因此，現將藉由以下實例闡釋本發明之各個實施例及中間體。實例僅意欲進一步闡述本發明且決不限制本發明之範疇。化合物名稱係藉由ChemDraw Ultra軟體, Cambridgesoft，12.0.2版生成。 除上述定義外，在下文實例及合成反應圖中使用以下縮寫。若本文所用縮寫未經定義，則其具有其公認之含義 Bn 苄基 Bz 苯甲醯基 BOP-Cl 雙-(2-側氧基-3-噁唑啶基)次膦醯氯 Bz 苯甲醯基 DCC 二環己基碳二亞胺 DCM 二氯甲烷 DIEA 二異丙基乙基胺 DMAP 4-二甲基胺基吡啶 DMF N,N-二甲基甲醯胺； DMPU 1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-嘧啶酮 EDC 1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二醯亞胺鹽酸鹽 ES 電噴射 Et
3
N 三乙胺 EtOAc 乙酸乙酯 EtOH 乙醇 Et
2
O 二乙醚 LC 液相層析 HOAc 乙酸 HPLC 高效液相層析 MeCN 乙腈 MeOH 甲醇 MS 質譜 NT 3-硝基-1,2,4-三唑 NTP 三磷酸核苷 Pg 保護基團 Ph 苯基 SEM 平均值之標準誤差 TEST 雙(三乙氧基矽基)丙基-四硫化物 THF 四氫呋喃 TFA 三氟乙酸 TFAA 三氟乙酸酐 TIPS 三異丙基矽基 製備以下苯酚並用於製備本發明化合物之中間體：
苯酚 1 步驟 a) 1-(3-(( 第三丁基 二甲基矽基 ) 氧基 ) 苯基 ) 乙酮 (Ph1-a)
向3-羥基苯乙酮(4.46 g, 32.8 mmol)於DMF (6 mL)中之溶液中添加咪唑(4.46 g, 65.5 mmol)。5 min後，添加TBDMS-Cl (4.69 g, 31.1 mmol)於DMF (4 mL)中之溶液。將反應混合物於室溫下攪拌90 min，隨後倒入含有5% EtOAc之己烷(200 mL)中並用1M HCl (60 mL)、水(60 mL)、飽和碳酸氫鈉(2×60 mL)、水(60 mL)及鹽水(60 mL)洗滌。將有機層經Na
2
SO
4
乾燥，過濾並濃縮且藉由矽膠上急驟層析用己烷 / EtOAc溶析純化獲得之殘餘物，此產生標題化合物(5.7 g, 69%)。
步驟 b) 第三丁基 二甲基 (3-( 丙 -1- 烯 -2- 基 ) 苯氧基 ) 矽烷 (Ph1-b)
在氮下將甲基(三苯基鏻)溴化物(10.2 g, 28.4 mmol)懸浮於無水THF (30 mL)中並將懸浮液冷卻至0℃。向混合物中逐滴添加正丁基鋰(17.8 mL, 28.4 mmol)並將所得溶液於室溫下攪拌30 min。向混合物中添加Ph1-a (5.7 g, 22.8 mmol)並使反應於室溫下進行60 min。將反應物用碳酸氫鈉水溶液驟冷並用二乙醚(50 mL) 萃取。將有機層用碳酸氫鈉溶液洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。經由矽膠塞用己烷溶析純化獲得之殘餘物，此產生標題化合物(3.9 g, 69%)。
步驟 c) 第三丁基 二甲基 (3-(1- 甲基環丙基 ) 苯氧基 ) 矽烷 (Ph1-c)
在氮下在10分鐘期間向烯烴Ph1-b (3.9 g, 15.7 mmol)於1,2-二氯乙烷(60 mL)中之冷卻(0℃)溶液中逐滴添加己烷(439.2 mmol)中之二乙基鋅。逐滴添加二碘甲烷(6.32 mL, 78.5 mmol)並將所得混合物於0℃下攪拌30 min且隨後使其達到室溫過夜。將混合物倒入氯化銨之冰冷溶液中並用二乙醚萃取。將有機層用飽和碳酸氫鈉洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。將粗製物吸收至己烷中並棄去剩餘二碘甲烷。將己烷層濃縮成粗製物，將其未經進一步純化即吸收至下一步驟中。
步驟 d) 3-(1- 甲基環丙基 ) 苯酚 ( 苯酚 1)
將Ph1-c (3.45 g, 13.1 mmol)吸收至氟化四丁基銨於THF (20 mL, 20 mmol)中之1M溶液中並將所得溶液於室溫下攪拌過夜。將反應物用1M HCl (50 mL)驟冷並使用乙酸乙酯(100 mL)萃取。將有機層用鹽水(2×50 mL)洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由矽膠上急驟層析用2-丙醇、EtOAc及己烷之混合物溶析純化殘餘物，此產生標題化合物(0.56 g, 29%)。MS 147.1 [M-H]
-
。
苯酚 2 標題化合物係使用針對苯酚1之製備所述之方法自4-羥基苯乙酮(6.0 g, 44.1 mmol)製得。產率53%。
苯酚 3 步驟 a) 1-(3-( 苄基氧基 ) 苯基 ) 環戊醇 (Ph3-a)
向鎂條(1.29 g, 52.8 mmol)於無水THF (50 mL)中之懸浮液中添加利用鎂升溫之碘。將混合物回流並添加3-溴苯酚之約5%溶液(13.9 g, 52.8 mmol)。在開始反應時，逐滴添加溴化物之溶液且隨後將混合物再回流1小時。將混合物冷卻至約5℃並逐滴添加環戊酮(4.44 g, 52.8 mmol)於THF (50 mL)中之溶液。將混合物於rt下攪拌72 h，隨後將反應物用冷卻之飽和氯化銨溶液驟冷並用二乙醚(×3)萃取。將有機相用鹽水洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由矽膠層析(異己烷 / EtOAc)純化產物，此產生標題化合物(8.5 g, 54%)。
步驟 b) 1-( 苄基氧基 )-3-( 環戊 -1- 烯 -1- 基 ) 苯 (Ph3-b)
向Ph3-a (8.4 g, 28.2 mmol)於苯(100 mL)中之溶液中添加對甲苯磺酸。利用DMF分離器使混合物回流3小時，隨後冷卻至rt，用二乙醚稀釋並用飽和碳酸氫鈉溶液及鹽水洗滌。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由矽膠層析(異己烷 / EtOAc)純化產物，此產生標題化合物(6.45 g, 91%)。MS 249.4 [M-H]
-
。
步驟 c) 3- 環戊基苯酚 ( 苯酚 3)
將Ph3-b (6.4 g, 26 mmol)於EtOAc (75 mL)及EtOH (75 mL)中之溶液於22℃及40 PSI下在10%碳載Pd (1.5 g)存在下於Parr中氫化過夜。過濾出觸媒並用EtOAc及EtOH洗滌。在減壓下蒸發溶劑並藉由矽膠層析(異己烷 / EtOAc)分離產物，此產生標題化合物(3.6 g, 82%)。MS 161.2 [M-H]
-
。
苯酚 4 步驟 a) 第三丁基 (3- 環丙基苯氧基 ) 二甲基矽烷 (Ph4-a)
將(3-溴苯氧基)(第三丁基)二甲基矽烷(5.46 g, 19 mmol)、環丙基
酸(2.12 g, 24.7 mmol)、磷酸三鉀(14.1 g, 66.5 mmol)、三環己基膦(0.53 g, 1.9 mmol)及Pd(OAc)
2
(0.21 g, 0.95 mmol)於甲苯(80 mL)及水(4 mL)中之懸浮液於110℃下攪拌過夜。將漿液用二乙醚稀釋並用水及鹽水洗滌。將有機相乾燥(MgSO
4
)，過濾並濃縮。藉由急驟管柱層析(EtOAc/己烷)純化粗製物，此產生標題化合物(1.94 g, 41%)。
步驟 b) 3- 環丙基苯酚 ( 苯酚 4)
向Ph4-a (1.94 g, 7.81 mmol)於THF (25 ml)中之溶液中添加1M氟化四丁基銨(10.1 ml, 10.1 mmol)。將溶液攪拌2小時，隨後蒸發溶劑並將殘餘物溶解於EtOAc中並用濃NH
4
Cl (水溶液)洗滌兩次並用鹽水洗滌一次。將有機相乾燥(MgSO
4
)，過濾並濃縮。藉由急驟管柱層析(己烷/乙酸乙酯9:1，具有1%異丙醇)純化粗製物，從而產生稍微不純之標題化合物(1.24 g, 119%)。
苯酚 5 步驟 a) 2-(4- 溴苯氧基 ) 四氫 -2H- 吡喃 (Ph5-a)
將4-溴苯酚(3.75 g, 21.7 mmol)溶解於3,4-二氫-2H-吡喃(16 ml, 175 mmol)中，添加催化量之對甲苯磺酸(15 mg, 0.09 mmol)並將混合物於22℃下攪拌45 min。將混合物用二乙醚稀釋並用1 M NaOH (水溶液)洗滌2次，用水洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)並濃縮，此產生標題化合物(5.57 g, 99%)。
步驟 b) 2-(4- 環丙基苯氧基 ) 四氫 -2H- 吡喃 (Ph5-b)
在15 min期間向Ph5-a (552.5 mg, 2.15 mmol)、ZnBr (144 mg, 0.64 mmol)、三-第三丁基膦四氟硼酸酯(35.6 mg, 0.12 mmol)及Pd(OAc)
2
(29.5 mg, 0.13 mmol)於THF (4 ml)中之溶液中添加0.5 M環丙基溴化鎂於THF (6.5 ml, 3.25 mmol)中之溶液。將混合物於22℃下攪拌90 min，隨後在冰浴上冷卻並添加冰水(10 ml)。將混合物用EtOAc萃取3次並將萃取物用鹽水洗滌且隨後乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由二氧化矽上管柱層析(石油醚/ EtOAc)純化殘餘物，此產生標題化合物(292 mg, 62 %)。
步驟 c) 4- 環丙基苯酚 ( 苯酚 5)
向Ph5-b (2.28 g, 10.45 mmol)於MeOH (15 ml)中之溶液中添加對甲苯磺酸單水合物(18.9 mg, 0.1 mmol)。將混合物於120℃下在微波反應器中加熱5 min，隨後濃縮並藉由二氧化矽上管柱層析(石油醚 / EtOAc)純化。使獲得之固體自石油醚結晶，此產生標題化合物(1.08 g, 77%)。
苯酚 6 步驟 a) 1-(3- 甲氧基苯基 ) 環丁醇 (Ph6-a)
在0℃與10℃之間向環丁酮(6.66 g, 95 mmol)於二乙醚(65 mL)中之攪拌溶液中逐滴添加3-甲氧基苯基溴化鎂於THF (2.11 g, 99.8 mmol)中之1 M溶液。將混合物於0℃至10℃下攪拌3小時，隨後向飽和NH
4
Cl (300 mL)及水(300 mL)之冰冷卻之溶液中添加混合物。將混合物攪拌10 min，隨後用二乙醚萃取三次。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾，並濃縮。藉由矽膠層析(異己烷 / EtOAc)純化獲得之粗產物，此產生標題化合物(16.9 g, 86%)。
步驟 b) 1- 環丁基 -3- 甲氧基苯 (Ph6-b)
向Ph6-a (15.4 g, 86.1 mmol)於乙醇(200 mL)中之溶液中添加10%碳載Pd (2.5 g)並在Parr中於60 psi下氫化混合物。18h後，添加額外10%碳載Pd (1.5 g)並將混合物於60 psi下再氫化18小時。過濾出觸媒並用EtOH及EtOAc洗滌。在減壓下濃縮溶液並藉由矽膠層析(異己烷 / EtOAc)分離粗產物，此產生標題化合物(14.0 g, 77%)。
步驟 c) 3- 環丁基苯酚 ( 苯酚 6)
於0℃下向Ph6-b (10.6 g, 65.6 mmol)於無水DCM (65 mL)中之溶液中逐滴添加1M三溴化硼(18.1 g, 72.2 mmol)於DCM中之溶液。將混合物於-5℃下攪拌2.5小時，隨後將反應物用冷卻之NH
4
Cl飽和溶液驟冷並用DCM萃取三次。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由矽膠層析(異己烷 / EtOAc)純化獲得之粗產物，此產生標題化合物(9.73 g, 88%)。
苯酚 7 步驟 a) 1-(4-( 苄基氧基 ) 苯基 ) 環丁醇 (Ph7-a)
在
≈
1 h期間於回流下向鎂條(2.43 g)及痕量碘於二乙醚(50 mL)中之懸浮液中逐滴添加1-(苄基氧基)-4-溴苯(2.63 g, 100 mmol)於二乙醚:THF 1:1 (100 mL)中之溶液。在添加完成後，將混合物回流4小時，隨後冷卻至
≈
0℃。添加無水THF (50 ml)，之後緩慢添加環丁酮(7.01 g, 100 mmol)於二乙醚(50 mL)中之溶液並使混合物達到rt。在攪拌2h後，添加冷的NH
4
Cl飽和溶液(500 ml)並將混合物攪拌15分鐘，隨後用EtOAc萃取。將有機相用鹽水洗滌，用硫酸鈉乾燥並在減壓下蒸發。藉由矽膠上管柱層析純化產物，此產生標題化合物(12.5 g, 42%)。
步驟 b) 4- 環丁基苯酚 ( 苯酚 7)
在氬下向Ph7-a (12.4 g, 41.4 mmol)於絕對EtOH (110 mL)中之溶液中添加10%碳載Pd (2.55 g, 21.5 mmol)並將混合物於45 psi下於rt下氫化18h。過濾出觸媒，用乙醇洗滌並濃縮溶液。藉由矽膠層析(異己烷 - EtOAc)純化產物。將適當部分彙集並濃縮且自石油醚結晶殘餘物，此產生標題化合物(3.15 g, 51%)。
苯酚 8 4-(1- 甲基環戊基 ) 苯酚 (Ph-8)
在30 min期間向新鮮AlCl
3
(1.33 g, 10 mmol)於戊烷(100 mL)中之懸浮液中逐滴添加1-甲基環戊醇(2.00 g, 20.0 mmol)及苯酚(2.07 g, 22.0 mmol)於戊烷(50 mL)中之溶液。將所得混合物在N
