이하 본 발명을 실시예에서 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위가 다음의 실시예로 한정되지 아니함을 밝혀 둔다.
[실시예 1]
송화가루 추출물의 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항균력 평가
송화가루 추출물의 항균력 실험은, 액체 배지에서 배양시킨 여드름 균에 일정한 농도의 상기 추출물을 가하여 혐기성 배양조에서 배양한 후, 여드름균 (Propionibacterium acnes ATCC 6919)의 발육을 억제하는 최소억제농도(MIC)를 측정함으로써 수행되었다. 실험과정은 아래와 같다.
1. 배양 방법
미국 ATCC 로부터 구입한 대표적 여드름 균이고 Type Strain인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) ATCC 6919균을 Reinforced Clostridial Media에서 3일간 배양하여(37℃) 활력이 좋아질 때까지 계속 계대 배양한다. 배양 방법은 다음과 같다.
a) 액체배양: Reinforced Clostridial Media를 Screw Cap Tube에 10㎖을 넣고 멸균함(121℃, 20분). 멸균이 끝나면 바로 별개로 멸균한 Liquid Paraffin 0.5㎖을 액체배지 위에 떨어뜨려 산소와의 접촉을 막는다. 배지가 식으면 균을 접종하여 37℃에서 배양하며 통상 72시간 배양을 한다.
b) 고체배양: 균주보관용 고체배지는 Reinforced Clostridial Media에 Agar 1.0%를 추가하여 배지를 제조하고 Screw Cap Tube에 10㎖을 넣고 멸균한다(121℃, 20분). 배지가 식으면 백금 Loop로 균을 접종하여 Stab Culture한다.(37℃, 72시간)
c) Plate배양: Plate배양 배지는 고체배양 배지와 같으며 Plate에 멸균한 Agar배지를 부은 후 식힌다. 완전히 식어 굳어지면 접종을 하여 Anaerobic Jar에 넣고 Gas-Pak에 10㎖의 물을 넣은 후 뚜껑을 닫아 37℃ 온도에서 72시간 배양한다.
2. 송화가루 추출물의 제조방법
a) 송화가루 100g을 추출기에 넣고 50% 에탄올 2리터를 부어 잘 섞은 후 60℃에서 3일간 추출한다.
b) 추출이 끝나면 추출물을 Wattman Filter Paper No.2 여과지로 여과 후 나온 여과액을 취하고 여과에서 걸린 찌꺼기는 버린다.
c) 여과액을 농축 Flask에 넣고 진공 농축을 하여 에탄올을 전부 제거하고 잔존한 물 역시 농축하여 대부분 제거한다.
d) 농축된 송화가루 추출물액을 -80℃의 Deep Freezer에서 얼린 후 Freeze-Drying하여 가루로 만든다. (20g의 송화가루 추출물 획득)
3. 송화가루 추출물의 프로피오니박테리움 아크네스 ATCC 6919 균에 대한 억제 실험
a) 충분히 계대 배양을 한 프로피오니박테리움 아크네스 ATCC 6919균의 배양액 1㎖을 취하여 Reinforced Clostridial Media 9㎖씩 넣은 배지에 접종하여 잘 섞는다.(10배 희석됨)
b) 상기와 같은 방법으로 계속 희석하여 10-1∼10-5배까지의 희석배양액을 만든다.
c) Freeze-Drying하여 만든 송화가루 추출물 10g을 10㎖의 50% 에탄올에 잘 녹인 후 2배씩 희석하여 각 농도별 송화가루 추출물 용액을 만든다. 이 용액을 0.2㎛의 Membrane Filter를 이용하여 제균여과 한다.
d) Reinforced Clostridial Agar Media를 멸균한 후 50℃로 식히고 상기 c)의 제균여과한 추출물을 최종 농도가 10㎎/㎖~0.1㎎/㎖로 되도록 각각 첨가하여 골고루 잘 섞는다.
e) 상기 b)의 희석배양액 1㎖씩을 각각 취하여 Petri Dish에 분주하고 각 농도별 Agar Media를 분주하여 골고루 잘 섞이도록 흔든 후 정치하여 Agar배지를 경화한다.
f) 배지가 경화하면 Anaerobic Jar에 넣고 Gas-Pak을 장치한 후 37℃에서 3일간 배양 후 나타난 Colony수를 측정하여 대조구와 비교, 억제율을 계산한다. 콜로니수 및 억제율의 결과는 하기 표 2 에서 보여진다.
