CN105385788A - 一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法 - Google Patents

一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105385788A
CN105385788A CN201510910818.1A CN201510910818A CN105385788A CN 105385788 A CN105385788 A CN 105385788A CN 201510910818 A CN201510910818 A CN 201510910818A CN 105385788 A CN105385788 A CN 105385788A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
buffered soln
dhplc
weev
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510910818.1A
Other languages
English (en)
Inventor
郑小龙
邓明俊
孙涛
岳志芹
王群
朱来华
孙明君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Original Assignee
Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau filed Critical Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority to CN201510910818.1A priority Critical patent/CN105385788A/zh
Publication of CN105385788A publication Critical patent/CN105385788A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物和方法，包括下列步骤：（1）样品中病毒RNA的提取及特异性片段的扩增；（2）PCR-DHPLC分析。本发明建立的WEEV的PCR-DHPLC方法在检测其他马病病毒时相互之间无交叉反应，未检测到其他马病病毒的阳性吸收峰；对WEEV不同模板浓度进行检测，检测极限可达到102拷贝/μL。所建立的方法结果与荧光RT-PCR的符合率达100%。

Description

一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物。
背景技术
西方马脑炎病毒（Wasternequineencephalitisvirus,WEEV）属于披膜病毒科甲病毒属，是引起西方马脑炎的病原体。该病毒可经呼吸道传播感染，但主要通过蚊虫传播。西方马脑炎可引起人和马发病，病马常呈亚临床症状，死亡率低于30%；WEEV对人的致死率明显低于东方马脑炎病毒。该病在北美西部呈地方性流行，主要分布于加拿大、美国西部和中部，南美一些国家也有本病发生，如巴西、阿根廷、智利、秘鲁和乌拉圭等国家。西方马脑炎在我国也有报道，1990年何海怀等从新疆乌苏县采集的按蚊和博乐县采集的全沟硬蜱中分离出WEEV。吕新军在对我国人体血清调查中发现，WEEV抗体的阳性率为2.71%，但在马属动物中的流行情况未见相关报道。随着我国马术运动的发展，国际马术比赛的日益频繁，我国进出境马匹的数量也在不断增加。为保障我国养马业的健康发展，保证国际赛事的顺利进行，建立快速、敏感、特异的WEEV检测方法十分必要。本试验针对WEEVE1基因，筛选高度保守的片段，设计引物构建了阳性质控品，并建立了WEEVPCR-DHPLC检测方法，并对其敏感性和特异性进行了分析。
目前，检测WEEV常用方法有病毒分离、血凝试验、血凝抑制试验、荧光RT-PCR等。传统的病原分离及血清学诊断方法操作繁琐，且对试验条件的要求较高，RT-PCR方法虽然能对该病毒进行检测，但仅依赖普通凝胶电泳还达不到高通量集成化诊断的层次。荧光RT-PCR和基因芯片等技术检测成本又相对较高。因而需要研究一种相对廉价，并能够对WEEV进行高通量快速排查、准确鉴别的集成化诊断技术。变性高效液相色谱(Denaturinghigh-performanceliquidchromatography，DHPLC)是近期发展起来的一种简单、快速、非凝胶的核酸分析方法。它利用样品分子对固定相亲和力的差异，在用流动相洗脱时，不同大小或者不同序列的核苷酸片段分子在固定相上移动速率不同而达到分离的目的。一般来说，产物分子量1％大小的片段即能够被分开。例如，100bp的产物能和101bp的产物分开，而用常规0．8％的琼脂糖凝胶电泳，其相差lObp的片段大小也是无法被分离。因此利用DHPLC可以区分不同长度DNA片段的特点，进行细微差异的DNA序列分析即可从毒株水平快速识别各亚型病原。
目前国内外的已见报道主要用于进行大肠杆菌等食品微生物的检测鉴别、致病微生物耐药菌株的鉴别筛选以及遗传疾病的基因诊断等。本研究旨在根据WEEV的序列特点，将PCR-DHPLC技术用于WEEV的检测，通过特异性、敏感性试验，并与荧光定量RT-PCR方法进行比较，建立一种特异性强、敏感性高的PCR-DHPLC检测新技术，用于WEEEV的快速、高通量检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
首先，本发明提供的一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物，引物序列如下：
WEEDHPF：5-TTTCACCCTTTGACCATA-3
WEEDHPR：5-ATTTCATACCCTGATACTGC-3
WEE-E1Template-F：5-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3