2
下於rt下攪拌72 h，隨後將反應混合物倒入水/冰及HCl (12 M, 20 mmol, 1.66 mL)中。將有機相用水(50 mL)及鹽水(50 mL)洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由二氧化矽上管柱層析(MeOH - DCM)純化粗製物，此產生標題化合物(426 mg, 12%)。
苯酚 9 步驟 a) 2-(4- 溴 -3- 甲基苯氧基 ) 四氫 -2H- 吡喃 (Ph9-a)
向4-溴-3-甲基苯酚(4.0 g, 21.4 mmol)於3,4-二氫-2-H-吡喃(16 mL, 175 mmol)中之溶液中添加pTs (16 mg, 0.086 mmol)。將反應混合物於室溫下攪拌1 h，隨後用二乙醚稀釋並用1M NaOH (水溶液)及水洗滌。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由二氧化矽上管柱層析(EtOAc / 庚烷)純化粗製物，此產生標題化合物(3.32 g, 57%)。
步驟 b) 2-(4- 環丙基 -3- 甲基苯氧基 ) 四氫 -2H- 吡喃 (Ph9-b)
將Ph9-a (3.12 g, 11.5 mmol)、ZnBr
2
(2.59 g, 11.5 mmol)、四氟硼酸三-第三丁基膦酯(0.2 g, 0.69 mmol)及Pd(OAc)
2
(258 mg, 1.15 mmol)放入燒瓶中並將燒瓶用N
2
沖洗多次。在攪拌的同時添加THF (10 mL)，之後在5分鐘期間逐滴添加THF (35 mL, 17.4 mmol)中之0.5 M環丙基溴化鎂。於rt下攪拌混合物，隨後經由矽藻土塞過濾，用MeOH溶析。濃縮溶液並藉由二氧化矽上管柱層析(EtOAc / 庚烷)純化粗製物，此產生標題化合物(1.69 g, 57%)。
步驟 c) 4- 環丙基 -3- 甲基苯酚 ( 苯酚 9)
將Ph9-b (1.70 g, 7.30 mmol)溶解於MeOH (20 ml)中並添加
p
TsxH
2
O (318 mg, 1.67 mmol)。在22℃下將混合物攪拌30分鐘，隨後濃縮。藉由管柱層析(EtOAc / 庚烷)純化粗製物，此產生標題化合物(704 mg, 65%)。
苯酚 10 步驟 a) 4- 環丙基 -1- 甲氧基 -2- 甲苯 (Ph10-a)
使4-溴-1-甲氧基-2-甲苯(4.39 g, 21.9 mmol)與環丙基溴化鎂根據Ph9步驟b中所述之程序反應，此產生標題化合物(1.54 g, 43%)。
步驟 b) 4- 環丙基 -2- 甲基苯酚 ( 苯酚 10)
在N
2
下於0℃下向Ph10-a (1.54 g, 9.49 mmol)於DCM (7.5 mL)中之溶液中添加BBr
3
(5 mL, 5 mmol)。將反應物攪拌2 h，隨後用MeOH (3 mL)驟冷並濃縮。將粗製物溶解於EtOAc中並用鹽水洗滌。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由二氧化矽上管柱層析純化粗產物，此產生標題化合物(826 mg, 59%)。MS 147.11 [M-H]
-
。
苯酚 11 4- 環丙基 -3- 甲氧基苯酚 ( 苯酚 11)
標題化合物係自4-溴-3-甲氧基苯酚(1.11 g, 5.49 mmol)根據針對苯酚9之製備所述之程序製得。產率40%。
苯酚 12 步驟 a) 3-( 二甲基胺基 )-1-(3- 羥基苯基 ) 丙 -1- 酮 (Ph12-a)
向3-羥基苯乙酮(4.08 g, 30 mmol)、對甲醛(4.05 g, 45 mmol)及二甲基胺鹽酸鹽(2.69 g, 33 mmol)於絕對EtOH (100 mL)中之溶液中添加幾滴HCl並將反應混合物回流18h。添加額外二甲基胺鹽酸鹽(0.55當量, 1.22 g)、對甲醛(0.5當量, 1.35 g)及HCl (0.5 mL)並將反應混合物額外回流4h，隨後冷卻至rt。收集沈澱之白色固體並用冷EtOH (50 mL)及冷丙酮(10 mL)洗滌且隨後冷凍乾燥，此產生標題化合物(2.59 g, 38 %)，其未經進一步純化即用於下一步驟。
步驟 b) 環丙基 (3- 羥基苯基 ) 甲酮 ( 苯酚 12)
於rt下向三甲基碘代氧化鋶(6.20 g, 28.2 mmol)於DMSO (100 mL)中之攪拌懸浮液中逐份添加NaH (60%礦物油分散液) (1.13 g, 28.2 mmol)。1h後，在攪拌及冷卻期間逐份添加固體Ph12-a (2.59 g, 11.3 mmol)。將反應混合物於rt下攪拌40h，隨後倒入冷水(200 mL)中並用DCM (3×100 mL)萃取。將有機相用飽和NH
4
Cl水溶液(2 × 100 mL)洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由二氧化矽上管柱層析(MeOH / DCM)純化獲得之粗製物，此產生標題化合物(883 mg, 48%)。
苯酚 13 步驟 a) 環丙基 (4- 羥基苯基 ) 甲酮 (Ph13)
在約30 min期間向NaOH溶液(8 mL，水溶液，50% w/w)中逐份添加對-羥基-γ-氯苯丁酮(4.95 g)，隨後添加NaOH (35 mL，水溶液，25% w/w)，之後一次性添加對-羥基γ-氯苯丁酮(4.95 g)。使溫度降至140℃並添加NaOH (8 g)。90 min後，添加H
2
O (10 ml)，且額外60 min後，冷卻反應混合物，用H
2
O稀釋並用HOAc (
≈
27-30 ml)中和至pH
≈7
。過濾所形成沈澱，用H
2
O洗滌並在真空中乾燥。將固體在CHCl
3
(200 ml)中在10 min期間於40℃下研磨，隨後於RT下過夜。在30 min期間將漿液加熱至40℃，隨後過濾。將濾液乾燥(MgSO
4
)，過濾並濃縮至≈70 ml。添加己烷且形成油狀物，其最終變為晶體。過濾漿液，用CHCl
3
/己烷洗滌固體並乾燥，此產生標題化合物(4.15 g, 51%)。
苯酚 14 步驟 a) 3-(1- 羥基 -2,2- 二甲基丙基 ) 苯酚 (Ph14-a)
在30分鐘期間向3-羥基苯甲醛(2.00 g, 16.4 mmol)於二乙醚(20 mL)中之冷(-10℃)混合物中逐滴添加t.Bu-MgBr (1.5當量)。在添加期間添加THF (20 mL)。使混合物達到23℃並攪拌6小時。再添加
t.
Bu
-
MgBr (0.7當量)並將混合物攪拌過夜，隨後冷卻並用飽和NH
4
Cl水溶液驟冷以產生。向混合物中添加EtOAc，之後添加1 M HCl水溶液直至獲得均勻混合物為止。分離各相並將有機相用鹽水洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由管柱層析純化所得粗製物，此產生標題化合物(1.1 g, 37%)。
步驟 b) 1-(3- 羥基苯基 )-2,2- 二甲基丙 -1- 酮 (Ph14)
向爐乾燥之圓底燒瓶中添加3 Å MS及氯鉻酸吡啶鎓鹽(PCC) (1.97 g, 9.15 mmol)，之後添加無水DCM (5 mL)。將混合物於20℃下攪拌5分鐘，其後緩慢添加AA8019 (1.10 g, 6.10 mmol)於DCM (5 mL)中之混合物。 完全氧化後，經由矽藻土墊過濾混合物，用二乙醚洗滌墊。濃縮濾液。藉由管柱層析純化粗製物，此產生標題化合物(402 mg, 37%)。MS 179.25 [M+H]+。
苯酚 15 1-(4- 羥基苯基 )-2,2- 二甲基丙 -1- 酮 (Ph15)
根據針對苯酚14之製備所述之程序使4-羥基苯甲醛(3 g, 24.6 mmol)反應，此產生標題化合物(538 mg, 17%)。
胺基酸 1 步驟 a) (S)-(S)- 2-(( 第三丁氧基 羰基 ) 胺基 ) 丙酸第二丁基酯 (AA1-a)
將L-Boc-丙胺酸(2.18 g, 11.5 mmol)溶解於無水DCM (40 mL)中並添加醇(
R)-
丁-2-醇(938 mg, 12.6 mmol)。將混合物冷卻至約5℃並一次性添加EDC (3.31 g, 17.2 mmol)，之後逐份添加DMAP (140 mg, 1.15 mmol)。使混合物達到室溫並攪拌過夜，隨後用乙酸乙酯(約300 ml)稀釋並將有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌三次並用鹽水洗滌一次。將有機相經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮。藉由矽膠層析用異己烷及10%乙酸乙酯溶析分離產物，此產生標題化合物(2.78 g, 98 %)。
步驟 b) (S)-(S)- 2- 胺基丙酸第二丁基酯 (AA1-b)
將AA1-a (2.77 g, 11.3 mmol)及對甲苯磺酸單水合物(2.15 g, 11.3 mmol)於EtOAc (45 mL)中之混合物於65℃下攪拌16 h，隨後在減壓下濃縮。將獲得之殘餘物自二乙醚結晶，此產生標題化合物(3.20 g, 89%)。
胺基酸 2 (S)-(R)- 2- 胺基丙酸戊 -2- 基酯 (AA2)
遵循針對AA1之製備所述之程序但使用
(R)
-戊-2-醇代替
(R)
-丁-2-醇，此產生標題化合物(4.6 g)。
胺基酸 3 (S)-(S)-2- 胺基丙酸戊 -2- 基酯 (AA3)
遵循針對AA1之製備所述之程序但使用(S)-戊-2-醇代替
(R)
-丁-2-醇，此產生標題化合物(8.3 g)。 製備以下中間體且其可用於製備本發明化合物：
中間體 1 步驟 a) (R)-2-(( 第三丁氧基 羰基 ) 胺基 ) 丙酸 4- 氟苄基酯 (I-1a)
將Boc-L-AlaOH (19.92 mmol)、DMAP(1.99 mmol)及(4-氟苯基)甲醇(23.9 mmol)溶解於CH
2
Cl
2
(100 mL)中。向此溶液中添加三乙胺(23.9 mmol)，之後添加EDC (23.9 mmol)並將所得反應混合物於室溫下在N
2
下攪拌過夜。將反應混合物用CH
2
Cl
2
(100 mL)稀釋，用飽和NaHCO
3
水溶液(2×50 mL)、飽和NaCl水溶液(2×50 mL)洗滌，乾燥(Na
2
S0
4
)並濃縮。藉由矽膠上管柱層析用正己烷-EtOAc (95:5至60:40)溶析純化獲得之殘餘物，此產生白色蠟狀固體狀標題化合物(4.44 g)。MS: 296 [M-H]
-
。
步驟 b) (R)-2- 胺基丙酸 4- 氟苄基酯 (I-1b)
將化合物I-1a (14.93 mmol)溶解於4M HCl/二噁烷(40 mL)中並於室溫下攪拌30分鐘並蒸發至乾燥，此產生白色粉末狀標題化合物之鹽酸鹽(3.4 g)。MS: 198 [M+H]
+
。
步驟 c) (2R)-2-(( 氯 ( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸 4- 氟苄基酯 (I-1)
於-78℃下向化合物I-5b (4.28 mmol)於CH
2
Cl
2
中之溶液中逐滴添加PhOPOCl
2
(4.28 mmol)，之後逐滴添加三乙胺(8.56 mmol)。將所得反應混合物於-78℃下在Ar下攪拌並使其達到室溫過夜。將反應混合物在矽膠上蒸發並藉由層析(正己烷/EtOAc (88:12)-(0:100))純化，此產生標題化合物(769 mg)。
31
P-NMR (CDCl
3
) δ: 7.85 (s)及7.54 (s) (R
P
及S
P
非鏡像異構物)。
中間體 2 步驟 a) (S)-(R)-2-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙酸第二丁基酯 (I-2a)
將L-Boc-丙胺酸(2.18 g, 11.5 mmol)溶解於無水DCM (40 mL)中並添加醇(R)
-
丁-2-醇(938 mg, 12.6 mmol)。將混合物冷卻至約5℃且一次性添加EDC (3.31 g, 17.2 mmol)，之後逐份添加DMAP (140 mg, 1.15 mmol)。使混合物達到室溫並攪拌過夜，隨後用乙酸乙酯(約300 ml)稀釋並將有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌三次並用鹽水洗滌一次。將有機相經硫酸鈉乾燥且在減壓下濃縮。藉由矽膠層析用異己烷及10%乙酸乙酯溶析分離產物，此產生標題化合物(2.78 g, 98 %)。
步驟 b) (S)-(R)- 2- 胺基丙酸第二丁基酯 (I-2b)
將I-10a (2.77 g, 11.3 mmol)及對甲苯磺酸單水合物(2.15 g, 11.3 mmol)於EtOAc (45 mL)中之混合物於65℃下攪拌16 h，隨後在減壓下濃縮。將獲得之殘餘物自二乙醚結晶，此產生標題化合物(3.20 g, 89%)。
步驟 c) (2S)-(R)- 2-(((4- 硝基苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸第二丁基酯 (I-2)
