CN104178587A - 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用 - Google Patents

一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104178587A
CN104178587A CN201410462170.1A CN201410462170A CN104178587A CN 104178587 A CN104178587 A CN 104178587A CN 201410462170 A CN201410462170 A CN 201410462170A CN 104178587 A CN104178587 A CN 104178587A
Authority
CN
China
Prior art keywords
buffered soln
dhplc
hypotype
moving phase
swine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201410462170.1A
Other languages
English (en)
Inventor
徐超
袁萍
张子宏
杨娜
李珂
苗丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201410462170.1A priority Critical patent/CN104178587A/zh
Publication of CN104178587A publication Critical patent/CN104178587A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物及其应用，所述的特异性引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，本发明采用PCR扩增结合非变性DHPLC分析模式，建立猪流感病毒快速筛选的一种新的方法，可以快速、自动化、高通量筛查猪流感病毒，大大提高了检测效率，缩短了检测时间，对预防和控制猪流感H5亚型的爆发具有重要的临床意义。

Description

一种利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物及其应用
技术领域
本发明涉及动物病毒检测技术领域，特别是一种利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物及其应用。
背景技术
猪流感，是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(Swine influeza virus,SIV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性的呼吸道传染病。在免疫选择压力下，猪流感病毒血清型众多，遗传变异频繁。根据血清学和病原学的研究报道表明，世界范围内存在H1N1、H1N2、H1N7、H3N1、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2等9种亚型，我国已经报道H1N1、H1N2、H3N2、H5N1、H6N6和H9N2等亚型，其中H5亚型猪流感的毒力较强，且可能导致高致病力禽流感的流行，成为畜牧业关注的主要猪流感亚型。鉴于猪流感病毒的亚型较多，且导致猪呼吸道的病原较多，临床症状难以区分。因此，建立猪流感H5亚型的快速诊断技术，是确诊病原亚型的有效措施。对猪流感的诊断方法主要为病毒的分离鉴定，HI试验、ELISA方法等血清学方法，常规PCR和定量PCR方法等核酸诊断方法。其中，病毒的分离鉴定耗时长，准确率低，现在已经较少实用。ELISA等血清学方法随着猪流感血清亚型的增多、新旧毒株之间具有一定的交叉反应,其应用受到一定的限制。常规PCR和定量PCR方法，敏感特异，但达不到高通量集成化诊断的要求。因此，需要研究一种能对猪流感病毒进行高通量、快速排查，准确鉴别的集成化检测技术。
高效变性液相色谱技术(Denaturing high performance liquid chromatograph,DHPLC)是近年来发现起来的一种快速、非凝胶的核酸分析方法。其原理为带有磷酸基团的DNA样品在缓冲液带动形成流动相，通过三乙胺乙酸盐(TEAA)的“桥分子”作用吸附于固定相上的DNASep分离柱。DNA片段越长，与较多的TEAA结合使其在色谱柱中滞留时间越长。通过增加流动相中具有亲水性的乙腈浓度，逐渐造成DNA和TEAA的脱离，核酸片段就会按分子量大小洗脱而分离。一般来说，产物分子相差1％的片段既能够被分离。目前国内外已经应用DHPLC进行病原的分型鉴别、遗传疾病的突变分析、食品微生物检测等领域。
但如何利用高效变性液相色谱技术检测猪流感病毒H5亚型，至今未见报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物及其应用，能够有效解决准确、灵敏和高通量的鉴别猪流感病毒H5亚型的问题。
本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：
(1)猪流感H5亚型引物的设计和合成
登录美国国立生物信息技术中心(NCBI)，检索已公布的猪流感病毒H5亚型基因序列，BLAST比对后，使用引物设计软件Primer 5.0设计一对引物，具体序列如下：上游引物SEQID NO.1为5’-AGTGAATTGGCATATGGTAACTG-3’；下游引物SEQ ID NO.2为5’-AACTGAGTGTCCATTTTGTCAAT-3’，引物由大连宝生物有限公司合成；
(2)病毒RNA的提取
参照Takra Minibest Viral RNA/DNA提取试剂盒说明书分别提取猪流感病毒H5N1亚型、H1N1亚型、H3N2亚型，猪瘟病毒，O型口蹄疫病毒，猪病毒性腹泻病毒，猪繁殖和呼吸综合征病毒的病毒RNA，取D260nm/D280nm比值范围在1.9～2.1的病毒RNA，-70℃保存备用；
(3)RT-PCR的反应体系和条件
以提取的病毒RNA模板，进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应体系如下，Taq酶(PrimeScriptEnzyme)2μl，反应缓冲液(buffer)25μl，浓度20pm/μl的上游引物1μl,浓度20pm/μl的下游引物1μl,病毒RNA模板5μl,超纯水16μl，反应条件为：42℃反转录30min，95℃ 3min,95℃ 30sec,退火温度52℃ 30sec,72℃ 1min,共30个循环；
(4)DHPLC方法的分析条件
DHPLC的分析条件：在非变性分析模式下,采用双链单片段DNA(double strande singalfragment)分析模式，DNASep柱温选择50℃，平衡分离柱至基线稳定后开始进样，上样量:PCR产物5μl，洗脱条件为：起始流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝69:125，7分钟时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝46:125，16.5分钟终止时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝43:125，流速为:0.9 ml/min；流动相浓度梯度变化由Navigator software分析软件控制设定，检测器为紫外检测器；