여드름 균에 대한 살균력 평가 결과, 본 발명의 송화가루 추출물은 하기의 표 1 에서와 같이, 0.06%의 아주 낮은 농도에서 살균력이 나타나기 시작하여 0.1% 이상에서 여드름 균을 완전 살균하는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 송화가루 추출물은 여드름균에 대한 매우 탁월한 항균효과를 갖고 있음을 알 수 있었다.
프로피오니박테리움 아크네스 ATCC 6919 에 대한 최소억제농도(MIC) 측정결과
추출물 농도(%) |
여드름 균의 성장 여부 |
1.0 |
- |
0.5 |
- |
0.25 |
- |
0.125 |
- |
0.063 |
± |
0.031 |
+ |
0.016 |
+ |
프로피오니박테리움 아크네스 ATCC 6919 에 대한 항균효과 실험 결과
추출물 농도 |
대조구 |
10㎎/㎖ |
5㎎/㎖ |
2.5㎎/㎖ |
1.25㎎/㎖ |
0.63㎎/㎖ |
0.32㎎/㎖ |
0.16㎎/㎖ |
0.08㎎/㎖ |
CFU(마리/㎖) |
417 |
- |
- |
- |
- |
2 |
50 |
123 |
265 |
억제율 (%) |
- |
100 |
100 |
100 |
100 |
99.52 |
88.01 |
70.50 |
36.45 |
[실시 예 2]
송화가루 추출물의 면포 감소효과
면포 감소실험을 위한 실험동물은 뉴질랜드산 흰토끼를 사용하였으며 4개월령 전후의 2~3㎏의 건강한 수컷을 입수 후 1주일의 순화 과정을 거쳐 육안으로 보아 건강한 동물만 사용하였다. 면포실험용 실험물질은 송화가루 추출물의 엑기스를 에탄올에 용해시켜 1% 용액이 되도록 사용하였다. 실험방법은 다음과 같다.
30마리의 토끼에 면포 유발물질인 이소프로필 이리스테이트(IPM)를 토끼의 양쪽 귀에 매일 1회 1㎖씩 7일간 도포하여 면포를 유발시켰으며 전형적인 면포가 형성된 25마리를 골라 각 군당 5마리씩 5군으로 분류하여 실험하였다.
면포 감소효과 실험은 면포가 유발된 오른쪽 귀에 상기 제조방법으로 만든 송화가루 추출물의 실험물질을 매일 1회 1㎖씩을 투여한 다음 면봉으로 고르게 도포 하였으며 왼쪽 귀에는 기제로 사용한 에탄올을 1㎖씩을 투여한 다음 면봉으로 10회 정도 고르게 도포 하여 오른쪽 귀와 비교하였다.
면포 치유기간은 2주간 진행하였으며 실험물질을 투여하면서 면포의 병변 진행정도와 면포 감소효과를 평가하였으며 실험이 끝난 후 각 실험군을 안락사 시켜양쪽 귀를 잘라 낸 후 기저부의 조직을 약 2.5cm x 1.5cm로 잘라 50℃ 의 물에 2분간 담갔다가 꺼내 표피를 박리한 후 슬라이드 글라스에 안쪽 면이 위로 오도록 얹어 건조시킨 후 입체현미경으로 관찰하고 화상분석기로 조직의 면포 수와 면적을 계산하였다. 그 결과 치료군의 면포 면적이 현저히 감소된 것을 알 수 있었다.
송화가루 추출물 적용 2주 후의 면포 감소율
|
실 험 군 |
1군 |
2군 |
3군 |
4군 |
5군 |
A: 왼쪽귀의면포면적/수(㎠) |
0.28+0.01 |
0.30+0.01 |
0.32+0.02 |
0.31+0.02 |
0.29+0.01 |
B: 오른쪽귀의면포면적/수(㎠) |
0.07+0.01 |
0.08+0.01 |
0.10+0.02 |
0.09+0.02 |
0.07+0.01 |
면포 감소율(%) |
75 |
73.3 |
68.8 |
71 |
75.9 |
* 면포 감소율 = (A - B)/A × 100
[실시 예 3]
송화가루 추출물을 함유한 팩 제제의 여드름 균에 대한 항균력
상기에 전술한 송화가루 추출물을 팩 제제에 적용하였을 경우의 여드름 균에 대한 항균효과를 검증하기 위하여 팩 제제를 만들어 여드름 균에 대한 항균효과를 측정하였다. 송화가루 추출물을 함유한 팩 제제는 통상적인 팩 제조방법에 의해서 제조하였으며 그 조성은 다음과 같다.