在氮下於-30℃下向化合物I-10b (3.15 g, 9.92 mmol)於DCM (75 ml)中之溶液中添加二氯磷酸苯基酯(1當量)，之後逐滴添加三乙胺(2當量)。 使混合物達到室溫並攪拌過夜，隨後冷卻至約5℃並添加固體狀4-硝基苯酚(1當量，15 mmol)，之後逐滴添加三乙胺(1當量g，15 mmol)並將混合物於室溫下攪拌4小時，隨後在減壓下濃縮，用乙酸乙酯(40 ml)及醚(40 ml)稀釋並於室溫下靜置過夜。過濾三乙胺-HCl鹽並在減壓下濃縮濾液。藉由矽膠上管柱層析用異己烷-乙酸乙酯溶析純化獲得之殘餘物，此產生標題化合物(4.19 g, 79%)。 以下化合物係根據針對I-2之製備所述之程序使用適當醇製得：
中間體 7 步驟 a) (S)-2- 胺基丙酸環辛基酯 (I-7a)
向L-丙胺酸(1.7 g, 19.1 mmol)及環辛醇(25 ml, 191 mmol)於甲苯(100 ml)中之漿液中添加對甲苯磺酸單水合物(3.6 g, 19.1 mmol)。將反應混合物於回流溫度下加熱25 h並使用Dean-Stark分離器自反應物移除水。在減壓下濃縮混合物並將殘餘物在真空下保持過夜。向殘餘物(27 g)中添加二乙醚(100 ml)。藉由過濾收集白色沈澱，用二乙醚(3×50 ml)洗滌並在真空下乾燥，此產生標題化合物(4.84 g, 68%)。
步驟 b) (2S)- 2-(((4- 硝基苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸環辛基酯 (I-7)
根據針對步驟c之I-2之製備所述之方法使化合物I-7a反應，此產生標題化合物(4.7 g, 76%)。
中間體 8 (2S)-2-(((4- 硝基苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸環庚基酯 (I-22)
遵循針對化合物I-7之製備所述之程序但使用環庚醇(27 ml, 224 mmol)代替環辛醇，此產生標題化合物(5.72 g. 55%)。
中間體 9 (2S)-2-(((4- 硝基苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸環己基酯 (I-23)
遵循針對步驟c之I-2之製備所述之程序但使用(S)-2-胺基丙酸環己基酯代替(S)-2-胺基丙酸3,3-二甲基丁基酯，此產生標題化合物(10.6 g, 82%)。
中間體 10 (S)-2-(( 雙 (4- 硝基苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸 2- 乙基丁基酯 (I-10)
向氯磷酸雙(4-硝基苯基)酯(6.14 g, 17.1 mmol)於DCM (50 ml)中之溶液中添加(S)-2-胺基丙酸2-乙基丁基酯(5 g, 14.49 mmol)，將混合物在冰浴中冷卻並逐滴添加Et
3
N (4.77 mL, 34.2 mmol)。15 min後移除冷卻並將反應混合物於23℃下攪拌直至根據TLC反應完全為止。隨後添加二乙醚，過濾混合物並濃縮濾液並藉由二氧化矽上管柱層析純化，此產生標題化合物(2.05 g, 82 %)。
中間體 11 步驟 a) (S)-2- 胺基丙酸異丙基酯 (I-11a)
於0℃下向L-丙胺酸之HCl鹽(17.8 g, 200 mmol)於異丙醇(700 mL)中之懸浮液中逐滴添加SOCl
2
(29 mL, 400 mmol)。將懸浮液於室溫下攪拌過夜，隨後濃縮，此產生標題化合物(29.2 g, 87%)。
步驟 b) (2S)-2-(((((S)-1- 異丙氧基 -1- 側氧基丙 -2- 基 ) 胺基 )(4- 硝基苯氧基 ) 磷醯基 )- 胺基 ) 丙酸異丙基酯 (I-11)
於-60℃下向胺I-11a (2.35 g, 14 mmol)及三乙胺(7.7 mL, 56 mmol)於DCM中之溶液中逐滴添加二氯磷酸4-硝基苯基酯(1.8 g 7 mmol)於DCM中之溶液。使反應混合物達到室溫，攪拌過夜，濃縮且隨後用乙酸乙酯及醚稀釋並於室溫下靜置過夜。過濾出三乙胺-HCl鹽，在減壓下濃縮濾液並藉由矽膠上層析用異己烷-乙酸乙酯溶析純化獲得之殘餘物，此產生標題化合物(1.6 g, 50%)。
中間體 12 步驟 a) (S)-2-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙酸新戊基酯 (I-12a)
於-5℃下向Boc-丙胺酸(18.9 g, 100 mmol)及新戊醇(13.0 mL, 120 mmol)於DCM (200 mL)中之溶液中逐份添加EDAC及DMAP。使反應混合物達到室溫並攪拌72 h。添加EtOAc (700 mL)並將有機相用飽和NaHCO
3
溶液洗滌三次並用鹽水洗滌一次，隨後濃縮。藉由管柱層析用己烷-EtOAc 90/10至80/20溶析純化獲得之殘餘物，此產生標題化合物(21 g, 81%)。
步驟 b) (S)-2- 胺基丙酸新戊基酯 (I-12b)
於-65℃下向Boc保護之胺I-12a (21.1 g, 82.0 mmol)於EtOAc (330 mL)中之溶液中添加對甲苯磺酸(15.6 g, 82.0 mmol)。將反應混合物於-65℃下攪拌8 h，隨後使其達到室溫過夜。隨後過濾並濃縮混合物，此產生標題化合物(21 g, 78%)。
(2S)-2-(((((S)-1 -( 新戊基氧基 )-l - 側氧基丙 -2- 基 ) 胺基 )(4- 硝基苯氧基 )- 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸新戊基酯 (I-12)
在1 h期間於-50℃下向胺I-12b (3.90 g, 24.5 mmol)於DCM (100 mL)中之溶液中逐滴添加4-硝基苯酚二氯磷酸酯。使反應混合物達到室溫，攪拌過夜，濃縮且隨後用二乙醚稀釋並於室溫下靜置過夜。過濾混合物，在減壓下濃縮濾液並藉由矽膠上層析用異己烷-乙酸乙酯溶析純化獲得之殘餘物，此產生標題化合物(4.8 g, 77%)。
中間體 13 (2S)-2-(( 氯 ( 苯氧基 ) 磷硫基 ) 胺基 ) 丙酸乙基酯 (I-13)
於-35℃下在N
2
下向苯酚(247 mg, 2.62 mmol)於無水DCM (8.8 mL)與無水THF (4.4 mL)之混合物中之溶液中添加硫代磷醯氯(0.27 mL, 2.62 mmol)。5 min後，逐滴添加三乙胺(365 mL, 2.62 mmol)並將反應混合物於-35℃下攪拌3h。添加丙胺酸乙基酯×HCl (403 mg, 2.62 mmol)並將反應混合物於-35℃下攪拌5 min，其後逐滴添加三乙胺(731 mL, 5.24 mmol)。使溫度緩慢達到rt過夜(17h)。將反應混合物用Et
2
O稀釋，過濾並在減壓下濃縮。對獲得之粗產物進行急驟層析(己烷:EtOAc 8:1)，此產生澄清油狀標題化合物(659 mg, 82%)。MS 306.18 [M-H]
-
。
中間體 14 (2S)-2-(( 氯 (4- 氯苯氧基 ) 磷硫基 ) 胺基 ) 丙酸新戊基酯 (I-14)
在氮下向硫代磷醯氯(400 mL, 3.87 mmol)於DCM中之-30℃溶液中一次性添加4-氯苯酚(381 mL, 3.87 mmol)，之後逐滴添加三乙胺(1.62 mL, 11.6 mmol)。將反應物攪拌2h，同時使溫度達到+5℃。添加(S)-2-胺基丙酸新戊基酯之pTs鹽(1.28 g, 3.87 mmol)並將混合物冷卻至-30℃。逐滴添加三乙胺(1.62 L, 11.6 mmol)並使反應物達到室溫並攪拌週末。將混合物濃縮至矽膠上並藉由急驟層析使用己烷/乙酸乙酯: 7/1純化殘餘物，此產生標題化合物(807 mg, 54%)。MS 368.34 [M+H]
+
。
中間體 15 (2S)-2-(( 氯 ( 萘 -1 - 基氧基 ) 磷硫基 ) 胺基 ) 丙酸甲基酯 (I-15)
於-35℃下在N
2
下向萘酚(1當量)於無水DCM (10 mL)與無水THF (5 mL)之混合物中之溶液中添加硫代磷醯氯(1當量)。5 min後，逐滴添加三乙胺(1當量)並將反應混合物於-35℃下攪拌3h。添加(S)-2-胺基丙酸甲基酯(1當量)並將反應混合物於-35℃下攪拌5 min，其後逐滴添加三乙胺(2當量)。使溫度緩慢達到rt過夜。將反應混合物用Et
2
O稀釋，過濾並在減壓下濃縮。對獲得之粗產物進行急驟層析(己烷:EtOAc 8:1)，從而產生標題化合物，8.0%，MS 564.24 [M+H]
+
。 以下中間體係根據針對中間體13所述之方法使用適當苯酚及胺基酸酯製得。
中間體 32 (2S)-(R)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸第二丁基酯 (I-32)
於-70℃下在氮下在15分鐘期間向(S)-(R)-2-胺基丙酸第二丁基酯之pTs鹽(12.0 g, 37.7 mmol)於DCM (50 mL)中之攪拌溶液中逐滴添加Et
3
N (10.9 mL, 78.1 mmol)。在1 h期間向此混合物中添加二氯磷酸苯基酯(5.61 mL, 37.7 mmol)於DCM (50 mL)中之溶液。將反應混合物於-70℃下額外攪拌30分鐘，隨後在2 h期間使其升溫至0℃並攪拌1 h。在20分鐘期間向混合物中添加五氟苯酚(6.94 g, 37.7 mmol)及Et
3
N (5.73 mL, 41.1 mmol)於DCM (30 mL)中之溶液。將粗製混合物於0℃下攪拌18 h，且隨後濃縮。將殘餘物吸收於THF (100 mL)中，過濾出不溶性物質並用THF洗滌若干次。蒸發溶劑並將殘餘物與第三丁基甲基醚一起研磨。過濾出不溶性物質並用第三丁基甲基醚洗滌。將合併之濾液濃縮並用正己烷/EtOAc (80:20；100 mL)超音波處理粗製固體。過濾固體，用正己烷/EtOAc (80:20)洗滌，此產生白色固體狀標題化合物之純P-立體異構物(2.3 g, 13%)。
中間體 33 (2S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸乙基酯 (I-33)
標題化合物係根據針對I-32所述之方法但自(S)-2-胺基丙酸乙基酯之HCl鹽(11.0 g, 71.1 mmol)開始製得。產率8.56 g, 27%。
中間體 34 (2S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸 2- 乙基丁基酯 (I-34)
標題化合物係根據針對I-32所述之方法但自(S)-2-胺基丙酸2-乙基丁基酯之pTs鹽(18.8 g, 54.4 mmol)開始製得。產率27.0 g，99%. LC-MS 496.44 [M+H]
+
。
中間體 35 (2S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸丁基酯 (I-35)
向(S)-2-胺基丙酸丁基酯(26.4 g, 83.1 mmol)於DCM (200 mL)中之冷卻(-20℃)漿液中添加二氯磷酸苯基酯(12.4 mL, 83.1 mmol)。將混合物攪拌10 min，隨後逐滴添加Et
3
N (25.5 mL, 183 mmol)達15 min。將混合物於-20℃下攪拌1h，隨後於0℃下攪拌30 min。將混合物於冰浴中保持冷卻並添加五氟苯酚(15.3 g, 0.08 mol)，之後逐滴添加Et
3
N (11.6 mL, 0.08 mol)。將混合物攪拌過夜並緩慢達到20℃。添加二乙醚並經由矽藻土過濾混合物，濃縮並藉由矽膠上管柱層析用石油醚/ EtOAc (9:1 -＞ 8:2)溶析純化。彙集適當部分，濃縮並自石油醚/EtOAc結晶，此產生白色固體狀標題化合物之純P-立體異構物(2.23 g, 5.8%)。
中間體 36 (2S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸環己基酯 (I-36)
於-15℃下向L-丙胺酸環己基酯(25.5 g, 74.4 mmol)於DCM (250 mL)中之溶液中一次性添加二氯磷酸苯基酯(11.1 mL, 74.4 mmol)。將所得混合物攪拌10 min，隨後經10 min之時段添加三乙胺(2.2當量)並使反應於-15℃下冷進行30 min且隨後於室溫下進行72 h。將反應物在冰上冷卻並添加五氟苯酚(13.7 g, 74.4 mmol)，之後經10 min添加三乙胺(1當量)。使反應物達到rt並攪拌30 min。經由矽藻土墊過濾出不溶性材料並用DCM (100 mL)洗滌濾餅。蒸發溶劑並在真空中乾燥殘餘物，隨後吸收至EtOAc (200 mL)中並攪拌20 min。經由矽藻土墊過濾出不溶性材料並用EtOAc (75 mL)洗滌餅並使溶液於5℃下靜置過夜。將所形成晶體溶解於EtOAc中並將溶液用2 M NaOH (×1)、2 M HCl (×1)洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)並濃縮，此產生(2.37 g, 6%)標題化合物之幾乎純非對映異構物(分解率 = 約90%)。
中間體 37 (2S)-2-((( 苯并 [d][1,3] 二氧雜環戊烯 -5- 基氧基 )( 全氟苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸異丙基酯 (I-37)
在N
2
下於-78℃下向芝麻酚(2.65 g, 19.2 mmol)於DCM (60 mL)中之溶液中添加POCl
3
(1.79 ml, 19.2 mmol)，之後逐滴添加Et
3
N (2.67 ml, 19.2 mmol)。將混合物於-20℃至-30℃下攪拌4 h。將混合物冷卻至-78℃並逐滴添加(S)-2-胺基丙酸異丙基酯(3.22 g, 19.2 mmol)於DCM (10 mL)中之溶液，之後經15 min添加Et