所述的缓冲溶液A为浓度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸盐(TEAA)；三乙胺乙酸盐(TEAA)购自Transgenomic公司；所述的缓冲溶液B由以体积百分比的乙腈25％和缓冲溶液A75％混合在一起组成，乙腈(色谱纯)购自Sigma公司；所述的Takra Minibest Viral RNA/DNA病毒DNA提取试剂盒购自宝生物公司。
本发明提出了利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物在制备检测猪流感H5亚型病毒试剂盒或试剂中的应用，其中，所述的DHPLC方法的分析条件同上。
本发明采用PCR扩增结合非变性DHPLC分析模式，建立猪流感病毒快速筛选的一种新的方法，可以快速、自动化、高通量筛查猪流感病毒，大大提高了检测效率，缩短了检测时间，对预防和控制猪流感H5亚型的爆发具有重要的临床意义。
附图说明
图1为猪流感H5亚型DHPLC检测方法的特异性结果。其中，1:SIV H5N1亚型，2:SIVH5亚型质粒，3:SIV H1N1亚型，4:SIV H3N2亚型，5:猪瘟病毒，6:O型口蹄疫病毒，7:猪病毒性腹泻病毒，8:猪繁殖和呼吸综合征病毒。
图2为猪流感H5亚型DHPLC检测方法的敏感性结果。其中，1:106 copies，2:105copies,3:104 copies,4:103 copies,5:102 copies,6:10 copies,7:1 copy,8:阴性对照。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明，这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。
实施例1(检测猪流感H5亚型的DHPLC方法特异性)的步骤如下：
(1)SIV H5亚型的序列分析与猪流感H5亚型引物的设计和合成
在NCBI上查找猪流感病毒H5亚型的HA基因序列(即SIV H5亚型的靶基因序列)，HA基因序列如下：
Agtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaataggggcgataaactctagtatgccattccacaacatccaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactgggctcagaaatagccctcaaggagagagaagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaacgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattgacaaaatgaacactcagtt
BLAST分析比较基因序列，使用引物设计软件Primer 5.0设计一对引物，具体序列如下：上游引物SEQ ID NO.1为5’-AGTGAATTGGCATATGGTAACTG-3’；下游引物SEQ ID NO.2为5’-AACTGAGTGTCCATTTTGTCAAT-3’。
(2)病毒RNA的提取
含猪流感H5亚型毒株的尿囊液和SIV猪鼻拭子的样品，8000r/min离心10分钟后，取上清，参照Takra Minibest Viral RNA/DNA提取试剂盒说明书提取含猪流感H5亚型毒株的尿囊液和SIV猪鼻拭子的样品RNA，即从含猪流感H5亚型毒株的尿囊液的样品中提取的是SIVH5N1亚型的RNA，从SIV猪鼻拭子的样品中提取的分别是SIV H1N1亚型、SIV H3N2亚型、猪瘟病毒、O型口蹄疫病毒、猪病毒性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒的RNA，对提取出的样品RNA用微量核酸蛋白分析仪测定D260nm和D280nm，计算RNA浓度，取D260nm/D280nm比值范围在1.9～2.1的病毒RNA，-70℃保存备用。
(3)RT-PCR的反应体系和条件
以提取的病毒RNA模板，进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应体系如下，Taq酶(PrimeScriptEnzyme)2μl，反应缓冲液(buffer)25μl，浓度20pm/μl的上游引物1μl,浓度20pm/μl的下游引物1μl,病毒RNA模板5μl,超纯水16μl，反应条件为：42℃反转录30min，95℃ 3min,95℃ 30sec,退火温度52℃ 30sec,72℃ 1min,共30个循环。
(4)DHPLC方法的分析条件
DHPLC的分析条件：DNAseq柱，4.6mm×5.4mm，粒度3μm，采用双链单片段DNA(double strande singal fragment)分析模式，使用紫外检测器，DNASep柱温选择50℃，平衡分离柱至基线稳定后开始进样，上样量:PCR产物5μl，洗脱条件为：起始流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝69:125，7分钟时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝46:125，16.5分钟终止时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝43:125，流速为:0.9ml/min；流动相浓度梯度变化由Navigator software分析软件控制设定。
(5)检测结果
猪流感病毒H5N1亚型出现特征性DHPLC吸收图谱，为阳性结果，而猪流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型、猪瘟病毒，O型口蹄疫病毒、猪病毒性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒为阴性结果(如图1)。
实施例2(检测猪流感H5亚型的DHPLC方法的灵敏性分析)步骤如下：
(1)SIV-H5亚型重组质粒的构建
提取猪流感H5亚型标准毒株的核酸，参照实施例1的方法进行PCR扩增，回收目的PCR产物，TA克隆于pMD18-T质粒，挑选阳性重组体，使用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ进行单、双酶切鉴定，并进行序列测定。
(2)灵敏性试验
用微量核酸蛋白分析仪测定猪流感病毒H5亚型重组质粒浓度，稀释为106,105,104,103,102,10和1个copies数核酸，参照实施例1的方法进行PCR扩增和DHPLC检测，研究方法的敏感性，结果表明DHPLC法可以检测最低10个copies核酸。
本发明经临床试验和应用，取得了良好的效果，具体如下：使用本发明的DHPLC方法对临床的151份猪鼻拭子皮毛样品进行SIV H5亚型检测，同时使用商品化猪流感H5亚型核酸检测试剂盒平行检测。结果，其中32份阳性样品中DHPLC法和定量PCR试剂盒的检测结果均为阳性，剩余119份结果均为阴性，两者的符合率为100％。说明DHPLC可以适用于临床的大批量SIV H5亚型的诊断，且筛选速度快，缩短了检测时间，对预防和控制猪流感H5亚型的爆发具有重要的临床意义。

