CN105669410A

CN105669410A - 一种从姜黄中提取姜黄素的方法

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Publication number: CN105669410A
Application number: CN201610023830.5A
Authority: CN
Inventors: 黄汉昌
Original assignee: Beijing Union University
Current assignee: Beijing Union University
Priority date: 2016-01-14
Filing date: 2016-01-14
Publication date: 2016-06-15
Anticipated expiration: 2036-01-14
Also published as: CN105669410B

Abstract

本发明提供一种从姜黄中提取姜黄素的方法，包括如下步骤，称取一定量的姜黄粉末，按液料比1：8～10加70～85％丙酮，提取3次，减压回收丙酮，得到棕褐色油状浸膏，用石油醚：水：乙酸乙酯进行液液萃取，粗分离，再用乙醇-水进行结晶和重结晶，得针状的姜黄素结晶，再用HPLC测定其质量分数。经计算，结晶后用HPLC检测纯度可达88％以上，重结晶后用HPLC检测纯度可达95％以上。

Description

一种从姜黄中提取姜黄素的方法

技术领域

本发明属于中药领域，涉及一种中药有效成分的提取方法，具体涉及一种从姜黄中提取姜黄素的方法。

背景技术

姜黄为姜科植物姜黄(CurcumalongaL.)的干燥根茎，具有行气止痛、通经破血、祛风疗痹等功效。近年国内外药理学研究发现姜黄属植物具有预防和治疗癌症及脑神经保护等多种作用，因而备受关注^[1]。

姜黄色素通常称为姜黄素，主要来源于姜科姜黄属植物姜黄的根茎^[2]。大量研究证明，姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基、抗微生物以及保护心脑血管系统、调节消化系统功能等多方面药理作用^[3]。姜黄还可作为调味品、天然色素、天然染料，由于安全无毒，无副作用，因而WHO与FDA批准姜黄素为天然食品添加剂。

由于姜黄色素主要来源于中药姜黄，其本身就是姜黄的有效药理成份之一，所以姜黄色素产品用作食品添加剂时，除了显色作用外，还有一定的营养和药理功能。据报道，姜黄色素产品中含有人体需要的18种氨基酸及多种微量元素成份，具有降压，利胆，行气解郁，凉血破瘀之功^[4]，是天然色素中极具开发前景的黄色素之一。因而，从中草药中提取和分离姜黄素已受到许多机构的垂青。

姜黄素的提取方法众多，但归纳起来主要有：秦炜等在利用传统方法提取的同时，使用了超声波技术，加快了浸取率，即由传统热浸取的0.727％提高到1.011％。Braga^[5]等人的二氧化碳超临界流体萃取，收率最大可达2.7％。董海丽^[6]等应用纤维素酶、果胶酶组成的复合酶对姜黄细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素等物质进行降解，以增大细胞内有效成分向提取介质扩散的传质面积并减小传质阻力，从而提高姜黄素的提取率，唐课文等的沉淀法提取^[2]，戴汉松^[7]等人用70％的乙醇进行粗提，再用正丙醇两次重结晶，可得95％以上的姜黄素。高苏亚^[8]采用乙醇加热回流和超声两种方法提取与分离姜黄素，采用氯仿：乙酸乙酯：甲醇＝38:1:1和75:1:1作为梯度洗脱剂的硅胶柱层析分离姜黄提取液，采用薄层法监测分离。结果表明，乙醇加热回流提取法较佳，提取条件为浓度65％乙醇，提取2次，固液比为1:10，提取时间2h，此工艺简单可行。

姜黄中的姜黄色素(curcumins)主要包括姜黄素(curcumin)、去甲氧基姜黄素(demethoxycurcumin)和双去甲氧基姜黄素(bisdemethoxycurcumin)，以姜黄素为主，是中药姜黄的主要活性成分，有抗炎、抗氧化、清除自由基、降血脂、抗诱变和抗癌等作用^[9]。

这三种成分结构上类似，因此在多方面具有相似的的药理作用，包括抗氧化抗癌等。但其结构上的微小差别导致其药理活性具有一定差异，其中，姜黄素被美国癌症研究所(NCI)认为是21世纪可能成为抗癌药物的有效先导化物之一^[10]，姜黄素还被广泛进行结构修饰用于抑菌^[11]等活性研究。在抑制癌细胞增生方面，去甲基姜黄素最佳；在防止细胞脂类过氧化物的形成方面，则是双去甲基姜黄素最佳。因此，将姜黄素类成分进一步分离提纯，使其各自充分发挥功效，具有十分重要的意义^[12]。