3
N (5.62 ml, 40.3 mmol)。使反應混合物達到rt並攪拌過夜。隨後使反應混合物之溫度降至0℃並一次性添加五氟苯酚(3.53 g, 19.2 mmol)，之後逐滴添加Et
3
N (2.67 ml, 19.2 mmol)。於0℃下攪拌所得漿液。在如藉由LC-MS判斷反應完成時，過濾混合物並用冷DCM洗滌固體。濃縮濾液並重新溶解於第三丁基醚中，再次過濾且隨後濃縮。添加EtOAc:己烷20:80並輕柔加熱所得漿液直至獲得澄清溶液為止。使溶液達到rt且隨後置於-20℃下。1小時後，形成晶體，過濾出，用己烷洗滌若干次且隨後在真空下乾燥，產率：1.8 g。濃縮母液並過濾出所形成晶體並在真空下乾燥，產率：5.5 g。總產率：7.3 g，69%。MS ES+ 498.06 [M+H]
+
。 以下中間體係根據針對中間體37所述之方法使用適當苯酚及胺基酸酯製得。
1
五氟苯酚下於-78℃下而非如I-37中於0℃下添加。
中間體 41 (2S)-(S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸第二丁基酯 (I-41)
標題化合物係根據針對I-32所述之方法但自(S)-(S)-2-胺基丙酸第二丁基酯(12.0 g, 37.8 mmol)開始代替(S)-(R)-2-胺基丙酸第二丁基酯製得。產率：3.33 g, 19 %。
中間體 42 (2S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸丙基酯 (I-42)
標題化合物係根據針對I-35所述之方法但自(S)-2-胺基丙酸丙基酯之HCl鹽(5.62 g, 33.53 mmol))開始代替(S)-(R)-2-胺基丙酸第二丁基酯之pTs鹽製得。將產物自異丙醚重結晶。產率：5.8 g (38%)。LC-MS ES+ 454.1 [M+H]
+
。
中間體 46 步驟 a) (S)-(R)-2-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙酸 1- 甲氧基丙 -2- 基酯 (I-46a)
於0℃下向Boc-L-丙胺酸(5 g, 0.03 mol)及(R)-(-)-1-甲氧基-2-丙醇(2.59 ml, 0.03 mol)之溶液中添加EDC (6.08 g, 0.03 mol)及4-(二甲基胺基)吡啶(0.48 g, 0.004 mol)。將反應混合物在融化冰水浴上攪拌且隨後於室溫下攪拌72h。 將反應混合物濃縮至約1/2體積，用乙酸乙酯(400 mL)稀釋並用飽和NH
4
Cl水溶液(200 ml)、10%檸檬酸水溶液(50 mL)及飽和NaHCO
3
水溶液(200 mL)洗滌。將有機層乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。 藉由矽膠管柱層析(Biotage SNAP ultra 100 g，梯度為庚烷中之5-30%乙酸乙酯)純化粗產物，此產生澄清油狀標題化合物(5.90 g, 85%)。
步驟 b) (S)-(R)-2- 胺基丙酸 1- 甲氧基丙 -2- 基酯 (I-46b)
將I-46a (5.88 g)於二噁烷中之4M HCl (50 mL)中之溶液攪拌90 min，隨後濃縮並自二噁烷(25 mL)冷凍乾燥殘餘物，此產生呈鹽酸鹽形式之標題化合物(5.19 g, 99%)。
步驟 c) (2S)(R)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 )- 丙酸 1- 甲氧基丙 -2- 基酯 (I-46)
向(S)-(R)-2-胺基丙酸1-甲氧基丙-2-基酯鹽酸鹽(5.18 g, 22.1 mmol)於DCM (35 mL)中之冷卻(0℃)溶液中逐滴添加三乙胺(9.25 mL, 66.4 mmol)。將混合物冷卻至-78℃並添加二氯磷酸苯基酯(3.29 mL, 22.1 mmol)於DCM (20 mL)中之溶液。將混合物攪拌10 min，隨後逐滴添加Et
3
N (25.5 mL, 183 mmol)達15 min。將混合物於-78℃下攪拌5 min，隨後於0℃下攪拌2h。逐滴添加DCM (20 mL)中之五氟苯酚(4.07 g, 22.1 mmol)及Et
3
N (3.39 mL, 23.3 mmol)，隨後使反應混合物緩慢達到室溫並攪拌過夜。濃縮混合物且添加THF (50 mL)。過濾出固體並用THF (3×25 mL)洗滌。濃縮濾液並在超音波處理幫助下將殘餘物溶解於第三丁基甲基醚(50 ml)中。添加庚烷(50 ml)並於室溫下靜置1h後自溶液沈澱出產物。再添加庚烷(50 ml)並藉由過濾移除固體。將沈澱用第三丁基甲基醚/庚烷1:2 (50 ml)及庚烷(50 ml)洗滌。在真空下乾燥沈澱，此產生根據NMR呈純異構物形式之標題化合物。(4.32 g, 40%)。LC-MS ES+ 484.34 [M+H]
+
。
中間體 47 步驟 a) (S)-2-(( 第三丁氧基羰基 ) 胺基 ) 丙酸 1,3- 二甲氧基丙 -2- 基酯 (I-47-a)
向Boc-L-丙胺酸(2.42 g, 12.8 mmol)及1,3-二甲氧基丙-2-醇(1.52 g, 12.6 mmol)之溶液中添加EDC (2.79 g, 14.5 mmol)、結晶4-(二甲基胺基)吡啶(229 mg, 1.88 mmol)及Et
3
N (5.27 ml, 37.8 mmol)。將反應混合物於室溫下攪拌72h，隨後用EtOAc稀釋並用NaHCO
3
(水溶液，×2)、0.1 M HCl (水溶液，×2)洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)並濃縮。獲得之粗產物直接用於下一步驟中。
步驟 b) (2S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 - 胺基 ) 丙酸 1,3- 二甲氧基丙 -2- 基酯 (I-47)
於22℃下將I-47a (3 g, 10.8 mmol)在THF中之4M HCl (15 mL, 60 mmol)中攪拌2h，隨後濃縮並與甲苯共蒸發兩次。添加溶解於DCM (40 ml)及二氯磷酸苯基酯(1.62 mL, 10.8 mmol)中之獲得之油狀物。將混合物在冰浴上冷卻且15 min後，緩慢添加Et
3
N (3.32 mL, 23.8 mmol)。將混合物於4℃下攪拌18h，隨後緩慢達到22℃。將混合物再次冷卻至0℃並添加五氟苯酚(2.01 g, 10.9 mmol)，之後逐滴添加Et
3
N (1.51 mL, 10.8 mmol)。將混合物於0℃下攪拌1h，隨後於22℃下攪拌5h。過濾混合物且用EtOAc ×3 (總共150 mL)洗滌固體。將合併之有機相用NaHCO
3
(水溶液，×2)及鹽水洗滌，隨後乾燥(Na
2
SO
4
)。使溶液穿過用石油醚 / EtOAc (8:2)溶析之短的二氧化矽管柱。收集適當部分並濃縮且將獲得之油狀物溶解於二異丙醚中並用庚烷處理，從而產生在靜置時固化之輕微渾濁溶液。將混合物於4℃下靜置72h，隨後藉由過濾收集固體，此產生標題化合物(333 mg, 6 %)。LC ES+ 514.0 [M+H]
+
。
中間體 48 (2S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸戊 -3- 基酯 (I-48)
標題化合物係根據針對I-32所述之方法但自(S)-2-胺基丙酸戊-3-基酯之HCl鹽(3.25 g, 16.6 mmol))開始代替 (S)-(R)-2-胺基丙酸第二丁基酯之pTs鹽製得。產率：8.0 g (18%)。LC-MS ES+ 482.4 [M+H]
+
。
中間體 49 標題化合物係根據WO 2014078427中所述之程序製得。
中間體 50 (2S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 喹啉 -6- 基氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸異丙基酯 (I-50)
向DCM (40 ml)中添加磷醯氯(1.5 mL, 16.4 mmol)並在乾冰/EtOH浴中冷卻混合物。添加6-羥基喹啉(2.38 g, 16.4 mmol)，之後逐滴添加DCM (5 mL)中之Et
3
N (2.28 mL, 16.4 mmol)。將混合物在冷卻下攪拌3 h，隨後添加異丙基丙胺酸(2.75 g, 16.4 mmol)，之後逐滴添加Et
3
N (4.57 ml, 32.8 mmol)。將混合物在冷卻下攪拌5 h。添加五氟苯酚(3.02 g, 16.4 mmol)，之後添加Et
3
N (2.28 ml, 16.4 mmol)並將混合物攪拌72h。將混合物用EtOAc (200 mL)稀釋並用0.1 M HCl (水溶液) ×2洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)並濃縮。藉由二氧化矽使用石油醚/EtOAc (1:1)純化殘餘物，以產生在EtOAc/石油醚中固化之米色溶液。藉由過濾收集固體，此產生標題化合物(787 mg, 9.5 %)。
中間體 51 (2S)-(S)-2-((( 全氟苯氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸 1- 甲氧基丙 -2- 基酯 (I-51)
標題化合物係根據針對I-46所述之方法但自(S)-(+)-1-甲氧基-2-丙醇(0.87 mL, 8.89 mmol)開始代替(R)-(-)-1-甲氧基-2-丙醇製得。產率：604 mg，14%。LC-MS ES- 481.5 [M-H]
-
。
實例 1 步驟 a) (4S,5R)-4-(( 三異丙基矽基 ) 氧基 )-5-((( 三異丙基矽基 ) 氧基 ) 甲基 ) 二氫呋喃 -2(3H)- 酮 (1a)
向(4S,5R)-4-羥基-5-(羥基甲基)二氫呋喃-2(3H)-酮(3.30 g, 25.0 mmol)及咪唑(10.2 g, 150 mmol)於DMF (35 mL)中之冰冷卻之攪拌溶液中逐滴添加TIPS-氯化物(16.4 g, 85 mmol)。將混合物於0℃下攪拌1 h，隨後於rt下攪拌40 h。將反應物用水驟冷並將混合物用EtOAc萃取三次。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮，且藉由矽膠管柱層析用異己烷及0%至10% EtOAc之梯度溶析分離產物。藉由矽膠管柱層析用甲苯溶析再次純化混合部分，此產生標題化合物(11.1 g, 94%)。
步驟 b) (3S,4R,5R)-3- 氟 -4-(( 三異丙基矽基 ) 氧基 )-5-((( 三異丙基矽基 ) 氧基 ) 甲基 )- 二氫呋喃 -2(3H)- 酮 (1b)
在10 min期間於-70℃下向1a (4.45 g, 10.0 mmol)及NFSI (4.73 g, 15.0 mmol)於無水THF (50 mL)中之溶液中逐滴添加雙(三甲基矽基)醯胺鋰之1M溶液(2.18 g, 13.0 mmol)。將混合物於-70℃下攪拌90 min，隨後添加至飽和氯化銨溶液及碎冰中。將混合物用EtOAc萃取三次，將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮，且藉由矽膠層析用異己烷及0%至5% EtOAc之梯度溶析分離產物。產率：4.63 g，67%。
步驟 c) (3S,4R,5R)-3- 氯 -3- 氟 -4-(( 三異丙基矽基 ) 氧基 )-5-((( 三異丙基矽基 ) 氧基 ) 甲基 )- 二氫呋喃 -2(3H)- 酮 (1c)
在10 min期間於-70℃下向1b (3.08 g, 6.65 mmol)及N-氯琥珀醯亞胺(1.07 g, 7.99 mmol)於無水THF (25 mL)中之溶液中逐滴添加雙(三甲基矽基)醯胺鋰之1M溶液。將混合物於-70℃下攪拌90 min，隨後添加至飽和氯化銨溶液及碎冰中。將混合物用EtOAc萃取三次，將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮，且藉由矽膠層析用異己烷及0%至5% EtOAc之梯度溶析分離產物。產率2.40 g，73%。
步驟 d)(3S,4R,5R)-3- 氯 -3- 氟 -4-(( 三異丙基矽基 ) 氧基 )-5-((( 三異丙基矽基 ) 氧基 ) 甲基 )- 四氫呋喃 -2- 醇 (1d)
在氬下於-70℃下向1c (5.20 g, 10.5 mmol)於無水甲苯(50 mL)中之溶液中逐滴添加DIBAL (2.23 g, 15.7 mmol)於DCM中之1M溶液。將混合物於-70℃下攪拌2 h，隨後使溫度升至-30℃並將反應物用2 mL MeOH驟冷且隨後添加至Rochelle鹽與碎冰之混合物中。將混合物攪拌30分鐘且隨後用EtOAc萃取三次。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠管柱層析用異己烷及0%至10% EtOAc之梯度溶析分離產物。產率5.22 g，85%。
