CN105461606A - 高纯度雷迪帕韦中间体的制备方法 - Google Patents

高纯度雷迪帕韦中间体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高纯度雷迪帕韦中间体(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸的制备方法。该方法是以(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸酯为起始原料，通过酶催化水解得到雷迪帕韦中间体的方法。试验证明，本发明方法得到了一种高纯度的雷迪帕韦中间体，为降低生产成本，提高用药安全性，提供了一种可行的途径。同时，本发明的方法具有操作简单、绿色环保、产率高、选择性高、成本低等优点，可实现大规模生产，便于工业推广应用。

Description

高纯度雷迪帕韦中间体的制备方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地涉及一种雷迪帕韦中间体，高纯度(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸的制备方法。
背景技术
2014年，吉拉德公司开发出的复方制剂雷迪帕韦/索非布韦复方(商品名Harvoni)在美国上市，这种药物主要适用于基因Ⅰ型慢性丙肝感染。
其中，(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸是雷迪帕韦(Ledipasvir)的关键中间体。该化合物的CAS登记号291775-59-2，具体结构式如下：
目前，已有专利WO2011/091532A1、WO2012/040923A1和US2013/0287731A1报道了该雷迪帕韦中间体的合成方法，上述专利主要公开了下述两条合成路线：
其是将制备得到的(1R,3S,4S)-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸乙酯或(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸乙酯经LiOH或盐酸水解，最终得到雷迪帕韦中间体(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸。
通常，中间体纯度越高，得到高纯度的终产物越容易，生产成本越低。但是，目前并没有文献报道如何制备得到高纯度的雷迪帕韦中间体。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种高纯度雷迪帕韦中间体(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸(Ⅵ)的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将式(Ⅴ)化合物溶解在含水的溶剂中，加入能水解酯键的酶组成反应溶液，水解，分离纯化得到式(Ⅵ)化合物；
其中，R表示C1～C6的烷基。所述C1～C6的烷基是指具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、辛基等等。
进一步地，R选自甲基或乙基。在本发明一种具体的实施方式中，R选自甲基。
进一步地，作为反应的原料，所述式(V)化合物的非对映异构体过量不低于70％；更进一步地，所述式(V)化合物的非对映异构体过量不低于80％。
进一步地，所述酶选自水解酶。所述“水解酶”指的是在国际酶学委员会(EzymeCommittee，EC)的分类系统下，催化反应类型为水解反应的酶类，即隶属于EC3的酶类。
更进一步地，所述水解酶选自酯水解酶或蛋白酶。所述“酯水解酶”指的是在国际酶学委员会的分类系统下，在水解酶大类下，按照水解键的类型，水解的键为酯键的酶类，即隶属于EC3.1的酶类。所述“蛋白酶”指的是在按照酶作用的底物进行分类的分类系统下，可以催化水解蛋白质的酶类。通常情况下，由于这类酶作用于肽键的专一性和活性较高，在EC分类系统中，隶属于EC3.4的酶类。然而本领域公知的，许多酶具有多种催化活性，也存在能水解酯键的蛋白酶，例如木瓜蛋白酶在该分EC分类系统中的编号是EC3.4.22.2，其也能水解酯键。在本发明具体的实施例中，也有多种蛋白酶体现出了水解酯键的活性。
当水解酶选自酯水解酶时，更进一步地，所述酯水解酶是羧酸酯水解酶。所述“羧酸酯水解酶”指的是在国际酶学委员会的分类系统下，在水解酶大类下，按照水解键的类型，水解的键为酯键，酯键具体为羧酸酯碱的酶类，即隶属于EC3.1.1的酶类。
更进一步地，所述脂肪酶选自猪胰脂肪酶、LipozymeTL100、LipozymeTLIM、LipozymeCALBL、牛胰脂肪酶或诺维信435脂肪酶中的一种或几种。