目前，姜黄色素的提取方法有碱水提取法、酶法提取法等。碱水提取虽然成本低，而且能得到纯度较高且能够干燥的色素产品，但由于操作过程复杂，反应条件剧烈，容易造成色素的破坏；酶法专业要求较高，不宜用于大规模的工业应用^[13]。

姜黄色素的分离纯化主要是以柱色谱^[14]和薄层色谱分离为主。薄层色谱分离效果好，但仅适用于少量样品；柱色谱分离量大，但由于姜黄素在洗脱剂中溶解度小，往往会耗费大量溶剂，造成浪费。李小鹏等^[15]研究了C18和C30柱在不同流动相体系中对3种姜黄素的分离效果。结果表明，使用简单的流动相体系时，3种姜黄素在C18柱上不能很好的分离，但在C30柱上可实现基线分离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从姜黄中提取姜黄素的方法，该方法根据姜黄色素中姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素三种成分极性的不同，在不同极性的溶剂中结晶行为也不同，采用溶剂萃取，结晶，重结晶分离纯化获得高纯度姜黄素。

为了实现上述目的，本发明提供一种从姜黄中提取姜黄素的方法，包括如下步骤：

1)提取：准确称取一定量的姜黄粉末，按料液质量体积比1:8～10加入70～85％丙酮，超声提取3次，减压回收丙酮，得到棕褐色油状浸膏，为姜黄素粗提物；

2)精制：通过用液-液萃取法，在姜黄素粗提物中加入萃取剂，萃取以除去水溶性及脂溶性化合物，冷冻干燥获得精制姜黄素粉末；

3)结晶：使用乙醇-水法对精制姜黄素粉末进行结晶，获得橙黄色针状结晶，将该橙黄色针状结晶冷冻干燥得到姜黄素一次结晶物；

4)重结晶：使用乙醇-水法对姜黄素一次结晶物进行重结晶，获得橙红色针状结晶，将该橙红色针状结晶冷冻干燥得到纯化姜黄素。

优选地，步骤1)中所述超声提取的条件为：超声频率40KHz，15min/次，每次间隔20min。

优选地，步骤2)中所述液-液萃取法为：在姜黄素粗提物中先加入1号萃取剂，混匀，静置分层，取下层溶液，丢弃上层溶液，反复萃取三次，去除其中的脂溶性杂质；其中姜黄素粗提物和1号萃取剂的质量体积比为1:20～100，1号萃取剂按体积比组成为：石油醚:丙酮:水＝1～3:1～3:1；然后在姜黄素粗提物中加入2号萃取剂，混匀，静置分层，取上层溶液，丢弃下层溶液，萃取三次，去除其中的水溶性杂质；其中，姜黄素粗提物和2号萃取剂的质量体积比为1:20～100，2号萃取剂的组成为乙酸乙酯和水按0.5～2:1体积比混合而成。

优选地，步骤3)所述使用乙醇-水法对精制姜黄素粉末进行结晶的步骤为：按料液质量体积比1:50～80在精制姜黄素粉末中加入乙醇，混匀后，充分搅拌，70℃水浴加热，加热过程须不时搅拌，使姜黄素粉末充分溶解，得深红色澄清透明溶液；然后向所得溶液中缓慢加入5～20％乙醇体积的70℃热蒸馏水，至出现浑浊；再向溶液中加入1～5％热水体积的乙醇，溶液再次变为深红色澄清透明溶液；将所得溶液从水浴锅中取出，用封口膜封口，置于冰箱4℃冷藏，静置24-72小时，获得橙黄色针状结晶。

优选地，步骤4)所述使用乙醇-水法对姜黄素一次结晶物进行重结晶的步骤为：按料液的质量体积比为1:50～80将姜黄素一次结晶物溶于乙醇，混匀，充分搅拌70℃水浴加热，加热过程须不时搅拌，使姜黄素一次结晶粉末充分溶解，得深红色澄清透明溶液；然后向所得溶液中缓慢加入5～20％乙醇体积的70℃热蒸馏水，至出现浑浊；再向溶液中加入1～5％热水体积的乙醇，溶液再次变为深红色澄清透明溶液；将所得溶液从水浴锅中取出，用封口膜封口，置于冰箱4℃中冷藏，静置36-72小时，获得橙红色针状结晶。

本发明根据姜黄色素中成分：姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的极性不同：双去甲氧基姜黄素>去甲氧基姜黄素>姜黄素，在不同溶剂中溶解行为的不同，采用溶剂萃取法，使用多次结晶的方式，获得纯化姜黄素。