步驟 e) (2S,3S,4R,5R)- 甲烷磺酸 3- 氯 -3- 氟 -4-(( 三異丙基矽基 ) 氧基 )-5-((( 三異丙基矽基 ) 氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -2- 基酯 (1e)
向1d (2.00 g, 4.01 mmol)及TEA (608 mg, 6.00 mmol)於DCM (20 mL)中之冷卻溶液中緩慢添加甲磺醯氯(688 mg, 6.00 mmol)。將混合物於RT下攪拌3小時，隨後用EtOAc (80 mL)稀釋，用飽和NaHCO
3
(水溶液)、HCl、水及鹽水洗滌。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。將粗產物在真空中乾燥且隨後未經進一步純化即用於下一步驟。
步驟 f) 1-((2R,3S,4R,5R)-3- 氯 -3- 氟 -4-(( 三異丙基矽基 ) 氧基 )-5-((( 三異丙基矽基 ) 氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -2- 基 ) 嘧啶 -2.4(1H,3H)- 二酮 (1f)
將尿嘧啶(699 mg, 6.24 mmol)及硫酸銨(25.8 mg, 0.195 mmol)於六甲基二矽氮烷(HDMS) (40 mL)中之懸浮液回流過夜。在真空中移除溶劑並將殘餘物溶解於DCM (60 mL)中。在氬下添加1e (2.25 g, 3.90 mmol)且隨後緩慢添加TMS三氟甲磺酸酯。將混合物於RT下攪拌10分鐘且隨後回流4小時。向冷卻之碳酸氫鈉溶液中添加混合物並用EtOAc萃取三次。將有機相用鹽水洗滌並經硫酸鈉乾燥。在減壓下蒸發溶液並藉由矽膠層析用異己烷及20%至50%乙酸乙酯純化混合物，此產生兩種化合物二TIPS (1.29 g, 56%)及單TIPS (390 mg, 23%)。
步驟 g) 1-((2R,3S,4R,5R)-3- 氯 -3- 氟 -4- 羥基 -5-( 羥基甲基 ) 四氫呋喃 -2- 基 ) 嘧啶 -2,4(1H,3H)- 二酮 (1g)
將1f (1.27 g, 2.14 mmol)於80%乙酸中之溶液於80℃下攪拌18 h，隨後濃縮並與甲苯共蒸發。將殘餘物溶解於無水THF (10 mL)中，添加三乙胺三氫氟化物(1.38 g, 8.56 mmol)並將混合物蒸發至二氧化矽上並藉由矽膠管柱層析用包括0%至10% MeOH之DCM溶析純化。藉由HPLC在用10%至20%乙腈及10 mmol乙酸銨溶析之Hypercarb管柱上純化混合部分，此產生標題化合物(19 mg, 3.2%)。MS 281.2 [M+H]
+
。
1
H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10.39 (s, 1H), 7.87 (d,
J
= 8.1 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.22 (d,
J =
16.1 Hz, 1H, 7), 5.73 (d,
J
=8.1 Hz, 1H), 5.52 (s, 1H), 4.21 (dd,
J =
19.6, 9.2 Hz, 1H), 3.87-3.77 (m, 2H), 3.64 (dd,
J=
12.7, 2.8 Hz, 1H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO) δ 162.76, 150.26, 139.06, 115.71, 113.71, 102.28, 86.98, 86.69, 81.01,73.28,73.14,58.19。
實例 2 (2S)-2-(((((2R,3R,4S,5R)-4- 氯 -5-(2,4- 二側氧基 -3.4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 氟 -3- 羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 甲氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸異丙基酯 (2)
在氬下向糖1g (28 mg, 0.1 mmol)於THF (1.5 mL)中之溶液中緩慢添加第三丁基氯化鎂之1M溶液(0.22 mL, 0.22 mmol)。將懸浮液於0℃下攪拌1h，隨後，添加DMPU (0.5 mL)，之後於0℃下在約5 min期間添加(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸異丙基酯(57 mg, 0.12 mmol) (如WO2011/123672中所述製得)於THF (0.5 mL)中之溶液。將混合物於0℃下攪拌5h，隨後達到RT並用飽和氯化銨溶液驟冷。將混合物用EtOAc萃取三次。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，在減壓下濃縮並藉由HPLC分離產物。(Gemini NX 30 mm 20%至60%乙腈、10 mmol乙酸銨梯度17分鐘且流速為40 ml/分鐘。)產率22 mg，40%。
實例 3 步驟 a) (2R,3R,4S,5R)- 乙酸 4- 氯 -5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 氟 -2-( 羥基甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (3a)
向化合物1f (81 mg, 0.29 mmol)於吡啶(25 mL)中之溶液中添加4-甲氧基三苯甲醯氯(133 mg, 0.43 mmol)。將所得混合物於室溫下攪拌40 h，用DCM稀釋並用NaHCO
3
洗滌。濃縮有機相並藉由矽膠上管柱層析純化殘餘物，此產生標題化合物(144 mg, 90%)。 將獲得之化合物溶解於無水吡啶(1.4 mL)中，添加Ac
2
O (29 μL, 0.31 mmol)並將溶液於rt下攪拌。2h後，添加MeOH，將混合物濃縮並用DCM (×3)萃取並將合併之有機層用飽和NaHCO
3
水溶液、Na
2
SO
4
洗滌，濃縮並與THF共蒸發一次。將殘餘物吸收於80% HOAc (35 mL)中並於45℃下攪拌3h，隨後濃縮。藉由矽膠上管柱層析純化殘餘物，此產生標題化合物(69 mg, 33%)。
步驟 b) 鋰 ((2R,3R,4S,5R)- 三磷酸 4- 氯 -5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 氟 -3- 羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 甲基酯 (3b)
在氮下向化合物3a (78 mg, 0.24 mmol)於無水吡啶(560 μL)與無水THF (560 μL)之混合物中之攪拌溶液中添加2-氯-1,3,2-苯并二氧雜膦-4-酮(64 mg, 0.31 mmol)於無水THF (280 μL)中之新鮮製備之溶液。將混合物於室溫下在氮下攪拌15分鐘，隨後在氮下添加三丁基銨P
2
O
7
(146 mg, 0.27 mmol)及三丁基胺(127 μL, 0.53 mmol)於無水DMF (560 μL)中之先前製備之溶液。將獲得之溶液於室溫下在氮下額外攪拌15分鐘，隨後以於吡啶/水(98/2, v/v) (1.1 mL)中之溶液形式添加I
2
(123 mg, 0.48 mmol)並將反應混合物攪拌15分鐘。藉由添加約19滴5% Na
2
SO
3
水溶液消滅過量碘並濃縮反應溶液。將殘餘物吸收於水/乙腈(95:5) (5 mL)中並於室溫下振盪30分鐘。添加濃縮之氨(10 mL)並將反應混合物於室溫下攪拌1½h，隨後濃縮並將殘餘物溶解於水/乙腈(95:5, 5 mL)中並冷凍乾燥。 將約430 mg粗物質溶解於10% MeCN/水(3 mL)中並過濾並藉由HPLC在Gilson儀器上使用Phenomenex Luna 5m NH
2
(150×21.2mm)管柱純化，溶劑A：95%水:5%乙腈: 0.05M碳酸氫銨，溶劑B：95%水:5%乙腈: 0.8M碳酸氫銨梯度：於30 min中0% B至50% B。 彙集NTP部分並濃縮，將殘餘物溶解於10% MeCN/水中並冷凍乾燥。將獲得之固體吸收於10% MeCN/水中，經由0.45 mm釉料過濾器過濾出不溶性物質並將澄清濾液蒸發至乾燥，溶解於水/乙腈(95:5)中，通過Dowex-Li
+
並冷凍乾燥，此產生標題化合物(39.3 mg, 28%)。
1
H NMR (500 MHz, D
2
O) δ 7.87 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 15.9 Hz, 1H, 1), 5.98 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.56 (dd, J = 19.1, 9.4 Hz, 1H, 5), 4.35 (dddd, J = 42.1, 12.3, 5.1, 2.2 Hz, 3H), 4.19 (d, J = 9.4 Hz, 1H,8)。
13
C NMR (126 MHz, D
2
O) δ 165.94, 151.67, 140.78, 114.54, 112.55, 103.12,87.95,87.62, 79.45, 79.38, 73.16, 73.02, 62.60, 62.56。
實例 4 (2S)-2-(((((2R,3R,4S,5R)-4- 氯 -5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 炔 -4- 氟 -3- 羥基四氫呋喃 -2- 炔甲氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸環己基酯 (4)
在N
2
下於0℃下向核苷1g (15 mg, 0.053 mmol)於無水THF (2 mL)中之溶液中添加t.BuMgCl (13.7 mg, 0.12 mmol)。將所得懸浮液於0℃下攪拌1 h，隨後添加DMPU (0.5 ml)，之後逐滴添加(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸環己基酯(33 mg, 0.067 mmol)於THF (0.5 mL)中之溶液，同時保持溫度於0℃下。4h後，添加NH
4
Cl (飽和水溶液)並將混合物用EtOAc萃取三次。將合併之萃取物用水及鹽水洗滌，隨後乾燥(Na
2
SO
4
)並在減壓下濃縮。使用Biotage (SNAP 25 g)用DCM/MeOH之梯度溶析純化獲得之殘餘物，之後使用Waters Gemini nx C18管柱(pH 7)進一步純化。彙集適當部分，濃縮並自水共蒸發，隨後自MeCN及水冷凍乾燥，此產生白色粉末狀標題化合物(9.9 mg, 31.4%)。LC-MS 590.09 [M+H]
+
。 以下化合物係藉由使用實例4之程序用指示磷酸化試劑磷酸化核苷1g合成：
實例 18 步驟 a) 1-((2R,3S,4R,5R)-3- 氯 -3- 氟 -4- 羥基 -5-(((6- 硝基 -2- 氧離子基 -4H- 苯并 [d][1,3,2] 二氧雜磷雜苯 -2- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -2- 基 ) 嘧啶 -2,4(1H,3H)- 二酮 (18a)
將核苷3a (69 mg, 0.21 mmol)溶解於乙腈/二氯甲烷(2.7/1.3，約4 mL)之混合物中並在氮下將溶液冷卻至-20℃。向溶液中添加Et
3
N (77 μL, 0.56 mmol)，之後添加製備為DCM中之溶液(1.34 mL；將2 mmol稀釋至5 mL以得到原液)之2-氯-6-硝基-4H-苯并[d][1,3,2]二氧雜磷雜苯(125 mg, 0.54 mmol)。移除冷卻浴並於室溫下攪拌反應物。1½h後，將反應物冷卻至-5℃並添加Oxone®, (0.855 mmol)於水(4.0 mL)中之溶液並將兩相系統劇烈攪拌15 min。隨後用EtOAc萃取混合物，分離各相並將有機相用冷水(2×)洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)。濃縮並自庚烷/DCM共蒸發，LCMS 536 [M+H]。此粗物質用於下一步驟。
步驟 b) ((2R,3R,4S,5R)- 三氫二磷酸 4- 氯 -5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 氟 -3- 羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 甲基酯 (18b)
將化合物18a與無水DMF共蒸發一次，隨後溶解於無水DMF (2.2 mL)中並在氮下添加雙-三丁基胺磷酸酯(0.25 mmol，0.5 mL，0.5M，於DMF中)。將溶液於室溫下攪拌約17h，隨後在真空中濃縮並添加幾mL水，之後添加濃氨(25-30 mL)及THF (1-2 mL)並將此混合物於室溫下攪拌。2 h後，藉由蒸發移除大部分NH
3
