3月7日)、欧洲专利申请号97304971.1(申请于1997年7月8日)、欧洲专利申请号99308617.2(申请于1999年10月29日)、WO 98/07697(公开于1998年2月26日)、WO 98/03516(公开于1998年1月29日)、WO 98/34918(公开于1998年8月13日)、WO 98/34915(公开于1998年8月13日)、WO 98/33768(公开于1998年8月6日)、WO 98/30566(公开于1998年7月16日)、欧洲专利公布606,046(公开于1994年7月13日)、欧洲专利公布931,788(公开于1999年7月28日)、WO 90/05719(公开于1990年5月331日)、WO 99/52910(公开于1999年10月21日)、WO 99/52889(公开于1999年10月21日)、WO 99/29667(公开于1999年6月17日)、PCT国际申请号PCT/IB98/01113(申请于1998年7月21日)、欧洲专利申请号99302232.1(申请于1999年3月25日)、英国专利申请号9912961.1(申请于1999年6月3日)、美国临时申请号60/148,464(申请于1999年8月12日)、美国专利号5,863,949(授权于1999年1月26日)、美国专利号5,861,510(授权于1999年1月19日)以及欧洲专利公布780,386(公开于1997年6月25日)中，所有专利都以引用的方式整体并入本文。优选的MMP抑制剂是不表现关节痛的那些抑制剂。更优选的是相对于其它基质-金属蛋白酶(即MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12及MMP-13)选择性抑制MMP-2和/或MMP-9的那些。
本文所述的化合物还可与以下活性剂一起使用：信号转导抑制剂，如可抑制EGFR(表皮生长因子受体)反应的试剂，如EGFR抗体、EGF抗体和作为EGFR抑制剂的分子；VEGF(血管内皮生长因子)抑制剂，如VEGF受体和可以抑制VEGF的分子；和erbB2受体抑制剂，如与erbB2受体结合的有机分子或抗体，例如HERCEPTINTM(Genentech,Inc.of South SanFrancisco,Calif.,USA)。
EGFR抑制剂描述于例如WO 95/19970(公开于1995年7月27日)、WO 98/14451(公开于1998年4月9日)、WO 98/02434(公开于1998年1月22日)以及美国专利号5,747,498(授权于1998年5月5日)中，并且这种物质可用于如本文所述的本发明中。EGFR-抑制剂包括但不限于单克隆抗体C225和抗EGFR22Mab(ImClone Systems Incorporated of New York,N.Y.,USA)、ABX-EGF(Abgenix/Cell Genesys)、EMD-7200(Merck KgaA)、EMD-5590(MerckKgaA)、MDX-447/H-477(Medarex Inc.of Annandale,N.J.,USA和Merck KgaA)、以及化合物ZD-1834、ZD-1838和ZD-1839(AstraZeneca)、PKI-166(Novartis)、PKI-166/CGP-75166(Novartis)、PTK 787(Novartis)、CP 701(Cep卤代n)、来氟米特(Pharmacia/Sugen)、CI-1033(Warner Lambert Parke Davis)、CI-1033/PD183,805(Warner Lambert ParkeDavis)、CL-387,785(Wyeth-Ayerst)、BBR-1611(Boehringer Mannheim GmbH/Roche)、Naamidine A(Bristol Myers Squibb)、RC-3940-II(Pharmacia)、BIBX-1382(BoehringerIngelheim)、OLX-103(Merck&Co.of Whitehouse Station,N.J.,USA)、VRCTC-310(VentechResearch)、EGF融合毒素(Seragen Inc.of Hopkinton,Mass.)、DAB-389(Seragen/Lilgand)、ZM-252808(Imperical Cancer Research Fund)、RG-50864(INSERM)、LFM-A12(Parker Hughes Cancer Center)、WHI-P97(Parker Hughes Cancer Center)、GW-282974(Glaxo)、KT-8391(Kyowa Hakko)及EGFR疫苗(York Medical/Centro de ImmunologiaMolecular(CIM))。这些及其它EGFR-抑制剂可用于本发明中。
以下VEGF抑制剂也可与本发明化合物组合：例如CP-547,632(Pfizer Inc.,N.Y.)、AG-13736(Agouron Pharmaceuticals,Inc.a Pfizer Company)、SU-5416及SU-6668(Sugen Inc.of South San Francisco,Calif.,USA)和SH-268(Schering)。VEGF抑制剂描述于例如WO 99/24440(公开于1999年5月20日)、PCT国际申请PCT/IB99/00797(申请于1999年5月3日)、WO 95/21613(公开于1995年8月17日)、WO 99/61422(公开于1999年12月2日)、美国专利号5,834,504(授权于1998年11月10日)、WO 98/50356(公开于1998年11月12日)、美国专利号5,883,113(授权于1999年3月16日)、美国专利号5,886,020(授权于1999年3月23日)、美国专利号5,792,783(授权于1998年8月11日)、WO 99/10349(公开于1999年3月4日)、WO 97/32856(公开于1997年9月12日)、WO 97/22596(公开于1997年6月26日)、WO 98/54093(公开于1998年12月3日)、WO 98/02438(公开于1998年1月22日)、WO 99/16755(公开于1999年4月8日)以及WO98/02437(公开于1998年1月22日)中，所有专利都以引用的方式整体并入本文。本发明中适用的一些具体VEGF抑制剂的其它实例是IM862(Cytran Inc.ofKirkland,Wash.,USA)；Genentech,Inc.of South San Francisco,Calif.的抗VEGF单克隆抗体；以及angiozyme，一种来自Ribozyme(Boulder,Colo.)和Chiron(Emeryville,Calif.)的合成核糖酶。这些及其它VEGF抑制剂可用于如本文所述的本发明中。
ErbB2受体抑制剂如CP-358,774(OSI-774)(它塞瓦)(OSI Pharmaceuticals,Inc.)、GW-282974(Glaxo Wellcome plc)以及单克隆抗体AR-209(AronexPharmaceuticals Inc.of The Woodlands,Tex.,USA)和2B-1(Chiron)可此外与本发明化合物组合，例如以下专利中所示的那些：WO 98/02434(公开于1998年1月22日)、WO 99/35146(公开于1999年7月15日)、WO 99/35132(公开于1999年7月15日)、WO 98/02437(公开于1998年1月22日)、WO 97/13760(公开于1997年4月17日)、WO 95/19970(公开于1995年7月27日)、美国专利号5,587,458(授权于1996年12月24日)以及美国专利号5,877,305(授权于1999年3月2日)，所有专利都据此以引用的方式整体并入本文。适用于本发明中的ErbB2受体抑制剂还描述于1999年1月27日申请的美国临时申请号60/117,341和1999年1月27日申请的美国临时申请号60/117,346中，这两者都以引用的方式整体并入本文。erbB2受体抑制剂化合物和在上述PCT申请、美国专利和美国临时申请中描述的物质以及抑制erbB2受体的其它化合物和物质都可根据本发明与本文所述的化合物一起使用。
化合物还可与适用于治疗异常细胞增殖或癌症的其它试剂一起使用，包括但不限于能增强抗肿瘤免疫应答的试剂，如CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4)抗体，及能阻断CTLA4的其它试剂；以及抗增殖剂如其它法呢基蛋白转移酶抑制剂及其类似物。可用于本发明中的特定的CTLA4抗体包括美国临时申请60/113,647(申请于1998年12月23日)中描述的那些，该专利以引用的方式整体并入，然而，其它CTLA4抗体也可以用于本发明。
还可使用其它抗血管生成剂，包括但不限于其它COX-II抑制剂、其它MMP抑制剂、其它抗VEGF抗体或其它血管形成效应物的抑制剂。
VIII.药物组合物
感染了HCV的宿主(包括但不限于人)可通过在药学上可接受的载体或稀释剂存在下向所述患者施用有效量的活性化合物或其药学上可接受的前药或盐来治疗。活性物质可通过任何适当途径，例如口服、胃肠外、静脉内、真皮内、皮下或局部，以液体或固体形式来施用。
化合物的优选剂量将在以下范围内：在约0.01与约10mg/kg之间、更一般在约0.1与5mg/kg之间、且优选地在约0.5与约2mg/kg接受者体重/天之间。药学上可接受的盐和前药的有效剂量范围可基于有待递送的母体化合物的重量来计算。如果盐或前药本身展现活性，那么有效剂量可如上使用盐或前药的重量或通过本领域技术人员已知的其它方式来估算。
化合物方便地以任何适合的单位剂型施用，包括但不限于含有7至600mg、优选地70至600mg活性成分/单位剂型的剂型。5-400mg的口服剂量通常是适宜的。
活性化合物在药物组合物中的浓度将取决于药物的吸收、失活及排泄率以及本领域技术人员已知的其它因素。应注意剂量值还将随有待缓解的病状的严重性而变化。还应理解，对于任何具体的受试者而言，具体的剂量方案应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人员的职业判断随时间进行调整，而且本文所列举的浓度范围只是示例性的，而不是为限制所要求保护的组合物的范围或实践。活性成分可以一次施用，或者可将其分成许多较小的剂量，而以不同的时间间隔施用。
施用活性化合物的一个优选模式是口服。口服组合物通常将包含惰性稀释剂或可食用的载体。可以将它们包封在明胶胶囊中，或者压制成片剂。为用于口服治疗性施用目的，可以将活性化合物加入赋形剂中并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。药学上相容的粘合剂和/或佐剂物质可以作为所述组合物的一部分包括在内。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或相似性质的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶态二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或者调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。当所述单位剂型为胶囊时，除上述类型的物质外，还可含有液体载体如脂肪油。另外，单位剂型还可含有各种改变剂量单位的物理形式的其它物质，例如糖包衣物、虫胶或其它肠溶剂(enteric agent)。
所述化合物可以作为酏剂、混悬液、糖浆剂、干胶片(wafer)、咀嚼胶等的组分施用。除(多种)活性化合物外，糖浆剂还可以含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂以及调味剂。
还可将化合物、其药学上可接受的前药或盐与不损害所需作用的其它活性物质混合，或与补充所需作用的物质如抗生素、抗真菌剂、抗炎药或其它抗病毒化合物混合。用于肠胃外、真皮内、皮下或局部施用的溶液或混悬液可包含下列组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及紧张性调节剂如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以被包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶内。
如果静脉内施用，那么优选载体是生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
透皮制剂
在一些实施方案中，组合物以透皮制剂的形式存在，例如在FDA批准的激动剂罗替戈汀透皮剂(Neupro贴剂)中所使用的。另一种合适的制剂是在题为“TransdermalTherapeutic System for Treating Parkinsonism”的美国公开号20080050424中描述的制剂。该制剂包括有机硅或基于丙烯酸酯的粘合剂，并且可以包括对活性物质具有增加的溶解度的添加剂，其量有效地增加基质对活性物质的溶解能力。
透皮制剂可以是单相基质，其包括背衬层、含活性物质的自粘基质和在使用前要除去的保护膜。更复杂的实施方案包含多层基质，其也可以包含非粘性层和控制膜。如果使用聚丙烯酸酯粘合剂，其可以与多价金属离子如锌、钙、铝或钛离子交联，例如乙酰丙酮铝和乙酰丙酮钛。
当使用有机硅粘合剂时，它们通常是聚二甲基硅氧烷。然而，原则上可以存在其它有机残基例如乙基或苯基，而不是甲基。因为活性化合物是胺，所以使用耐胺的粘合剂可能是有利的。代表性的耐胺性粘合剂描述于例如EP0180377中。
代表性的基于丙烯酸酯的聚合物粘合剂包括丙烯酸、丙烯酰胺、丙烯酸己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮和它们的组合。
粘合剂必须对活性物质具有合适的溶解能力，并且活性物质最能够在基质内移动，并且能够穿过接触表面到达皮肤。本领域技术人员可以容易地配制具有活性物质的适当透皮转运的透皮制剂。
某些药学上可接受的盐倾向于更优选用于透皮制剂，因为它们可以帮助活性物质通过角质层的屏障。实例包括脂肪酸盐，例如硬脂酸盐和油酸盐。油酸盐和硬脂酸盐是相对亲脂性的，并且甚至可以作为皮肤中的渗透促进剂。
也可以使用渗透促进剂。代表性的渗透促进剂包括脂肪醇、脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪酸酰胺、甘油或其脂肪酸酯、N-甲基吡咯烷酮、萜烯如柠檬烯、α-蒎烯、α-萜品醇、香芹酮、香芹醇、柠檬烯氧化物、蒎烯氧化物和1,8-桉树脑。
贴剂通常可以通过将活性剂溶解或悬浮在乙醇或另一种合适的有机溶剂中，然后在搅拌下加入粘合剂溶液来制备。另外的辅助物质可以添加到粘合剂溶液、活性物质溶液或含活性物质的粘合剂溶液中。然后可将溶液涂覆到合适的片材上，除去溶剂，将背衬层层压到基质层上，以及从整个层压材料冲压出贴片。
纳米颗粒组合物
本文所述的化合物还可以以纳米颗粒组合物的形式施用。
在一个实施方案中，控释纳米颗粒制剂包含待施用的纳米颗粒活性剂和速率控制聚合物，其具有施用后延长试剂释放的功能。在该实施方案中，组合物可以在施用后释放活性剂约2小时至约24小时或至多30天或更长的时间。包括纳米颗粒形式的活性剂的代表性控释制剂描述于例如美国专利8,293,277中。
纳米颗粒组合物包含本文所述活性剂的颗粒，其具有吸附在其表面上或与其表面缔合的非交联表面稳定剂。
纳米颗粒的平均粒度通常小于约800nm，更典型地小于约600nm，还更典型地小于约400nm，小于约300nm，小于约250nm，小于约100nm，或小于约50nm。在该实施方案的一个方面中，当通过光散射技术测量时，至少50％的活性剂颗粒分别具有小于约800、600、400、300、250、100或50nm的平均粒度。
各种表面稳定剂通常与纳米颗粒组合物一起使用以防止颗粒结块或聚集。代表性表面稳定剂选自由明胶、卵磷脂、葡聚糖、阿拉伯树胶、胆固醇、黄芪胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇、聚西托醇乳化蜡、脱水山梨醇酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、磷酸酯、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、非结晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、泰洛沙泊、泊洛沙姆、泊洛沙胺、泊洛沙胺908、磺基琥珀酸钠的二烷基酯、月桂基硫酸钠、烷基芳基聚醚磺酸酯、蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯的混合物、对异壬基苯氧基聚(缩水甘油)、SA9OHCO、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、正癸基-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-D-吡喃麦芽糖苷、正十二烷基-D-吡喃葡萄糖苷、正十二烷基-D-麦芽糖苷、庚酰基-N-甲基葡糖酰胺、正庚基-D-吡喃葡萄糖苷、正庚基-D-硫代葡萄糖苷、正己基-D-吡喃葡萄糖苷、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺、正壬基-D-吡喃葡萄糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、正辛基-D-吡喃葡萄糖苷和辛基-D-硫代吡喃葡萄糖苷。溶菌酶也可以用作纳米颗粒组合物的表面稳定剂。已知当通过静脉内(IV)或皮下(SQ)给予时，某些纳米颗粒例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-纳米颗粒靶向肝脏。
由于HCV和其他病毒引起肝脏损伤并存在于肝脏中，因此在一个实施方案中，纳米颗粒或其它药物递送载体靶向肝脏。一种这样类型的肝靶向药物递送载体描述于Park等人的Mol Imaging.2011年2月；10(1)：69-77中，并使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)作为分子靶标。Park教导将此靶标用于肝细胞癌(HCC)，慢性持续性肝炎常导致的原发性肝癌。
在该实施方案的一个方面，该药物递送载体还用于将治疗剂靶向肝脏以治疗病毒感染。此外，由于本文所述的化合物具有抗癌用途，这种类型的系统可以将化合物靶向肝脏并治疗肝癌。GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白多糖，其在正常成人组织中不表达，但在高达80％的人肝细胞癌中显着过表达。可以例如使用抗体介导的靶向和结合靶向GPC3(参见Hsu等人，Cancer Res.1997；57：5179-84)。
