CN105451712A - 用于制备与蜂蜡组合的基于花粉的物质的反应平台和方法及其用途 - Google Patents

Abstract

提供了用于生产基于花粉的提取物的两阶段反应平台，所述反应平台包括以下步骤：第一阶段，其包括：使花粉粒打开和/或萌发，使经处理的花粉粒与一种或多种蜂巢组分反应，所述蜂巢组分选自蜂蜡、蜂蜜或含酶物质，以及搅拌以形成胶状物；和第二阶段，其包括：在密闭容器中加热所述胶状物以产生提取物。所述提取物可以是发酵的提取物。水性皮肤乳膏包含基于花粉的提取物和甘油、天然油、润滑剂、防腐剂、维生素、香料、乳化剂或蜡中的一种或多种。皮肤乳膏可被用于处理皮肤状况或炎症。在另一个实施方式中，提供治疗湿疹或牛皮癣的方法，所述方法包括：向需要这种治疗的个体施用治疗有效量的水性皮肤乳膏。

Description

用于制备与蜂蜡组合的基于花粉的物质的反应平台和方法及其用途

发明领域

描述了用于制造基于花粉的产品的方法以及反应平台。描述了适合施用给个体的化妆和营养制剂，其包含与蜂蜡组合的基于花粉的物质，包括多肽、氨基酸、脂肪酸甘油三酯和类黄酮。

背景

自然状态下的蜂巢包含有趣的化学，包括通过某些酶的作用释放有价值的被运输至蜂巢的花粉的生物活性组分。然而，使用蜂巢原料或混合物存在问题，包括组分分离、微生物菌群污染、和/或暴露于用来消灭害虫(例如螨虫)的杀虫剂。因此，需要一种使用协同组合的期望蜂巢组分有效利用(economize)已流水线化的生产的方法。

本发明人(Weir，曾用名O’Brien)已证实：植物具备内部遗传机制以控制凋亡(又名程序性细胞死亡(PCD))的过程和进展。在一个实例中，染色体凝聚(其是哺乳动物细胞中PCD的标志)在植物细胞中在凋亡早期阶段可以是可逆的(O’Brien等人,ThePlantJournal(1998)13(6):803-814)。

花粉具有被称为孢粉素的硬壳，孢粉素非常耐化学降解。此外，花粉表面上有引起已知变态反应的蛋白。在一种方法中，利用反应使花粉粒在压力下“爆炸”或“破裂”，随后使用蛋白酶来使产生变态反应的蛋白水解和失活。

在另一种可行的两步反应中，可操作花粉使起始萌发并因此更温和和天然地释放花粉的生物活性内容物。

因此，如果能够找到一种方法首先打开花粉粒或使花粉粒萌发从而以生物方式释放有益组分，随后加入其它蜂巢组分，那么这将模拟天然过程，从而提供获得营养品或化妆品的新方法。

异位性皮炎(通常被称为湿疹)是复杂的皮肤疾病，其特征为瘙痒、受损的表皮屏障功能、以及对多种食物和环境变应原的免疫球蛋白致敏(Sohn,A.等人,“Eczema,”Mt.SinaiJ.Med.(2011)78:730-739)。皮肤炎症表现得类似红斑，其可包括起鳞(scaling)和痂(Krafchik,B.R.,“Eczema,”Paediatr.ChildHealth(2000)5:101-105)。其通常由于基因与环境的相互作用而发生。有湿疹的患者发展出更高的皮肤感染风险。护肤品(包括保湿乳膏)被用于处理干燥和鳞状的皮肤(Loden,M.等人,“Adouble-blindstudycomparingtheeffectofglycerineandureaondry,eczematousskininatopicpatients,”ActaDerm.Venereol.(2002)82:45-47)。这种乳膏(cream)的效果表明了对尝试所述产品的患者的生活质量有积极影响(Eberlein,B.等人,“Adjuvanttreatmentofatopiceczema:assessmentofanemollientcontainingN-palmitoylethanolamine(ATOPAstudy),”J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol.(2008)22:73-82)。

如果能够找到一种方法来使用基于植物的物质以影响或控制哺乳动物细胞中的免疫或PCD信号通路，这将为营养和医学领域做出有价值的贡献。

此外，如果能够找到一种方法来使用基于植物的物质(包括基于花粉的提取物)以处理炎性或皮肤状况(conditions)，这将为营养、化妆和医学领域做出有价值的贡献。

发明概述

基于花粉的提取物包含萌发的花粉、蜂巢组分、和任选地含酶物质(包括蜜露或植物粉)。

水性皮肤乳膏(aqueousskincream)包含基于花粉的提取物和甘油、天然油、润滑剂、防腐剂、维生素、香料、乳化剂或蜡中的一种或多种。皮肤乳膏可被用于处理皮肤状况或炎症。

提供治疗湿疹或牛皮癣的方法，所述方法包括：向需要这种治疗的个体施用治疗有效量的水性皮肤乳膏。所述皮肤乳膏可局部(topically)施用至皮肤。

提供用于生产基于花粉的提取物物质的两阶段反应平台，所述反应平台包括以下步骤：第一阶段，其包括：使花粉粒打开和/或萌发，使经处理的花粉粒与一种或多种蜂巢组分反应，所述蜂巢组分选自蜂蜡、蜂蜜或含酶物质，以及搅拌以形成胶状物；和第二阶段，其包括：在密闭容器中加热所述胶状物以产生提取物。所述提取物可以是发酵的提取物。应该理解，可通过加入一种或多种组分使提取物进一步可发酵。

附图简介

图1描述了根据本发明的一个实施方式制备的打开和发酵的花粉的脂肪酸分析。

图2描述了根据本发明的一个实施方式制备的打开和发酵的花粉(来自反应的上层和沉降物二者)的脂肪酸分析。

图3A描述了在MTT试验中用具有非常强的细胞保护活性的基于椰子水的提取物(作为未发酵的“水”提取物)处理HL-60细胞。

图3B描述了在MTT试验中用具有非常强的细胞保护活性并促进细胞增殖的基于椰子水的提取物(作为发酵的2阶段“乙醇”提取物)处理HL-60细胞。

图4描述了在MTT试验中用包含具有非常强的细胞保护活性的树番茄粉并促进细胞增殖的基于椰子水的提取物(作为发酵的2阶段“乙醇”提取物)处理HL-60细胞。

图5描述了根据本发明的一个实施方式制备的打开和发酵的花粉的凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。泳道标记如下：DE2-DE9(12.5μl上样)、蛋白标记、和DE2-DE7(2.5μl)上样，如下所述。

图6描述了根据本发明的一个实施方式制备的打开和发酵的花粉的RP-UHPLC和阴离子电喷雾电离(ESI)分析(实施例2A)，其显示了长达72小时的2阶段发酵反应的产物。

图7A显示了：处理之前，具有严重湿疹的人类患者的一只手的照片。

图7B显示了：使用实施例6B的发酵的基于花粉的乳膏局部处理4周后，图7A的湿疹患者的照片。

图8A显示了：处理之前，具有严重湿疹的人类患者的一条胳膊的照片。

图8B显示了：使用实施例6B的发酵的基于花粉的乳膏局部处理4周后，图8A的湿疹患者的照片。

图9A显示了：处理之前，具有牛皮癣病变的人类患者的一条腿的照片。

图9B显示了：使用实施例6D的发酵的基于花粉的乳膏局部处理4周后，图9A的牛皮癣患者的照片。

图10描述的柱状图显示了：接受含有根据本发明的一个实施方式制备的发酵的基于花粉的提取物的皮肤乳膏(实施例6B)的临床处理组(n＝20)的异位性皮炎严重度得分(SCORAD)指数。