송화가루 추출물을 함유한 팩 제제의 조성(중량%)
성분 |
함량(중량%) |
대조구 |
제1시험군 |
제2시험군 |
제3시험군 |
제4시험군 |
제5시험군 |
카올린 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
15.0 |
글리세린 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
에탄올 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
5.0 |
벤토나이트 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
4.0 |
글리세릴모노스테이트아레이트 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
세토스테아릴 알콜 |
3.0 |
3.0 |
3. |
3.0 |
3.0 |
3.0 |
폴리옥시에틸렌모노스테아린산 에스테르 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
산화티탄 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
2.0 |
송화가루 추출물 |
- |
1.0 |
5.0 |
10.0 |
15.0 |
20.0 |
정제수 |
61.0 |
60.0 |
56.0 |
51.0 |
46.0 |
41.0 |
상기와 같이 제조된 팩 제제의 프로피오니박테리움 아크네스 ATCC 6919에 대한 항균효과를 측정하기 위하여 충분히 활성화 된 여드름 균의 배양액을 10, 100, 1000배까지 희석한 각각의 100㎕를 적당한 배지가 함유된 페트리디쉬에 접종한 후 고르게 도포하고 혐기성 배양액에서 3일간 배양하여 자란 콜로니(colony)를 측정하였다(A). 동시에 상기 표 4 의 각 실험군 5% 수용액 100㎕ 를 여드름 균의 배양액의 희석액과 함께 페트리디쉬에 접종하고 고르게 도포하여 혐기성 배양조에서 3일간 배양하여 자란 콜로니를 측정하여(B) 항균효과를 측정하였다. 살균율이 90% 이상일 때 효과가 있는 것으로 판정하였다. 살균율의 측정은 다음과 같은 식에 의거하여 측정하였고 팩 제제의 항균효과는 표 5 에 나타내었다.
송화가루 추출물을 함유한 팩 제제의 여드름 균에 대한 항균효과
콜로니colony |
실 험 군 |
대조군 |
제1시험군 |
제2시험군 |
제3시험군 |
제4시험군 |
제5시험군 |
A(cfu/㎖) |
1533 |
1416 |
1629 |
1473 |
596 |
1509 |
B(cfu/㎖) |
1050 |
252 |
69 |
12 |
11 |
6 |
살균율(%) |
31.5 |
82.2 |
95.8 |
99.2 |
99.3 |
99.6 |
* 살균율(%) = [(A-B)/A] × 100
송화가루 추출물이 함유된 팩 제제의 여드름 균에 대한 항균효과는 상기 표에서 보듯이 대조군보다 월등했으며 송화가루 추출물이 5% 이상 함유되었을 때 95% 이상의 항균효과를 나타내었고 10% 이상에서는 살균율이 모두 99% 이상을 나타내어 추출물의 농도가 증가되어도 항균효과에는 큰 차이가 없었다.
[실시 예 4]
송화가루 추출물을 함유한 여드름 예방 및 치료용 팩 제제의 면포 감소 효과
송화가루 추출물을 함유한 여드름 예방 및 치료용 팩 제제의 면포 감소효과를 평가하기 위하여 실시예 3 에서 제조한 임상실험용 팩 제제를 사용하였고 면포감소실험을 위한 실험동물은 뉴질랜드산 흰토끼를 사용하였으며 4개월령 전후의 2~3kg의 건강한 수컷을 입수 후 1주일의 순화 과정을 거쳐 육안으로 보아 건강한 동물만 사용하였다. 실험방법은 다음과 같다.
30마리의 토끼에 면포 유발물질인 이소프로필 이리스테이트(IPM)를 토끼의 양쪽귀에 매일 1회 1㎖씩 7일간 도포하여 면포를 유발시켰으며 전형적인 면포가 형성된 25마리를 골라 각 군당 5마리씩 5군으로 분류하여 실험하였다.
면포 감소효과 실험은 면포가 유발된 오른쪽 귀에 상기 제조방법으로 만든 송화가루 추출물이 함유된 각각의 팩 제제를 매일 1회 2g을 투여한 다음 면봉으로 고르게 도포하였다. 왼쪽 귀에는 대조군인 송화가루 추출물이 함유되지 않은 팩 제제를 매일 1회 2g씩 투여한 다음 면봉으로 10회 정도 고르게 도포하여 오른쪽 귀와 비교하였다.
면포 치유기간은 2주간 진행하였으며 팩 제제는 도포 후 충분히 씻어 내거나 떼어내는 방법으로 진행하였다. 팩 제제를 투여하면서 면포의 병변 진행정도와 면포 감소효과를 평가하였으며 실험이 끝난 후 각 실험군을 안락사 시킨 후 실시예 2 에서와 같은 방법으로 면포 감소효과를 측정하였다.