在美国专利号7,304,045中描述了用于靶向肝脏的另一种类型的药物递送系统。该'045专利公开了双粒子肿瘤或癌靶向系统，其包括与半乳糖胺缀合的第一配体介导的靶向纳米粒子，其中配体在靶细胞上。第一纳米颗粒包括聚(γ-谷氨酸)/聚(丙交酯)嵌段共聚物和n个抗病毒化合物，在这种情况下是本文所述的化合物，在'045专利中是更昔洛韦。第二纳米颗粒包括聚(γ-谷氨酸)/聚(丙交酯)嵌段共聚物，内皮细胞特异性启动子和(单纯疱疹病毒)-(胸苷激酶)基因构建的质粒，并提供增强的通透性和滞留-介导的靶向。第一和所述第二纳米颗粒在配置用于递送至肝脏的溶液中混合。当待治疗的病症是肝肿瘤或癌症时，递送可以直接到或邻近肝肿瘤或癌症。
其中可配制纳米颗粒的代表性的速率控制聚合物包括壳聚糖、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、阿拉伯胶、琼脂、瓜尔胶、谷类胶、葡聚糖、酪蛋白、明胶、果胶、角叉菜胶、蜡、虫胶、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素(HPC)、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素钠(CMC)、聚环氧乙烷、烷基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、亲水性纤维素衍生物、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三酸乙酸纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚甲基丙烯酸烷基酯、聚乙酸乙烯酯、衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸及其相应的酯的聚合物、以及衍生自丙烯酸或甲基丙烯酸及其相应的酯的共聚物。
制备纳米颗粒组合物的方法描述于例如美国专利第5,518,187号和第5,862,999号中，均为“Method of Grinding Pharmaceutical Substances”；美国专利第5,718,388号“Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances”；和美国专利第5,510,118号“Process of Preparing Therapeutic Compositions Containing Nanoparticles”中。
纳米颗粒组合物也描述于，例如，美国专利号5,298,262“Use of Ionic CloudPoint Modifiers to Prevent Particle Aggregation During Sterilization”；美国专利号5,302,401“Method to Reduce Particle Size Growth In Lyophilization”；美国专利号5,318,767“X-Ray Contrast Compositions Useful in Medical Imaging”；美国专利号5,326,552“Novel Formulation For Nanoparticulate X-Ray Blood Pool ContrastAgents Using High Molecular Weight Non-ionic Surfactants”；美国专利号5,328,404“Method of X-Ray Imaging Using Iodinated Aromatic Propanedioates”；美国专利号5,336,507“Use of Charged Phospholipids to Reduce Nanoparticle Aggregation”；美国专利号5,340,564“Formulations Comprising Olin 10-G to Prevent ParticleAggregation and Increase Stability”；美国专利号5,346,702“Use of Non-IonicCloud Point Modifiers to Minimize Nanoparticulate Aggregation DuringSterilization”；美国专利号5,349,957“Preparation and Magnetic Properties ofVery Small Magnetic-Dextran Particles”；美国专利号5,352,459“Use of PurifiedSurface Modifiers to Prevent Particle Aggregation During Sterilization”；美国专利号5,399,363和5,494,683，均为“Surface Modified Anticancer Nanoparticles”；美国专利号5,401,492“Water Insoluble Non-Magnetic Manganese Particles asMagnetic Resonance Enhancement Agents”；美国专利号5,429,824“Use of Tyloxapolas a Nanoparticulate Stabilizer”；美国专利号5,447,710“Method of MakingNanoparticulate X-Ray Blood Pool Contrast Agents Using High Molecular WeightNon-ionic Surfactants”；美国专利号5,451,393“X-Ray Contrast Compositions Usefulin Medical Imaging”；美国专利号5,466,440“Formulations of Oral GastrointestinalDiagnostic X-Ray Contrast Agents in Combination with PharmaceuticallyAcceptable Clays”；美国专利号5,470,583“Method of Preparing NanoparticleCompositions Containing Charged Phospholipids to Reduce Aggregation”；美国专利号5,472,683“Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbamic Anhydrides as X-RayContrast Agents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,500,204“Nanoparticulate Diagnostic Dimers as X-Ray Contrast Agents for Blood Pooland Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,518,738“Nanoparticulate NSAIDFormulations”；美国专利号5,521,218“Nanoparticulate Iododipamide Derivativesfor Use as X-Ray Contrast Agents”；美国专利号5,525,328“NanoparticulateDiagnostic Diatrizoxy Ester X-Ray Contrast Agents for Blood Pool andLymphatic System Imaging”；美国专利号5,543,133“"Process of Preparing X-RayContrast Compositions Containing Nanoparticles”；美国专利号5,552,160“SurfaceModified NSAID Nanoparticles”；美国专利号5,560,931“Formulations of Compoundsas Nanoparticulate Dispersions in Digestible Oils or Fatty Acids”；美国专利号5,565,188“Polyalkylene Block Copolymers as Surface Modifiers forNanoparticles”；美国专利号5,569,448“Sulfated Non-ionic Block CopolymerSurfactant as Stabilizer Coatings for Nanoparticle Compositions”；美国专利号5,571,536“Formulations of Compounds as Nanoparticulate Dispersions inDigestible Oils or Fatty Acids”；美国专利号5,573,749“NanoparticulateDiagnostic Mixed Carboxylic Anydrides as X-Ray Contrast Agents for Blood Pooland Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,573,750“Diagnostic Imaging X-RayContrast Agents”；美国专利号5,573,783“Redispersible Nanoparticulate FilmMatrices With Protective Overcoats”；美国专利号5,580,579“Site-specificAdhesion Within the GI Tract Using Nanoparticles Stabilized by High MolecularWeight,Linear Poly(ethylene Oxide)Polymers”；美国专利号5,585,108“Formulationsof Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents in Combination withPharmaceutically Acceptable Clays”；美国专利号5,587,143“Butylene Oxide-Ethylene Oxide Block Copolymers Surfactants as Stabilizer Coatings forNanoparticulate Compositions”；美国专利号5,591,456“Milled Naproxen withHydroxypropyl Cellulose as Dispersion Stabilizer”；美国专利号5,593,657“NovelBarium Salt Formulations Stabilized by Non-ionic and Anionic Stabilizers”；美国专利号5,622,938“Sugar Based Surfactant for Nanocrystals”；美国专利号5,628,981“Improved Formulations of Oral Gastrointestinal Diagnostic X-Ray ContrastAgents and Oral Gastrointestinal Therapeutic Agents”；美国专利号5,643,552“Nanoparticulate Diagnostic Mixed Carbonic Anhydrides as X-Ray ContrastAgents for Blood Pool and Lymphatic System Imaging”；美国专利号5,718,388“Continuous Method of Grinding Pharmaceutical Substances”；美国专利号5,718,919“Nanoparticles Containing the R(-)Enantiomer of Ibuprofen”；美国专利号5,747,001“Aerosols Containing Beclomethasone Nanoparticle Dispersions”；美国专利号5,834,025“Reduction of Intravenously Administered Nanoparticulate FormulationInduced Adverse Physiological Reactions”；美国专利号6,045,829"NanocrystallineFormulations of Human Immunodeficiency Virus(HIV)Protease Inhibitors UsingCellulosic Surface Stabilizers”；美国专利号6,068,858“Methods of MakingNanocrystalline Formulations of Human Immunodeficiency Virus(HIV)ProteaseInhibitors Using Cellulosic Surface Stabilizers”；美国专利号6,153,225“Injectable Formulations of Nanoparticulate Naproxen”；美国专利号6,165,506“NewSolid Dose Form of Nanoparticulate Naproxen”；美国专利号6,221,400“Methods ofTreating Mammals Using Nanocrystalline Formulations of Human ImmunodeficiencyVirus(HIV)Protease Inhibitors”；美国专利号6,264,922“Nebulized AerosolsContaining Nanoparticle Dispersions”；美国专利号6,267,989“Methods forPreventing Crystal Growth and Particle Aggregation in NanoparticleCompositions”；美国专利号6,270,806“Use of PEG-Derivatized Lipids as SurfaceStabilizers for Nanoparticulate Compositions”；美国专利号6,316,029“RapidlyDisintegrating Solid Oral Dosage Form,"美国专利号6,375,986“Solid DoseNanoparticulate Compositions Comprising a Synergistic Combination of aPolymeric Surface Stabilizer and Dioctyl Sodium Sulfosuccinate”；美国专利号6,428,814“Bioadhesive nanoparticulate compositions having cationic surfacestabilizers”；美国专利号6,431,478“Small Scale Mill”；和美国专利号6,432,381“Methods for targeting drug delivery to the upper and/or lowergastrointestinal tract”中，所有这些通过引用并入本文。此外，2002年1月31日公开的，名称为“Controlled Release Nanoparticulate Compositions”的美国专利申请第20020012675A1号描述了纳米颗粒组合物，并且具体通过引用并入本文。
包括本文所述的化合物以及单磷酸酯前药和单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯类似物形式的纳米颗粒制剂可用于治疗或预防黄病毒、RSV引起的感染和流感感染，以及治疗或预防某些类型的癌症，包括但不限于肝癌、急性骨髓性白血病、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、头颈癌、乳腺癌、头颈癌、胃癌、一些皮肤癌和本文其他地方描述的可用抗癌核苷治疗的其他类型的癌症。
无定形小颗粒组合物描述于例如美国专利号4,783,484“ParticulateComposition and Use Thereof as Antimicrobial Agent”；美国专利号4,826,689“Method for Making Uniformly Sized Particles from Water-Insoluble OrganicCompounds”；美国专利号4,997,454“Method for Making Uniformly-Sized ParticlesFrom Insoluble Compounds”；美国专利号5,741,522“Ultrasmall,Non-aggregatedPorous Particles of Uniform Size for Entrapping Gas Bubbles Within andMethods”；和美国专利号5,776,496,“Ultrasmall Porous Particles for EnhancingUltrasound Back Scatter”中。
控释制剂
在一个优选实施方案中，所述活性化合物与保护所述化合物免受体内快速清除的载体共同制备，如控释制剂，包括但不限于植入物和微囊化递送系统。可使用生物可降解性、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯及聚乳酸。例如，肠溶包衣的化合物可用来保护胃酸引起的裂解。用于制备这种制剂的方法对本领域技术人员是显而易见的。适合的材料也可以商购获得。
脂质体悬浮液(包括但不限于靶向受感染细胞、具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也优选作为药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法，例如如美国专利号4,522,811(以引用的方式并入)中所述来制备。例如，可以如下制备脂质体制剂：溶解合适的(多种)脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱和胆固醇)于无机溶剂中，然后所述无机溶剂蒸发，在容器表面留下干脂质的薄膜。然后将活性化合物的水溶液引入容器中。随后用手转动容器使脂类物质从容器壁上脱落并分散到脂类聚集物中，从而形成脂质体混悬液。
描述本发明中所用的术语是常用的且为本领域技术人员所知。如本文所用，以下缩写具有指定含义：
ACN 乙腈
aq 含水
BSA 二(三甲基硅基)乙酰胺
BzCl 苯甲酰氯
CDI 羰基二咪唑
DIPEA 二异丙基乙胺(Hunig’s碱)