图11描述的柱状图显示了：接受含有根据本发明的一个实施方式制备的发酵的基于花粉的提取物的皮肤乳膏(实施例6B)的临床处理组(n＝20)的皮肤病生活质量指数(DLQI)。

详细描述

在下文中，连同阐释本发明原理的附表和附图一起提供了本发明的一个或多个实施方式的详细描述。因而，该详细描述通过示例性方式而非限制性方式阐释了本发明。该描述能够清楚地使本领域技术人员能够实施和使用本发明，并且描述了本发明的若干实施方式、改变、变化、替代方式和用途，包括目前我们认为本发明的最佳实施方式。应当清楚地理解：可对所述发明进行常规的变化和改变，且这种变化和改变明确落入本发明的精神和范围内。

换言之，结合这些实施方式描述本发明，但本发明不限于任何实施方式。本发明的范围仅由权利要求限定且本发明包含多种替代方式、修改和等同。以下描述中给出了多个特定细节以提供对本发明的透彻理解。这些细节被提供用于示例的目的，可根据权利要求且利用或不利用这些特定细节中的一些或全部来实现本发明。

已提供了安全有效的基于花粉的皮肤乳膏，其包含蜂蜡和任选地酶，其可以以治疗有效量被施用至个体用于治疗湿疹或牛皮癣。基于花粉的皮肤乳膏可局部施加在皮肤上。

花粉具有被称为孢粉素的硬壳，孢粉素非常耐化学降解。此外，花粉表面上有引起已知变态反应的蛋白。在一种方法中，利用反应使花粉粒在压力下“爆炸”或“破裂”(常用的非生物方法)，随后使用蛋白酶来使产生变态反应的蛋白水解和失活。任选地，然后可使用肽酶由产生的混合物或汤(soup)中产生肽。

不同于试着使花粉粒爆炸(其的确有部分作用)，尝试操作或处理花粉粒以起始萌发并因此天然地释放它们的内容物，从而优化生物活性并提供定向性强得多的产品。这可以被认为是打开花粉的“生物”方法。如果花粉粒爆炸，则所释放的化合物更响应于压力(这对一些医疗状况有益)，但如果它们通过萌发温和释放，则它们促进细胞更新和修复(如之前所讨论的)。通过利用生物萌发途径，有活力的花粉粒开始萌发而受损或死亡的花粉粒保留并可被滤出。因此，通过除去死亡的花粉粒，这种途径也是一种改善。

在一个实施方式中，已发现两步法可被用于生产基于花粉的提取物物质，所述方法包括利用生物方法使花粉粒打开和/或萌发，和使经处理的花粉粒与一种或多种蜂巢组分(例如，蜂蜡、蜂胶(propolis)等)反应。

发酵方法的开发和花粉粒的打开。

首先，在密封的不锈钢瓶内，在水(500mL)中将少量干花粉(25g)与白糖(5g)和活性酵母(5g)混合。在环境温度下，约72小时后，所产生的这种混合物发酵并产生醇和伴随的醇气味。

利用来自新西兰南部(Nothofagusspp.)山毛榉森林中的山毛榉树的蜜露(分离自新西兰山毛榉蚧壳虫Ultracoelostomaassimile(Maskell))和原蜜(马努卡,忍冬花,三叶草)进行之后的实验。在新西兰内，这种昆虫主要出现在南岛且在黑山毛榉(N.solandrisolandri)和山地山毛榉(N.s.cliffortioides)上最常见，但通常任何山毛榉都能满足(Gaze等人,N.Z.J.Ecol.(1983)6:33-37)。在这些实验中，发酵反应在较高温度(37℃、42℃或65℃)下在约24小时内发生，但在25℃下则耗费48小时。显示出约66％的花粉粒打开。此外，使用蜜露不产生醇气味，但会产生非常金黄色的油质汤。

发酵和花粉粒打开之后进行脂肪酸(FA)含量分析，如图1和2中所示(NZLabs,Auckland,新西兰)。示例性的发酵后沉降物的过滤请参见下文的制备实施例A和B。

FA分析结果清楚显示：在打开的花粉粒中，脂肪酸含量被保持和保护。该实验所证明的关键事情在于：脂肪酸从花粉中释放，但在未爆炸的花粉中，所分析的汤中没有脂肪酸。

反应平台的开发

发现了有效打开花粉粒的方法后，进行了花粉粒内容物和来自蜂巢的其它组分(例如，蜂蜡、蜂胶等)的反应。通过如下所述的一些制备实施例开发了方法。

已发现：包含昆虫酶的蜜露(来自南方山毛榉森林)比原蜜效果好。蜜露是由山毛榉树上的食用汁液的蚧壳虫提炼的物质。这种蜜露是蜂蜜物质，但含有来自蚧壳虫的酶和它们的“肠道菌群，包括嗜果糖(fructophilic)乳酸菌”。这种发现导致以下结论：蜜露包含来自蚧壳虫和来自多种细菌的酶，其当然也在某些所检测的原蜜中。不局限于理论，认为蜜露酶会类似于蜜蜂唾液，因此还有助于方法的第二阶段。

多种有用形式的代表性两步法中所用成分的描述如下。

原花粉：包含脂肪酸、多肽、EPA、DHA、长链烷烃、激素、维生素、植物激素、纤维素、木质素和类黄酮。

原蜂蜡：包含信息素、植酸、几丁质和脂肪酸。

原蜜：包含天然存在的细菌，例如乳酸菌。

蜜露：包含钾、糖、昆虫酶和嗜果糖乳酸菌。

菠萝粉：包含菠萝蛋白酶、同源丝氨酸蛋白酶、和肽酶；包含钾。

包含类黄酮和/或酶的替代性植物粉：树番茄(抗氧化剂和酶)、黑加仑(抗氧化剂/细胞修复/脑功能)、卡瓦椒(kawakawa)(膀胱和消化健康/抗氧化剂/消炎/排毒/痤疮)、蜂胶(痤疮)、松树皮(雌激素调节和遮光剂)、巴西莓、石榴、樱桃(帮助睡眠/褪黑素)、猕猴桃、木瓜和费约果。可如下所述制备冷冻干燥的植物粉。制备期望植物(例如，菠萝、树番茄、卡瓦椒等)的浆。将产生的浆冷冻至-20℃持续48小时，然后冷冻干燥。或者，可从AlaronGMPManufacturers(AlaronProducts,Nelson,新西兰)商购有用的冷冻干燥植物粉。或者，反应中可使用喷雾干燥或甚至新鲜的植物源，例如在取得冷冻干燥粉之前，最初使用菠萝的茎和果实。

其它有用的植物组分可包括但不限于：苹果的果肉或果皮；鳄梨的浆或果皮；山毛榉的树皮或叶子；蓝莓；黑莓；巴西莓浆果、姜；葡萄皮；麻油；芮木泪柏(rimu)的树皮或叶子；姜黄；洋葱；橙子；猕猴桃的果肉、果皮或籽；贝壳松(kauri)的树皮或叶子；新西兰桃花心木(kohekohe)；芒果；麦卢卡(manuka)的油或叶子；诺丽果；橄榄的废弃物、果皮或油；葡萄籽油、摩洛哥坚果油、荷荷巴油和新西兰圣诞树(pohutakawa)。