结晶及重结晶

结晶：物质从液态(溶液或熔融状态)或气态形成晶体。晶体在溶液中形成的过程称为结晶。

重结晶：是将晶体溶于溶剂或熔融以后，又重新从溶液或熔体中结晶的过程。重结晶可以使不纯净的物质获得纯化。

用于结晶和重结晶的常用溶剂有：水、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、冰醋酸、二氧六环、四氯化碳、苯、石油醚等。此外，甲苯、硝基甲烷、乙醚、二甲基甲酰胺、二甲亚砜等也常使用。

结晶的特点

(1)选择性高：只有同类分子或离子才能排列成晶体。

(2)纯度高：通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤，洗涤，可以得到纯度较高的晶体。

(3)设备简单，操作方便。

(4)影响因素多，溶剂的选择(单一或复合)，结晶温度，搅拌速度，搅拌方式，过饱和度的选择，养晶的时间，溶媒滴加的方式和速率等等。

原理

结晶：溶质从溶液中析出的过程，可分为晶核生成(成核)和晶体生长两个阶段，两个阶段的推动力都是溶液的过饱和度(结晶溶液中溶质的浓度超过其饱和溶解度之值)。晶核的生成有三种形式：即初级均相成核、初级非均相成核及二次成核。

重结晶：固体混合物在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。一般是温度升高，溶解度增大。若把固体溶解在热的溶剂中达到饱和，冷却时由于溶解度降低，溶液变成过饱和而析出晶体。利用溶剂对被提纯物质及杂志的溶解度不同，可以使被提纯物质从过饱和溶液中析出。而让杂质全部或大部分仍留在溶液中，从而达到提纯目的。

结晶方法的选择

结晶的方法一般有2种：一种是蒸发溶剂法，即蒸发溶剂，使溶液由不饱和变为饱和，继续蒸发，过剩的溶质就会呈晶体析出的方法，它适用于温度对溶解度影响不大的物质；另一种是冷却热饱和溶液法，即先加热溶液，蒸发溶剂成饱和溶液，此时降低热饱和溶液的温度，溶解度随温度变化较大的溶质就会呈晶体析出的方法，此法适用于温度升高，溶解度也增加的物质。而姜黄素溶解度随温度升高而升高，所以选用冷却热饱和溶液法。

结晶与重结晶溶剂的选择条件

(1)所选溶剂不与被提纯物质起化学反应。

(2)在较高温度时能溶解大量的被提纯物质；而在室温或更低温度时，只能溶解很少量的该种物质。使被提纯物质热易溶，冷难溶。

(3)对杂质的溶解非常大或者非常小(前一种情况是使杂质留在母液中不随被提纯物晶体一同析出；后一种情况是使杂质在热过滤时被滤去)。

(4)容易挥发(溶剂的沸点较低)，易与结晶分离除去。

(5)能给出较好的晶体。

(6)无毒或毒性很小，便于操作。

(7)价廉易得，回收率高。

(8)适当时候可以选用混合溶剂。

结晶试剂及温度的确定

已有用甲醇-水，正丙醇用于姜黄素的结晶，考虑到乙醇毒性及刺激性都较小，所以选用乙醇-水。乙醇的沸点为78.4℃(351.6K)，所以温度设为70℃。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种从姜黄中提取姜黄素的方法，通过丙酮提取，液液萃取、结晶与重结晶，获得高纯度的姜黄素，结晶后用HPLC检测纯度可达88％以上，重结晶后用HPLC检测纯度可达95％以上，实现了姜黄素的纯度高，提取成本低，二次污染小。

本发明提供的方法解决了传统工业生产过程中姜黄素单体纯度低的难题，可应用于姜黄素的规模化提取制备生产，提高我国农产品的深加工利用水平和农产品的附加值。生产的姜黄素晶体可以应用于具有抗氧化、延缓老年性记忆衰退等保健食品或者具有保护心脑血管等相关药物的开发。

附图说明

图1为本发明提供提纯结晶前姜黄素的HPLC光电二极管阵列检测器(PDA)测定图。

图2为本发明提供结晶后姜黄素的HPLC光电二极管阵列检测器(PDA)测定图。

图3为本发明提供重结晶后姜黄素的HPLC光电二极管阵列检测器(PDA)测定图。

附图标记：

1：姜黄素；2：去甲氧基姜黄素；3：双去甲氧基姜黄素

具体实施方式

下面以具体实施例和附图来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

溶液配制：

70～85％丙酮的配制：准确量取700～850mL丙酮，加蒸馏水定容至1000mL，配置3000mL备用。

乙腈-5％乙酸(1：1)的配制：准确量取500mL乙腈，5％乙酸500mL，混匀，磁性漏斗过滤，密闭保存，备用。

5％醋酸水溶液配制：准确量取50mL醋酸，用双蒸水定容至1000mL，混匀，磁性漏斗过滤，密封保存。配制4000mL备用。

1.姜黄素的粗提取：

准确称取70.00g的姜黄粉末，75％丙酮700mL，超声15min/次，每次间隔20min。提取3次，减压回收丙酮，液液萃取，得到棕褐色油状浸膏，为姜黄素粗提物，称重15.33g。取10mg姜黄素粗提物，溶于加有100μL甲醇的离心管作为样品，用HPLC检测，提取物中姜黄素粗提物的含量为0.72g，提取率为1.03％。