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
EtOAc 乙酸乙酯
h 小时
HOBt N-羟基苯并三唑
LiHMDS 六甲基二硅基胺基锂
M 摩尔
min 分钟
Ms 甲磺酸
NCS N-氯代琥珀酰亚胺
NBS N-溴代琥珀酰亚胺
NFSI N-氟代苯磺酰亚胺
NIS N-碘代琥珀酰亚胺
NMI 1-甲基咪唑
Pyr 吡啶
rt或RT 室温
TBDPSCl 叔丁基(氯代)二苯基硅烷
TBAF 四丁基氟化铵
TBAT 三苯基二氟硅酸四丁基铵
TBTU O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐
TEA 三乙胺
THF 四氢呋喃
Ts 甲苯磺酸盐
IX.用于制备活性化合物的一般方法
用于简易制备活性化合物的方法是本领域已知的并且来自选择性组合已知方法。本文所公开的化合物可如下所详细描述或通过本领域技术人员已知的其它方法来制备。本领域普通技术人员应当理解到可以进行细节的改变而不脱离本发明的精神且决不限制本发明的范围。
各种反应方案概述如下。
方案1.是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是核苷1的合成方法。
方案2.是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是核苷1的替代合成方法。
方案3.是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是单磷酸酯前药I的合成方法。
方案4.是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是单磷酸酯前药IV、V和VI的合成方法。
方案5.是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是单磷酸酯前药VII的合成方法。
方案6.是合成本发明活性化合物的一个非限制性实例，且特别是单磷酸酯前药VIII的合成方法。
式IA的化合物可以通过首先制备核苷1C制备，核苷1C的制备转而由本领域的普通技术人员使用在以下文献中所概述的方法以及通过一般方案1-2来完成：(a)Rajagopalan,P.；Boudinot,F.D；Chu,C.K.；Tennant,B.C；Baldwin,B.H.；Antiviral Nucleosides:Chiral Synthesis and Chemotheraphy:Chu,C.K.；编著Elsevier:2003；b)RecentAdvances in Nucleosides:Chemistry and Chemotherapy:Chu,C.K.；编著Elsevier:2002；c)Frontiers in Nucleosides&Nucleic Acids,2004,编著R.F.Schinazi&D.C.Liotta,IHL Press,Tucker,GA,USA,第319-37页；d)Handbook of NucleosideSynthesis:Vorbruggen H.&Ruh-Pohlenz C.John Wiley&sons 2001)。具体地，核苷1C可以通过在路易斯酸例如TMSOTf的存在下将糖2C与受保护的、甲硅烷基化或游离的核苷碱基偶联来制备。3'和5'-羟基的脱保护得到核苷1C。
方案1核苷1C的合成方法。(碱基和R1如活性化合物部分所定义)
式1B的化合物可以使用相同的一般反应方案，但使用以下中间体(化合物3A)而不是如上所示的化合物2C来制备：
在本文所述的方案中，如果核苷碱基包括可能在偶联步骤期间干扰或被分解或以其它方式转化的官能团，则可以使用合适的保护基团保护此类官能团。在偶联步骤之后，受保护的官能团(如果有的话)可以脱保护。
或者，核苷1C可从1'-卤基、1'-磺酸酯或1'-羟基化合物3B来制备。对于1'-卤基或1'-磺酸酯的情况，在碱如三乙胺或氢化钠存在下保护的或游离的核苷碱基，接着脱保护将得到核苷1C。对于1'-羟基的情况，在光延偶合剂如偶氮二甲酸二异丙酯存在下保护的或游离的核苷碱基，接着脱保护将得到核苷1C。
方案2核苷1C的替代合成方法。(碱基如活性化合物部分所定义)。
正如方案1，可使用中间化合物4A代替化合物3B
在从碱：制备C-核苷的情况下，可以使用在WO09132123、WO09132135、WO2011150288和WO2011035250中描述的方法。
单磷酸酯前药I可如方案3中所述由苯酚4B开始制备。将4B暴露于三氯氧磷或三氯硫代磷酸酯，得到5A，随后使其与氨基酯6A反应，得到氨基磷酸酯7A。然后可以通过5'-羟基与氯磷酰基氨基丙酸酯7A反应将核苷1C转化为单磷酸酯类似物8A。如果存在保护基团，则从碱基和/或糖去除保护基团，提供单磷酸酯前药I。
方案3单磷酸酯前药I的合成方法(碱基、R1、Y、R16、R17和R18如活性化合物部分中所定义)。
使用中间体化合物3A或4A制备的核苷可以代替化合物1C使用。
单磷酸酯前药IV可以通过取代的吡啶9A与三氯氧磷反应制备。所得中间体可接着与L-氨基酸的酯6A反应，得到11A(方案4)。然后可以通过5'-羟基与氯磷酰底物11A反应将核苷1C转化为单磷酸酯类似物IV。如果必要，去除保护基团，提供单磷酸酯前药IV。利用类似的方案，用R15OH或9A取代6A，也可以制备单磷酸酯前药V和VI。
方案4单磷酸酯前药IV-VI的合成方法。(碱基、R1、R2、R3、R5、R16、R17和R18如活性化合物部分中所定义)。
如上所述，“合适的保护”包括保护不涉及偶联化学的OH和胺部分。包括在Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，第二版，1991中描述的那些的保护基团可以在偶联步骤后除去。
使用中间体化合物3A或4A制备的核苷可以代替化合物1C使用。
单磷酸酯前药VII可以通过12A与三氯氧磷反应得到13A来制备(方案5)。然后可以通过5'-羟基与氯磷酰底物13A反应将核苷1C转化为单磷酸酯类似物VII。如果必要，去除保护基团提供单磷酸酯前药VII。
方案5单磷酸酯前药VII的合成方法。(碱基、R1、R2、R3、R5和R19如活性化合物部分中所定义)。
使用中间体化合物3A或4A制备的核苷可以代替化合物1C使用。
单磷酸酯前药VIII可以通过14A与三氯氧磷反应得到15A来制备(方案6)。然后可以通过5'-羟基与氯磷酰底物15A反应将核苷1C转化为单磷酸酯类似物VIII。如果必要，去除保护基团，提供单磷酸酯前药VIII。
方案6单磷酸酯前药VIII的合成方法。(碱基、R1、R2、R3、R5和R21如活性化合物部分中所定义)。
方案6中形成的前药比非环状氨基磷酸酯更稳定，并且由于形成无毒的代谢物，其比含有未取代的苯酚部分的氨基磷酸酯毒性更小。
使用中间体化合物3A或4A制备的核苷可以代替化合物1C使用。
具体实施例
按照以下实施例和反应顺序制备本发明代表性的具体化合物；作为说明，提供实施例和描述反应顺序的示意图，以帮助理解本发明，但不能将其解释为以任何方式限制随后的权利要求书中叙述的本发明。本发明化合物也可用作随后的实施例中的中间体以产生本发明另外的化合物。没有必要试图对任何反应中获得的产率进行优化。本领域技术人员应知道如何通过反应时间、温度、溶剂和/试剂的常规改变来提高所述产率。
无水溶剂购自Aldrich Chemical Company公司(Milwaukee，WI)和EMD Chemicals公司(Gibbstown，NJ)。试剂购自商业来源。除非另外指出，否则在实施例中使用的材料得自易于获取的商业供应商，或者通过化学合成领域技术人员已知的标准方法合成。熔点(mp)是在电热数字熔点仪上测定，并且未校正。1H和13C NMR光谱用Varian Unity Plus 400光谱仪在室温下测定，且以距离内标四甲基硅烷的ppm低场报道。使用氘交换、去耦实验或2D-COSY以确定质子的归属。通过以下符号表示信号的多重度：s(单峰)，d(双重峰)，dd(两个双重峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，br(宽峰)，bs(宽单峰)，m(多重峰)。所有J值都以Hz为单位。质谱是在Micromass Platform LC分光计上使用电喷雾技术测定的。元素分析通过Atlantic Microlab Inc.(Norcross,GA)进行。在Whatman LK6F硅胶板上进行分析TLC，且在Whatman PK5F硅胶板上进行制备TLC。柱色谱法在硅胶上或经由反相高效液相色谱法进行。
实施例1
核苷类似物12的制备
2-脱氧核糖酸内酯(2)
向2-脱氧-D-核糖(42.0g，313mmol)在800mL水中的溶液中加入Br2(42mL)。将烧瓶密封，将内容物在室温下搅拌5天。通过加入碳酸银中和所得混合物直至pH为7。将混合物过滤并用水洗涤。除去水后，粗产物通过硅胶垫过滤，用乙酸乙酯/MeOH(10:1至4:1)洗脱。在减压下浓缩滤液，得到2-脱氧核糖酸内酯2，为无色胶状物(31.1g，75％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):2.17(dd,J＝17.8和2.4Hz,1H),2.76(dd,J＝17.8和6.4Hz,1H),3.48-3.54(m,2H),4.20-4.24(m,2H),5.06(t,J＝5.4Hz,1H),5.50(d,J＝4.0Hz,1H)。
2-脱氧-3,5-二-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-D-核糖酸内酯(3)
向2-脱氧核糖酸内酯2(8.95g，66.80mmol)在300mL无水DMF中的溶液中加入咪唑(22.7g，333mmol，5.0eq)和叔丁基二苯基甲硅烷基氯(38.4g，140mmol，2.1eq)。将反应在室温下搅拌24小时，通过加入水淬灭。水层用己烷(3×100mL)萃取，合并的有机层用盐水洗涤，并用无水Na2SO4干燥。将粗产物真空浓缩，通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯50:1至30:1)纯化，得到产物3，为无色油状物(33.7g，83％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):0.90(s,9H),1.05(s,9H),2.50(dd,J＝18.0,2.0Hz,1H),2.76(dd,J＝18.0,6.8Hz,1H),3.12(dd,J＝11.6,2.4Hz,1H),3.56(dd,J＝11.6和2.4Hz,1H),4.31(d,J＝1.2Hz,1H),4.51(d,J＝6.8Hz,1H),7.28-7.59(m,20H)。
2-脱氧-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-D-核糖酸内酯(4)。
在1000mL圆底烧瓶中，将化合物3(39.7g，65.2mmol)和NFSi(30.84g，97.8mmol，1.5eq)溶于320mL无水THF中。将溶液冷却至-78℃，在35分钟内滴加85mL(85mmol，1.3当量)1M LiHMDS的THF溶液。将反应在-78℃下再搅拌1小时，并用饱和NH4Cl猝灭。将混合物温热至室温，并用己烷(3×120mL)萃取水层。合并有机层，用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩。粗产物通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯100:0至20:1)纯化，得到化合物3和4的混合物。粗混合物通过快速色谱法(己烷/DCM 10:1至3：1)纯化第二次，得到4(9.81g，24％)和回收的起始原料3(8.7g)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):0.99(s,9H),1.19(s,9H),3.53(dd,J＝12.4,3.2Hz,1H),3.82(d,J＝12.0Hz,1H),4.30(m,1H),4.90(dt,J＝18.8；6.8Hz,1H),5.38(dd,2JFH＝51.2Hz；),7.38-7.43and7.45-7.50(m,12H),7.57-7.74(m,8H).19FNMR(CDCl3,376.3MHz)δ(ppm):-201.71(dd,2JFH＝51.2Hz； ).13C NMR(CDCl3,100.6MHz):19.39,19.54,26.90,27.10,61.49,73.12(J＝21.6Hz),82.1(J＝9.1Hz),92.59(J＝199.5Hz),128.07,128.10,128.33,130.12,130.22,130.66,130.71,131.94,132.47,132.49,133.06,135.77,135.97,136.04,136.09,168.91(J＝23.3Hz)。
2-脱氧-2-氟-2-氯-3,5-二-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-D-核糖酸内酯(5)。
在250mL圆底烧瓶中，将化合物4(9.7g，15.47mmol)和NCS(4.17g，31.2mmol，2.0eq)溶于75mL无水THF中。将溶液冷却至-78℃，并在20分钟内滴加23.2mL(23.2mmol，1.5eq)1M LiHMDS的THF溶液。将反应混合物在-78℃下再搅拌45分钟，然后用饱和NH4Cl溶液淬灭。将混合物温热至室温，用己烷(3×70mL)萃取水层。合并有机层，用饱和NaHCO3溶液，水和盐水洗涤。将溶液用无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩。粗产物通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯100:0至20:1)纯化，得到化合物5和6的4/1混合物(5.83g，57％)。另外的快速色谱法(己烷/乙酸乙酯100:0至20:1)得到纯化合物5和6。化合物5：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):0.87(s,9H),1.08(s,9H),3.52(dd,J＝12.0,4.4Hz,1H),3.64(dd,J＝12.0,4.0Hz,1H),4.46-4.55(m,2H,H3’和H4’),7.29-7.35and 7.38-7.46(m,16H),7.60-7.65(m,4H).19FNMR(CDCl3,376.3MHz)δ(ppm):-132.33(d,)。
化合物6：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):0.85(s,9H),1.11(s,9H),3.47(dd,J＝12.0,3.2Hz,1H),3.77(dd,J＝12.0,1.2Hz,1H),4.28(m,1H,H4’),4.77(dd,J＝13.6,8.0Hz,1H,H3’),7.27-7.34和7.39-7.49(m,16H),7.60-7.67(m,4H).19F NMR(CDCl3,376.3MHz)δ(ppm):-127.34(d,)。
1-羟基-2-脱氧-2-氟-2-氯-3,5-二-O-(叔丁基二苯基甲硅烷基)-D-呋喃核糖(7)。
在0℃下向化合物5(3.93g，5.94mmol)在30mL无水THF中的溶液中滴加13.1mL 1M的(tBuO)3AlH的THF溶液(13.1mmol，2.2eq)。在室温下搅拌3小时后，将反应混合物用饱和的NH4Cl溶液在0℃淬灭。然后将混合物缓慢温热至室温另外2小时。将反应混合物通过硅胶垫过滤，用乙酸乙酯洗涤。水层用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将溶液用Na2SO4干燥，并真空浓缩，得到粗产物7，将其直接用于下一步骤。
4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氯-3-氟四氢呋喃-2-基苯甲酸酯(8)。
在0℃下向粗化合物7(3.90g，5.88mmol)在30mL CH2Cl2中的溶液中加入Et3N(1.25mL，9.18mmol，1.6eq)和BzCl(0.89mL，7.66mmol，1.3eq)。在室温下搅拌12小时后，用5％NaHCO3水溶液(15mL)淬灭反应。水层用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。将溶液用Na2SO4干燥并真空浓缩。粗产物通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯100:0至20:1)纯化，得到8(3.55g，79％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):0.94(s,9H),1.13(s,9H),3.50(dd,J＝12.0,4.4Hz,1H),3.60(dd,J＝12.0,3.0Hz,1H),4.30(m,1H),4.48-4.64(m,2H,H3和H4’),6.62(s,1H,H1’),7.31-7.39(m,8H),7.45-7.58(m,10H),7.63-7.71(m,5H),8.20(dd,J＝8.0,1.2Hz,2H)。
1-(4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-5-(((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氯-3-氟四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(9)
在60℃下将尿嘧啶(457mg，4.08mmol)和BSA(2.6mL，10.6mmol，5eq)在ACN(10mL)中的溶液搅拌15分钟，然后加入化合物9(1.57g，2.04mmol)和TMSOTf(1.92mL，10.6mmol，5当量)。然后将反应容器放入微波反应器(CEM Discover)的空腔中，并在140℃下照射6.5分钟。通过在0℃下加入5％NaHCO3水溶液(15mL)淬灭反应。水层用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。将溶液用Na2SO4干燥，并真空浓缩。通过快速色谱法(己烷/乙酸乙酯5:1至2:1)纯化残余物，得到作为2/1α/β混合物的9(470mg，30％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):0.95和0.86(2s,13.5H),1.11和1.13(2s,13.5H),3.50(dd,J＝12.0,3.6Hz,1H),3.73(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),3.85(dd,J＝12.0,2.4Hz,0.5H),4.0(dd,J＝12.0,2.4Hz,0.5H),4.34-4.36(m,1H),4.48(dd,J＝13.8,8.0Hz,0.5H),4.69(dd,J＝14.8,6.8Hz,1H),4.83(d,J＝8.0Hz,0.5H),5.83(d,J＝8.4Hz,1H),6.35(d,J＝15.0Hz,H1’),6.42(d,J＝14.4Hz,0.5H,H1’),7.28-7.38and 7.41-7.59(m,24H),7.60-7.74(m,6H),7.79(dd,J＝8.0,1.4Hz,0.5H),8.14(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),9.37(s,0.5H),9.44(s,1H,NH)。LC-MS:计算值C41H46ClFN2O5Si2:756.26,758.26，实测值757.2和759.2。