其中，优选地，所述脂肪酶选自猪胰脂肪酶或诺维信435脂肪酶。
当水解酶选自蛋白酶时，进一步地，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、rTrypsin、木瓜蛋白酶或α-糜蛋白酶中的一种或几种；优选α-糜蛋白酶。
进一步地，所述含水的溶剂选自水或磷酸盐溶液，或选自水或磷酸盐溶液与下述有机溶剂的混合溶液：乙醇、丙酮、四氢呋喃或1,4-二氧六环；所述磷酸盐溶液是pH＝8的磷酸盐缓冲溶液；所述混合溶液中，水或磷酸盐溶液与有机溶剂的体积比为1:1～1.5。
更进一步地，所述溶剂中还含有有机碱，所述有机碱选自三乙胺、二异丙胺、叔丁胺或N-甲基吗啉中的一种或几种。
更进一步地，所述溶剂为仅含有三乙胺的水溶液。更进一步地，所述水与三乙胺的体积比为30:1～100:1。更进一步地，所述水与三乙胺的体积比为40:1～50:1。
进一步地，所述式(V)化合物与溶剂的质量体积比为1:12.5～1：25。更进一步地，所述式(V)化合物与溶剂的质量体积比为1:18～1：20。
进一步地，所述酶与式(V)化合物的质量比为1:50～1：200。更进一步地，所述酶与式(V)化合物的质量比为1:100～1:120。
进一步地，所述反应的温度为25℃～70℃。更进一步地，所述反应的温度为45℃～55℃，优选50℃。
进一步地，所述反应的时间为5h～120h。更进一步地，所述反应的时间为24h～48h，优选24h。
进一步地，所述分离纯化的方法如下：用低极性有机溶剂萃取反应液，取水相，加入低极性有机溶剂，降温至0-10℃，调pH＝1-4，取有机相，浓缩析晶，过滤干燥即得；
所述低极性有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、醋酸异丙酯或甲基异丁酮。在本发明具体的实施例中，调pH＝2，低极性有机溶剂选自二氯甲烷。
进一步地，所述析晶的温度为0℃-50℃。更进一步地，所述析晶的温度为5℃-20℃。
进一步地，所述式(Ⅴ)化合物具有化合物3所示的结构：
所述化合物3是通过下述路线制备得到的：
化合物1在甲醇中经还原、脱苄基得到化合物2，化合物2与二碳酸二叔丁酯反应，得到化合物3。
本发明方法可用于下述路线的雷迪帕韦中间体制备：
在通常的实施方式中，包括以下步骤：
(1)化合物1在甲醇中经还原、脱苄基得到化合物2，化合物2与二碳酸二叔丁酯反应，得到化合物3，非对映体纯度(de)为80-86％。化合物3中含有7-10％的非对映异构体杂质。
(2)按照本发明的酶催化方法，以步骤(1)中得到的化合物3为原料制备得到雷迪帕韦中间体。
发明人在前期研究中发现，按照现有的方法在制备得到(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸的同时，还有少量的非对映异构体杂质生成(7-10％)，该非对映异构体杂质的结构式及其结构表征如下所示：
质谱：MS(M+H+):m/z240.1；1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.51(s,1H),4.17-4.16(d,1H),4.05-4.03(d,1H),2.68(s,1H),1.59-1.47(m,5H),1.42-1.39(m,4H),1.32(s,6H)。而目标产品的(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸氢谱为：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ12.47(s,1H),4.12-4.05(d,1H),3.60(s,1H),2.58(s,1H),1.73-1.38(m,5H),1.31(s,4H),1.25(s,5H),1.23-1.20(t,1H)，两者差异明显。
发明人用常规的结晶方法纯化含有上述非对映异构体杂质的雷迪帕韦中间体，发现很难将该杂质的含量降低至0.5％以下，而且收率也较低。如果该杂质在这个中间体中不能有效控制，该杂质最终会以原料药的非对映异构体的形式传递到原料药中，难以除去，影响了最终产品雷迪帕韦的质量。
可见，现有报道的方法难以稳定得获得高纯度、高品质的雷迪帕韦中间体(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸。
而试验证明，本发明的酶催化方法，选择性地水解了(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸甲酯，而非对映异构体杂质不被水解，得到了高纯度的产品(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸，其de值可达98.6％～99.7％。尤其当采取优选的酶时，de值大于99.0％。收率还可以达到70％以上。