그 결과 치료군의 면포 면적이 현저히 감소된 것을 알 수 있었다. 송화가루 추출물이 함유된 팩 제제의 면포 감소효과는 표 6 에 나타내었다.
송화가루 추출물이 함유된 팩 제제의 면포 감소효과
측 정 군 |
실 험 군 |
1군 |
2군 |
3군 |
4군 |
5군 |
A: 대조군(왼쪽귀)의면포면적/수(㎠) |
0.31+0.01 |
0.30+0.01 |
0.29+0.02 |
0.32+0.02 |
0.30+0.01 |
B: 치료군(오른쪽귀)의 면포면적/수(㎠) |
0.11+0.01 |
0.07+0.01 |
0.05+0.02 |
0.05+0.02 |
0.04+0.01 |
면포 감소율(%) |
64.5 |
76.7 |
82.8 |
84.4 |
86.7 |
* 면포 감소율 = (A - B)/A × 100
[실시예 5]
송화가루 추출물을 함유한 팩 제제의 임상실험
실시예 3 에서 제조한 팩 제제를 사용하여 여드름 예방 및 치료에 대한 임상 실험을 실시하였으며 실험대상자는 여드름으로 고생하는 표 7 에서의 3등급 내지 9등급에 해당하는 10대 중반에서 30대 중반의 남녀 각각 30명씩을 선정하여 10명씩 실험군 팩 하나를 선택하여 1일 1회씩 한 달간 사용하도록 한 후 그 결과를 평가하였다. 임상 실험 결과는 다음 표 8 에서 보여진다.
육안관찰에 의한 피부등급 기준
등 급 |
피 부 상 태 |
0 |
정상 |
1 |
면포의 수나 크기가 매우 작거나 염증이 진행되지 않은 상태 |
2 |
면포의 수나 크기가 중간 정도로 염증이 진행되지 않은 상태 |
3 |
작은 염증성 구진이 부분적으로 존재하는 상태 |
4 |
작은 염증성 구진이 광범위하게 존재하는 상태 |
5 |
커다란 염증성 구진이 광범위하게 존재하는 상태 |
6 |
구진 내부에 고름이 잡힌 농포가 부분적으로 발생한 상태 |
7 |
많은 수의 농포가 존재하는 상태 |
8 |
심한 결절성 낭종이 부분적으로 존재하는 상태 |
9 |
심한 낭종이 얼굴 전체에 존재하는 상태 |
송화가루 추출물을 함유한 팩 제제의 임상실험 결과(명)
효 과 |
실 험 군 |
대조구 |
제1시험군 |
제2시험군 |
제3시험군 |
제4시험군 |
제5시험군 |
우 수 |
0 |
0 |
6 |
9 |
9 |
10 |
양 호 |
1 |
4 |
3 |
0 |
1 |
0 |
무변화 |
7 |
6 |
1 |
1 |
0 |
0 |
악 화 |
2 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
부작용 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
계 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
상기의 표 8 에서 보듯이 송화가루 추출물을 함유한 팩 제제(실험군 1~5)의 여드름 치료효과는 대조구에 비해 월등한 것으로 나타났다. 송화가루 추출물이 1% 함유된 팩 제제(제1시험군)의 경우 대조구보다 약간의 효과가 더 있었으며 5% 이상 함유된 팩 제제(제2~5시험군)는 매우 우수한 치료효과를 보였고 부작용도 전혀 발견되지 않았다. 상기 임상실험 결과는 육안 관찰에 의한 것이다.
[실시예 6]
송화가루 추출물을 함유한 피부외용제의 제조
송화가루 추출물을 함유한 비누, 크림, 화장수, 로숀, 화운데이션 제제의 임상실험을 위하여, 통상의 제조방법에 따라 하기와 같은 조성비로 피부외용제를 만들었다.