1-(3-氯-3-氟-4-羟基-5-羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H，3H)-二酮(10)
在0℃下向化合物9(470mg，0.62mmol)在3.0mL无水THF中的溶液中滴加1.26mLTBAF的THF溶液(1.0M，1.26mmol，2.0eq)。加入后，将反应混合物温热至室温并搅拌30分钟。减压蒸发溶剂，残余物通过快速色谱(CH2Cl2/MeOH 30:1至10:1v/v)纯化，得到10(β-异构体，47mg，27％)和11(α-异构体，63mg，36％)。
(10):1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm):3.76(dd,J＝12.0,2.4Hz,1H,H5’),3.90(dt,J＝9.2,2.4Hz,1H,H4’),3.96(dd,J＝12.0,2.0Hz,1H,H5’),4.29(dd,J＝18.4,9.2Hz,1H,H3’),5.72(d,J＝8.0Hz,1H,H5),6.30(d,J＝15.6Hz,1H,H1’),7.93(d,J＝8.4Hz,1H,H6).13CNMR(100MHz,CD3OD)δ(ppm):58.54,73.97(d,2JF,C3’＝17.11Hz),81.37,87.81(d,2JF,C1’＝42.27Hz),101.74,114.16(d,1JF,C2’＝252.63Hz,C2’),140.0,150.64,164.23.LC-MS:计算值C9H10CFN2O5280.03,282.02，实测值281.09,283.09
(11):1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm):3.71(dd,J＝12.4,3.5Hz,1H,H5’),3.92(dd,J＝12.4,2.5Hz,1H,H5’),4.2-4.26(m,1H,H4’),4.54(dd,J＝18.96,8.4Hz,1H,H3’),5.76(d,J＝8.0Hz,1H,H5),6.50(d,J＝16.8Hz,1H,H1’),7.63(d,J＝8.2Hz,1H,H6).13C NMR(100MHz,CD3OD)δ(ppm):59.88,74.66(d,2JF,C3’＝17.32Hz),83.10,86.6(d,2JF,C1’＝15.91Hz),101.52,110.5(d,1JF,C2’＝257.94Hz,C2’),141.35,150.74,164.31.LC-MS:计算值C9H10ClFN2O5 280.03,282.02，实测值281.09,283.08。
(2S)-异丙基-2-(((4-氯-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(12)
在0℃下在10分钟内向10(47mg，0.167mmol)和(2S)-异丙基2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸酯(77mg，0.25mmol，1.5eq)在1mL无水THF中的溶液中加入1-甲基咪唑(20μL，2.0mmol)。在0℃下搅拌2小时后，将反应在室温下保持4小时。用异丙醇(0.5mL)猝灭反应，减压除去溶剂，残余物通过快速色谱(CH2Cl2/MeOH＝50:1至20:1v/v)纯化，得到12(44mg，48％)，为1:1非对映体(Rp/Sp)混合物。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm):1.24,1.249,1.253and 1.26(4s,6H),1.33,1.34,1.36和1.37(4d,J＝1.2Hz,3H),3.88-3.97(m,1H),4.11-4.16(m,1H),4.27-4.33(m,1H),4.37-4.46(m,1H),4.49-4.60(m,1H),4.95-5.03(m,1H),5.67和5.72(2d,J＝8.0Hz,1H,H5),6.33和6.36(2d,J＝16Hz,1H,H1’),7.20-7.29(m,3H),7.38-7.42(m,2H),7.57和7.60(2d,J＝8.0Hz,1H,H6).31P NMR(162MHz,CD3OD)δ(ppm):-3.64和3.65.LC-MS:计算值C21H26ClFN3O9P 549.11,551.10，实测值550.10,552.0。
(3S，4R，5R)-4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基-5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-氯-3-氟四氢呋喃-2-基甲磺酸酯(13)
在0℃下向化合物7(3.5g，5.3mmol)在DCM(25mL)中的溶液中加入Et3N(1.44mL，10.6mmol，2.0eq)和MsCl(0.62mL，1.5eq)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时，并在室温下搅拌另外1小时。然后将反应用DCM(100mL)稀释，用1N HCl，5％NaHCO3和水洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩，得到粗混合物(3.71g，95％)。将粗混合物在冻干器上干燥24小时，并且不经进一步纯化用于下一步骤。
4-氨基-1-((2R，3S，4R，5R)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)嘧啶-2(1H)-酮(15)
将N4-苯甲酰基胞嘧啶(700mg，3.26mmol，1.5eq)和BSA(1.72mL，7.07mmol，2.72eq)在二氯乙烷(18mL)中的混合物在60℃下搅拌25分钟。在室温下加入在5mL二氯乙烷中的化合物13(2.0g，2.60mmol)和TMSOTf(1.41mL，7.8mmol，3.0eq)。将反应混合物温热至80℃，并在80℃下搅拌6小时。通过在0℃下加入NaHCO3水溶液(5％)淬灭反应。水层用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。将溶液用Na2SO4干燥，并真空浓缩。通过快速色谱法(DCM/MeOH 100:1至20:1)纯化残余物，得到混合物14(1.16g，52％)。在0℃向化合物14(1.15g，1.34mmol)的无水DCM(7.0mL)溶液中滴加TBAF溶液(1.0M的THF溶液，2.9mL，2.9mmol，2.16eq)。加入后，将反应混合物温热至室温并搅拌1小时。在减压下蒸发溶剂，将残余物通过硅胶垫过滤，用DCM/MeOH(20:1)洗脱，将粗产物溶于20％NH3/MeOH(10mL)中，搅拌过夜。除去溶剂后，将粗产物通过快速色谱法(DCM/MeOH 100:1至10:1)纯化，得到混合物。再次通过制备型HPLC(phenomenex gemini C18柱，100mmX30mm，5微米，ACN/水)纯化混合物，得到15(87mg，23％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm):3.11(dd,J＝12.7,2.8Hz,1H,H5’),3.99-4.04(m,2H,H4’和H5’),4.35(dd,J＝17.8,9.0Hz,1H,H3’),6.17(d,J＝8.0Hz,1H,H5),6.38(d,J＝14.6Hz,1H,H1’),8.35(d,J＝8.0Hz,1H,H6).13C NMR(100MHz,CD3OD)δ(ppm):58.40,73.74(d,J＝17.41Hz),81.87,88.14(d,J＝40.41Hz),94.26,113.74(d,1JF,C2’＝251.95Hz,C2’),143.36,148.20,160.58.19F NMR(376MHz,CD3OD)δ(ppm):-124.42.LC-MS:计算值C9H11ClFN3O4 279.04,281.04，实测值280.0,281.9。
(((2R,3R,4S,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2H)-4-氯-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)-L-丙氨酸异丙酯(16)
在0℃下向15(87mg，0.31mmol)的2mL无水THF溶液中加入t-BuMgCl(0.47L，0.47mmol，1.51eq)。在0℃下搅拌30分钟后，加入在0.5mL THF中的(2S)-2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯(95mg，0.33mmol，1.1eq)。将反应在室温下保持3小时。用异丙醇(0.8mL)淬灭反应。减压除去溶剂，残余物通过制备TLC(CH2Cl2/MeOH 10:1v/v)纯化，得到16(30mg，18％)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm):1.23和1.25(2s,6H),1.36和1.37(2d,J＝0.88Hz,3H),3.89-3.97(m,1H),4.09-4.12(m,1H),4.25-4.31(m,1H),4.36-4.42(m,1H),4.37-4.55(m,1H),4.50-4.60(m,1H),4.99(m,1H),5.80(d,J＝7.56Hz,1H,H5),6.42(2d,J＝16Hz,1H,H1’),7.21-7.30(m,3H),7.40(t,J＝7.48Hz,2H),7.56(d,J＝7.56Hz,1H,H6).19FNMR(376MHz,CD3OD)δ(ppm):-123.60.13C NMR(100MHz,CD3OD)δ(ppm):19.08,19.15,20.48,20.57,50.28,64.10,68.79,75.0(d,J＝18.01Hz),78.90(d,J＝7.52Hz),95.36,113.71(d,1JF,C2’＝252.18Hz,C2’),119.99(d,J＝4.62Hz),124.89,129.48,140.47,150.68(d,J＝7.05Hz),156.38,166.19,172.94(d,J＝5.17Hz).31P NMR(162MHz,CD3OD)δ(ppm):3.49.LC-MS:计算值C21H27ClFN4O8P 548.12,550.12，实测值549.30,551.20。
1,3-二(1,1-二甲基乙基)-(9-((2R,3S,4R,5R)-4-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)甲基))-3-氯-3-氟四氢呋喃-2-基)-6-氯-9H-嘌呤-2-基)亚氨基二碳酸酯17a
在0℃下向化合物7(260mg，0.39mmol)，6-Cl-2-N-Boc2-嘌呤碱(220mg，0.60mmol)和三苯基膦(260mg，1mmol)的THF(10mL)溶液中滴加DIAD(160mg，0.8mmol)。除去冰浴，将黄色悬浮液向室温搅拌24小时。将反应混合物减压浓缩，所得残余物通过硅胶柱色谱纯化(己烷：乙酸乙酯＝10:1)，得到核苷的两部分。两个主要点的上部是所需产物17a，而下部是17b至17c的三种异构体的混合物。
17a:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(s,1H),7.30-7.71(m,20H),6.61(d,J＝10.2Hz,1H),4.58(t,J＝6.2Hz,1H),4.30(s,br,1H),3.76-3.79(m,1H),3.62-3.66(m,1H),1.45(s,18H),1.13(s,9H),0.99(s,9H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-125.53(t,J＝8.96Hz)；MS m/z1014[M+H]
1,3-二(1,1-二甲基乙基)-(6-氯9-((2R,3S,4R,5R)--3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-2-基)亚氨基二碳酸酯18
在室温下向化合物17a(300mg，0.3mmol)的THF(5mL)溶液中加入Et3N.3HF(0.3mL，1.80mmol)，将反应混合物搅拌一天。真空除去挥发物，残余物在硅胶(DCM:MeOH＝20:1)上色谱分离，得到化合物18(150mg，93％)，为无色泡沫状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.77(s,1H),6.47(d,J＝14.0Hz,1H),4.88-4.96(m,1H),4.48(s,br,1H),4.01-4.22(m,3H),3.83(s,br,1H),1.43(s,18H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-125.58；MS m/z 538[M+H]。
(2S)-2-(((((2R,3R,4S,5R)-5-(2-(双(叔丁氧羰基)氨基)-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-氯-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯19
在上面所示的方案中，连接到-P(O)(OPh)Cl部分的“AA”是指氨基酸。所得产物(化合物19)中氨基酸的结构是清楚的。
在0℃在10分钟内向化合物18(64mg，0.12mmol)的THF(1mL)溶液中滴加tBuMgCl(2M，0.12mL，0.24mmol)。移去冰浴，将反应混合物向室温搅拌30分钟。将反应混合物用适当的磷酰氯(1M，在THF中，0.2mL，0.2mmol)处理，并在室温下搅拌过夜。通过加入iPrOH(0.5mL)淬灭反应，并真空浓缩。通过制备型TLC(DCM:MeOH＝20:1)纯化残余物，得到产物19(20mg，21％)，为无色形式。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(s,1H),7.97(s,1H),7.16-7.35(m,5H),6.40(d,J＝13.9Hz,1H),5.29-5.31(m,1H),4.96-4.99(m,2H),4.52-4.58(m,1H),4.30-4.32(m,1H),3.94-3.99(m,2H),1.55(s,9H),1.16-1.37(m,9H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-125.53；MS m/z 807[M+H]。
(2S)-2-(((((2R,3R,4S,5R)-5-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-4-氯-4-氟-3-羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸异丙酯20
在0℃下向三氟乙酸(2mL)和H2O(0.5mL)的混合物中加入化合物19(20mg)。然后将所得溶液在室温下搅拌4小时。在真空中除去挥发物，并将残余物通过制备型TLC(DCM：MeOH＝15：1)纯化，得到产物20(7mg，47％)，为白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(s,1H),7.21-7.40(m,5H),6.18(d,J＝14.8Hz,1H),5.62(s,2H),5.02-5.14(m,2H),4.74-4.75(m,1H),4.43-4.45(m,1H),4.26(s,1H),3.87-3.99(m,2H),1.23-1.40(m,9H)；19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-125.00(t,J＝16.2Hz)；31P NMR(400MHz,CDCl3)δ3.39；MS m/z 607[M+H]。
根据Cen,Y.；Sauve,A.A.J.Org.Chem.2009,74,5779-5789中报道的方法合成2-脱氧-3,5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-D-核糖酸内酯(21)。
2-脱氧-2-氯-3,5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-D-核糖酸内酯(22)
在0℃下向化合物21(5g，13.86mmol)和三乙胺(11.6mL，83.11mmol)在180mL二氯甲烷中的溶液中加入TMSOTf(7.54mL，41.59mmol)，并将溶液在该温度下搅拌30分钟。加入N-氯琥珀酰亚胺(2.8g，20.96mmol)在36mL二氯甲烷中的溶液。在0℃下再搅拌1小时后，通过将反应混合物倒入饱和NaHCO3溶液中淬灭反应，然后用二氯甲烷萃取。有机层用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯40:1)纯化，得到化合物22(4.22g，77％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):4.59-4.62(m,1.5H),4.48(m,0.5H),4.38-4.42(m,1.5H),4.16-4.19(m,1H),3.90-3.95(m,1.5H),3.76-3.81(m,1.5H),0.8和0.9(均为s,27H),0.08,0.12,0.13,0.14(均为s,18H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ171.4,169.7,86.0,83.8,75.1,70.6,61.5,59.9,59.2,55.9,25.9,25.7,18.4,18.0,-4.9,-5.3,-5.4,-5.5.MS(HR-ESI)：C17H36ClO4Si2[(M+H)+]。计算值:m/z 395.1841。实测值:m/z 395.1834。