並將殘餘物用DCM (4×40mL)萃取。濃縮水層並將殘餘物溶解於10%MeCN/Milli Q水中。過濾出不溶性物質並將濾液濃縮至乾燥。 將獲得之殘餘物溶解於10% MeCN/水(1.5 mL)中，裝載至活性碳管柱(0.85×3.00 cm)上並用10%MeCN/Milli Q水溶析。彙集適當部分，濃縮，與MeCN (×2)共蒸發且最後在冷凍乾燥器上乾燥。將粗製殘餘物(76 mg)溶解於10% MeCN/Milli Q水(1 mL)中並藉由半製備型HPLC在Luna NH
2
管柱上在Gilson機器上使用0% B至30% B之梯度(30 mL/min)經20 min (溶劑A：0.05M碳酸氫銨、5%乙腈；溶劑B：0.8M碳酸氫銨、5%乙腈)純化。彙集適當部分並濃縮至乾燥，將殘餘物溶解於Milli Q水與一些MeCN中並冷凍乾燥。將鬆散殘餘物吸收於Milli Q水中之10%MeCN中，經由0.2 mm過濾器過濾懸浮液且彙集澄清濾液並冷凍乾燥，此產生標題化合物(28.6 mg, 36%)。LCMS ES
-
438.8 [M-H]
- 實例 19 ，化合物 1 之替代途徑 步驟 a) (3S,4R,5R)- 乙酸 3- 氯 -3- 氟 -4-(( 三異丙基矽基 ) 氧基 )-5-((( 三異丙基矽基 ) 氧基 ) 甲基 )- 四氫呋喃 -2- 基酯 (19a)
在氬下於-35℃下向化合物1c (16.3 g, 32.8 mmol)於THF (120 mL)中之溶液中逐滴添加Li(O-t-Bu)
3
AlH於THF (39 mL, 39 mmol)中之1M溶液。將混合物於-35℃下攪拌1h，隨後於rt下攪拌1h。將混合物冷卻至-25℃，添加DMAP (4.00 g, 32.8 mmol)並將混合物攪拌15分鐘，隨後逐滴添加乙酸酐(33.5 g, 328 mmol)並將混合物攪拌2h。使混合物達到0℃並添加EtOAc (200 mL)及水(200 mL)。分離各相且用EtOAc (×2)萃取水相。將合併之有機相用水(×2)及鹽水(×1)洗滌。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並在減壓下濃縮。將殘餘物與甲苯共蒸發兩次且藉由矽膠上層析用異己烷及2%至6% EtOAc溶析純化產物，此產生標題化合物(17.1 g, 96%)。
步驟 b) (3S,4R,5R)- 乙酸 3- 氯 -3- 氟 -4- 羥基 -5-( 羥基甲基 ) 四氫呋喃 -2- 基酯 (19b)
向化合物19a (17.0 g, 31.4 mmol)於乙腈(115 mL)及THF (23 mL)中之攪拌溶液中添加三乙胺三氫氟化物(20.5 g, 126 mmol)。將混合物於rt下攪拌72 h，於50℃下攪拌20 h且隨後於rt下攪拌過夜。在二氧化矽(60 g)上濃縮溶液並藉由矽膠層析用異己烷及EtOAc之梯度溶析純化，此產生標題化合物(68.0 g, 85%)。
步驟 c) (2R,3R,4S)- 苯甲酸 5- 乙醯氧基 -2-(( 苯甲醯基氧基 ) 甲基 )-4- 氯 -4- 氟四氫呋喃 -3- 基酯 (19c)
在冰冷卻下向化合物19b (6.80 g, 26.8 mmol)之攪拌溶液中添加三乙胺(10.8 g, 107 mmol)，之後逐滴添加苯甲醯氯(9.41 g, 66.9 mmol)。使混合物達到rt並攪拌過夜。添加EtOH (5 mL)並將混合物攪拌30分鐘，隨後在真空中濃縮。添加水並用EtOAc (×3)萃取混合物。將有機層用水及鹽水洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠層析用異己烷及EtOAc之梯度溶析純化產物，此產生標題化合物(10.1 g, 86%)。
步驟 d) ((2R,3R,4S)- 苯甲酸 3-( 苯甲醯基氧基 )-4- 氯 -4- 氟 -5- 羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 甲基酯 (19d)
向化合物19c (10.1 g, 23.0 mmol)於EtOAc (100 mL)及DMSO (50 mL)中之攪拌溶液中添加乙醇胺(1.55 g, 25.4 mmol)。將混合物於rt下攪拌72 h，隨後用二乙醚(300 mL)及EtOAc (300 mL)稀釋並用水(×4)洗滌。將合併之水相用EtOAc萃取，隨後將EtOAc相用鹽水(×2)洗滌。將合併之有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並在減壓下濃縮。藉由矽膠層析用DCM與EtOAc之梯度溶析純化產物，此產生標題化合物(7.50 g, 82%)。
步驟 e) ((2R,3R,4S)- 苯甲酸 3-( 苯甲醯基氧基 )-4- 氯 -4- 氟 -5-(( 甲基磺醯基 ) 氧基 ) 四氫呋喃 -2- 基 ) 甲基酯 (19e)
於-15℃下在N
2
下向化合物19d (8.36 g, 21.2 mmol)於無水DCM (100 mL)中之溶液中添加Et
3
N (3.54 mL, 25.4 mmol)，之後添加MsCl (1.97 mL, 25.4 mmol)。將反應混合物於-15℃下攪拌2 h，隨後倒入HCl (80 mL，1M，水溶液)中。分離各相並用DCM萃取水層。將合併之有機萃取物用NH
4
Cl (飽和水溶液)洗滌，乾燥(MgSO
4
)並在減壓下濃縮，以產生澄清油狀標題化合物(9.86 g, 98%)。
步驟 f) ((2R,3R,4S,5R)- 苯甲酸 3-( 苯甲醯基氧基 )-4- 氯 -5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 氟四氫呋喃 -2- 基 ) 甲基酯 (19f)
將尿嘧啶(3.09 g, 27.5 mmol)及硫酸銨(48.5 mg, 0.367 mmol)在N
2
下在HMDS (49.3 mL, 236 mmol)中加熱回流16 h。將反應混合物冷卻至rt，在減壓下濃縮並在真空中乾燥。在N
2
下向化合物19e (8.68 g, 18.4 mmol)於無水DCE (75 mL)中之溶液中添加於無水DCE (50 mL)中之殘餘物。在N
2
下向溶液中緩慢添加TMSOTf (6.12 g, 27.5 mmol)。在添加後，將反應混合物加熱至80℃並保持5 h且隨後於65℃下加熱16 h。將反應混合物冷卻至rt，用NaHCO
3
(飽和水溶液)驟冷，過濾並用DCM萃取兩次。將合併之有機萃取物乾燥(MgSO
4
)並在減壓下濃縮。添加EtOAc及DCM並藉由過濾收集所形成沈澱，此產生純β-異構物(660 mg, 7.4%)。將濾液蒸發至二氧化矽上並藉由急驟層析(hex:EtOAc 2:1 - 1:1)純化，此產生呈與α-異構物之混合物形式之標題化合物，α:β＞5:95 (942 mg, 11%)。
步驟 e) 1-((2R,3S,4R,5R)-3- 氯 -3- 氟 -4- 羥基 -5-( 羥基甲基 ) 四氫呋喃 -2- 基 ) 嘧啶 -2,4(1H,3H)- 二酮 (19e)
將化合物19f (670 mg, 1.37 mmol)懸浮於NH
3
(7N，於MeOH中)中。30 min後，添加EtOH (5 mL)並將懸浮液於rt下攪拌。額外1小時後，懸浮液變成溶液且隨後將反應混合物於rt下攪拌15 h。在減壓下蒸發溶劑並藉由急驟層析(DCM:MeOH 10:1)純化獲得之殘餘物，此產生白色固體狀標題化合物(380 mg, 99%)。LC-MS ES- 279.31 [M-H]
-
。 以下化合物係藉由使用實例4之程序用指示磷酸化試劑磷酸化核苷1g合成：
1
反應混合物中不存在DMPU
2
18h後添加額外0.8當量磷酸化試劑(I-49)
實例 26 步驟 a) (2R,3R,4S,5R)-4- 甲基苯甲酸 4- 氯 -5-(2,4- 二側氧基 -3,4- 二氫嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 氟 -2-(((4- 甲基苯甲醯基 ) 氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (26a)
將核苷1g (253 mg, 0,9 mmol)溶解於吡啶(5 ml)及DCM (5 ml)中。添加三乙胺(630 ml, 4.52 mmol)並在冰浴上冷卻混合物。15 min後，添加4-甲基苯甲醯氯(300 ml, 2.27 mmol)並將混合物在冷卻下攪拌10 min，隨後於22℃下攪拌90 min。添加NaHCO
3
(水溶液)並將混合物用DCM稀釋並用1M HCl (水溶液) ×3洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)並濃縮。藉由二氧化矽上管柱層析用石油醚/EtOAc (3:1)溶析純化殘餘物，此產生標題化合物(279.2 mg, 60%)。LC-MS
步驟 b) 4- 胺基 -1-((2R,3S,4R,5R)-3- 氯 -3- 氟 -4- 羥基 -5-( 羥基甲基 )- 四氫呋喃 -2- 基 ) 嘧啶 -2(1H)- 酮 (26b)
將化合物26a (279 mg, 0.54 mmol)溶解於吡啶(5 mL)中，添加分子篩(4 Å，半勺)並將混合物在冰浴上攪拌15 min。添加磷醯氯(200 μl, 2.18 mmol)且5 min後，添加1,2,4-1H-三唑(373 mg, 5.4 mmol)。將混合物在冷卻下攪拌15 min，隨後於22℃下攪拌5h。添加氨(32%, 10 mL, 82.2 mmol)並將混合物於22℃下攪拌過夜。濃縮混合物，溶解於水中並用EtOAc ×2洗滌。將合併之有機層用水萃取，將合併之水萃取物濃縮，且藉由二氧化矽上管柱層析用DCM/MeOH (8:2)溶析純化殘餘物，此產生標題化合物(139 mg, 83%)。MS ES+ 279.9 [M+H]
+
。
步驟 c) (2S)-2-(((((2R ,3R,4S,5R)-5-(4- 胺基 -2- 側氧基嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 氯 -4- 氟 -3- 羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 甲氧基 )( 苯氧基 ) 磷醯基 ) 胺基 ) 丙酸異丙基酯 (26c)
將化合物26b (27.4 mg, 0.1 mmol)溶解於含有分子篩之無水THF (6 mL)中，且將混合物於22℃下攪拌30 min，隨後添加THF (0.11 ml)中之2M第三丁基氯化鎂並將混合物再攪拌30 min。添加(2S)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷醯基)胺基)丙酸異丙基酯(51.4 mg, 0.11 mmol)並將混合物攪拌15 h，隨後用EtOAc稀釋，用NaHCO
3
(水溶液)洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由YMC-二氧化矽用DCM:MeOH (95:5 → 90:10)之梯度溶析純化殘餘物。彙集適當部分並濃縮。藉由製備型HPLC使用Gemini C18管柱用乙腈/水(pH 7, 0.01 M NH
4
OAc, 20-40%)之梯度溶析純化殘餘物。濃縮產物，隨後在用MeOH/ 水(pH 7, 0.01 M NH
4
OAc, 33-50 %)之梯度溶析之氟苯基管柱純化。收集產物，溶解於乙腈/水(1:4)中並凍乾，此產生標題化合物(13 mg, 24%) LC-MS 548.9 [M+H]
+
。
實例 27 步驟 a) N-(1-((2R,3S,4R,5R)-3- 氯 -3- 氟 -4- 羥基 -5-( 羥基甲基 ) 四氫呋喃 -2- 基 -2- 側氧基 -1,2- 二氫嘧啶 -4- 基 ) 異丁醯胺 (27a)
於58℃下向核苷26b (139 mg, 0.497 mmol)於二噁烷(1.7 mL)及水(0.19 mL)中之溶液中添加異丁酸酐(118 mg, 0.746 mmol)。將溶液於58℃下攪拌3h，隨後濃縮。將殘餘物溶解於DCM中之20%EtOH中並用飽和NaHCO
3
水溶液/鹽水30:70 v/v洗滌(×4)，乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮。藉由矽膠上管柱層析用EtOH/DCM (2→8%)之梯度溶析純化殘餘物，此產生固體狀標題化合物(62 mg)。
步驟 b) (2R,3R,4S,5R)- 異丁酸 4- 氯 -4- 氟 -5-(4- 異丁醯胺基 -2- 側氧基嘧啶 -1(2H)- 基 )-2-(((4- 甲氧基苯基 ) 二苯基甲氧基 ) 甲基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (27b)
向化合物27a (62 mg, 0.177 mmol)於吡啶(1.1 mL)中之溶液中添加4-甲氧基三苯甲醯氯(65.7 mg, 0.177 mmol)並將所得混合物於室溫下振盪約6h，隨後添加額外4-甲氧基三苯甲醯氯(16 mg，0.3當量)並將混合物再振盪18h。添加異丁酸酐(33.6 mg, 0.212 mmol)並將溶液於rt下振盪4h。將反應物用MeOH驟冷，隨後濃縮並用DCM(×3) / 飽和NaHCO
3
水溶液萃取。將有機相乾燥(Na
2
SO
4
)，過濾並濃縮且將殘餘物與甲苯共蒸發兩次且與THF共蒸發兩次。 獲得之固體殘餘物直接用於下一步驟。
步驟 c) (2R,3R,4S,5R)- 異丁酸 4- 氯 -4- 氟 -2-( 羥基甲基 )-5-(4- 異丁醯胺基 -2- 側氧基嘧啶 -1(2H)- 基 ) 四氫呋喃 -3- 基酯 (27c)