椰奶(即椰子水)：包含激素和营养物。椰子水/椰奶是通过购买新鲜椰子并且在临使用前引流出新鲜椰奶得到的。商购的椰奶可被使用但不能被巴氏灭菌。

椰子油：包含多肽、脂肪酸、EPA、DHA，和特别地肉豆蔻烷酸。一种有用的品牌是HomeEssentials品牌，100％。

贻贝油：包含多肽、脂肪酸、EPA和DHA。

某些蜂巢组分(例如，蜂蜜、蜜露、花粉、蜂蜡、原蜂胶)来源于ScottApiaries,以以下销售HanmerBees,HanmerSprings,NorthCanterbury,新西兰。可通过在黑暗密封的玻璃容器中处理25g蜂胶/50mL水并在28℃下温和旋转5天来制备用作水提取物的蜂胶。

甘油(即，丙三醇)可购自SigmaAldrich(St.Louis,Missouri)。

水可以是过滤的无菌雨水、蒸馏水、去离子水、RO水等。

制备实施例A(包括菠萝粉)

混合以下成分：原花粉(50g)、原蜂蜡(25g)、菠萝粉(12.5g)、原蜂蜜(12.5g)、甘油(12.5g)和水(1000mL)。混合之后，将不锈钢容器中的反应混合物加热至60℃并搅拌15分钟。此时，无氧地密封钢容器并加压至120psi。将容器贮存在60℃下24小时。在此期间，容器中的压力增强，且混合物变得起泡和放热。反应在16-24小时内自然停止。然后过滤溶液以除去沉降物。将这种反应产物提取物加热、倒入乳膏配方(例如，实施例3)中，并利用打蛋器手动搅打直至平滑(即，具有粘性相等的稠度)。

该反应产生了仍然具有蛋白酶活性、肽和甘油三酯的反应产物溶液。

以这种方式，反应产物被配制为在可商购的水性乳膏中的5重量％(参见，例如，实验水性乳膏制剂，实施例3)。在具有多种皮肤病的受试者上试验这种配制的反应产物。这种反应产物作用于老年斑、结痂性湿疹、牛皮癣、疱疹、软疣体(corpusmolluscum)和痤疮。但是，当用在发炎性湿疹或狼疮上时，反应产物引起刺激。

制备实施例B(包括菠萝粉和树番茄粉)

混合以下成分：原花粉(50g)、原蜂蜡(25g)、菠萝粉(6.25g)、树番茄粉(6.25g)、贻贝油(25g)、蜂蜜(12.5g)、甘油(12.5g)和水(1000mL)。混合之后，将不锈钢容器中的反应混合物加热至60℃并搅拌15分钟。此时，无氧地密封钢容器并加压至120psi。将容器贮存在37℃下24小时。在此期间，容器中的压力增强，且混合物变得起泡和放热。反应在16-24小时内自然停止。然后过滤溶液以除去沉降物。

在这个实验中，降低温度以保护植物粉。该方法产生肽、酯化的脂肪酸和酯化的类黄酮。这种较低的温度还保护来自花粉的维生素和氨基酸免受热变性。还考虑可使用其它油代替贻贝油，包括但不限于贻贝油/椰子油(1:1重量/重量)的组合。

到以上反应产生和/或经受发酵的程度，所产生的基于花粉的物质被认为是可发酵的。

在一个实施方式中，可在密闭的钢容器或其它恰当的压力容器中如所述进行花粉打开发酵反应。在一个替代性实施方式中，可在恰当的塑料或玻璃容器或反应容器中有氧地如所述进行花粉打开发酵反应。

此时的一个问题是：所有其它竞争者和本文所述的方法均涉及裂开花粉粒以释放其中的内容物(非生物方法)。最期望的是生物方法，以生产生物活性状态增强的那些生物活性组分，如同花粉粒开始萌发时一样。此时，内容物在渗透过程中被制备为对于最佳萌发为生物可利用的。

植物细胞萌发过程等同于人类中的胚胎形成，因此对于细胞再生、分裂、伤口修复等是最佳的。

已知椰奶(又名椰子水)包含胚胎形成所需的所有营养物以及刺激细胞分裂和生长的植物激素包括吲哚乙酸、赤霉素和生长素。椰奶还包含通过渗透萌发所需的钾。一个研究发现：椰奶(现在称为椰子水)可被用于使植物细胞变为全能的和由单细胞长成全新的植物。这是利用洋桔梗物种来进行的，以前洋桔梗物种中没有一种能够再生，因为其不受正常激素刺激物的影响(O’Brien等人,PlantCellTissueandOrganCulture(1993)33:31-37)。

与裂开花粉粒不同，本文中展示了生物方法来触发萌发并因此激活它，即产生增强的生物活性。不局限于理论，认为如果花粉粒萌发，则蜜露中和/或来自花粉本身的酶可提供其它组分(例如，乳酸菌或菠萝粉)能够提供的蛋白酶/肽酶酶促反应。

基于钾的渗透性吸收，花粉粒将开始萌发。如果用于反应平台中，则蜂蜜/蜜露和菠萝均包含足够的钾以触发该反应，在较温暖温度下尤其如此。椰奶中的钾也很高，因此钾与植物激素的组合导致触发萌发。

通过使用椰子水，向产品中掺入了椰子水中所含的矿物质和生长激素。这些组分与花粉协同作用，以促进细胞更新和细胞修复，这与压力源破裂或破坏花粉的效果不同。

结合以下实施例可进一步理解上述方法。

实施例1(反应平台)

混合以下成分：原花粉(50g)、椰奶(200ml)和蜜露(12.5g)。将这3种成分加热至30℃并搅拌30分钟以刺激萌发。接下来，加入以下成分：熔化的原蜂蜡(25g)、甘油(12.5g)和水(1000mL)。任选的成分可包括：椰子油、菠萝粉、或其它植物粉(如上文所列)。取决于加入什么组分和最后期望的医学或营养处理，反应在25℃、30℃、37℃、42℃或65℃下进行。反应平台可无氧地或有氧地实施。

实施例2(两阶段反应平台)

以下进行的所有反应均在37℃下无氧温育72小时。任选地，可在37℃下使用蜂蜡，从而导致反应更加无氧(anaerobic)，因为蜂蜡在其它组分上形成固体蜡层。如果该反应持续7天，则蜂蜡被酶消化并变成溶液的一部分(即，自乳化)。

实施例2A(湿疹/牛皮癣)

成分	重量(g)
		花粉	50g
蜂蜡	25g
		椰子油	25g
甘油	12.5g
		蜜露	12.5g
椰子水	200ml

(第1阶段)在25℃下，将花粉浸在椰子水中30分钟。同时在置于沸水中的不锈钢碗中熔化蜂蜡。一旦蜂蜡熔化便将其剧烈搅拌5分钟，并将碗置于65℃保温箱中，从而导致蜂蜡保持为液体。

浸泡60分钟之后，然后将甘油搅拌进花粉混合物中，随后将蜜露搅拌进花粉混合物中。然后在25℃下搅拌该混合物30分钟，这完成了第1部分。接下来，将椰子油搅拌进熔化的蜂蜡中，这完成了第2部分。

然后将花粉混合物(第1部分)搅拌进蜂蜡混合物中(第2部分)并用手剧烈搅拌全部混合物约15分钟直至形成粘稠的胶状物(第1阶段结束)。应注意用手搅拌是费力的，在加热板上磁力搅拌会是有用的。