因此，本发明方法得到了一种高纯度的雷迪帕韦中间体，为降低生产成本，提高用药安全性，提供了一种可行的途径。
同时，本发明方法还具有下述优点：所用的溶剂为水，具有绿色环保、廉价易得、反应收率高、没有副产物生成、操作简单、生产过程安全、产能高以及后处理简单等优点，适于推广应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
原料和试剂的来源：
化合物1按照文献Aza-Diels-AlderReactionofMethyl2-[(R)-1-Phenylethyl]imino-ethanoatewithCyclopentadieneUsingPracticalandEnvironmentallyFriendlyBiphasicSolventSystem(OrganicProcessResearch&Development2005,9,105-109)中的制备方法得到。
猪胰脂肪酶、牛胰脂肪酶和α-糜蛋白酶购自阿拉丁。
木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶购自国药集团化学试剂有限公司。
诺维信435、诺维信Alcalase2.4L、LipozymeTL100、LipozymeTLIM、rTrypsin和LipozymeCALBL购自Novozymes。
Boc表示叔丁氧羰基。
合成路线如下：
实施例1
1)(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸的制备：取化合物1(50g)、甲醇(250g)和Pd/C(5％w/w，9.8g)，氮气置换，充氢气至0.8-1.0MPa，于45-55℃反应一段时间(2-4小时)，浓缩，加入100g甲醇、200g水，用碳酸钠调节pH为8，保持温度小于5℃，缓慢滴加二碳酸二叔丁酯(86g)，搅拌反应半小时后。自然升至室温，加入DCM萃取，收集有机相，浓缩得化合物3(28g，yield＝77％，de为80-86％)，重复三次，三个批次的结果如下表所示：
2)制备光学纯(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸：化合物3(10g，39mmol)、水(50mL)、三乙胺(1.2mL)、猪胰脂肪酶(50mg)加入到100mL的三口瓶中，并在55℃反应24小时。
反应方程式为：
分离纯化：用二氯甲烷(50mL)萃取反应液，收集水相，继续向水相中加入等体积的二氯甲烷，降温至0-10℃，加入一定量的6NHCl，调pH至2左右。收集有机相，浓缩至固体析出，冷却至室温，加入石油醚(5mL)析晶，抽滤，干燥，得白色固体6(7.28g)，收率为72.0％，de>99％，非对映异构体杂质含量为0.1％。白色固体经结构表征确认为目标产物，具体数据如下：
质谱：MS(M-H+):m/z240.3。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ12.47(s,1H),4.12-4.05(d,1H),3.60(s,1H),2.58(s,1H),1.73-1.38(m,5H),1.31(s,4H),1.25(s,5H),1.23-1.20(t,1H)。
实施例2
化合物3(10g，39mmol，de为83％)、水(50mL)、三乙胺(6mL)、猪胰脂肪酶(55mg)加入到100mL的三口瓶中，并在55℃反应24小时。反应完成后，用二氯甲烷(50mL)萃取反应液，收集水相，继续向水相中加入等体积的二氯甲烷，降温至0-10℃，加入一定量的6NHCl，调pH至2左右。收集有机相，浓缩至固体析出，冷却至室温，加入石油醚(5mL)析晶，抽滤，干燥，得白色固体6(7.18g)，收率为69.2％，de为99.7％，非对映异构体杂质含量为0.17％。白色固体经结构表征确认为目标产物，具体数据如下：
质谱：MS(M-H+):m/z240.3。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ12.45(s,1H),4.12-4.05(d,1H),3.61(s,1H),2.57(s,1H),1.73-1.38(m,5H),1.31(s,4H),1.25(s,5H),1.23-1.21(t,1H)。
实施例3酶的筛选
化合物3(10g)，水(50mL)、三乙胺(1.2mL)加入到100mL的三口瓶中，加入不同的水解酶，并在50℃反应24小时，反应结果如表1。
表1不同水解酶催化化合物3的水解
结果表明，上述水解酶均能有效得到高de值的产品，de值为98.6％～99.7％。其中，猪胰脂肪酶和诺维信435较佳，产率均大于70％。
实施例4三乙胺用量的筛选