將化合物27b (123 mg, 0.177 mmol)溶解於80% AcOH (25 mL)及THF (5 mL)中並將溶液於45℃下攪拌2h，隨後濃縮並與THF (×3)及甲苯(×1)共蒸發。藉由矽膠上管柱層析用DCM中之0→4% EtOH之梯度溶析純化殘餘物，此產生標題化合物(36 mg，經3個步驟為48.5%)。LC-MS 420.0 [M+H]
+
。
步驟 d) (((2R,3R,4S,5R)-5-(4- 胺基 -2- 側氧基嘧啶 -1(2H)- 基 )-4- 氯 -4- 氟 -3- 羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 甲基 ) 三磷酸 (27d)
將化合物27c (36.0 mg, 0.086 mmol)溶解於MeCN/DCM: 1.06 / 0.54 (約1.6 mL)之混合物中並將溶液在氮下冷卻至-20℃。向溶液中添加Et
3
N (31.1 μL, 0.223 mmol)，之後添加2-氯-6-硝基-4H-苯并[d][1,3,2]二氧雜磷雜苯(50.1 mg, 0.214 mmol)於DCM (0.71 mL)中之溶液。移除冷卻浴並將反應物於室溫下攪拌1½h。將反應物冷卻至-5℃並添加Oxone
®
(0.343 mmol)於水(1.73 mL)中之溶液並將兩相系統劇烈攪拌15 min。將混合物用乙酸乙酯萃取，將有機相用冷水(2×)洗滌，乾燥(Na
2
SO
4
)並濃縮。將殘餘物與甲苯共蒸發一次且與無水DMF共蒸發一次，隨後溶解於無水DMF (1 mL)中。在氮下添加三丁基胺焦磷酸酯(0.1 mmol, 54.6 mg)並於室溫下將溶液振盪約18h，隨後濃縮。向殘餘物中添加30%MeCN / H
2
O (約20 mL)並於rt下將溶液振盪20-25 min。蒸發揮發物並將殘餘油-固體混合物溶解於濃氨(10-15 mL)中並於室溫下振盪約5 h。 藉由蒸發移除大部分NH
3
，隨後用DCM (4×40 mL)萃取殘餘物。棄去有機萃取物並濃縮水層。將殘餘物溶解於水中之5% MeCN (1.5-2.0 mL)中並裝載至活性碳管柱(0.85×2.5)上。用水中之5% MeCN洗滌管柱並收集6-7 mL溶析劑並濃縮且冷凍乾燥。將殘餘物溶解於5%MeCN/水(1.6 mL)中並藉由半製備型HPLC使用Phenomenex Luna 5m NH
2
管柱在Gilson機器上用0% B至40% B之梯度(30 mL/min)經30 min (溶劑A：0.05M碳酸氫銨、5%乙腈；溶劑B：0.8M碳酸氫銨、5%乙腈)溶析純化。彙集適當NTP部分並濃縮至乾燥，將殘餘物溶解於MQ水與5%MeCN中並冷凍乾燥。將殘餘物吸收於MQ水中之5%MeCN (4-5 mL)中並經由0.45 mm過濾器過濾懸浮液並濃縮濾液。將殘餘物溶解於水中之5% MeCN (0.5 mL)中並施加至短的Li+ Dowex管柱(6×1 cm)上並用水中之5% MeCN洗滌。彙集第一批約10 mL，濃縮並冷凍乾燥，此以根據PI分析含有6.6% NDP之89%純度產生標題化合物(11.7 mg, 30%)。MS ES+ 519.9 [M+H]
+
。 用於所例示化合物之選擇之NMR數據：
化合物 9 1
H NMR (500 MHz, DMSO-d
6
) δ 7.55 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.87 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.76 - 6.60 (m, 2H), 6.32 - 6.19 (m, 1H), 6.10 - 6.01 (m, 1H), 6.02 (s, 2H), 5.62 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.86 (p, J = 6.3 Hz, 1H), 4.37-4.15 (m, 4H), 4.07 - 3.97 (m, 1H), 3.79 (tq, J = 10.1, 7.1 Hz, 2H), 1.23 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.3 Hz, 5H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO-d
6
) δ 172.50, 147.46, 144.86, 144.81, 143.91, 115.06, 115.05, 113.05, 113.05, 112.41, 112.40, 112.37, 112.37, 107.88, 102.36, 102.34, 101.52, 78.74, 74.44, 74.30, 67.90, 64.28, 49.65, 40.63, 40.40, 40.34, 40.27, 39.99, 39.90, 39.83, 39.73, 39.66, 39.57, 39.40, 39.23, 39.07, 38.90, 21.28, 21.26, 19.72, 19.67, -0.00。
化合物 10 1
H NMR (500 MHz, DMSO-d
6
) δ 7.58 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.20 - 7.05 (m, 2H), 6.90 (td, J = 7.9, 1.6 Hz, 1H), 5.60 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.87 (dq, J = 12.5, 6.2 Hz, 1H), 4.41 - 4.20 (m, 5H), 4.09 - 3.99 (m, 1H), 4.00 - 3.77 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 1.79 (s, 1H), 1.22 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.3 Hz, 5H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO-d
6
) δ 172.59, 172.55, 162.64, 150.28, 150.24, 150.09, 139.37, 139.32, 125.29, 120.90, 120.88, 120.25, 115.03, 113.02, 112.85, 102.25, 78.82, 74.38, 74.24, 67.85, 64.26, 55.59, 49.57, 40.26, 40.20, 40.17, 39.99, 39.90, 39.82, 39.73, 39.66, 39.57, 39.40, 39.23, 39.07, 38.90, 21.30, 21.26, 19.63, 19.58。
化合物 11 1
H NMR (500 MHz, DMSO-d
6
) δ 7.57 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.98 - 6.86 (m, 3H), 6.25 (t, J = 16.6 Hz, 1H), 5.62 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.86 (hept, J = 6.2 Hz, 1H), 4.37- 4.15 (m, 4H), 4.07 - 3.97 (m, 1H), 3.78 (tq, J = 10.2, 7.1 Hz, 1H), 3.72 (s, 2H), 1.23 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.22-1.11 (m, 8H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO-d
6
) δ 172.52, 172.48, 162.65, 155.91, 150.08, 143.96, 143.91, 120.95, 120.92, 114.99, 114.42, 112.98, 102.27, 78.77, 74.44, 74.30, 67.86, 64.21, 55.29, 49.65, 40.25, 40.15, 39.99, 39.90, 39.83, 39.74, 39.66, 39.57, 39.40, 39.24, 39.07, 38.90, 21.30,21.27, 19.69, 19.64。
化合物 13 1
H NMR (500 MHz, DMSO-d
6
) δ 0.82 (t, 3H), 1.12 (d, 3H), 1.25 (d, 3H), 1.49 (m, 2H), 3.83 (dtd, 1H), 4.02 (m, 1H), 4.26 (dt, 2H), 4.34 (m, 1H), 4.72 (h, 1H), 5.58 (d, 1H), 6.12 (dd, 1H), 6.26 (m, 1H), 7.20 (m, 3H), 7.37 (t, 2H), 7.53 (d, 1H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO-d
6
) δ 9.35, 19.05, 19.77 (d), 28.00, 40.08, 49.72, 64.32, 72.27, 74.35 (d), 78.72 (m), 102.36, 114.08(d), 119.95(d), 124.49, 129.54, 150.53(d), 163.41 (m), 172.62(d)。
化合物 15 1
H NMR (500 MHz, DMSO-d
6
) δ 1.16 (d, 6H), 1.24 (d,3H), 1.80 (m, 1H), 1.96 (m, 1H), 2.05 (pdd, 2H), 2.26 (m, 2H), 3.49 (p, 1H), 3.81 (tq, 1H), 4.04 (m, 1H), 4.30 (m, 3H), 4.86 (hept, 1H), 5.60 (d, 1H), 6.07 (dd, 1H), 6.24 (d, 1 H),_6.68 (d, 1H), 7.03 (m, 3H), 7.28 (t, 1H), 7.58 (d, 1H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO-d
6
) 6 17.58 , 19.65 (d), 21.26, 21.29, 29.13, 49.65, 64.33, 67.87, 74.37(d), 78.78,102.28, 113.98(d), 117.35(d), 117.76(d), 122.45, 129.25, 139.49, 147.50, 150.05, 150.56, 162.56, 172.48 (d)。
化合物 16 1
H NMR (500 MHz, DMSO-d
6
) δ 0.78 (m, 8H), 1.15 (d, 12H), 1.23 (d,7H), 1.35 (s, 6H), 3.80 (tq, 2H), 4.03 (m, 2H), 4.25 (m, 4H), 4.34 (m, 2H), 4.86 (p, 2H), 5.59 (d, 2H), 6.07 (dd, 2H), 6.24 (d, 2H), 6.72 (s, 1H), 7.01 (m, 6H), 7.26 (t, 2H), 7.57 (d, 2H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO-d
6
) δ 16.03, 18.82, 19.65 (d), 21.26, 21.30, 24.42, 49.63, 64.29, 67.87, 74.35(d), 78.78, 87.51, 102.30, 114.00(d), 116.92(d), 117.60(d), 122.06, 129.18, 139.60 (m), 148.45, 150.13, 150.50 (d), 162.69, 172.47 (d)。
化合物 17 13
C NMR (126 MHz, DMSO-d
6
) δ 15.52, 18.66, 19.65 (d), 21.25, 21.30, 24.98, 49.67, 64.23, 67.87, 74.35(d), 78.76, 87.49, 102.25, 113.97(d), 119.69(d), 127.19, 139.65(d), 142.69, 148.17(d), 150.02, 162.52, 172.46(d)。
化合物 21 1
H NMR (500 MHz, DMSO) δ 1.25 (d, 3H), 3.23 (m, 6H), 3.41 (m, 4H), 3.87 (ddt, 1H), 4.04 (m, 1H), 4.31 (m, 3H), 5.02 (p, 1H), 5.61 (d, 1H), 6.20 (m, 2H), 7.21 (m, 3H), 7.38 (t, 2H), 7.57 (d, 1H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO) δ 19.72 (d), 49.60, 58.36, 64.28, 70.33, 70.46, 71.53, 74.38 (d), 78.81 (d), 102.26, 114.00(d), 119.99(d), 124.53, 129.55, 150.03, 150.51 (d), 162.54, 172.59 (d)。