(第2阶段)然后将这种胶状混合物放入带有螺旋密封型盖的不锈钢容器中并在37℃下温育至少72小时，这产生了分离的2阶段提取物(第2阶段结束)。

在一个优选的实施方式中，植物粉(或其它有用的植物部分)例如树番茄、卡瓦椒等可在胶状物形成之后加入，然后使全部混合物在密闭条件和/或发酵下经受加热。在一个替代性实施方式中，如果需要任何其它组分(例如，菠萝粉、果粉等)，则在胶状物形成之后，当混合物冷却时加入这些组分。也就是说，树番茄、卡瓦椒等可在第2阶段结束之后加入。

在另一个实施方式中，其它组分(例如，菠萝粉、树番茄、卡瓦椒、果粉等)可在第2阶段结束之后加入并加热。

应该理解：第2阶段的发酵过程可进行约24小时至168小时。在一个优选的实施方式中，温育在37℃下进行约24小时至72小时。在一个更优选的实施方式中，温育在37℃下进行约72小时。

在另一个替代性实施方式中，增加第1阶段中椰子水的含量可降低制造成本。

在另一个替代性实施方式中，可使熔化的蜂蜡(或第2部分的组分)维持在较低温度(例如，42℃或37℃)下以保护其它更敏感的组分(例如，氨基酸、肽或脂肪酸)。在这个实施方式中，蜂蜡自乳化入最终的产物混合物中。

实施例2B(老年斑/光化性角化病)

成分	重量(g)
		花粉	50g
蜂蜡	25g
		椰子油	25g
甘油	12.5g
		蜜露	12.5g
椰子水	200ml
		菠萝粉	12.5g

实施例2C(抗微生物剂和创伤愈合)

成分	重量(g)
		花粉	50g
蜂蜡	25g
		椰子油	25g
甘油	12.5g
		蜜露	12.5g
椰子水	200ml
		蜂胶	5ml*

*在反应结束时加入。蜂胶被制备为25g/50ml水。

实施例2D(抗病毒-疱疹、带状疱疹、软疣体、水痘)

成分	重量(g)
		花粉	50g
蜂蜡	25g
		椰子油	25g
甘油	12.5g
		蜜露	12.5g
椰子水	200ml
		卡瓦椒粉	12.5g
蜂胶	5ml*

*在反应结束时加入。蜂胶被制备为25g/50ml水。

在以下的实施例2E、2F和2G中，蜂蜡被省略，所以加入油之后溶液的更为液态(粘性较低)，且完成反应耗费另外24-48小时。

实施例2E(化妆–美容/抗衰老)

成分	重量(g)
		花粉	50g
椰子油	25g
		甘油	12.5g
蜜露	12.5g
		椰子水	180ml
海藻水	20ml*

*使微藻生长至指数期，离心并且在临30℃下的发酵前向反应容器中加入浆体。

任选地，向该实施例中加入12.5g黑加仑粉作为抗氧化剂。

实施例2F(核心配方–任选的树番茄)

成分	重量(g)
		花粉	50g
椰子油	25g
		甘油	12.5g
蜜露	12.5g
		椰子水	200ml
树番茄粉(任选的)	12.5g

实施例2G(化妆–美容/雌激素)

成分	重量(g)
		花粉	50g
椰子油	25g
		甘油	12.5g
蜜露	12.5g
		椰子水	180ml
海藻水	20ml*
		松皮粉(Pine bark powder)a	12.5g

*使微藻生长至指数期、离心并加入浆体。

^a松皮粉通过热水提取松树皮然后冷冻干燥来制备。

化学分析

分析依照本发明的原理制成的反应样品(即，实施例2A或2B)以评估温育期间这些混合物中的化学组分如何变化。利用标准方法，通过液相色谱-高分辨率质谱(LC-HRMS)进行植物化学分析，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)评估蛋白质/肽组合物。

在第2阶段发酵反应中温育0小时(起始材料)至72小时之后，充分混合样品并利用乙醇提取一份(1.0-1.5g)。对于依照实施例2B的温育，在时间0之后向起始材料DE5和DE7(分别含或不含蜂蜡的实施例2A)中加入菠萝粉。使用反相超高效液相色谱(RP-UHPLC)和负离子电喷雾电离(ESI)通过LC-MS分析产生的提取物。

在图5中，所检测样品如下：

DE2：提取物样品2A，不含蜂蜡，72小时

DE3：提取物样品2A，72小时

DE4：提取物样品2B，不含蜂蜡，24小时

DE5：提取物样品2A，0小时(起始材料–第1阶段)

DE6：提取物样品2B，24小时

DE7：提取物样品2A，不含蜂蜡，0小时(起始材料–第1阶段)

DE8：提取物样品2B，不含蜂蜡，72小时

DE9：提取物样品2B，72小时

使用12.5％的还原性SDS-PAGE凝胶。标记为Biorad#161-0373，染色剂类型：AllBlue(Bio-RadLab.,Hercules,California)。

一般而言，图5显示：作为2阶段方法的一部分，分子量较大的蛋白质被降解或消化成分子量较小的蛋白质组分。

样品DE5和DE7是2阶段方法的(第1阶段)起始材料，其显示：样品中大量蛋白质具有高分子量(>250kD)-如此多以至于它们中的许多不进入凝胶。样品DE2和DE3在50-75kD之间显示出显著的条带(其还以较低的量存在于剩余样品中)。在约25kD处的另一条带出现在样品DE4、DE6和DE8中，并以较低的程度出现在DE9中。

样品DE4、DE6和DE8在分子量小于15kD处显示出显著染色。样品DE2、DE3和DE9在该范围内以较低的程度显示蛋白质/肽。

因此，相较于起始材料(DE5和DE7)，温育样品中的蛋白质随时间的大小分布明显较小，无论含或不含菠萝粉酶、或者含或不含蜂蜡。

在图6中，观察第2阶段温育的进程并分析反应产物。所检测样品如下：

DE5：提取物样品2A，0小时(起始材料–第1阶段)，如上所述

DE6’：提取物样品2A，24小时

DE9’：提取物样品2A，48小时

DE11’：提取物样品2A，72小时

第2阶段发酵反应的进程显示了被确定为二咖啡酰基奎宁酸异构物和被认为是二咖啡酰基酒石酸酯或醚化合物的化合物的模式。如图6中所示，72小时之后，观察到形成了酚类化合物二咖啡酰基奎宁酸的多种异构物，其是第2阶段反应的指示物或标记。认为也形成了多种二咖啡酰基酒石酸酯或醚异构物(例如，咖啡酰基部分的四甲基醚)。这些样品显示出含有大量咖啡酰基奎宁酸异构物和被认为的二咖啡酰基酒石酸酯或醚化合物(即，菊苣酸衍生物，包括甲基醚或酯)。

因此，虽然不想被理论束缚，但肽在根据“亲脂化(lipophilization)”或“脂化(lipolyzation)”方法的2阶段方法中产生，其中蛋白质被消化、酚类化合物被异构化或甲基化，且脂肪酸可参与酯化反应以产生有用和有益的新产品。在另一个实施方式中，预期可连同脂肪酸发生类黄酮的羟基化和/或乙酰化。在另一个实施方式中，预期在2阶段发酵反应期间可发生单宁的水解或配基的糖基化。在又一个实施方式中，预期在2阶段发酵反应期间可发生脂肪酸的羟基化。实际上，通过HPLC分析观察到：2阶段反应产物的液体组合物产生了提高的脂质含量。

如下所述生产润滑乳膏。

实施例3(实验水性乳膏制剂)