化合物3(10g)，水(50mL)、猪胰脂肪酶(50mg)和一定量的三乙胺加入到100mL的三口瓶中，并在50℃反应24小时，反应结果如表2。
表2三乙胺用量对化合物3水解的影响
结果表明，在上述三乙胺的用量下，本发明方法均能有效得到高de值的产品。其中三乙胺的用量为1.2mL时，产率最佳。
实施例5溶剂的筛选
化合物3(10g)、猪胰脂肪酶(50mg)、三乙胺(1.2mL)和适宜的溶剂(50mL)加入到100mL的三口瓶中，并在50℃反应24小时，反应结果如表3。
表3溶剂对化合物3水解的影响
a溶剂：有机溶剂25mL，水或磷酸盐溶液25mL
b由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠(0.2M，pH＝8.0)组成的缓冲体系；
c溶剂：水50mL，有机碱1.2mL。
结果表明，除了丙酮之外，在上述溶剂下，本发明方法均能有效得到高de值的产品，当溶剂为水时，效果最佳。
实施例6温度的筛选
化合物3(10g)、水(50mL)、猪胰脂肪酶(50mg)和三乙胺(1.2mL)加入到100mL的三口瓶中，并在一定温度下反应24小时，结果如表4。
表4温度对化合物3水解的影响
结果表明，在25℃～70℃下，本发明方法均能有效得到高de值的产品，当温度为50℃时，效果最佳。
实施例7酶量的筛选
化合物3(10g)、水(50mL)、猪胰脂肪酶和三乙胺(1.2mL)加入到100mL的三口瓶中，并在50℃反应，反应结果如表5。
表5酶量对化合物3水解的影响
结果表明，在不同酶类和反应时间的条件下，本发明方法均能有效得到高de值的产品。当酶量为50mg且反应时间24h时，效果最佳。
对比实施例1
将化合物3(10g)、水(50mL)、LiOH(1.67g)和四氢呋喃(50mL)加入到250mL的三口瓶中，并在50℃下反应24小时。
分离纯化：用二氯甲烷洗涤反应液，继续向水相中加入等体积的二氯甲烷，降温至0-10℃，加入一定量的盐酸(6N)，调整pH为2左右。反应完成后，有机相减压浓缩至有少量固体析出，加入石油醚析晶，抽滤，得白色固体6.84g，收率为72.4％，de％＝89.6％。化合物4的质谱和核磁数据如下：
MS(M-H+):m/z240.3。
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ12.47(s,1H),4.12-4.05(d,1H),3.60(s,1H),2.58(s,1H),1.73-1.38(m,5H),1.31(s,4H),1.25(s,5H),1.23-1.20(t,1H)。
对比实施例2
将化合物8(10g)、水(50mL)、LiOH(1.67g)和四氢呋喃(50mL)加入到250mL的三口瓶中，并在50℃下反应24小时。
分离纯化：用二氯甲烷洗涤反应液，继续向水相中加入等体积的二氯甲烷，降温至0-10℃，加入一定量的盐酸(6N)，调整pH为2左右。反应完成后，有机相减压浓缩至有少量固体析出，加入石油醚析晶，抽滤，得白色固体6.58g，收率为73.4％，de＝84.2％。
结合对比实施例1的结果表明，式(V)化合物选择不同的R基团作为原料时，按照现有技术的方法，其均不能在水解时得到高纯度的雷迪帕韦中间体。
对比实施例3
不同杂质含量的(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸，用不同体系进行重结晶，重结晶按照下述的的方法进行：
取含有0.55～5％非对映异构体杂质的(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸，加入到合适的溶剂中加热溶解，并搅拌均匀，降温至室温，析出固体(化合物5)，抽滤，用石油醚洗涤滤饼，过滤，得白色固体，即得重结晶后的(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸产品，检测其中非对映异构杂质的含量，具体的实验及其结果如下表6所示：
表6不同溶剂的重结晶纯化结果
DCE：二氯乙烷，MIBK：4-甲基-2-戊酮，iPrOAc：醋酸异丙酯，MeOH：甲醇，MTBE：甲基叔丁基醚，iPrOH：异丙醇，Heptane：正庚烷。
从表6数据可以看出，不同杂质含量的产品，用不用的体系进行重结晶。当杂质含量在5％时，杂质的含量可以通过结晶，降低至0.5％左右，但是不能实现将杂质降低到0.5％以下；当杂质的含量在0.5％时，重结晶的方法不能再将杂质的含量进一步降低。
综上所述，传统方法制备(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸的选择性较差，也难以通过重结晶的方法得到更高纯度的产品。而本发明通过的酶催化方法，即酶催化(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸酯的水解来制备的(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸，可以得到高纯度的产品，de值可达98.6％～99.7％。