化合物 24 1
H NMR (500 MHz, DMSO) δ 1.15 (dd, 6H), 1.22 (d, 3H), 3.52 (m, 1H), 3.78 (tq, 1H), 4.05 (m, 1H), 4.16 (m, 1H), 4.26 (dt, 1H), 4.34 (m, 1H), 4.86 (hept, 1H), 5.65 (d, 1H), 6.14 (dd, 1H), 6.23 (s, 1H), 6.27 (s, 1H), 7.21 (m, 3H), 7.37 (t, 2H), 7.50 (d, 1H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO) 5 19.62 (d), 21.25 (d), 49.61, 63.83, 67.92, 74.16 (d), 78.53 , 102.42, 114.03(d), 119.85(d), 124.49, 129.58, 139.35 (dd), 150.26, 150.56(d), 162.87, 172.51 (d)。
化合物 26b 1
H NMR (500 MHz, DMSO) δ 3.62 (d, 1H), 3.80 (m, 2H), 4.15 (dd, 1H), 5.26 (s, 1H), 5.77 (d, 1H), 6.31 (d, 1H), 6.41 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.36 (s, 1H), 7.73 (d, 1H)。
13
C NMR (126 MHz, DMSO) 5 58.50, 58.62, 73.62 (d), 80.48 , 87.01 (m), 94.50, 94.56, 114.92 (d), 140.04, 154.57, 165.42。
化合物 27d 1
H NMR (500 MHz, D20) δ 4.12 (d, 1H), 4.24 (ddd, 1H), 4.33 (m, 1H), 4.46 (dd, 1H), 6.09 (d, 1H),6.39(d, 1H), 7.80 (d, 1H)。
13
C NMR (126 MHz, D20) δ 62.48 (d), 73.03 (d), 78.99 (d), 88.15 (d), 97.04, 113.71 (d), 140.63, 157.39, 166.21。
生物實例 複製子分析
可在旨在鑑別抑制HCV功能細胞複製細胞系(亦稱作HCV複製子)之化合物之細胞分析中檢驗式I化合物在抑制HCV RNA複製之活性。適宜細胞分析係基於多靶標篩選策略中之雙順反子表現構築體，如由Lohmann等人 (1999)，Science，第285卷，第110-113期所述，由Krieger等人 (2001), Journal of Virology 75: 4614-4624所述進行修改。 該分析利用穩定轉染之細胞系Huh-7 luc/neo (下文稱作Huh-Luc)。此細胞系具有編碼雙順反子表現構築體之RNA，該構築體包含自腦心肌炎病毒(EMCV)之內部核糖體進入位點(IRES)轉譯之HCV 1b型之野生型NS3-NS5B區，之前係報告基因部分(FfL-螢光素酶)及可選標記部分(neo
R
，新黴素磷酸轉移酶)。該構築體係由HCV 1b型之5'及3' NTR (非轉譯區)作邊界。在G418 (neo
R
)存在下複製子細胞之繼續培養取決於HCV RNA之複製。表現HCV RNA且自主且高程度地複製、尤其編碼螢光素酶之穩定轉染之複製子細胞用於篩選抗病毒化合物。 在以不同濃度添加之測試及對照化合物存在下將複製子細胞平鋪於384孔板中。在培育3天後，藉由分析螢光素酶活性(使用標準螢光素酶分析受質及試劑及Perkin Elmer ViewLux™ ultraHTS微量板成像儀)量測HCV複製。在無任何抑制劑下，對照培養物中之複製子細胞具有高螢光素酶表現。在Huh-Luc細胞上監測化合物對螢光素酶活性之抑制活性，從而提供每一測試化合物之劑量-反應曲線。隨後計算EC
50
值，該值代表將所檢測螢光素酶活性之值減少50%、或更特定而言遺傳連接之HCV複製子RNA複製之能力所需之化合物之量。
酶分析
如複製子分析中可證實，本發明化合物係由靶標組織中之細胞激酶代謝成5'-三磷酸酯。據信此三磷酸酯係抗病毒活性物質。本文所述酶分析可用於確認本發明化合物作為5'-三磷酸酯代謝物具有抗病毒活性。 酶分析在HCV NS5B-21 (21-胺基酸C-末端截短形式) SPA分析(閃爍迫近分析)中量測三磷酸酯化合物之抑制效應。該分析係藉由評估使用異質生物素化RNA模板藉由HCV NS5B-21納入新近合成之RNA中之放射性標記之ATP的量來實施。 為測定IC
50
值，以100 ml反應混合物之最終體積以不同濃度測試化合物。藉由添加0.5M EDTA溶液停止反應。將試樣轉移至經鏈黴抗生物素預塗佈之閃爍板中。使用閃爍計數器(Wallac Microbeta Trilux)對納入之放射活性進行定量。
材料及供應商 方法 分析條件
分析應包括酶對照(約四種，含有1 μl DMSO代替抑制劑)及含有除模板外之所有成份之背景對照。 將化合物在單獨稀釋板上，以DMSO連續稀釋至100×最終期望分析濃度。 對於欲使用之孔之數目足夠之反應混合物係根據下表構成且向96孔聚丙烯板中添加90 μl/孔。向每一孔中添加來自稀釋板之DMSO中之1 μl化合物，只是酶對照孔及背景對照孔添加1 μl DMSO。
反應混合物
製備含有1.5 ml/孔之
3
H-ATP(45Ci/mmol)、2.0ml/孔之100 mM ATP及6.5ml/孔之H
2
O之ATP混合劑且藉由添加10 μl/孔之此混合劑開始反應。 於22℃下培育120 min。 利用添加100ml/孔之0.5M EDTA (pH=8.0)停止反應。 將185 μl/孔轉移至鏈黴抗生物素閃爍板。 將板培育過夜且在Microbeta Trilux中使用方案Flash plates H3對閃爍板進行讀數。
結果之處理
抑制之計算：
背景 = 無模板之反應緩衝液。 使用Graphpad Prism測定IC
50
。以對數對抑制%繪製化合物濃度曲線。將曲線與非線性回歸擬合至Log (抑制劑)對反應方程。
其中Y係抑制%，X係log (抑制劑)且頂值及底值係抑制%之上限及下限。
生物實例 1
在上述複製子分析中測試由本發明化合物展現之HCV複製之抑制。化合物顯示微莫耳活性，其中Huh-Luc細胞系中之細胞毒性超過50 mM。EC
50
值提供於表1中 表1
生物實例 2
在上述酶分析中測試實例3及27之核苷酸且IC
50
值經測定分別為0.72 mM及0.089 mM。
比較實例 1
速複布韋在若干國家中出售用於治療HCV，主要針對基因型1及4。速複布韋之結構係：
比較實例 1
如可見，速複布韋不同於本發明實例2之化合物，其不同之處在於其在2'位處具有β-甲基，而本發明化合物在此位置處具有β-氯取代基。在Lawitz等人，N. Eng. J. Med., 2013；368:1878-87中報告之分裂III期臨床試驗中，「
速複布韋
-
利巴韋林群組中之反應比率在基因型 3 感染之患者中較彼等基因型 2 感染者中低 (56% 對 97%) 」。
在Kylefjord等人，J Virol. Methods 2014 195:156-63中所述之基因型3a瞬時複製子分析中比較市售速複布韋與實例2之化合物之抗病毒活性。 速複布韋針對基因型3a之EC
50
係0.230 mM +/- 0.067，n = 11，與之相比，實例2之化合物EC
50
為0.072 mM +/-0.024，n= 9。預計本發明化合物相對於速複布韋之三倍更好功效可顯著改良臨床中之病毒反應比率。 在帶有棘手S282T突變(賦予HCV核苷美立他濱(mericitabine)抗性)之基因型3a之瞬時複製子中維持本發明化合物之功效相對於速複布韋數倍改良，其中速複布韋具有0.48 mM之EC
50
(n=1)且實例2之化合物具有0.13 mM之EC
50
(n=1)。類似地，在基因型3a瞬時複製子中製備藉由暴露於核苷美立他濱並賦予速複布韋抗性生成之L159F/L320F雙重突變體(Tong等人2013 J. Infect. Dis., 209 (5), 668-75)，如Kylefjord等人，同上中所述。在此雙重突變體中，速複布韋具有0.190之EC
50
(n=1)，而實例2之化合物顯示0.062之EC
50
(n=1)。 進一步評估實例2之化合物以評價針對HCV之基因型1-6 (野生型及多種臨床相關之突變體菌株)之抗病毒活性。評估之結果與基因型之平均EC
50
及速複布韋之相應值一起概述於表2及3中。 表2
除AVG外，EC
50
數據(所有皆以mM表示)係以幾何平均值提供，其中EC
50
係以算術平均值+/- SEM提供。 *嵌合複製子含有con1背景中之所述GT NS5B基因。 參考文獻：Con1 (Lohmann等人，2003)；H77 (Blight等人，2003)；GT2a (Wakita等人，2005)；GT3a (Kylefjord等人，2013)；GT4-6 (Wong等人，2012)；L159F/L320F (Tong等人，2013)。 表3
除AVG外，EC
50
數據(所有皆以mM表示)係以幾何平均值提供，其中EC
50
係以算術平均值+/- SEM提供。 *嵌合複製子含有con1背景中之所述GT NS5B基因。 參考文獻：Con1 (Lohmann等人，2003)；H77 (Blight等人，2003)；GT2a (Wakita等人，2005)；GT3a (Kylefjord等人，2013)；GT4-6 (Wong等人，2012)；L159F/L320F (Tong等人，2013)。 自該兩個表明了，與速複布韋相比，本發明實例2之化合物在野生型菌株及兩種臨床相關之突變體菌株中針對HCV GT3a之功效明顯改良，同時保持針對其他基因型之良好功效。
三磷酸酯形成分析
為估計本發明化合物生成抗病毒活性三磷酸酯物質之能力，實施三磷酸酯形成分析。在分析中一式三份測試每一化合物。 使用12孔板中之新鮮人類平鋪之肝細胞(Biopredic, France)。每一孔平鋪有0.76 × 10
6
個細胞並於37℃下於CO
2
培育箱中在1 mL培育培養基中與化合物之10 mM DMSO溶液(0.1% DMSO)一起培育6-8小時。藉由用1 mL冰冷之Hank平衡溶液(pH 7.2)洗滌每一孔兩次停止培育，之後添加0.5 mL冰冷70%甲醇。在添加甲醇後立刻藉由細胞刮刀使細胞層自孔之底部脫離並利用自動吸量管上下抽吸5-6次。將細胞懸浮液轉移至玻璃小瓶並於-20℃下儲存過夜。 隨後使各自由不同量之蛋白、游離核苷及單磷酸酯、二磷酸酯及三磷酸酯組成之試樣渦旋並於10℃下在Eppendorf離心5417R中以14000 rpm離心10分鐘。將上清液轉移至具有墊圈之2 mL玻璃小瓶並使其經受生物分析。
生物分析
向每一試樣中添加內標準品(Indinavir)並在與QTRAP 5000質譜儀耦聯之二管柱系統上分析試樣(10 mL注射體積)。二管柱系統由兩個二元幫浦X及Y、兩個切換閥及自動取樣器組成。所用之兩個HPLC管柱係Synergy POLAR-RP 50*4.6 mm，4 mm粒子及BioBasic AX 50*2.1 mm 5 mm粒子。LC流速係0.4-0.6 mL/min mL/min (改善步驟中使用較高流速)。 POLAR-RP管柱之HPLC流動相由2%乙腈中之10 mmol/L乙酸銨(流動相A)及90%乙腈中之10 mmol/L乙酸銨(流動相B)組成且BioBasic AX管柱之HPLC流動相由2%乙腈中之10 mmol/L乙酸銨(流動相C)及2%乙腈中之1%氫氧化銨(流動相D)組成。幫浦Y之HPLC梯度以0%流動相B開始且保持2 min。在裝載期期間，流動相穿過POLAR-RP及BioBasic AX管柱，且前藥、核苷及內標準品截留於POLAR-RP管柱上；而核苷酸(單磷酸酯、二磷酸酯及三磷酸酯)溶析至BioBasic AX管柱上並於該處截留。 在下一步驟中，流體自POLAR-RP管柱切換至MS且流動相C自幫浦X切換至BioBasic AX管柱。用約2分鐘內0% B直至100% B之梯度溶析POLAR-RP管柱上之化合物並使用多種反應監測模式(MRM)以陽性或陰性模式進行分析。在最後步驟中，將BioBasic AX管柱之流體切換至MS且用最高50% D之約7分鐘梯度溶析磷酸酯並使用MRM以陽性或陰性模式進行分析。在最後步驟期間，改善兩個管柱。 隨後藉由與標準曲線比較測定每一化合物之三磷酸酯濃度。藉由分析具有已知濃度之三磷酸酯之標準試樣作出標準曲線。使標準品在與測試試樣相同之基質中流動。由於端視肝細胞供體之磷酸化程度之變化，在每一輪分析中需要內部參考化合物以使得能夠使不同輪之結果彼此分級。 在整個本說明書及隨附申請專利範圍中，除非上下文另有要求，否則詞語「包含(comprise)」及變化形式(例如，「comprises」或「comprising」)應理解為暗指包括所述整數、步驟、整數組或步驟組，但並不排除任一其他整數、步驟、整數組或步驟組。 本文引用之所有文件(包括專利及專利申請案)之全文皆以引用方式併入本文中。