成分	重量/重量(％)
		鲸蜡硬脂醇	8.1％
白软石蜡	15.0％
		液体石蜡	6.0％
十二烷基硫酸钠	0.9％
		苯氧乙醇	1.0％
纯化水	70.0％

不添加提取物的水性乳膏被用作安慰剂，因此前提是：添加提取物必须比作为目前的非甾族抗湿疹治疗的水性乳膏在临床上显著更好。

相应地，在一些人类志愿者中，使用对羟基苯甲酸酯类显著抑制了提取物的功效。在一些人类志愿者中，苯氧乙醇未完全抑制但仍然降低了提取物的功效，这被假定为是由于杀菌性能。利用对羟基苯甲酸甲酯时发现了类似于对羟基苯甲酸酯类的结果，即提取物的功效显著降低。

接下来，使用Geogard221制备一批水性乳膏，Geogard221作为替代苯氧乙醇和/或对羟基苯甲酸酯类的抑菌防腐剂，其包含8％的去水醋酸和87％的苄醇(可获自Lonza,Allendale,NewJersey)。当在一些人类志愿者中检验时，该制剂提供提取物的全部功效。因此，发现了防腐剂的类型是重要的，可认为是具有更多“天然产物”相似性的添加剂。

实施例4(天然基乳膏制剂)

成分	重量/重量(％)
		鲸蜡硬脂醇	8.1％
Cetomacrogol*	15.0％
		甘油	2.5％
Crodamol(椰子油)	2.0％
		蜂蜡	2.0％
Geogard**	0.5％
		纯化水	70.0％

*Cetomacrogol1000，一种PEG聚合物

**Geogard221

因此，发现了非常稳定且不使用杀菌防腐剂的有用的水性乳膏制剂。这种物质是可被涂在人类皮肤上的漂亮软膏。

向实施例4的基础乳膏中加入基于制剂的总重量量为5重量％的实施例2A的2阶段提取物。基于制剂的总重量，2阶段提取物的可用量可以为约0.5重量％至约10重量％。基于制剂的总重量，2阶段提取物的优选范围可以为约0.5重量％至约5重量％。

此外，向实施例4的基础乳膏中加入精油或香料，其中基于制剂的总重量，柑橘油提取物的加入量为0.4重量％。基于制剂的总重量，一种或多种精油的可用量可以为约0.4重量％至约1重量％。

实施例5(检验包含实施例2A提取物的基础乳膏)

利用人类志愿者，如下所述检验包含5重量％实施例2A提取物和0.4重量％柑橘油提取物的实施例4的基础乳膏(表1)。

表1

如表1中所示，这种制剂清除了志愿者上的湿疹和牛皮癣。受试者1、3、4、5、8、9和10有一周不使用乳膏，然后试用为临床试验准备的实施例6的乳膏(以下)，与实施例4具有等效结果。

实施例6A(皮肤乳膏制剂)

如下所述制备皮肤乳膏制剂。

**Geogard221

Olivem1000可获自B&TSrl(Milan,意大利)，其是用于水包油乳膏和洗剂的来源于橄榄油的非离子、未乙氧基化的自乳化体系。

在如实施例5的人类志愿者中使用实施例6A的初始试验给出了关于湿疹和牛皮癣等的类似结果。

实施例6B(皮肤乳膏制剂)

在另一个实施方式中，制备皮肤乳膏制剂。

¹脂化的脂肪酸和肽，如本文所述的图1、2和5中所示。

最终的制剂是灰白色的粘性乳膏，pH4.0-5.0。微生物学性质：需氧平板计数：(30℃)377cfu/g；酵母和霉菌：<1cfu/g。可用手将乳膏局部施加在人类皮肤表面。

在一个实施方式中，可使用约1重量％至约10重量％的2阶段提取物。在另一个实施方式中，可使用约70重量％至约90重量％的水。增加水含量和/或替代性地增加第1阶段中的椰子水含量(如上所述)可降低制造成本。

如下所述在临床试验中检验实施例6B的乳膏制剂。

实施例6C(临床研究–湿疹)

该研究的目的是确定实施例6B在治疗轻至中度湿疹中的效果，包括减少病变出现、减少瘙痒和起鳞(scaling)的症状、以及减少泛红。

临床研究设计

该研究被设计为开放标签、适应性设计的预备研究。

研究中包括在其他方面均健康的具有轻至中度湿疹的18-70岁的受试者。筛选总共n＝40个受试者，且从中n＝21个被随机化；但仅n＝20个受试者完成了研究。使用其它标准录入/排出标准。监测不良事件。MaGilIRB(Rockville,MD)授予了方案的最初IRB批准。所有招募材料在使用之前均经IRB批准。

对于每个受试者，研究持续时间长达5周，包括5次访视，其中试验期为30天(约4周)。

V1：筛选访视–-7天

V2：第0天–基线

V3：第7天

V4：第15天

V5：第30天–研究结束

受试者被要求经受任何和所有湿疹治疗的7天的洗去。

皮肤病学评估。由有资格的从业者进行皮肤病学检查。这种评估包括异位性皮炎严重度得分(SCORAD)，其是对病变性质的评价和分级。受试者完成了皮肤病生活质量指数(DLQI)，其是对每个受试者自身皮肤状况的自我评估。

照片。为受试者拍照以检查和评价皮肤病变，所述皮肤病变用解剖学位置和尺寸来鉴定。

分配程序。在该次访视时，分配如下：

给予受试者供应一周的研究产品(实施例6B的乳膏)并指示每天涂抹2次。给予受试者每日给药日志。

指示：指示患者每日2次将乳膏局部施加在受影响的区域。也就是说，指示具有湿疹的患者每日2次将乳膏局部施加在给定的病变处。

剂量：基于本文所示的临床试验，每个患者每天使用平均2.46g实施例6B的乳膏。每处病变使用平均1.52g实施例6B的乳膏。

数据分析。使用SocialSciences的统计软件(SPSS版本19)运行所有终点的所有描述性和推演性分析。

首要目标是通过检查皮肤病变照片(图7A-7B和8A-8B)来评估病变出现的减少。第二个目标是通过不同的皮肤病学评估来评估瘙痒、起鳞和泛红症状的减少，如表1A中所示。

表1A

瘙痒、起鳞和泛红的视觉模拟量表(VAS)症状得分。还要求受试者经受对湿疹皮肤病变的瘙痒、起鳞和泛红的皮肤病学评估。分析显示瘙痒、起鳞和泛红的平均VAS症状得分从第1周至第2、3和4周显著降低(对于所有时间点，p-值≤0.05)。

根据表1A，第1周至第4周，瘙痒(VAS)症状得分由基线降低为-30.27％。

根据表1A，第1周至第4周，起鳞(VAS)症状得分由基线降低为-30.53％。

根据表1A，第1周至第4周，泛红(VAS)症状得分由基线降低为-33.95％。

已发现：从基线至第30天，湿疹的严重度具有统计学显著变化(p-值≤0.05)。总体上，中度湿疹被报告为严重度降低且19.44％的病变在第30天时已消失。注意到：大多数中度至重度病变也减少(基于病变计数，和轻度、中度或重度类型的评估)。参见表1A。

还观察到：用局部乳膏处理之后，湿疹皮肤病变的总体平均尺寸(长度×宽度)大幅减小。例如，平均长度减小为-23.8％(从6.3cm到4.8cm)，而平均宽度减小为-22.8％(从3.9cm到3.0cm)。