WEE-E1Template-R：5-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3
利用上述引物，本发明还提供一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法，包括下列步骤：
（1）样品中病毒RNA的提取及特异性片段的扩增；
（2）PCR-DHPLC分析。
所述的样品中病毒RNA的提取及WEEV特异性片段的扩增的具体步骤是：
样品中病毒RNA的提取：对样品或灭活毒株进行模板RNA的提取，使用Qiagen公司提供的一步法试剂盒提取RNA保存备用，具体方法按RNA提取试剂盒说明书进行，RT-PCR反应采用Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒对WEEV及用于特异性试验的病毒RNA进行反转录；
WEEV特异性片段的扩增：取5uL已制备的RNA，加入10μM的WEEDHPF和WEEDHPR各1μL；5×RT-PCRbuffer5μL；2.5mMdNTP1μL和0.5μLEnzymemix进行RT-PCR扩增；反应条件为50℃30min；94℃15min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
所述的PCR-DHPLC分析条件为：
色谱柱：PS-DVB﹠C18DNASep色谱柱（4.6mm×50mm,粒度3μm）；柱温：60.1℃；流动相：0.0min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；0.5min,45.9%缓冲溶液A，54.1%缓冲溶液B；5.0min,36.9%缓冲溶液A，63.1%缓冲溶液B；5.1min，0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B；5.6min,0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B；5.7min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；6.6min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；流速：0.9mL/min；检测器：荧光检测器（光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s）；上样量：PCR产物5μL；在变性分析模式下，采用双链DNA单片段（double-strandedsinglefragment）分析模式，清洗模式采用normal,分析检测过程仪器梯度由Navigatorsoftware分析软件控制设定。
缓冲溶液A为：0.1M的TEAA，缓冲溶液B为：0.1M的TEAA+25%的乙腈。
本发明的有益效果：
本发明建立的WEEV的PCR-DHPLC方法在检测其他马病病毒时相互之间无交叉反应，未检测到其他马病病毒的阳性吸收峰；对WEEV不同模板浓度进行检测，检测极限可达到102拷贝/μL。所建立的方法结果与荧光RT-PCR的符合率达100%。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1cRNA的RT-PCR鉴定结果。M，DL2000DNAMarker；1-2，cRNART-PCR鉴定产物。
图2PCR-DHPLC检测WEEV的特异性。1.WEEV；2.马鼻肺炎1型；3.马动脉炎病毒；4.马流感病毒（H3N8）；5.东方马脑脊髓炎病毒；6.委内瑞拉马脑脊髓炎病毒；7.西尼罗病毒；8.空白对照
图3PCR-DHPLC检测WEEV的特异性。1.1.0×106拷贝/μL；2.1.0×105拷贝/μL；3.1.0×104拷贝/μL；4.1.0×103拷贝/μL；5.1.0×102拷贝/μL；6.10拷贝/μL；7.1.0拷贝/μL；
图4WEEV荧光定量RT-PCR检测方法敏感性分析。
具体实施方式
实施例1西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法的建立
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验毒株、核酸
马鼻肺炎病毒（EHV-1）、马动脉炎病毒（EAV）、马流感病毒（H3N8）、西尼罗病毒RNA（WNV）、WEEVRNA、东方马脑脊髓炎（EEEV）RNA和委内瑞拉马脑脊髓炎（VEEV）RNA由本实验室保存。
1.1.2主要试剂
RT-PCR反转录试剂盒、RNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒购自Qiagen公司；三乙胺乙酸盐（TEAA，色谱纯）购自Transgenomic公司；乙腈（色谱纯）购自TEDIA公司；引物由上海Invitrogen生物技术公司合成；胰化蛋白胨、酵母抽提物；琼脂糖、氨苄青霉素、等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。硅胶膜型DNA纯化试剂盒、硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、DNAMarker(DL2000：20001000750500250100bp)，均购自大连宝生物有限公司。其它常规化学试剂购均为分析纯。
1.1.3主要仪器设备及生物信息学分析软件
变性高效液相色谱仪器（TransgenomicWave4500）,为北京环球基因公司产品；AllegraTM21R高速冷冻离心机，BeckmanCoulter公司产品；Sigma1-15普通离心机，Sigma公司产品；DNAStar7.1软件（包含MegAlign程序和Editseq程序）；Premer5.0引物设计软件。
1.2方法
1.2.1引物设计
引物序列如下：
WEEDHPF：5-TTTCACCCTTTGACCATA-3