2.精制：

1号萃取剂：石油醚:丙酮:水＝2:2:1(v/v)。

2号萃取剂：乙酸乙酯：水＝1:1(v/v)。

通过用液-液萃取法，按姜黄素粗提物和1号萃取剂的质量体积比为1:60，加入后混匀，静置分层，取下层溶液，进行三次萃取，去除提取物中脂溶性杂质；然后，按姜黄素粗提物和2号萃取剂的质量体积比为1:60，，加入后混匀，静置分层，取上层溶液，进行三次萃取，利用姜黄素在两相中的分配比，去除水溶性杂质，干燥，获得精制姜黄素粉末。萃取前后成分含量检测，损失率为0.75％。

3.结晶

由于粗提取和精制制得姜黄素粉末数量少，不利于结晶和重结晶操作，因此重复上述姜黄素提取和精制步骤来增加精制姜黄素粉末，至精制姜黄素粉末总量为6.11g。

精制姜黄素粉末6.11g加入400mL乙醇，混匀后，充分搅拌，70℃水浴加热，加热过程须不时搅拌，使姜黄粉末充分溶解，得深红色澄清透明溶液。后向所得溶液中缓慢加入70℃热蒸馏水35mL，至出现浑浊。再向溶液中加入10mL乙醇，溶液再次变为深红色澄清透明溶液。将所得溶液从水浴锅中取出，用封口膜封口，置于冰箱4℃冷藏，静置36小时。烧杯壁和烧杯底出现橙黄色针状结晶，倒出上清液，将结晶干燥，得一次结晶物，称重3.68g，回收率60.2％。

制备含量检测样品，由于高浓度姜黄素超出检出限，因此进行逐级稀释，方法为：取10mg一次结晶物溶于100μL的甲醇，取50μL所得溶液中加入50μL甲醇，稀释为二倍溶液，然后再取稀释溶液50μL加入50μL甲醇，制成四倍稀释液，选取四倍稀释液作为样品进行HPLC检测姜黄素含量。

4.重结晶

取结晶粉末1.66g，溶于180mL乙醇，混匀，充分搅拌，70℃水浴加热，加热过程须不时搅拌，使结晶粉末充分溶解，得深红色澄清透明溶液，后向所得溶液中缓慢加入70℃热蒸馏水20mL，至出现浑浊。再向溶液中加入10mL乙醇，溶液再次变为深红色澄清透明溶液。将所得溶液从水浴锅中取出，用封口膜封口，置于冰箱4℃中冷藏，静置48小时。烧杯壁和烧杯底出现橙红色针状结晶，倒出上清液，将结晶干燥，称重得重结晶1.12g，回收率67.4％。

制备含量检测样品，由于高浓度姜黄素超出检出限，因此进行逐级稀释，方法为：取10mg重结晶溶于100μL的甲醇，取50μL所得溶液中加入50μL甲醇，稀释为二倍溶液，后再取稀释溶液50μL加入50μL甲醇，制成四倍稀释液，选取四倍稀释液作为样品进行HPLC检测姜黄素含量。

5.HPLC测定

1)检测波长的选择

对姜黄素于200-600nm进行波长扫描，在420-430nm处有明显的紫外吸收峰，在427nm处有最大吸收峰且分离效果较好，所以选427nm为检测波长。

2)流动相的选择

由于姜黄素的提取成分中含有姜黄素、单脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素，三种成分结构相似，其极性大小顺序为：双脱甲氧基姜黄素>单脱甲氧基姜黄素>姜黄素。为了使三者得到更好的分离，文献^[16]报道用甲醇-乙腈或5％醋酸溶液-乙腈以一定得比例作为流动相，分离效果好。通过条件优化，确定最佳流动相配比为：乙腈-5％醋酸溶液(1：1)。