SCORAD是用于评估湿疹的程度和严重度的临床工具(异位性皮炎评分)。皮肤科医生可在治疗前后利用该工具来判断治疗是否有效。

异位性皮炎严重度得分(SCORAD)指数被用作湿疹的标准化评定量表。这种组合得分指数由异位性皮炎欧洲特别小组(EuropeanTaskForceonAtopicDermatitis)在1993年开发。它已经受真实性和可靠性检验并显示局部甾类化合物和UV-A疗法试验中的灵敏性改变。它使用9法则组合了疾病程度的评估，其中利用疾病强度的6个临床特征(在单个代表性位点评估)，加上瘙痒和睡眠丧失的视觉模拟评分。所述指数已显示出与疾病严重度的整体评估一致并与认为反映异位性皮炎的疾病活动性的多种循环因子一致。

根据表1A，受试者内分析显示：处理组中的受试者的平均SCORAD指数得分从基线到第7天(p-值＝0.049)和第30天(p-值＝0.004)具有统计学显著降低。此外，注意到了从基线到所有时间点的一致降低并在第30天发现了最多的降低(-49.11％)。图10显示了SCORAD结果。

受试者完成了皮肤病生活质量指数(DLQI)，其是对每个受试者自身皮肤状况的自我评估。皮肤病生活质量指数(DLQI)由10个问题组成，问题涉及在过去的一周里患者在皮肤病对与他们的生活质量相关的不同健康方面的影响方面的感知。

根据表1A，受试者的平均皮肤病生活质量指数(DLQI)得分显示出从基线到所有时间点持续降低，其中最多的降低在第30天(-48.03％)。从基线到第30天(p-值≤0.05)观察到了统计学显著变化。图11显示了DLQI结果。

还评估了受试者从第0天至第30天的生命得分(vitalscore)。观察到：受试者的体温、收缩压、舒张压、脉搏率和呼吸率从基线至任何时间点尽管展示出增加或降低的趋势，但无统计学显著变化。另一方面，从基线至第15天观察到了体重显著但较少的增加(p≤0.05)。根据表1A，相较于基线，在第15天，体重增加为+0.81％(约1.2磅)；在第30天之前，体重增加为+0.97％(约1.5磅)。从遭受本文所述各种状况或疾病的患者的营养观点来看，这种结果可是有价值的。

对于该研究，没有报告不良事件或严重的不良事件。

总之，临床研究的结果表明：实施例6B的产品对治疗轻至中度异位性皮炎(又名湿疹)有效，这通过皮肤病变的尺寸以及疾病的其它标志(例如，瘙痒、起鳞和泛红)减少得到证明。

预期局部施用皮肤乳膏将成功治疗与湿疹、牛皮癣有关的症状和相关的炎性病症。乳膏通常以基本上覆盖受影响表面区域的方式被局部施加在皮肤上。乳膏可被配制成化妆品、药物或营养组合物，其分别包括药学上或营养学上可接受的载体。

在人类个体中，皮肤乳膏(实施例6B)的有用治疗剂量范围可以为但不限于约1g至约5g。另一个更窄的合适剂量范围为约1g至约2g，例如，1-2g/病变。对于施用至人类皮肤，另一种有用的治疗剂量为约0.5g/病变至约1.5g/病变。

例如，在人类患者中，皮肤乳膏(实施例6A-6D)可以以日剂量为约1g至约5g被提供。另一个更窄的合适剂量范围为每天约1g至约2g。另一个更窄的合适剂量范围为每天约1g至约3g。

实施例6D(牛皮癣)

通过将2阶段提取物(实施例2B)替换为实施例6C中的提取物2A来制备试验乳膏。

用牛皮癣试验乳膏治疗腿上具有鳞状发作的牛皮癣患者(图9A)。经4周局部施用乳膏(如上文在实施例6C中所示)通过减少结痂和起鳞提供了显见的改善(图9B)。

还考虑：本文所述的2阶段反应平台可被用于生产基于花粉的反应产物与蜂巢组分的组合的经口制剂。这种产品可包括2阶段反应混合物，所述2阶段反应混合物已被冷冻干燥或冻干，然后被恰当配制为经口施用。

实施例7(细胞保护试验)

MTT试验已被调整以测量提取物是否能保护细胞免受凋亡(程序性细胞死亡)，细胞凋亡是通过以下实现的，

1.使用过氧化氢的氧化压力，或者

2.使用依托泊苷(化疗药物)的DNA损伤。

MTT试验传统上被用于测量化合物/提取物的细胞毒性。这是通过凭借活细胞线粒体中MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)朝向甲瓒的还原测量细胞增殖来实现的。如果细胞处于压力状态或者濒临死亡，则它们不能进行该反应，因此OD(光密度)低。如果在提取物的存在下，细胞运作良好，则细胞增殖发生。因此，OD与有活力的(活)细胞的数目直接相关。

在所示的图3A、3B和4中，OD越高，则存在越多活细胞。没有一种提取物显示出细胞毒性，因为条(bar)与仅细胞处理中的高度相同。

传统MTT试验被调整以测量提取物的细胞保护。这提供了提取物是否能保护细胞免受压力的测量。检验HL-60细胞。如图3A中所示例，试验的前提如下：

1.仅细胞–仅使细胞生长48小时；

2.细胞+过氧化氢。使细胞生长24小时，然后加入过氧化氢(助氧化剂)持续另外24小时。过氧化氢对细胞有毒性，因此抑制生长甚至杀灭细胞；

3.细胞+依托泊苷。使细胞生长24小时，然后加入依托泊苷(化疗药物)持续另外24小时。依托泊苷对细胞非常有毒性，其通过损伤DNA和阻止细胞分裂从而阻止细胞增殖来杀灭细胞。因此，依托泊苷导致抑制细胞生长和最终细胞死亡；

4.仅提取物是将细胞与提取物一起温育48小时。如果提取物对细胞有毒性，则OD将比仅细胞处理的OD要低；

5.提取物+过氧化氢。将提取物加入细胞中持续24小时，然后加入过氧化氢。如果提取物能够保护线粒体免受来自过氧化氢的氧化压力(即，自由基)，则细胞将继续生长；和

6.提取物+依托泊苷。将提取物加入细胞中持续24小时，然后加入依托泊苷。如果提取物能够保护DNA免受依托泊苷化疗，则细胞将继续生长。

有效的提取物(例如树番茄、苹果皮和卡瓦椒)可被用于评估生物活性。例如，制备树番茄提取物并如上所述通过在临密封容器之前(第2阶段之前)加入树番茄粉来使其反应，或者不使其反应而是在反应完成之后(在第2阶段之后，或者完全省略第2阶段)加入树番茄粉。通过与其它组分反应，看起来生物活性被增强或者甚至被改变，这是因为反应混合物中的脂质通过充当脂质膜载体，和/或通过酯化类黄酮而协同增强了生物活性。在以下实施例中，“水”样品表示：树番茄提取物或不含树番茄的椰子水提取物(如实施例2F中)在第2阶段不反应或发酵，而“乙醇”样品表示：树番茄提取物或不含树番茄的椰子水提取物(如实施例2F中)在第2阶段反应和发酵。

因此，MTT试验作为标准方法被执行，其中使用不含树番茄的的实施例2F(以1:16稀释)作为“水”提取物，表示在这种情况下，不进行第2阶段发酵。这种提取物显示出强的功效，因为它没有细胞毒性并且保护细胞免受DNA损伤和自由基压力。图3A中显示：基于椰子水的提取物(不含树番茄)作为“水”提取物具有非常强的细胞保护活性，且图3B中显示：基于椰子水的提取物(不含树番茄)作为“乙醇”提取物甚至更有效地促进细胞增殖。