송화가루 추출물을 함유한 비누 제제의 조성
성 분 |
함량(중량%) |
비누베이스 |
93.77 |
향료 |
1.2 |
색소 |
0.01 |
항산화제 |
0.02 |
송화가루 추출물 |
5.0 |
송화가루 추출물을 함유한 크림 제제의 조성
성 분 |
함량(중량%) |
마카데미아오일 |
2.0 |
스쿠알란 |
3.0 |
스테아린산 |
7.0 |
바셀린 |
3.0 |
1,3-부틸렌글리콜 |
7.0 |
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌소르비탄 |
1.3 |
자기유화형 모노스테아린산 글리세린 |
2.7 |
에틸렌디아민테트라아세트산 나트륨 |
0.05 |
글리세린 |
4.0 |
향료 |
0.25 |
방부제 |
적량 |
산화방지제 |
적량 |
송화가루 추출물 |
10.0 |
정제수 |
잔부 |
송화가루 추출물을 함유한 화장수 제제의 조성
성 분 |
함량(중량%) |
구연산 |
0.1 |
살리실산 |
0.5 |
1,3-부틸렌글리콜 |
5.0 |
폴리옥시에틸렌오레일에테르 |
0.8 |
에탄올 |
30.0 |
향료 |
0.15 |
방부제 |
적량 |
송화가루 추출물 |
2.0 |
정제수 |
잔부 |
송화가루 추출물을 함유한 로숀 제제의 조성
성 분 |
함량(중량%) |
스테아린산 |
0.5 |
에탄올 |
10.0 |
바셀린 |
1.0 |
스쿠알란 |
2.5 |
유동파라핀 |
6.0 |
모노올레인산 폴리옥시에틸렌소르비탄 |
1.5 |
1,3-부틸렌글리콜 |
8.0 |
에틸렌디아민테트라아세트산 나트륨 |
0.05 |
트리에탄올아민 |
0.8 |
향료 |
0.2 |
방부제 |
적량 |
산화방지제 |
적량 |
송화가루 추출물 |
4.0 |
정제수 |
잔부 |
송화가루 추출물을 함유한 화운데이션 제제의 조성
성 분 |
함량(중량%) |
스테아린산 |
2.0 |
1,3-부틸렌글리콜 |
2.0 |
세틸스텔아릴알콜 |
0.5 |
액상 라놀린 |
1.5 |
유동 파라핀 |
3.5 |
미리스틴산 이소프로필 |
4.5 |
카르복시에틸셀룰로오스 나트륨 |
0.3 |
벤토나이트 |
1.0 |
글리세린 |
1.0 |
이산화티탄 |
5.0 |
탈크 |
6.0 |
착색안료 |
적량 |
향료 |
0.15 |
방부제 |
적량 |
산화방지제 |
적량 |
송화가루 추출물 |
2.0 |
정제수 |
잔부 |
상기의 조성비로 만든 각각의 제제들을 사용하여 여드름 예방 및 치료에 대한 임상실험을 실시하였으며, 실험대상자는 표 7 에서의 3등급 내지 9등급에 해당하는 남녀 각 5명을 선정하였다(화운데이션 제제는 여성만 사용함). 비누, 크림,로션, 화장수는 동시에 1일 2회씩 한 달간, 화운데이션은 1일 1회씩 한 달간 사용하여 그 결과를 평가하였다.
평가방법은 실험 시작 전후에 표 7 과 같은 판정기준으로 육안관찰에 의해 등급을 매긴 후 3등급 이상의 상태 호전이 나타나면 우수, 1~2등급의 호전은 양호 등으로 판정하였으며 그 결과는 다음 표 14 에서 보여진다.
효 과 |
우수 |
양호 |
무변화 |
악화 |
부작용 |
계 |
7 |
2 |
1 |
0 |
0 |
10 |
[실시예 7]
송화가루 자체의 여드름 예방 및 치료효과에 대한 임상실험
송화가루 자체의 여드름 예방 및 치료효과에 대한 임상실험을 위하여 송화가루와 바셀린을 1:2로 혼합하여 크림성상의 제제를 만들었다. 실험대상자는 표 7 에서의 3등급 내지 9등급에 해당하는 남녀 각 5명을 선정하여 1일 1회씩 한 달간 사용하여 그 결과를 평가하였다.
송화가루 고유의 색상과 제제의 성상 때문에 외출 시에는 사용할 수가 없어서 밤에만 사용하였다. 평가방법은 실험 시작 전후에 표 7 과 같은 판정기준으로 육안관찰에 의해 등급을 매긴 후 3등급 이상의 상태 호전이 나타나면 우수, 1~2등급의 호전은 양호 등으로 판정하였으며 그 결과는 다음 표 15 에서 보여진다.
효 과 |
우수 |
양호 |
무변화 |
악화 |
부작용 |
계 |
4 |
4 |
2 |
0 |
0 |
10 |
제품의 성상에 따라 송화가루 자체를 적용할 수도 있으나, 송화가루 자체 보다는 그 추출물을 적용하는 것이 사용감과 여드름에 대한 효능 면에 있어서 월등한 것으로 나타났다.