(2R)-2-脱氧-2-氯-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-D-核糖酸内酯(23)
向经火焰干燥的100mL圆底烧瓶中加入在无水THF(80ml)中的化合物22(4g，10.12mmol)和NFSI(4.78g，15.15mmol)。将溶液冷却至-78℃，滴加13.16mL1M LiHMDS的THF溶液。将反应混合物在相同温度下再搅拌1小时，并用饱和NH4Cl溶液淬灭。使混合物升温至室温，并用乙酸乙酯萃取水层。合并有机层，用饱和NaHCO3、水和盐水洗涤，用无水Na2SO4,干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯40:1)纯化残余物，得到化合物23(2.25g，55％)。
1H NMR(400MHz CDCl3):4.79(dd,J＝14.5Hz,J＝8.4Hz,1H),4.09(dt,J＝1.9Hz,1H),4.01(dt,J＝2.3Hz,1H),3.80(两个d,J＝1.9Hz,1H),0.9(ds,18H),0.09(四个s,12H).19F NMR(376MHz,CDCl3):-127.5(d,J＝14.3Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ165.5,104.4(d,J＝264Hz),80.9,71.9,58.6,25.9,25.6,18.4,18.2,-4.6,-5.1,-5.3,-5.4.MS(HR-ESI)：C17H35ClFO4Si2[(M+H)+]。计算值：m/z413.1740。实测值：m/z 413.1746。
(2R)-2-脱氧-2-氯-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-D-呋喃核糖(24)
在0℃下向化合物23(5.37g，13mmol)的无水THF溶液中滴加LiAlH[OC(CH3)3]3(32.48mL，32.48mmol，1M的THF溶液)。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后通过加入饱和NH4Cl溶液猝灭。将溶液通过硅胶垫过滤，并用80mL乙酸乙酯洗涤。将有机层用水、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯20:1)纯化残余物，得到化合物24(5.23g，97％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):5.25(ddd,J＝12.5Hz,J＝6.3Hz,J＝0.9Hz,0.5H),5.16(d,J＝9.6Hz,1H),4.66(dd,J＝12.5Hz,J＝6.7Hz,1H),4.39(ddd,J＝11.7Hz,J＝4.0Hz,J＝0.9Hz,0.5H),4.07-4.11(m,0.5H),3.92(dt,J＝1.9Hz,1H),3.82(d,J＝9.3Hz,1H),3.78(dt,J＝2.5Hz,1H),3.72和3.69(均为dd,J＝4.0Hz,J＝1.8Hz,0.5H),3.61-3.66(m,1.5H),3.50(d,J＝12.2Hz,0.5H),0.93,0.92,0.90(均为s,27H),0.19,0.16,0.15,0.1,0.07,0.00(均为s,18H).19F NMR(376MHz,CDCl3):-122.59(dd,J＝12.2Hz,J＝6.4Hz),-130.55(d,J＝12.5Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ116.1(d,J＝249Hz),115.1(d,J＝263Hz),99.5,99.2,98.9,84.5,82.7,82.6,74.7,74.5,72.2,72.0,62.0,61.2,26.0,25.7,18.49,18.47,18.2,18.1,-4.4,-4.7,-4.8,-5.28,-5.31,-5.37,-5.4.MS(HR-ESI)：C17H36ClFNaO4Si2[(M+Na)+]。计算值：m/z 437.1722。实测值：m/z 437.1717。
(2R)-1-苯甲酰基-2-脱氧-2-氯-2-氟-3,5-二-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-D-呋喃核糖(25)
在0℃下，向化合物24(4.72,11.37mmol)的二氯甲烷(100mL)溶液中加入三乙胺(3.96mL，28.36mmol)和苯甲酰氯(1.97mL，17.00mmol)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。将反应混合物用乙酸乙酯(40mL)稀释，用5％NaHCO3水溶液、水、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯20:1)纯化残余物，得到化合物25(5.65g，96％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):8.10和8.05(m,2.2H),7.57-7.62(m,1.2H),7.42-7.47(m,2.4H),6.54和6.46(m,1.25H),4.80(dd,J＝12.5Hz,J＝7.9Hz,1H),4.37(dd,J＝18.1Hz,J＝4.7Hz,0.25H),4.21(m,0.25H),3.85-3.91(m,2H),3.76-3.84(m,0.5H),3.68-3.72(m,1H),0.95和0.78(均为s,22H),0.07,0.00,0.08,0.16,020和0.22(均为s,15H).19FNMR(376MHz,CDCl3):-115.15(dd,J＝17.8Hz,J＝7.7Hz)和128.53(d,J＝12.1Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ164.9,133.7,130.3,130.2,129.4,128.6,114.0(d,J＝273Hz),97.7,87.4,82.5,72.0,62.0,60.8,25.7,25.8,25.9,26.0,18.5,18.2,-4.5,-4.7,-4.8,-5.2,-5.3,-5.4.MS(HR-ESI)：C24H40ClFNaO5Si2[(M+Na)+]。计算值：m/z 541.1985。实测值：m/z541.1978。
3',5'-二-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-2-脱氧-2-氯-2-氟尿苷(26)
将尿嘧啶(0.5g，4.46mmol)和BSA(2.65mL，10.81mmol)的无水乙腈(10mL)溶液在60℃下搅拌15分钟，然后冷却至室温。将化合物25(1.14g，2.19mmol)和TMSOTf(2.22mL，12.28mmol)加入甲硅烷基化的尿嘧啶溶液中。然后将反应容器放入微波反应器的空腔中，并在150℃下照射6.5分钟。通过在0℃下加入5％NaHCO3水溶液淬灭反应。水层用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。将溶液用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯4:1)纯化，得到26α(350mg)和26β(140mg)。
化合物26α：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.58(s,1H),7.49(d,J＝8.04Hz,1H),6.45(d,J＝10.5Hz,1H),5.72(dd,J＝8.3Hz,J＝2.3Hz,1H),4.61(dd,J＝12.3Hz,J＝4.8Hz,1H)4.20(m,1H),3.75(m,2H),0.93(两个s,18H),0.08(四个s,12H)。19F NMR(376MHz,CDCl3):-114.05(t,J＝11.3Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ162.7,150.2,140.4,117.9(d,J＝252Hz),102.0,88.2,86.1,74.8,61.3,26.0,25.7,18.4,18.1,-4.7,-4.9,-5.3,-5.32.MS(HR-ESI)：C21H38ClFN2NaO5Si2[(M+Na)+]。计算值：m/z 531.1890。实测值：m/z 531.1882。X射线晶体结构如图5所示。
化合物26β：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.64(s,1H),7.73(dd,J＝8.3Hz,J＝1.5Hz,1H),6.37(d,J＝5.6Hz,1H),5.72(dd,J＝8.3Hz,J＝2.4Hz,1H),4.42(dd,J＝16.3Hz,J＝7.3Hz,1H,3.96(dt,J＝2.7Hz 1H),3.86(m,1H),3.79(m,1H),0.93(两个s,18H),0.08(四个s,12H).19F NMR(376MHz,CDCl3):-122.39(dd,J＝16.04Hz,J＝4.7Hz).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ162.6,150.1,139.6,114.6(d,J＝259Hz),102.7,87.8,82.0,73.2,60.3,26.0,5.7,18.5,18.2,-4.39,-4.91,-5.29,-5.39.MS(HR-ESI)：C21H38ClFN2NaO5Si2[(M+Na)+]。计算值：m/z 531.1890。实测值：m/z 531.1884。
2'-脱氧-2'-氯-2'-氟尿苷(27)
向化合物26β(21mg，0.041mmol)的无水THF(1mL)溶液中加入TBAF(91μL，0.091mmol，1M，在THF中)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂，残余物通过快速柱色谱(CH2Cl2/MeOH 10:1)纯化，得到化合物7(8mg，70％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.95(dd,J＝8.4Hz,J＝2.0Hz,1H),6.33(d,J＝8.4Hz,1H),5.72(d,J＝8.8Hz,1H),4.36(dd,J＝17.0Hz,J＝6.9Hz,1H),3.9(m,2H),3.78(m,1H).19F NMR(376MHz,CD3OD):-124.82(dd,J＝17.4Hz,J＝8.5Hz).13C NMR(100MHz,CD3OD):δ165.7,152.1,142.2,116.3(d,J＝258Hz),102.8,88.8,83.6,74.1,60.6.MS(HR-ESI)：C9H11ClFN2O5[(M+H)+]。计算值：m/z281.0341。实测值：m/z 281.0333。
5'-O-(异丙基-L-丙氨酸酯,苯基磷酰胺基)-2'-脱氧-2'-氯-2'-氟尿苷非对映异构体混合物(28)。
向化合物27(30mg，0.11mmol)和磷酰氯中间体(0.21g，0.69mmol)在THF(2mL)中的充分搅拌的悬浮液中加入N-甲基咪唑(68μL，0.85mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂，残余物通过快速柱色谱法(CH2Cl2/MeOH 20:1)纯化，得到化合物28，为非对映异构体混合物(1:1)(20mg，34％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.66和7.58(均为dd,J＝8.3Hz,J＝2.4Hz,1H),7.35-7.38(m,2H),7.20-7.27(m,3H),6.33-6.37(m,1H),5.69和5.64(均为d,J＝8.3Hz,1H),4.93-4.99(m,1H),4.29-4.41(m,3H),4.10(m,1H),3.9(m,1H),1.29-1.36(m,3H),1.22-1.24(m 6H).19F NMR(376MHz,CD3OD):-124.88(m).32P NMR(162MHz,CDCl3):3.65,3.58.13CNMR(100MHz,CD3OD):δ173.2,162.8,150.5,150.3,140.1,130.1,125.6,120.1,113.7(d,J＝257Hz),103.0,87.3,80.4,73.4,69.8,64.2,50.6,21.8,20.9.MS(HR-ESI)：C21H27ClFN3O9P[(M+H)+].计算值：m/z 550.1157。实测值：m/z 550.1149。
4-N-苯甲酰基-3'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧-2'-氯-2'-氟胞苷(29)
将N-苯甲酰基胞嘧啶(0.66g，3.06mmol)和BSA(1.9mL，7.66mmol)的无水乙腈(8mL)溶液在60℃下搅拌15分钟，然后冷却至室温。在0℃下将化合物25(1g，1.92mmol)在2mL乙腈和TMSOTf(3.11mL，17.23mmol)中的溶液加入甲硅烷基化的N-苯甲酰基胞嘧啶溶液中。然后将反应容器放入微波反应器的空腔中，并在150℃下照射10分钟。通过在0℃下加入5％NaHCO3水溶液猝灭反应。水层用乙酸乙酯萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤。将溶液用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯1:1)纯化残余物，得到29α(352mg)和29β(120mg)。
化合物29α：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.95(br s,1H),7.91(d,J＝7.6Hz,1H),7.86(d,J＝7.6Hz,1H),7.61(m,2H),7.51(m,2H),6.77(d,J＝8.1Hz,1H),4.73(dd,J＝12.3Hz,J＝7.1Hz,1H),4.20(m,1H),3.92(m,1H),3.75(m,1H),2.76(br s,1H),0.92(s,9H),0.17(s,6H).19F NMR(376MHz,CDCl3):-116.55(s).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ166.6,162.9,155.2,145.1,133.5,133.0,129.2,127.8,117.7(d,J＝258Hz),96.6,88.2,84.8,74.5,60.6,25.7,18.3,-4.6,-4.9.MS(HR-ESI)：C22H30ClFN3O5Si[(M+H)+]。计算值：m/z 498.1627。实测值：m/z498.1624。
化合物29β:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.81(br s,1H),8.17(d,J＝7.3Hz,1H),7.86(d,J＝7.3Hz,1H),7.60(m,2H),7.49(m,2H),6.55(d,J＝6.8Hz,1H),4.51(dd,J＝16.6Hz,J＝7.4Hz,1H),4.09(m,1H),3.95(m,1H),3.84(m,1H),2.7(br s,1H),0.93(s,9H),0.15(s,6H).19F NMR(376MHz,CDCl3):-122.31(s)。13C NMR(100MHz,CDCl3):δ170.8,162.9,155.1,145.3,133.4,133.0,129.1,127.8,114.5(d,J＝260Hz),97.4,89.2,82.2,73.4,59.7,25.8,18.1,-4.6,-4.9。MS(HR-ESI)for C22H30ClFN3O5Si[(M+H)+]。计算值：m/z 498.1627。实测值：m/z 498.1620。
4-N-苯甲酰基-2'-脱氧-2'-氯-2'-氟胞苷(30)
向化合物29β(70mg，0.14mmol)的无水THF(2mL)溶液中加入TBAF(180μL，0.18mmol，1M的THF溶液)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物用乙酸乙酯(5mL)稀释，用水、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱法(CH2Cl2/MeOH 10:1)纯化残余物，得到化合物30(39mg，73％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ8.51(d,J＝7.6Hz,1H),7.97(m,2H),7.64(m,2H),7.52(m,2H),6.51(d,J＝6.1Hz,1H),4.44(dd,J＝16.1Hz,J＝7.3Hz,1H),3.93-4.01(m,2H),3.83(m,1H).19F NMR(376MHz,CD3OD):-124.97(dd,J＝16.6Hz,J＝5.3Hz).13C NMR(100MHz,CD3OD):δ169.1,165.4,157.7,146.4,134.59,134.17,129.8,129.2,116.2(d,J＝257Hz),98.5,90.0,83.4,73.6,60.3.MS(HR-ESI)：C16H16ClFN3O5[(M+H)+]。计算值：m/z 384.0763。实测值：m/z 384.0753。
2'-脱氧-2'-溴-2'-氟胞苷(31)
将化合物30(39mg，0.1mmol)在饱和甲醇氨(2mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。将溶液在减压下蒸发至干，并与甲醇共蒸发几次。残余物通过快速柱色谱(CH2Cl2/MeOH 4:1)纯化，得到化合物31(20mg，71％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.95(dd,J＝7.6Hz,J＝1.9Hz,1H),6.45(d,J＝8.2Hz,1H),5.93(d,J＝7.3Hz,1H),4.36(dd,J＝17.2Hz,J＝7.2Hz,1H),3.94(m,1H),3.89(m,1H),3.8(m,1H).19F NMR(376MHz,CD3OD):-124.72(dd,J＝16.7Hz,J＝7.6Hz).13C NMR(100MHz,CD3OD):δ167.6,158.0,143.7,116.4(d,J＝258Hz),96.2,89.3,83.1,74.1,60.7。MS(HR-ESI)：C9H12ClFN3O4[(M+H)+]。计算值：m/z 280.0500。实测值：m/z 280.0492。