接下来，使用上述树番茄提取物(实施例2F)执行相同的试验流程。树番茄“水”提取物自身已显示出部分减少细胞生长，并具有抵抗过氧化氢和依托泊苷的强细胞保护生物活性。当掺入发酵反应中以提供树番茄“乙醇”提取物时，存在显著的细胞增殖和细胞保护，如图4中所示(即，由“Tam”提供的保护)。因此，树番茄的生物活性通过反应被协同改变。

这个实施例中所检验的本发明提取物显示出强的功效，因为它们没有细胞毒性并且保护细胞免受DNA损伤和自由基压力。注意到了过氧化氢和依托泊苷二者均诱导细胞凋亡。化疗就是这样起作用的-其诱导DNA损伤，然后细胞死亡。这些实验的结果显示：本发明的提取物具有抵抗氧化压力且抵抗DNA损伤化疗的强细胞保护活性。因此，这些结果证明：这些提取物保护免受细胞凋亡诱导。

实施例8(免疫试验)

使用IL-10和TNFα的双标签抗体标记(BioActivesResearchNewZealandLtd.,Auckland,N.Z.)，利用标准方法进行流式细胞术以测量细胞因子的表达。对于该实验，以以下方式处理细胞：

1.仅细胞–仅使细胞生长48小时；

2.(对照)细胞+脂多糖(LPS)。使细胞生长24小时，然后加入LPS(促炎性细菌毒素)持续另外24小时。；

3.仅提取物是将细胞与提取物一起温育48小时；和

4.提取物+LPS。将提取物加入细胞中持续24小时，然后加入LPS。

表2

TNF是促炎性细胞因子。TNF增加指示炎症。LPS(脂多糖)是细菌毒素，其在本试验中被用于诱导炎症(TNF从平均19.9至31.7)。

IL-10是抗炎性细胞因子，其参与减少变态反应例如湿疹。通过增加IL-10，TNF随同其它炎性细胞因子一起减少。LPS还通过触发TNF增加，从而导致减少IL-10的级联反应。如表2中所示，在LPS的存在下，根据本发明制备的椰子和树番茄提取物将TNF表达维持在正常水平，同时增加IL-10以抗击促炎性攻击。

实施例9(痤疮乳膏制剂)

在另一个实施方式中，制备处理痤疮的乳膏制剂。

²不含蜂蜡。

省略了蜂蜡，因为它无益于痤疮的皮肤治疗。

任选地，可加入组合物总重量的最多2.0％的水杨酸。在一个实施方式中，加入0.5重量％的水杨酸。

罗汉松提取物获自本地物种的树皮。

预期局部施加痤疮乳膏将成功处理与痤疮有关的症状和相关的炎性病症。乳膏通常以基本上覆盖受影响表面区域的方式被局部施加在皮肤上。乳膏可被配制成化妆品、药物或营养组合物，它们分别包括药学上或营养学上可接受的载体。

本发明的化妆品(或药用化妆品)、或营养组合物可以与营养学上可接受的载体组合施用。在这种制剂中，活性成分可构成1重量％-99重量％，或者替代性地，0.1重量％-99.9重量％。或者，活性成分可以在约5重量％-约75重量％、或者约10重量％-约75重量％的范围内。“营养学上可接受的载体”表示与制剂的其它成分相容且对使用者无害的任何载体、稀释剂或赋形剂。有用的赋形剂包括微晶纤维素、硬脂酸镁、硬脂酸钙、任何可接受的糖(例如，甘露醇、木糖醇)，对于化妆品用途，油基是优选的。

本发明的局部药物组合物可以与药学上可接受的载体组合施用。在这种制剂中，活性成分可构成1重量％-99重量％，或者替代性地，0.1重量％-99.9重量％。“药学上可接受的载体”表示与制剂的其它成分相容且对使用者无害的任何载体、稀释剂或赋形剂。

根据某些实施方式，本文公开的局部药物组合物可以以油膏、乳膏、洗剂、凝胶或其它经皮递送系统的形式被提供，如L.V.Allen,Jr.等人,Ansel’sPharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems,第9版,第272-293页(Philadelphia,Pennsylvania:LippincottWilliams&Wilkins,2011)中所述，其通过引用被并入本文。

在本文中使用时，油膏指的是包含油膏基的半固体制品，其中所述油膏基质中掺入或熔合(即，与制剂的其它组分熔在一起，然后伴随连续搅拌进行冷却以形成凝结的制品)了一种或多种活性成分。油膏基的形式可以是：油质或烃基(例如，矿脂或矿脂/蜡组合)；吸收基，其允许水性溶液掺入从而导致油包水乳剂(例如，亲水性矿脂)的形成或者其是允许额外量的水性溶液掺入的油包水乳剂(例如，羊毛脂)；水可移除基，其是可用水或水性溶液稀释的水包油乳剂(例如，亲水性油膏，USP)；或者不含油质组分的水溶性基(例如，聚乙二醇(PEG)制剂，其组合了平均分子量低于600的PEG和平均分子量高于1000的PEG)等。

在本文中使用时，乳膏指的是半固体制品，其包含溶解或分散在油包水乳剂或水包油乳剂或另一种类型的水洗型基质中的一种或多种有活性、发酵的基于花粉的物质，或者药剂。一般而言，乳膏通过易于施加/抹开在例如皮肤表面和易于从经处理的表面移除来与油膏区分。

在本文中使用时，洗剂(Lotion)指的是固体材料在水性运载体中的悬浮物。一般而言，洗剂具有不油腻的特征且在大面积皮肤上的扩展性比油膏、乳膏和凝胶强。

在本文中使用时，凝胶指的是半固体体系，其包含小分子和/或大分子在水性运载体中的分散体，通过加入胶凝剂使得分散体成胶状。合适的胶凝剂包括但不限于，合成的大分子(例如，卡波姆聚合物)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和/或羟丙基甲基纤维素)、和天然树胶(例如，黄原胶、卡拉胶等)。凝胶制品的形式可以是单相凝胶，其中活性或药物成分贯穿液体运载体均匀分散而无无可见边界；或者两相凝胶，其中絮凝剂或者活性或药物成分的小独立颗粒分散在液体运载体内部。

经皮制品可以由已与渗透促进剂组合的油膏、乳膏或凝胶形成，且它们被设计为全身性地递送活性或药物成分。渗透促进剂包括，例如，二甲基亚砜、乙醇、丙二醇、甘油、PEG、脲、二甲基乙酰胺、十二烷基硫酸钠、泊洛沙姆、司盘类(Spans)、吐温类(Tweens)、卵磷脂和/或萜烯及其它。

适合用作化妆和/或局部药物组合物的其它半固体形式包括糊剂(含较大部分固体物质的制品，从而使得它们比油膏更硬)和甘油明胶(包含明胶、甘油、水以及活性或药物成分的胶质体(plasticmasses))。

在另一些实施方式中，可以依照SamplePreparationofPharmaceuticalDosageForms,B.Nickerson编(NewYork:Springer,2011)中所述的剂量形式来制备局部和/或化妆组合物，所述文献通过参考并入本文。