同时，本发明通过对酶进行的筛选发现，当采用猪脂肪酶和诺维信435催化时，在de值高于99％的同时，其反应收率也在70％以上。
可见，本发明方法得到了一种高纯度的雷迪帕韦中间体，为降低生产成本，提高用药安全性，提供了一种可行的途径。同时，本发明的方法具有操作简单、绿色环保、产率高、选择性高、成本低等优点，可实现大规模生产，便于工业推广应用。
本发明不受上述实施例的限制，上述实施例只是说明本发明的原理、过程及可行性，任何与本发明相同或相近的技术方案都落入本发明的保护范围范围内。

Claims (10)

1.高纯度雷迪帕韦中间体(1R,3S,4S)-N-叔丁氧羰基-2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羧酸(Ⅵ)的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
将式(Ⅴ)化合物溶解在含水的溶剂中，加入能水解酯键的酶组成反应溶液，水解，分离纯化得到式(Ⅵ)化合物；
其中，R表示C1～C6的烷基；优选地，R选自甲基或乙基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述式(V)化合物的非对映异构体过量不低于70％，优选不低于80％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述酶选自水解酶；优选地，所述水解酶选自酯水解酶或蛋白酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述酯水解酶是羧酸酯水解酶；优选地，所述羧酸酯水解酶是脂肪酶；所述脂肪酶优选自猪胰脂肪酶、LipozymeTL100、LipozymeTLIM、LipozymeCALBL、牛胰脂肪酶或诺维信435脂肪酶中的一种或几种；最优选地，所述脂肪酶选自猪胰脂肪酶或诺维信435脂肪酶。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛋白酶选自胃蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、rTrypsin、木瓜蛋白酶或α-糜蛋白酶中的一种或几种；优选α-糜蛋白酶。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述含水的溶剂选自水或磷酸盐溶液，或选自水或磷酸盐溶液与下述有机溶剂的混合溶液：乙醇、四氢呋喃或1,4-二氧六环；所述磷酸盐溶液是pH＝8的磷酸盐缓冲溶液；所述混合溶液中，水或磷酸盐溶液与有机溶剂的体积比为1:1-1.5；
优选地，所述溶剂中还含有有机碱，所述有机碱选自三乙胺、二异丙胺、叔丁胺或N-甲基吗啉中的一种或几种。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述溶剂为仅含有三乙胺的水溶液，所述水与三乙胺的体积比为30:1～100:1，优选的体积比为40:1～50:1。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述式(V)化合物的摩尔量与溶剂的体积比为0.78mmol/mL；
所述式(V)化合物的摩尔量与酶的质量比为0.65～7.8mmol/mg；优选地，所述式(V)化合物的摩尔量与酶的质量比0.78mmol/mg；
所述反应的温度为25℃～70℃；优选45℃～55℃，最优选50℃；
所述反应的时间为5h～120h，优选24h～48h，最优选24h。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述分离纯化的方法如下：用低极性有机溶剂萃取反应液，取水相，加入低极性有机溶剂，降温至0-10℃，调pH＝1-4，取有机相，浓缩析晶，过滤干燥即得；所述低极性有机溶剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、醋酸异丙酯或甲基异丁酮；
所述析晶的温度为0℃-50℃，优选的温度为5℃-20℃。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：所述式(Ⅴ)化合物具有化合物3所示的结构：
所述化合物3是通过下述路线制备得到的：
化合物1在甲醇中经还原、脱苄基得到化合物2，化合物2与二碳酸二叔丁酯反应，得到化合物3。
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