3'-O-(叔丁氧基羰基)-2'-脱氧-2'-氯-2'-氟胞苷(32)
向化合物31(109mg，0.39mmol)和DBDC(85mg，0.39mmol)在二恶烷(8mL)中的溶液中加入Na2CO3(207mg，1.9mmol)的水(2mL)溶液。将反应混合物在25℃下搅拌48小时。将反应混合物用水(4mL)稀释，并将产物用乙酸乙酯萃取，用水、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱法(CH2Cl2/MeOH 10:1)纯化残余物，得到化合物32(44mg，30％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.80(dd,J＝7.6Hz,J＝2.8Hz,1H),6.45(d,J＝6.4Hz,1H),5.93(d,J＝7.9Hz,1H),5.31(dd,J＝16.9Hz,J＝6.2Hz,1H),4.10(m,1H),3.92(m,1H),3.78(m,1H),1.50(s,9H).19F NMR(376MHz,CD3OD):-124.07(t,J＝14.7Hz).13C NMR(100MHz,CD3OD):δ167.6,157.8,153.2,143.0,113.8(d,J＝257Hz),96.5,89.1,85.0,81.3,76.9,60.8,27.8.MS(HR-ESI):C14H20ClFN3O6[(M+H)+]。计算值：m/z 380.1025。实测值：m/z 380.1017。
5'-O-(异丙基-L-丙氨酸酯，苯基磷酰胺基)-3'-O-(叔丁氧基羰基)-2'-脱氧-2'-氯-2'-氟胞苷非对映异构体混合物(33)。
向化合物32(44mg，0.11mmol)和磷酰氯中间体(105mg，0.34mmol)在THF(3mL)中的充分搅拌的混合物中加入叔丁基氯化镁(180μL，0.18mmol，1M的THF溶液)，将反应混合物在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂，残余物通过快速柱色谱法(CH2Cl2/MeOH 10:1)纯化，得到化合物33，为非对映异构体混合物(1:1)(67mg，89％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):7.28-7.35(m,3H),7.13-7.23(m,3H),6.51-6.57(m,1H),5.76和5.68(均为d,J＝7.6Hz,1H),5.17-5.22(m,1H),4.97-5.00(m,1H),4.29-4.45(m,2H),4.21(m,1H),3.91-3.99(m,2H),1.51(s,9H),1.36-1.41(m,3H),1.16-1.23(m,6H)。19FNMR(376MHz,CDCl3):-125.8(s),126.1(s)。32P NMR(162MHz,CDCl3):2.51,2.38.13C NMR(100MHz,CDCl3):δ173.0,165.7,155.5,151.7,150.7,142.2,129.93,129.88,125.3,120.3,111.5(d,J＝254Hz),95.5,87.1,84.7,84.7,69.5,64.5,50.5,27.7,21.8,21.0.MS(HR-ESI)：C26H36ClFN4O10P[(M+H)+]。计算值：m/z 649.1842。实测值：m/z 649.1837。
5'-O-(异丙基-L-丙氨酸酯，苯基磷酰胺基)-2'-脱氧-2'-氯-2'-氟胞苷非对映异构体混合物(34)。
将化合物33(67mg，0.1mmol)和三氟乙酸(TFA)在二氯甲烷(3mL，1:1)中的溶液在0℃下搅拌2小时。将反应混合物用水稀释，用饱和Na2CO3水溶液、水、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。通过快速柱色谱法(CH2Cl2/MeOH 10:1)纯化残余物，得到化合物34(28mg，50％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.64&7.56(均为dd,J＝7.6Hz,J＝2.3Hz,1H),7.34-7.40(m,2H),7.20-7.27(m,3H),6.44-6.49(m,1H),5.85&5.89(均为d,J＝7.6Hz,1H),4.96-5.00(m,1H),4.35-4.43(m,2H),4.30(m,1H),4.10(m,1H),3.91(m,1H),1.34(m,3H),1.22(m,6H)。19F NMR(376MHz,CDCl3):-124.83(s).32P NMR(162MHz,CD3OD):3.60,3.54。13C NMR(100MHz,CD3OD):δ174.5,167.6,157.9,152.1,142.8,130.8,126.3,121.4,115.8(d,J＝257Hz),96.5,89.1,81.4,74.9,70.2,65.9,51.8,21.9,20.5。MS(HR-ESI)：C21H28ClFN4O8P[(M+H)+]。计算值：m/z 549.1317。实测值：m/z 549.1313。
1-((2R,3S,4S,5R)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-基)-4-(羟基氨基)嘧啶-2(1H)-酮(35)
向15(16mg，0.057mmol)在0.5mL H2O中的溶液中加入盐酸羟胺(20mg，0.29mmol，5.1eq)。将反应混合物在50℃下搅拌并通过TLC和LC-MS监测。3小时后，加入另外的羟胺(20mg，0.29mmol，5.1eq)，将反应混合物在60℃下再搅拌18小时。加入NaHCO3(150mg，1.78mmol)以淬灭反应。减压蒸发水。残余物通过硅胶柱色谱(CH2Cl2:MeOH＝20:1至8:1v/v)纯化，得到35(7.5mg，0.025mmol)，45％产率。
lH NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):3.39(与水峰重叠,1H),3.61(d,J＝12.4Hz,1H),3.77-3.79(m,2H),4.12-4.16(m,1H),5.32(s,1H),5.63(d,J＝8.0Hz),6.15(d,J＝17.2Hz,1H),6.47(s,1H),7.04(d,J＝8.0Hz,1H),10.13(s,1H).LC-MS:计算值C9H11ClFN3O5 295.04,297.04，实测值296.10,298.10。
1-((2R,3R,4R,5R)-3-氯-3-氟-4-羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基)-4-(羟基氨基)嘧啶-2(1H)-酮(36)
向31(7mg，0.025mmol)在0.5mL H2O中的溶液中加入盐酸羟胺(8.7mg，0.125mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌并通过TLC和/或LC/MS监测。16小时后，加入另外的羟胺(8.7g，0.125mmol)，将反应混合物在50℃再搅拌24小时。在完全消耗起始物后，用AcOEt(3×25mL)萃取水溶液。将合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(CH2Cl2:MeOH＝95:5至90:10v/v)纯化，得到36(3mg，40％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ7.21(dd,J＝8.3Hz,J＝2.3Hz,1H),6.25(d,J＝8.4Hz,1H),5.6(d,J＝8.3Hz,1H),4.29(dd,J＝17.3Hz,J＝6.8Hz,1H),3.88(m,1H),3.82(m,1H),3.74(m,1H)。19F NMR(376MHz,CD3OD):-124.5(dd,J＝16.8Hz,J＝9.5Hz)。LCMS:实测值：296.1计算值：295.03。
实施例2
细胞毒性测定
如先前所述，在Vera，人PBM，CEM(人类淋巴母细胞)，MT-2和HepG2细胞中评估化合物的毒性(参见Schinazi R.F.,Sommadossi J.-P.,Saalmann V.,Cannon D.L.,Xie M.-Y.,Hart G.C.,Smith G.A.&Hahn E.F.Antimicrob.Agents Chemother.1990,34,1061-67)。包括环己酰亚胺作为阳性细胞毒性对照，并包括暴露于溶剂的未处理细胞作为阴性对照。使用前述半数有效方法从浓度-反应曲线获得细胞毒性IC50(参见Chou T.-C.&TalalayP.Adv.Enzyme Regul.1984,22,27-55；Belen'kii M.S.&Schinazi R.F.AntiviralRes.1994,25,1-11)。结果在下面的表1中显示。
表1
实施例3
在HepG2细胞中的线粒体毒性测定：
i)化合物对细胞生长和乳酸产生的影响：对HepG2细胞生长的影响通过在0μΜ、0.1μΜ、1μΜ、10μΜ及100μΜ药物存在下孵育细胞来确定。将细胞(5×104个/孔)涂于12孔细胞培养板中的具有补充有10％胎牛血清、1％丙酮酸钠及1％青霉素/链霉素的非必需氨基酸的最小必需培养基中并且在37℃下孵育4天。孵育期结束时，使用血球计测定细胞数量。还由Pan-Zhou X-R,Cui L,Zhou X-J,Sommadossi J-P,Darley-Usmer VM."Differential effects of antiretroviral nucleoside analogs on mitochondrialfunction in HepG2cells"Antimicrob.Agents Chemother.2000；44:496-503所教导。
为了测量化合物对乳酸产生的影响，来自储备培养物的HepG2细胞被稀释并以2.5×104个细胞/孔涂于12孔培养板中。可添加各种浓度(0μΜ、0.1μΜ、1μΜ、10μΜ及100μΜ)的化合物，并且将培养物在37℃下在湿润的5％CO2气氛中孵育4天。在第4天，测定每个孔中的细胞数量并收集培养基。将培养基过滤，并且使用比色乳酸测定(Sigma-Aldrich)来测定培养基中的乳酸含量。因为乳酸产物可被视为受损的线粒体功能的标记物，所以在测试化合物存在下生长的细胞中检测到的升高水平的乳酸产生可用于指示药物诱导的细胞毒性效应。
ii)化合物对线粒体DNA合成的影响：已开发了精确地定量线粒体DNA含量的实时PCR测定(参见Stuyver LJ,Lostia S,Adams M,Mathew JS,Pai BS,Grier J,Tharnish PM,Choi Y,Chong Y,Choo H,Chu C K,Otto MJ,Schinazi RF.Antiviral activities和cellular toxicities of modified 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydrocytidineanalogs.Antimicrob.Agents Chemother.2002；46:3854-60)。此测定用于本申请中所述的所有研究，所述研究确定化合物对线粒体DNA含量的影响。在此测定中，低传代数的HepG2细胞以5,000个细胞/孔接种于涂布胶原的96孔板中。测试化合物可添加至培养基中以获得0μΜ、0.1μΜ、10μΜ及100μΜ的最终浓度。在培养第7天，细胞核酸可通过使用可商购获得的柱(RNeasy 96试剂盒；Qiagen)来制备。这些试剂盒共同纯化RNA和DNA，且因此将总核酸从柱上洗脱。线粒体细胞色素C氧化酶亚基II(COXII)基因及β-肌动蛋白或rRNA基因可使用多重Q-PCR方案从5μl洗脱的核酸来扩增，其中适合的引物和探针用于靶标和参照扩增两者。对于COXII，可分别使用以下有义、探针及反义引物：5'-TGCCCGCCATCATCCTA-3'、5'-四氯-6-羧基荧光素-TCCTCATCGCCCTCCCATCCC-TAMRA-3'及5'-CGTCT GTTATGTAAAGGATGCGT-3'。对于β-肌动蛋白基因(GenBank登录号E01094)的外显子3，有义、探针及反义引物分别是5'-GCGCGGC TACAGCTTCA-3'、5'-6-FAMCACCACGGCCGAGCGGGATAMRA-3'及5'-TCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。rRNA基因的引物和探针可从Applied Biosystems商购获得。因为相等的扩增效率可对于所有基因获得，所以比较CT方法可用于研究线粒体DNA合成的可能抑制。比较CT方法使用以下算术公式，其中靶标(COXII基因)的量相对内源参照物(β-肌动蛋白或rRNA基因)的量进行归一化并且与校准器(在第7天时没有药物的对照)有关。用于此方法的算术公式是由2-ΔΔCT给出，其中ΔΔCT是(平均靶标测试样品的CT-靶标对照的CT)-(平均参照测试的CT-参照对照的CT)(参见Johnson MR,K Wang,J B Smith,MJ Heslin,RBDiasio.Quantitation of dihydropyrimidine dehydrogenase expression by real-time reverse transcription polymera se chain reaction.Anal.Biochem.2000；278:175-184)。在药物存在下生长的细胞中的线粒体DNA含量的下降指示线粒体毒性。
在HepG2细胞中评估化合物10和12对线粒体和核DNA水平以及乳酸产生的影响(14天测定)，数据列于下表2中：
表2
数据显示，如本文所述的化合物10和12是无毒的。
实施例4
在Neuro2A细胞中的线粒体毒性测定
为了估计本发明的化合物产生神经元毒性的可能性，小鼠Neuro2A细胞(美国典型培养物保藏中心131)用作模型系统(参见Ray AS,H ernandez-Santiago BI,Mathew JS,Murakami E,Bozeman C,Xie MY,Dutschman GE,Gullen E,Yang Z,Hurwitz S,Cheng YC,Chu CK,McClure H,Schinazi RF,Anderson KS.Mechanism of anti-humanimmunodeficiency virus activity of beta-D-6-cyclopropyl氨基-2',3'-didehydro-2',3'-dideoxyguanosine.Antimicwb.Agents Chemother.2005,49,1994-2001)。抑制50％细胞生长所必需的浓度(CC50)可使用基于3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物染料的测定如所述来测量。细胞乳酸和线粒体DNA水平在限定的药物浓度下的扰动可如上所述进行。ddC和AZT可用作对照核苷类似物。
实施例5
骨髓细胞毒性的测定
原代人骨髓单核细胞从Cambrex Bioscience(Walkersville，MD)商购获得。CFU-GM测定在50单位/mL人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子存在下使用双层软琼脂进行，而BFU-E测定使用含有1单位/mL促红细胞生成素的乙基纤维素基质(参见Sommadossi JP,Carlisle R.Toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidine和9-(1,3-dihydrosy-2-propoxymethyl)guanine for normal human hepatopoietic progenitor cells invitro.Antimicrob.Agents Chemother.1987；31:452-454；Sommadossi,JP,Schinazi,RF,Chu,CK,and Xie,MY.Comparison of Cytotoxicity of the(-)and(+)enantiomer of 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine in normal human bone marrow progenitorcells.Biochem.Pharmacol.1992；44:1921-1925)。每个实验都在来自三个不同供体的细胞中一式两份进行。AZT用作阳性对照。细胞在化合物存在下在37℃和5％CO2下孵育14-18天，并且大于50个细胞的集落使用倒置显微镜计数以测定IC50。50％抑制浓度(IC50)通过药物浓度对BFU-E存活分数的对数的最小二乘线性回归分析来获得。统计分析可用Student's t检验针对独立的非成对样品进行。数据总结在下表中：
表3：骨髓集落形成细胞测定(BFU-E)
IC50以μM计
供体 12 AZT
1 ＞100 0.3
2 ＞100 2.9
实施例6
HCV复制子测定1
将含有HCV复制子RNA的Huh 7 Clone B细胞以5000个细胞/孔接种于96孔板中，并且在接种之后立即一式三份在10μM下测试化合物。五天孵育(37℃，5％CO2)之后，通过使用来自Gentra的versaGene RNA纯化试剂盒分离总细胞RNA。在单步多重实时RT-PCR测定中扩增复制子RNA和内部对照(TaqMan rRNA对照试剂，Applied Biosystems)。化合物的抗病毒有效性通过从无药物的对照(ΔCt HCV)的阈值RT-PCR循环减去测试化合物的阈值RT-PCR循环来计算。3.3的ΔCt等于复制子RNA水平的1-log减少(等于90％的起始材料减少)。化合物的细胞毒性还通过使用ΔCt rRNA值来计算。(2′-C-Me-C)被用作阳性对照。为了测定EC90和IC50值2，ΔCt：值首先被转换为起始材料的分数3，然后用于计算抑制％。
参考文献：
1.Stuyver L et al.，Ribonucleoside analogue that blocks replication或bovine viral diarrhea和hepatitis C viruses in culture.Antimicrob.AgentsChemother.2003，47，244-254.
2.Reed IJ&Muench H，A simple method或estimating fifty percentendpoints.Am.J.Hyg.27：497，1938.