3)色谱柱

色谱柱选用ODS(C18)柱25cm×4.6mm×5um柱，柱温30℃，流速：1mL/min。

6.测定结果

使用光电二极管阵列检测器(PDA)测定HPLC的结果。

1)结晶前HPLC的测定结果：

图1中三种化合物按照：3：双去甲氧基姜黄素；2：去甲氧基姜黄素；1：姜黄素的顺序出峰。由图1采用峰面积归一法计算得出结晶前，双去甲氧基姜黄素的含量为8％，去甲氧基姜黄素的含量为19％，姜黄素的含量为71％。其中图上姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素的主吸收峰后面的小峰是姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素在不同波长下的吸收光谱图，可以看出在425nm左右为最大的吸收峰。

2)结晶后HPLC的测定结果：

图2中两种化合物按照：2：去甲氧基姜黄素；1：姜黄素的顺序出峰。由图2采用峰面积归一法计算得出经过结晶除去了双去甲氧基姜黄素，去甲氧基姜黄素的含量由结晶前19％减为11％而目标产物姜黄素的含量由结晶前71％提高到88％。其中图上姜黄素、去甲氧基姜黄素的主吸收峰后面的小峰是姜黄素、去甲氧基姜黄素在不同波长下的吸收光谱图，可以看出在425nm左右为最大的吸收峰。

3)重结晶后HPLC的测定结果：

图3中两种化合物按照：2：去甲氧基姜黄素；1：姜黄素的顺序出峰。由图2采用峰面积归一法计算得出经过重结晶，去甲氧基姜黄素含量由结晶的11％减为5％，而目标产物姜黄素含量由结晶的88％提高到95％。其中图上姜黄素、去甲氧基姜黄素的主吸收峰后面的小峰是姜黄素、去甲氧基姜黄素在不同波长下的吸收光谱图，可以看出在425nm左右为最大的吸收峰。

从上面实施例可以看出，本发明提供的一种从姜黄中提取姜黄素的方法，通过丙酮提取，液液萃取，结晶与重结晶，获得高纯度的姜黄素，提取方法简单，反应条件温和，不破坏色素结构，分离时无需消耗大量溶剂，降低了提取成本，也减低了二次污染的可能。

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Claims

1.一种从姜黄中提取姜黄素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的从姜黄中提取姜黄素的方法，其特征在于，步骤1)中所述超声提取的条件为：超声频率40KHz，15min/次，每次间隔20min。

3.如权利要求1所述的从姜黄中提取姜黄素的方法，其特征在于，步骤2)中所述液-液萃取法为：在姜黄素粗提物中先加入1号萃取剂，混匀，静置分层，取下层溶液，丢弃上层溶液，反复萃取三次，去除其中的脂溶性杂质；其中姜黄素粗提物和1号萃取剂的质量体积比为1:20～100，1号萃取剂按体积比组成为：石油醚:丙酮:水＝1～3:1～3:1；然后在姜黄素粗提物中加入2号萃取剂，混匀，静置分层，取上层溶液，丢弃下层溶液，萃取三次，去除其中的水溶性杂质；其中，姜黄素粗提物和2号萃取剂的质量体积比为1:20～100，2号萃取剂的组成为乙酸乙酯和水按0.5～2:1体积比混合而成。

4.如权利要求1所述的从姜黄中提取姜黄素的方法，其特征在于，步骤3)所述使用乙醇-水法对精制姜黄素粉末进行结晶的步骤为：按料液质量体积比1:50～80在精制姜黄素粉末中加入乙醇，混匀后，充分搅拌，70℃水浴加热，加热过程须不时搅拌，使姜黄素粉末充分溶解，得深红色澄清透明溶液；然后向所得溶液中缓慢加入5～20％乙醇体积的70℃热蒸馏水，至出现浑浊；再向溶液中加入1～5％热水体积的乙醇，溶液再次变为深红色澄清透明溶液；将所得溶液从水浴锅中取出，用封口膜封口，置于冰箱4℃冷藏，静置24-72小时，获得橙黄色针状结晶。

5.如权利要求1所述的从姜黄中提取姜黄素的方法，其特征在于，步骤4)所述使用乙醇-水法对姜黄素一次结晶物进行重结晶的步骤为：按料液的质量体积比为1:50～80将姜黄素一次结晶物溶于乙醇，混匀，充分搅拌70℃水浴加热，加热过程须不时搅拌，使姜黄素一次结晶粉末充分溶解，得深红色澄清透明溶液；然后向所得溶液中缓慢加入5～20％乙醇体积的70℃热蒸馏水，至出现浑浊；再向溶液中加入1～5％热水体积的乙醇，溶液再次变为深红色澄清透明溶液；将所得溶液从水浴锅中取出，用封口膜封口，置于冰箱4℃中冷藏，静置36-72小时，获得橙红色针状结晶。