WEEDHPR：5-ATTTCATACCCTGATACTGC-3
WEE-E1Template-F：5-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3
WEE-E1Template-R：5-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3
1.2.2病毒RNA的提取及WEEV特异性片段的扩增
对灭活毒株进行模板RNA的提取，使用Qiagen公司提供的一步法试剂盒提取RNA保存备用，具体方法按RNA提取试剂盒说明书进行。RT-PCR反应采用Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒对WEEV及用于特异性试验的病毒RNA进行反转录。取5uL已制备的RNA，加入适量WEEDHPF、WEEDHPR；5×RT-PCRbuffer；dNTP和Enzymemix进行RT-PCR扩增。反应条件为50℃30min；94℃15min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
1.2.3标准阳性模板的制备
用WEE-E1Template-F和WEE-E1Template-R引物按照1.2.2的方法进行RT-PCR扩增（退火温度为58℃），将RT-PCR产物按试剂盒说明书（宝生物工程有限公司）进行切胶回收，连接至pMD20T载体，转化DH5α，37℃培养过夜，挑取单个菌落，扩大培养后提取质粒，挑选经PCR鉴定正确的重组质粒,送英骏生物科技有限公司测序。将测序正确的重组质粒命名为pMD20T-WEE。
选用限制性内切酶XbaI将重组质粒pMD20T-WEE进行线性化，并纯化回收，用SP6RiboMaxLargeScaleRNAProductionSystem试剂盒进行体外转录，转录产物经无RNase的Dnase消化后除去其中的DNA，然后用RNeasyKit进行纯化，制备出所需的cRNA。用核酸蛋白分析仪测定cRNA浓度，计算拷贝数。
1.2.4DHPLC分析条件
色谱柱：PS-DVB﹠C18DNASep色谱柱（4.6mm×50mm,粒度3μm）；柱温：60.1℃；流动相：0.0min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；0.5min,45.9%缓冲溶液A，54.1%缓冲溶液B；5.0min,36.9%缓冲溶液A，63.1%缓冲溶液B；5.1min，0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B；5.6min,0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B；5.7min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；6.6min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；流速：0.9mL/min；检测器：荧光检测器（光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s）；上样量：PCR产物5μL。在变性分析模式下，采用双链DNA单片段（double-strandedsinglefragment）分析模式，清洗模式采用normal,分析检测过程仪器梯度由Navigatorsoftware分析软件控制设定。
1.2.5特异性试验
取马鼻肺炎病毒（EHV-1）、马动脉炎病毒（EAV）和马流感病毒（H3N8）提取RNA（DNA）与西尼罗病毒RNA（WNV）、WEEVRNA、东方马脑脊髓炎（EEEV）RNA和委内瑞拉马脑脊髓炎（VEEV）分别进行PCR-DHPLC检测，并做空白对照，按照1.2.2扩增条件和1.2.4DHPLC分析条件进行PCR-DHPLC检测的特异性试验。
1.2.6灵敏度试验
将已制备的cRNA做10倍梯度稀释，按照1.2.2扩增条件和1.2.4DHPLC分析条件进行PCR-DHPLC检测，以此计算出PCR-DHPLC所能检出的最低模板拷贝数，确定本方法的灵敏度。同时进行荧光RT-PCR检测，以比较两种检测方法的灵敏度。
1.2.7临床验证与应用
应用建立的PCR-DHPLC方法和荧光RT-PCR方法对30份马血样进行检测，并对检测结果进行对比分析。
2.结果
2.1标准阳性模板的制备
将扩增得到的WEEV基因特异性保守片段克隆至pMD20T载体中，利用体外转录试剂盒制备出所需的cRNA作为阳性模板，对其进行RT-PCR鉴定，得到1317bp的片段（图1）。经序列测定，扩增得到的特异性保守序列与GenBank中登陆序列同源性达到100%。
2.2PCR-DHPLC反应条件的确立
为确保PCR-DHPLC的高效性、特异性及敏感性，我们对其反应条件进行了优化。由试验结果可知，PCR的最佳退为温度为55℃，反应循环数为35个循环；DHPLC的最佳洗脱温度为60.1℃。
2.3特异性试验
取马鼻肺炎病毒（EHV-1）、马动脉炎病毒（EAV）和马流感病毒（H3N8）提取RNA（DNA）与西尼罗病毒RNA（WNV）、EEEVRNA、西方马脑脊髓炎（WEEV）RNA和委内瑞拉马脑脊髓炎（VEEV）分别进行PCR-DHPLC检测，检测结果，仅WEEV出现扩增吸收峰，结果为阳性，其余均未出现相应的扩增吸收峰，结果均为阴性（图2）。
2.4灵敏度试验
将制备的WEEVcRNA10倍梯度稀释成浓度分别为1～1.0×106拷贝/μL，并分别以此为模板进行PCR-DHPLC检测。结果显示PCR-DHPLC检测WEEV的灵敏度可达到1.0×102拷贝/μL（图3）。同时将稀释的cRNA进行荧光RT-PCR检测，显示荧光RT-PCR的灵敏度为10拷贝（图4）。结果表明PCR-DHPLC的灵敏度比荧光RT-PCR方法的灵敏度低一个数量级。
实施例2临床验证与应用