3.Applied Biosystems公司手册
针对HCV lb的化合物10和12的半数有效浓度(EC50)范围示于表4中：
A＝＞10μΜ
B＝1-10μΜ
C＝0.1-1μΜ
D＝<1μΜ
表4
实施例7：
NS5B酶测定
21-氨基酸C-末端截短的HCV NS5B RNA聚合酶可以从HCV复制子细胞克隆，用6-His-末端尾修饰，在原核表达载体(pQE60；Qiagen)中表达，随后在Talon钴亲和树脂柱(Clontech，Palo Alto，Calif.)上纯化。1可通过SDS-PAGE和Western印迹监测纯化。所得纯化的蛋白质可以相对于50mM磷酸钠(pH 8.0)-300mM氯化钠-0.5％Triton X-100-50％甘油-2mM二硫苏糖醇透析过夜。当储存在-20℃时，透析液保持一致性超过6个月。通过使用来自同一供应商的牛血清白蛋白标准品，可以使用Coomassie Plus蛋白测定试剂(Pierce)定量蛋白质。
可以通过使用负IRES作为模板，监测32P标记的UMP掺入新合成的RNA链中来研究NS5B RNA聚合酶反应。稳态反应可以在50mM HEPES缓冲液(pH7.5)中含有2.8mg负IRES RNA模板，140单位抗核糖核酸酶(Ambion)，1.4mg NS5B，适量的[α-32P]UTP，各种浓度的天然和修饰的核苷酸，1mM MgCl2，0.75mM MnCl2和2mM二硫苏糖醇的140mL总体积中进行。核苷酸浓度可以根据抑制剂而变化。反应温度通常为约27℃。在所需时间，可以取20mL等分试样，通过将反应混合物与80mL含有12.5mM EDTA，2.25M NaCl和225mM柠檬酸钠的终止液混合来淬灭反应。为了确定天然核苷酸TP(NTP)底物的稳态参数，可以改变一种NTP浓度，并且可以将其他三种NTP的浓度固定在饱和浓度。为了确定A类似物的Ki，UTP，GTP和CTP的浓度可以分别固定为10,100和100mM，并且可以改变ATP和A类似物的浓度。通过使猝灭的反应混合物通过使用斑点印迹装置穿过Hybond N+膜(Amersham Biosciences)，可以将放射性RNA产物与未反应的底物分离。RNA产物可以保留在膜上，并且游离核苷酸可以被洗掉。膜可以用含有0.6M NaCl和60mM柠檬酸钠的溶液洗涤例如四次。在用水冲洗膜然后用乙醇冲洗后，可以切掉斑点并在Packard液体闪烁计数器中计数放射性。产物的量可以基于反应混合物中的总放射性计算。反应速率可以从产物形成的时间进程的斜率确定。为了测定抑制常数(Ki)，可以用不同浓度的底物和抑制剂确定反应速率，并拟合成竞争抑制方程：ν＝(Vmax·[s])/{Km·(1+[I]/Ki)+[S]}，其中ν是观察的速率，[S]是底物浓度，[I]是抑制剂浓度，Vmax是最大速率。Km是Michaelis常数，且Ki是抑制常数。
参考文献：
1)Stuyver LJ,Whitaker T,McBrayer TR,Hernandez-Santiago BI,Lostia S,Tharnish PM,Ramesh M,Chu CK,Jordan R,Shi J,Rachakonda S,Watanabe KA,Otto MJ,Schinazi RF.Ribonucleoside Analogue That Blocks Replication of Bovine ViralDiarrhea and Hepatitis C Viruses in Culture Antimicrob.Agents Chemother.2003,47,244。
实施例8：
RNA合成和链终止
i)HCV NS5B的表达和纯化：插入表达载体pET-22(Novagen)中的HCV NS5B序列在大肠杆菌BL21(DE3)中表达为C末端截短的酶(Δ21)，并利用金属离子亲和色谱(来自Clonetech的Talon试剂盒)纯化。通过测序(Sequetech)确认序列。
ii)标准反应条件：反应混合物由在含有40mM HEPES，pH 8，10mM NaCl，1mM二硫苏糖醇和0.2mM MnCl2的缓冲液中的1μMRNA模板(RNA20)，1.5μM HCV NS5B和0.25μM放射性标记的引物(P16)组成。此外，反应含有10μMGTP-UTP和3μM测试类似物-TP。30分钟后停止反应，产物用异丙醇沉淀，在95℃热变性5分钟，并在12％聚丙烯酰胺，7M尿素凝胶上分离。对于用模板/引物掺入的核苷酸类似物的单个位点，确定抑制50％全长产物形成所需的链终止子的浓度(EC50)。
iii)数据采集和分析：用磷光成像仪(FLA-7000，Fujifilm)扫描和分析凝胶，并计算EC50值。
化合物12(10-TP)的三磷酸酯是HCV 1b wt NS5B聚合酶的抑制剂。清除抑制剂暂停位点在图1所示的凝胶中是明显的，并且以剂量依赖性方式发生。12(10-TP)相对于HCV1b wt NS5B聚合酶的剂量反应导致6.9μM的IC50值(显示于图2中)。
实施例9：
核苷酸类似物对线粒体DNA聚合酶γ的DNA聚合酶和核酸外切酶活性的影响
i)人聚合酶γ的纯化：聚合酶γ的重组大和小亚基可如先前所述进行纯化(参见Graves SW,Johnson AA,Johnson KA.Expression,purification,and initial kineticcharacterization of the large subunit of the human mitochondrial DNApolymerase.Biochemistry.1998,37,6050-8；Johnson AA,Tsai Y,Graves SW,JohnsonKA.Human mitochondrial DNA polymerase holoenzyme:reconstitution和characterization.Biochemistry 2000；39:1702-8)。可在280nm下用分光光度法来测定蛋白质浓度，对于聚合酶γ的大和小亚基，消光系数分别是234,420和71,894M-1cm-1。
ii)核苷酸掺入的动力学分析：可进行预稳态动力学分析以测定核苷-TP及天然dNTP底物的DNA聚合酶γ的掺入的催化效率(k/K)。这允许确定此酶掺入修饰的类似物和预测毒性的相对能力。核苷酸类似物通过DNA聚合酶γ掺入的预稳态动力学分析可基本上如先前所述进行(参见Murakami E,Ray AS,Schinazi RF,Anderson KS.Investigating theeffects of stereochemistry on incorporation和removal of 5-氟cytidine analogsby mitochondrial DNA polymerase gamma:comparison of D-and L-D4FC-TP.AntiviralRes.2004,62,57-64；Feng JY,Murakami E,Zorca SM,Johnson AA,Johnson KA,SchinaziRF,Furman PA,Anderson KS.Relationship between antiviral activity和hosttoxicity:comparison of the incorporation efficiencies of 2',3'-dideoxy-5-氟-3'-thiacytidine-triphosphate analogs by human immunodeficiency virus type1reverse transcriptase和human mitochondrial DNA polymerase.Antimicrob AgentsChemother.2004,48,1300-6)。简言之，聚合酶γ的大(250nM)和小(1.25mM)亚基和60nMDNA模板/引物在50mM Tris-HCl、100mM NaCl,pH 7.8中的预孵育混合物可添加至含有MgCl2(2.5mM)及各种浓度的核苷酸类似物的溶液中。可对反应进行淬火并且如先前所述来分析。将数据拟合成如上所述相同的方程，并且以μM计的结果如下面的表5所示。
表5人DNA聚合酶的抑制IC 50 (μM)
iii)人聚合酶γ3'5'核酸外切酶活性的测定：人聚合酶γ核酸外切酶活性可通过在dNTP不存在下测量裂解产物的形成率来研究。反应可通过添加MgCl2(2.5mM)至聚合酶γ大亚基(40nM)、小亚基(270nM)及1,500nM链终止模板/引物在50mM Tris-HCl、100mM NaCl,pH 7.8的预孵育混合物中开始，并且在指定的时点用0.3M EDTA淬火。所有反应混合物都可在20％变性聚丙烯酰胺测序凝胶(8M尿素)上分析，在Bio-Rad GS-525分子图像系统上成像，并且用Molecular Analyst(Bio-Rad)定量。对由早期时点形成的产物以时间函数进行绘图。数据可通过线性回归与Sigma Plot(Jandel Scientific)拟合。可将线的斜率除以反应中的活性酶浓度以计算核酸外切酶活性的kexo(参见Murakami E,Ray AS,Schinazi RF,Anderson KS.Investigating the effects of stereochemistry on incorporation和removal of 5-氟cytidine analogs by mitochondrial DNA polymerase gamma:comparison of D-and L-D4FC-TP.Antiviral Res.2004；62:57-64；Feng JY,Murakami E,Zorca SM,Johnson AA,Johnson KA,Schinazi RF,Furman PA,Anderson KS.Relationshipbetween antiviral activity和host toxicity:comparison of the incorporationefficiencies of 2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine-triphosphate analogsby human immunodeficiency virus type 1reverse transcriptase和humanmitochondrial DNA polymerase.Antimicrob Agents Chemother.2004；48:1300-6)。
实施例10
核苷类似物三磷酸酯的合成
核苷类似物三磷酸酯是使用Ludwig和Eckstein的方法从相应的核苷来合成。(Ludwig J,Eckstein F."Rapid和efficient synthe sis of nucleoside5'-O-(1-thiotriphosphates),5'-triphosphates和2',3'-cyclophosphorothioates using2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one"J Org.Chem.1989,54631-5)。粗核苷类似物三磷酸酯可例如通过FPLC使用HiLoad 26/10Q Sepharose Fast Flow Pharmacia柱和TEAB缓冲液(pH 7.0)的梯度来纯化。产物将通过UV光谱学、质子NMR、磷NMR、质谱学及HPLC来表征。代表性质谱图示于图4中。
所得的三磷酸酯可用作如上所述的细胞药理学测定的对照并且用于HCV-Pol的动力学研究。
实施例11
HepG2细胞中的细胞药理学
HepG2细胞可从美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)处获得，并且在225cm2组织培养烧瓶中，在补充有非必需氨基酸、1％青霉素-链霉素的最低必需培养基中生长。培养基可每三天更新一次，并且细胞可每周传代一次进行培养。在以暴露于30mL胰蛋白酶-EDTA 10分钟分离贴壁单层且用培养基连续洗涤三次之后，汇合的HepG2细胞可以2.5×106个细胞/孔的密度接种于6孔板中并且暴露于10μΜ[3H]标记的活性化合物(500dpm/pmol)达规定的时间段。
细胞被维持在37℃和5％CO2气氛下。在选定的时间点，将细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次。
细胞内活性化合物及其各自的代谢物是通过在-20℃下用60％甲醇孵育细胞沉淀过夜，然后在冰浴中用另外20pal的冷甲醇萃取1小时来提取。然后将提取物合并，在轻柔过滤的空气流下干燥并储存于-20℃直到HPLC分析。
实施例12
Huh7细胞中的细胞药理学
与HepG2细胞药理学概述的方法类似，将化合物在Huh-7细胞中以50μM的浓度一式三份孵育4小时。3TC用作阳性对照并一式两份进行，同时将DMSO(10μL)作为空白对照孵育一式两份。使用冰冷的70％甲醇作为提取溶剂。ddATP(10nM)用作内标。
在Huh-7细胞中化合物12相对索非布韦的三磷酸酯产生示于图3中。结果表明，当化合物12在Huh-7细胞中孵育时比索非布韦在相同的浓度下在相同的细胞系中孵育时产生大约300％更多的活性三磷酸酯。在图3中，索非布韦的三磷酸酯被识别为2’-Me,2’-F U-TP。
实施例13
PBM细胞中的细胞药理学
将测试化合物在PBM细胞中以50μM在37℃下孵育4小时。然后除去含有药物的培养基，用PBS洗涤PBM细胞两次以除去细胞外药物。使用1mL 70％冰冷的甲醇(含有10nM内标ddATP)从10×106个PBM细胞提取细胞内药物。沉淀后，将样品在室温下保持15分钟，随后涡旋30秒，然后在-20℃下储存12小时。然后将上清液蒸发至干。干样品储存在-20℃下，直到LC-MS/MS分析。在分析前，将每个样品在100μL流动相A中重构，并在20,000g下离心以除去不溶性颗粒。
梯度分离在Hypersil GOLD柱(100×1.0mm，3μm粒度；Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)上进行。流动相A由2mM磷酸铵和3mM己胺组成。乙腈在15分钟内从10％增加至80％，并在80％保持3分钟。10％乙腈下的平衡持续15分钟。
总运行时间为33分钟。将流速保持在50μL/min，并使用10μL注射。自动进样器和柱室通常分别保持在4.5和30℃。
第一个3.5分钟的分析被转移至废物。质谱仪在正电离模式下以3.2kV的喷雾电压操作。
实施例14
西尼罗病毒药物敏感性也可以如先前在以下文献中所述来测定：Song,G.Y.,Paul,V.,Choo,H.,Morrey,J.,Sidwell,R.W.,Schinazi,R.F.,Chu,C.K.Enantiome ricsynthesis of D-and L-cyclopentenyl nucleosides和their antiviral activityagainst HIV和West Nile virus.J.Med.Chem.2001,44,3985-3993。
实施例15
黄热病药物敏感性也可如先前在以下文献中所述来测定：Julander,J.G.,Furuta,Y.,Shafer,K.,Sidwell,R.W.Activity of T-1106in a Hamster Model ofYellow Fever Virus Infection.Antimicob.Agents Chemother.2007,51,1962-1966。
实施例16
The essential role of a particular viral protein(Dengue virusenvelope protein(E))in viral propogation.Mondotte等人,J.Virol.2007年7月,第81卷第13期，7136-7148页公开了可用于鉴定用于治疗由登革热病毒引起的感染的化合物的测定，并且该测定可用于鉴定本文所述的对登革热有活性的那些化合物。
另一种测定法描述于Levin，第14届丙型肝炎病毒&相关病毒，格拉斯哥，UK，2007年9月9-13日中。该测定涉及人和登革热病毒聚合酶，其中推定的化合物可以针对酶测试，优选一式两份，在一定浓度范围内，例如从0.8mM至100mM。化合物也可以与对照(无抑制剂)，溶剂稀释(0.016％至2％DMSO)和参考抑制剂一起进行。
用于登革热的合适的高通量测定在Lim等人，Antiviral Research，第80卷，第3期，2008年12月，第360-369页中描述。登革热病毒(DENV)NS5在其N末端氨基酸序列处具有甲基转移酶(MTase)活性并且使得在病毒基因组RNA中形成1型帽结构m7GpppAm2'-O。对于DENV22'-O-MTase活性的最佳体外条件可使用纯化重组蛋白及短的生物素化GTP-带帽RNA模板来表征。衍生自初始速度的稳态动力学参数可用于确立针对化合物测试的稳固的闪烁亲近测定。通过Lim等人，Antiviral Research，第80卷，第3期，2008年12月，第360-369页的预孵育研究显示MTase-AdoMet和MTase-RNA复合物具有同样的催化能力并且所述酶支持随机的bi动力学机制。Lim用竞争性抑制剂S-腺苷-同型半胱氨酸及两个同系物西萘芬净和脱氢西萘芬净验证了测定。存在于DENV2MTase的N末端处的GTP-结合袋先前被假定为帽结合位点。此测定允许快速且高灵敏度的检测2'-O-MTase活性并且可容易地适于抑制性化合物的高通量筛选。
实施例17
抗诺瓦克病毒活性
化合物可通过抑制诺瓦克病毒聚合酶和/或解旋酶，通过抑制在复制周期中所需的其它酶或通过其它途径展现抗诺瓦克病毒活性。
目前没有被批准用于诺瓦克病毒感染的药物治疗(http://www.cdc.gov/ncidod/ dvrd/revb/gastro/norovirus-qa.htm)，并且这大概至少部分是由于缺乏细胞培养系统的可用性。近来，已经开发用于原始的诺瓦克G-I毒株的复制子系统(Chang,K.O.,等人(2006)Virology353:463-473)。
诺瓦克病毒复制子和丙型肝炎复制子都需要病毒解旋酶、蛋白酶和聚合酶的作用以便进行复制子的复制。最近，已经报道利用诺瓦克病毒基因组I和II接种体的体外细胞培养传染性测定(Straub,T.M.等人(2007)Emerg.Infect.Dis.13(3):396-403)。此测定利用在微载体珠上的小肠上皮细胞在旋转壁式生物反应器中进行。传染性测定可用于筛选进入抑制剂。
实施例18
诺瓦克病毒感染的诊断
可以通过使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定检测受影响的人的粪便中的病毒RNA来诊断诺瓦克病毒感染。病毒可从在症状开始之后48至72时间内采集的粪便样本中鉴定，但也可使用RT-PCR对在症状开始之后长达7天时采集的样品获得令人满意的结果。其它诊断方法包括电子显微镜和血清学测定：至少相隔三周收集的双份血清中的滴度有升高。还可利用酶联免疫测定法，但它们倾向于具有相对较低的灵敏度，这限制了其对爆发的病因学诊断的使用。经常使用诺瓦克病毒感染的临床诊断，特别是当肠胃炎的其它病原体已被排除时。
实施例19
抗基孔肯雅活性
抗基孔肯雅活性可以如“Anti-Chikungunya Viral Activities ofAplysiatoxin-Related Compounds from the Marine Cyanobacterium Trichodesmiumerythraeum”Gupta,D.K.；Kaur,P.；Leong,S.T.；Tan,L.T.；Prinsep,M.R.；Chu,J J.H.MarDrugs.Jan 2014；12(1):115–127；10.3390/md12010115以及其中引用的参考文献所描述地进行评价。
实施例20
抗癌测定
抗癌测定可以在以下参考文献和其中引用的那些参考文献中找到：
“Handbook of Anticancer Drug Development”Lippincott Williams&Wilkins，Daniel R.Budman，Alan Hilary Calvert，Eric Keith Rowinsky，2003 400页
“Apoptosis assays for quantifying the bioactivity of anticancer drugproducts”Joslyn K.Brunelle，Baolin Zhang Drug Resistance Updates，13(6)2010，第172-179页。
实施例21
抗RSV活性
抗RSV活性可以如下面的参考文献中所概述的进行评价：