此外，还考虑了洗发剂和其它类型的清洁产品。另外，还考虑了局部喷雾剂，包括用于向例如皮肤、背部、颈部、臂、腿和躯干的一种或更多种施加的喷雾剂。

对于经口施用，可以将发酵的基于花粉的提取物或其固体制剂(例如冻干粉)与一种或多种固体无活性成分组合以制备片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒或其它合适的剂量形式。例如，活性剂可以与至少一种赋形剂组合，所述赋形剂例如填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶液缓凝剂、吸收加速剂、润湿剂、吸附剂或滑润剂。其它有用的赋形剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、甘露醇、木糖醇、增甜剂、淀粉、羧甲基纤维素、微晶纤维素、硅石、明胶、二氧化硅等。

给药途径

发酵的基于花粉的提取物可通过任意途径施用，包括但不限于，经口、舌下、经颊、眼、肺部、直肠和肠胃外施用，或者作为经口或鼻用喷雾剂(例如，雾状蒸汽、液滴或固体颗粒吸入)。肠胃外施用包括，例如，静脉内、肌肉内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、膀胱内(例如，至膀胱)、皮内、经皮、局部、局部喷雾或皮下施用。

治疗可在单个不间断的时段中或者在不连续的时段中进行所需的长度。治疗医生知道如何基于患者的反应增加、减少或中断治疗。根据一个实施方式，治疗进行约4周至约5周。根据需要，可重复治疗日程。

此外，认为这种技术和方法可应用于其它反应平台。上述实施例描述了这样的技术平台，其中取决于期望的终产物，可添加不同起始材料。通过改变设置，例如有氧/无氧、温度和压力，获得不同的终产物化合物。由反应平台产生的终产物类似于自然中产生的那些。这些化合物模拟自然界中控制免疫和细胞死亡信号通路的那些，其可被用于治疗一系列免疫和凋亡相关疾病。

在一个替代性实施方式中，技术平台可包含生物反应器，所述生物反应器利用天然存在的化学反应来生产调控哺乳动物细胞信号传导的经修饰的或新的生物活性化合物。这些化学反应可被应用于任何植物、微生物、海生生物(marine)或昆虫衍生的提取物以产生与人类信号通路直接相互作用从而调控免疫和细胞死亡反应的生物活性组分。

虽然本发明前面的说明书中已就某些实施方式作了描述，而且为了阐释还提及许多细节，但对于本技术领域的普通技术人员显而易见的是：本发明还可有额外的实施方式，而且某些本文所述的细节也可以作很大的变化而不会脱离本发明的基本原理。

在描述本发明的上下文中(特别是权利要求书的上下文中)不使用数量词修饰应被解释为同时包括单数和复数，除非在本文中另有说明或上下文明显地否定。本文中数值范围的列举仅意欲作为分别指每个落入所述范围内的单独数值的简略表达方法，除非本文另有说明，每个单独的数值均如其在本文中被单独地引用一样纳入本说明书。本文描述的所有方法可以任意合适的顺序进行，除非本文另有说明或上下文明确地否定。本文提供的任意和所有实施例，或示例性用语(例如，“例如”)的使用仅意欲更好地说明本发明并且不限制本发明原本要求保护的范围。本说明书中的用语不应被解释为指示实施本发明所必需的任何未要求保护的元素。

本文引用的所有参考文献均通过引用全部并入本文。本发明可被具体化为其它特定形式而不脱离其精神或基本属性，因此，应该参考所附的权利要求书而非上述说明书来表明本发明的范围。

Claims (20)

1.一种制造基于花粉的可发酵组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在环境温度下将干花粉粒浸泡在椰子水中以提供经浸泡的花粉；

(b)在环境温度下用甘油和蜜露处理所述经浸泡的花粉以提供萌发的花粉混合物；

(c)在约65℃下熔化蜜蜡并保持为液体的蜜蜡；

(d)用等重量的椰子油处理熔化的蜜蜡以提供蜜蜡混合物；

(e)向所述蜜蜡混合物中加入所述萌发的花粉混合物；

(f)搅拌合并的混合物以形成胶状物；和

(g)在密闭容器中在37℃下温育所述胶状物约72小时以产生发酵的基于花粉的组合物。

2.权利要求1所述的方法，其中所述经浸泡的花粉是萌发的。

3.权利要求1所述的方法，其中所述花粉的重量约是所述蜜蜡的重量的2倍，以及其中所述甘油和蜜露的重量约是所述蜜蜡的重量的一半。

4.权利要求1所述的方法，其中在步骤(g)之前或之后，加入含酶组分。

5.权利要求4所述的方法，其中所述含酶组分选自：菠萝粉、树番茄粉、卡瓦椒粉、猕猴桃粉、蜂蜜、另外的蜜露，及其混合物。

6.权利要求1或4所述的方法，其还包括步骤(h)：加入选自蜂胶、松皮粉或其混合物的物质从而终止发酵。

7.根据权利要求1所述的方法制造的发酵的基于花粉的提取物组合物。

8.权利要求7所述的发酵的基于花粉的提取物，其包含一种或更多种肽和一种或更多种脂肪酸。

9.权利要求8所述的发酵的基于花粉的提取物，其还包含至少一种二咖啡酰基奎宁酸异构物。

10.一种用于治疗或预防个体中的皮肤状况的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供发酵的基于花粉的组合物，所述组合物包含一种或更多种肽、一种或更多种脂肪酸和至少一种二咖啡酰基奎宁酸异构物；

(b)制备皮肤乳膏，所述皮肤乳膏包含约1-10重量％的发酵的基于花粉的组合物；

(c)向需要这种治疗的个体局部施用治疗有效量的所述皮肤乳膏；

其中所述皮肤状况的症状减少。

11.权利要求10所述的方法，其中所述个体是人。

12.权利要求11所述的方法，其中所述皮肤状况选自：湿疹、牛皮癣、皮炎、酒渣鼻、痤疮、光化性角化病(AK)、痣、老年斑、皱纹、创伤、撕裂伤、疤痕、光损伤、疱疹、软疣体和狼疮。

13.权利要求11所述的方法，其中所述皮肤状况是湿疹，以及以每天约0.5g至约3g的量将所述皮肤乳膏施加在一处或更多处皮肤病变上。

14.权利要求13所述的方法，其中所述一处或更多处皮肤病变的数目和/或尺寸减少至少约20％。

15.权利要求13所述的方法，其中所述一处或更多处皮肤病变的数目和/或尺寸减少至少约15％。

16.权利要求13所述的方法，其中湿疹严重度(SCORAD)指数得分减少至少约40％。

17.权利要求13所述的方法，其中平均皮肤病生活质量指数(DLQI)得分减少至少约40％。

18.一种局部皮肤乳膏组合物，所述局部皮肤乳膏组合物包含：

发酵的基于花粉的组合物，其包含基于所述组合物的总重量约1-10重量％量的一种或更多种肽、一种或更多种脂肪酸和至少一种二咖啡酰基奎宁酸异构物；

含橄榄油鲸蜡醇酯和橄榄油山梨醇酯的乳化油，其基于所述组合物的总重量的存在量为约7重量％；

至少一种植物油组分，其基于所述组合物的总重量的存在量为约5-7重量％；

甘油，其基于所述组合物的总重量的存在量为约2-4重量％；和

水，其基于所述组合物的总重量的存在量为约70重量％。

19.权利要求18所述的局部皮肤乳膏，其还包含至少一种选自维生素A、维生素C、维生素E，及其混合物的维生素，所述至少一种维生素基于所述组合物的总重量的存在量为约1-2重量％。

20.权利要求18所述的局部皮肤乳膏，其中所述至少一种植物油组分选自：乳木果油、红花油、澳洲坚果油、榛果油、黑加仑油、猕猴桃籽油、葡萄籽油、摩洛哥坚果油、荷荷巴油，及其混合物。