对30份临床血样提取RNA，应用本试验建立的PCR-DHPLC方法，荧光RT-PCR方法进行检测，同时设阳性对照和空白对照。两种检测方法的验证比较结果表明，PCR-DHPLC检测30份样品均为阴性，与荧光定量RT-PCR检测方法结果一致，且阳性及阴性对照均成立。
核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>一种西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物及其检测方法
<160>4
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(18)
<400>1
TTTCACCCTTTGACCATA18
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(20)
<400>2
ATTTCATACCCTGATACTGC20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(22)
<400>3
TTCGAACATGCGACCACTGTGC22
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>primer_bind
<222>(1)..(21)
<400>4
TCTACGTGTGTTTATAAGCAT21

Claims (5)

1.西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测引物，其特征在于，引物序列如下：
WEEDHPF：5-TTTCACCCTTTGACCATA-3；
WEEDHPR：5-ATTTCATACCCTGATACTGC-3；
WEE-E1Template-F：5-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3；
WEE-E1Template-R：5-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3。
2.西方马脑脊髓炎病毒PCR-DHPLC检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
（1）样品中病毒RNA的提取及特异性片段的扩增；
（2）PCR-DHPLC分析。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，样品中病毒RNA的提取及WEEV特异性片段的扩增的具体步骤是：
样品中病毒RNA的提取：对样品或灭活毒株进行模板RNA的提取，使用Qiagen公司提供的一步法试剂盒提取RNA保存备用，具体方法按RNA提取试剂盒说明书进行，RT-PCR反应采用Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒对WEEV及用于特异性试验的病毒RNA进行反转录；
WEEV特异性片段的扩增：取5uL已制备的RNA，加入10μM的WEEDHPF和WEEDHPR各1μL；5×RT-PCRbuffer5μL；2.5mMdNTP1μL和0.5μLEnzymemix进行RT-PCR扩增；反应条件为50℃30min；94℃15min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，DHPLC分析条件为：
色谱柱：PS-DVB﹠C18DNASep色谱柱（4.6mm×50mm,粒度3μm）；柱温：60.1℃；流动相：0.0min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；0.5min,45.9%缓冲溶液A，54.1%缓冲溶液B；5.0min,36.9%缓冲溶液A，63.1%缓冲溶液B；5.1min，0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B；5.6min,0%缓冲溶液A，100%缓冲溶液B；5.7min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；6.6min,50.9%缓冲溶液A，49.1%缓冲溶液B；流速：0.9mL/min；检测器：荧光检测器（光源：150WXenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s）；上样量：PCR产物5μL；在变性分析模式下，采用双链DNA单片段（double-strandedsinglefragment）分析模式，清洗模式采用normal,分析检测过程仪器梯度由Navigatorsoftware分析软件控制设定。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，缓冲溶液A为：0.1M的TEAA，缓冲溶液B为：0.1M的TEAA+25%的乙腈。
CN201510910818.1A 2015-12-10 2015-12-10 一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法 Pending CN105385788A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510910818.1A CN105385788A (zh) 2015-12-10 2015-12-10 一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510910818.1A CN105385788A (zh) 2015-12-10 2015-12-10 一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105385788A true CN105385788A (zh) 2016-03-09

Family