“Polyadenylation-dependent screening assay for respiratory syncytialvirus RNA transcriptase activity and identification of an inhibitor”StephenW.Mason,Carol Lawetz,Yvon Gaudette,Florence Erika Scouten,Lisette Lagacé,Bruno Simoneau1Michel Liuzzi.Nucl.Acids Res.(2004)32(16):4758-4767；doi:10.1093/nar/gkh809。
“Screening and evaluation of anti-respiratory syncytial viruscompounds in cultured cells”Lundin A1,T,Trybala E.Methods MolBiol.2013；1030:345-63.doi:10.1007/978-1-62703-484-5_27。
“A fluorescence-based high-throughput antiviral compound screeningassay against respiratory syncytial virus”Kwanten L1,De Clerck B,RoymansD.Methods Mol Biol.2013；1030:337-44.doi:10.1007/978-1-62703-484-5_26。
实施例22
抗流感活性
抗流感活性可以如下文参考文献中所概述的进行评价：Schmidtke等人，“A rapidassay for evaluation of antiviral activity against coxsackie virus B3,influenza virus A,and herpes simplex virus type 1,”J Virol Methods.2001Jun；95(1-2):133-43。
Ching-Yao Su,"High-throughput identification of compounds targetinginfluenza RNA-dependent RNA polymerase activity，”PNAS，第107卷第45期，19151-19156(2010年11月9日)。
“In vitro and in vivo assay systems for study of influenza virusinhibitors”Robert W.Sidwell；Donald F.Smee.Antiviral Research 48(1)2000，第1-16页。
“A cell-based luminescence assay is effective for high-throughputscreening of potential influenza antivirals”James W.Noah；William Severson；Diana L.Noah；Lynn Rasmussen；E.Lucile White；Colleen B.Jonsson.AntiviralResearch 73(1)2007，第50-59页。
“High-Throughput Screening of a 100,000-Compound Library forInhibitors of Influenza A Virus(H3N2)”William E.Severson；Michael McDowell；Subramaniam Ananthan；Dong-Hoon Chung；Lynn Rasmussen；Melinda I.Sosa；E.LucileWhite；James Noah；Colleen B.Jonsson.J Biomol Screen 2008 13:879-887,doi:10.1177/1087057108323123。
本发明的范围不限于本文所述的具体实施方案。实际上，除了所描述的那些之外，对于本领域技术人员来说根据前面的描述和附图本发明的各种修改将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用了各种出版物，其公开内容通过引用整体并入本文。

Claims (38)

1.一种具有式1A的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，
R5是O、CH2、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基组成的组，或者当OR8出现在式1A中时其是从α氨基酸衍生的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，以及其中苯基和吡啶基任选地由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(b)
(c)L-氨基酸的酯其中R17限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R6和R7可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；
其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(e)R6和R7可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2，及其药学上可接受的盐或前药。
2.一种具有式1A的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，
R5是O、CH2、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基组成的组，或者当OR8出现在式1A中时其是从α氨基酸衍生的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，以及其中苯基和吡啶基任选地由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(b)
(c)L-氨基酸的酯其中R17限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R6和R7可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；
其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(e)R6和R7可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3)环烷基NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2，及其药学上可接受的盐或前药。
3.一种具有式1A的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，
R5是O、CH2、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基组成的组，或者当OR8出现在式1A中时其是从α氨基酸衍生的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由Li、Na、K、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基限于苯基且杂芳基限于吡啶基，以及其中苯基和吡啶基必须由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(b)
(c)R6和R7可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；
其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R6和R7可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3)环烷基NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2，及其药学上可接受的盐或前药。
4.一种具有式(1B)的化合物
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，R5是O、CH2、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基、C(O)(C1-8)芳基、C(O)NH(C1-8)芳基组成的组，或者当OR8出现在式1B中时其为从α氨基酸衍生的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，以及其中苯基和吡啶基任选地由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(b)
(c)L-氨基酸的酯其中R17限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R2和R3可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；
其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(e)R2和R3可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3)环烷基NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2，及其药学上可接受的盐或前药。
5.一种具有下面的式1A之一的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，R5是O、CH2、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基、C(O)(C1-8)芳基、C(O)NH(C1-8)芳基组成的组，或者当OR8出现在式1A或1B中时其为从α氨基酸衍生的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，以及其中苯基和吡啶基任选地由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(b)
(c)L-氨基酸的酯其中R17限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R6和R7可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；
其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(e)R6和R7可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3)环烷基NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2，及其药学上可接受的盐或前药，
条件是R1，R2和R3中的一个或多个不是H或R5不是O。
6.权利要求1的化合物，其中所述化合物为β-D或β-L构型。
7.权利要求1或2的化合物，具有下式：
其中R4和碱基如上述权利要求1或2中所定义，
及其药学上可接受的盐或前药。
8.权利要求7的化合物，其中所述化合物为β-D或β-L构型。
9.一种选自由以下组成的组的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1至9的化合物和药学上可接受的载体。
11.权利要求10的组合物，其中所述组合物是透皮组合物或纳米颗粒组合物。
12.权利要求10的药物组合物，其还包含第二抗病毒剂。
13.权利要求12的药物组合物，其中所述第二抗病毒剂选自由干扰素、利巴韦林、NS3蛋白酶抑制剂、NS5A抑制剂、非核苷聚合酶抑制剂、解旋酶抑制剂、聚合酶抑制剂、核苷酸或核苷类似物、IRES依赖性翻译的抑制剂及它们的组合组成的组。
14.权利要求1-9中任一项的化合物在制备用于治疗HCV感染、预防HCV感染或降低HCV感染的生物学活性的药物中的用途。
15.一种治疗感染HCV的宿主的方法，其包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求1至9中任一项的化合物。
16.权利要求15的方法，其中所述化合物与另一种抗HCV剂联合施用。
17.一种用于治疗、预防或降低选自由黄热病、登革热、基孔肯雅和西尼罗病毒组成的组的病毒导致的感染的生物学活性的方法，其包括对需要治疗或预防的患者施用预防有效量的权利要求1-9中任一项的化合物。
18.权利要求17的方法，其中对需要预防的患者联合施用所述化合物与另一种抗黄病毒科病毒剂。
19.一种用于治疗受诺瓦克病毒或沙波病毒(Saporovirus)感染的宿主，预防诺瓦克病毒或沙波病毒感染或降低宿主中诺瓦克病毒或沙波病毒感染的生物活性的方法，其包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求1-9中任一项的化合物。
20.权利要求19的方法，其中所述化合物与另一种抗诺瓦克病毒或抗沙波病毒病毒剂联合施用。
21.一种用于治疗受RSV或流感感染的宿主，预防RSV或流感感染或降低宿主中的RSV或流感感染的生物学活性的方法，其包括对需要治疗或预防的患者施用有效量的权利要求1-9中任一项的化合物。
22.权利要求22的方法，其中所述化合物与另一种抗RSV或抗流感剂组合施用。
23.一种治疗患有癌症的宿主的方法，其包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求1至9中任一项的化合物。
24.权利要求23的方法，其中所述化合物与另一种抗癌剂联合施用。
25.一种治疗癌症或治疗黄热病、登革热、西尼罗病毒、RSV、流感、基孔肯雅或诺瓦克病毒感染的方法，其包括对需要治疗的患者施用式1A或1B化合物，其中式1A或1B的化合物具有下式：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，R5是O、CH2、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基、C(O)(C1-8)芳基、C(O)NH(C1-8)芳基组成的组，或者当OR8出现在式1A或1B中时其为从α氨基酸衍生的酯，
R6和R7独立地选自由以下组成的组：
(a)OR15，其中R15选自由H、Li、Na、K、C1-20烷基、C3-6环烷基、C1-4(烷基)芳基、苄基、C1-6卤代烷基、C2-3(烷基)OC1-20烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中芳基包括苯基且杂芳基包括吡啶基，以及其中苯基和吡啶基任选地由0至3个独立地选自由(CH2)0-6CO2R16和(CH2)0-6CON(R16)2组成的组的取代基取代；
R16独立地为H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(b)
(c)L-氨基酸的酯其中R17限于天然L-氨基酸中存在的那些，以及R18是H、C1-20烷基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(d)R6和R7可以一起形成环其中R19是H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪醇的碳链或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基、或取代杂芳基取代的C1-20烷基；
其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
(e)R6和R7可以一起形成选自由以下组成的环
其中：
R20是O或NH，以及
R21选自由H、C1-20烷基、C1-20烯基、衍生自脂肪酸的碳链和由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基、环烷基烷基、环杂烷基、芳基、杂芳基、取代芳基或取代杂芳基取代的C1-20烷基组成的组；其中取代基是C1-5烷基，或由低级烷基、烷氧基、二(低级烷基)-氨基、氟、C3-10环烷基取代的C1-5烷基，或环烷基；
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3)环烷基NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2，及其药学上可接受的盐或前药。
26.一种具有下面的式之一的化合物：
或其药学上可接受的盐或前药，其中：
R1是H或Me，其中当R1是Me时，它可以全部或部分是R或S或它们的任何混合物；
R2是H、N3、F、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基或(C2-8)炔基；
R4是H或P(O)R6R7，其中，当手性存在于R4的磷中心时，它可以全部或部分是Rp或Sp或它们的任何混合物，R5是O、CH2、CHF、CF2或C＝CH2，
当R5是O时，R3是H或CN，以及
当R5是CH2、CHF、CF2或C＝CH2时，R3选自由CN、(C1-8)烷基、(C2-8)烯基、(C2-8)炔基和(C1-8)O烷基组成的组，
R8选自由H、C(O)(C1-8)烷基、C(O)(C1-8)支链烷基、C(O)NH(C1-8)烷基、C(O)NH(C1-8)支链烷基、C(O)(C1-8)芳基、C(O)NH(C1-8)芳基组成的组，或者当OR8出现在式1A或1B中时其为从α氨基酸衍生的酯，
P(O)R6R7是二磷酸酯或三磷酸酯，具体地，R6是OH，且R7是
碱基选自由以下组成的组：
X1是CH或N，
R9是OH、NH2、O(C1-10)烷基、NH(C1-10)烷基、N((C1-10)烷基)2、NH(C3)环烷基NH(CO)(C1-20)烷基、NH(CO)O(C1-20)烷基、NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基、NHO(CO)NH(C1-20)烷基，
R10是H、F或CH3以及
X2是H、F、Cl或NH2，及其药学上可接受的盐或前药，
条件是当式为1A且碱基不为且R9不为NHOH、NHO(CO)(C1-20)烷基或NHO(CO)NH(C1-20)烷基，R1、R2和R3中的一个或多个不是H或R5不是O。
27.权利要求26的化合物在制备用于治疗HCV感染、预防HCV感染或降低HCV感染的生物学活性的药物中的用途。
28.一种治疗感染HCV的宿主的方法，其包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求26的化合物。
29.权利要求28的方法，其中所述化合物与另一种抗HCV剂联合施用。
30.一种用于治疗、预防或降低由选自由黄热病、登革热、基孔肯雅和西尼罗病毒组成的组的病毒导致的感染的生物学活性的方法，其包括对需要治疗或预防的患者施用预防有效量的权利要求26的化合物。
31.权利要求30的方法，其中对需要预防的患者联合施用所述化合物与另一种抗黄病毒科病毒剂。
32.一种用于治疗受诺瓦克病毒或沙波病毒感染的宿主，预防诺瓦克病毒或沙波病毒感染或降低宿主中诺瓦克病毒或沙波病毒感染的生物活性的方法，其包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求26的化合物。
33.权利要求32的方法，其中所述化合物与另一种抗诺瓦克病毒或抗沙波病毒病毒剂联合施用。
34.一种用于治疗受RSV或流感感染的宿主，预防RSV或流感感染或降低宿主中的RSV或流感感染的生物学活性的方法，其包括对需要治疗或预防的患者施用有效量的权利要求26的化合物。
35.权利要求34的方法，其中所述化合物与另一种抗RSV或抗流感剂组合施用。
36.一种治疗患有癌症的宿主的方法，其包括对需要治疗的患者施用有效量的权利要求26的化合物。
37.权利要求36的方法，其中所述化合物与另一种抗癌剂联合施用。
38.一种治疗癌症或治疗黄热病、登革热、西尼罗病毒、RSV、流感、基孔肯雅或诺瓦克病毒感染的方法，其包括对需要治疗的患者施用权利要求26的化合物。
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