ID=55418562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510910818.1A Pending CN105385788A (zh) 2015-12-10 2015-12-10 一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105385788A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004072231A2 (en) * 2003-02-10 2004-08-26 Clearant, Inc. Pathogen inactivation assay
CN102808044A (zh) * 2012-09-12 2012-12-05 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒
CN104178587A (zh) * 2014-09-12 2014-12-03 徐超 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004072231A2 (en) * 2003-02-10 2004-08-26 Clearant, Inc. Pathogen inactivation assay
CN102808044A (zh) * 2012-09-12 2012-12-05 北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒
CN104178587A (zh) * 2014-09-12 2014-12-03 徐超 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIAGEN: "QIAGEN OneStep RT-PCR Kit Handbook", 《WWW.WENKU.BAIDU.COM》 *
赵月峨等: "西部马脑炎病毒基因组序列的RT-PCR检测", 《军事医学科学院院刊》 *
金奇: "《医学分子病毒学》", 28 February 2001, 科学出版社 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106319092B (zh) 一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的hrm检测引物、试剂盒及方法
CN102605106B (zh) 蚕微孢子虫、核型多角体病毒和浓核病毒的三重荧光pcr检测方法及试剂盒和引物、探针
CN102277454A (zh) 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒
CN111500776A (zh) 新型冠状病毒2019-nCoV荧光RPA检测引物和探针、试剂盒和方法
CN103757139A (zh) 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
CN102839223A (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在16种常见呼吸道病毒分型检测中的应用
CN110904270A (zh) 猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒的多重RT-PCR检测方法及应用
CN105400906A (zh) 一种同时检测猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪细小病毒三重pcr的引物组及其应用
CN103276109A (zh) 禽流感h7n9病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN102952893A (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用
CN103205512A (zh) 检测猪萨佩罗病毒的引物、Taqman-MGB探针及试剂盒
CN112391483A (zh) 用于恒温扩增检测鼠疫杆菌的核酸序列、试剂盒及方法和应用
CN113718064A (zh) 一种鉴别pcv2和pcv3的探针引物组合、试剂盒及应用
CN105506186A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法
CN101386893B (zh) 一种检测口蹄疫病毒基因组rna的单细胞实时荧光定量rt-pcr的方法
CN105586438B (zh) 用于检测赤羽病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法
CN108359743A (zh) 一种用于鉴别fpv和cpv的hrm引物组，含有该引物组的试剂盒及其应用
CN102220435A (zh) 一种实时荧光定量rt-pcr检测美洲型prrsv及其变异株的方法
CN103146842A (zh) 兔出血症病毒rt-pcr检测方法
CN111808994A (zh) 一种用于检测香蕉条斑病毒gf分离物的rpa引物及检测方法
CN107513583A (zh) 检测非典型猪的瘟病毒的绝对荧光定量pcr引物及试剂盒
CN103555859B (zh) 一种检测甘蔗条纹花叶病毒的荧光定量rt-pcr试剂盒
CN103215389B (zh) 猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒
CN113667668B (zh) 基于CRISPR/Cas系统的HBV检测
CN105385788A (zh) 一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160309

RJ01 Rejection of invention patent application after publication