Claims (3)

1.一种利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物在检测猪流感H5亚型病毒中的应用，其中，所述的DHPLC的分析条件为：DNAseq柱，4.6mm×5.4mm，粒度3μm，采用双链单片段DNA分析模式，使用紫外检测器，DNASep柱温选择50℃，平衡分离柱至基线稳定后开始进样，上样量:PCR产物5μl，洗脱条件为：起始流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=69:125，7分钟时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=46:125，16.5分钟终止时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=43:125，流速为:0.9 ml/min；流动相浓度梯度变化由Navigator software分析软件控制设定；所述的缓冲溶液A为浓度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸盐的缓冲溶液；所述的缓冲溶液B由以体积百分比的乙腈25%和缓冲溶液A75%混合在一起组成。
3.权利要求1所述的利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物在制备检测猪流感H5亚型病毒试剂盒或试剂中的应用，其中，所述的DHPLC的分析条件为：DNAseq柱，4.6mm×5.4mm，粒度3μm，采用双链单片段DNA分析模式，使用紫外检测器，DNASep柱温选择50℃，平衡分离柱至基线稳定后开始进样，上样量:PCR产物5μl，洗脱条件为：起始流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=69:125，7分钟时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=46:125，16.5分钟终止时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=43:125，流速为:0.9 ml/min；流动相浓度梯度变化由Navigator software分析软件控制设定；所述的缓冲溶液A为浓度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸盐的缓冲溶液；所述的缓冲溶液B由以体积百分比的乙腈25%和缓冲溶液A75%混合在一起组成。
CN201410462170.1A 2014-09-12 2014-09-12 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用 Pending CN104178587A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410462170.1A CN104178587A (zh) 2014-09-12 2014-09-12 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410462170.1A CN104178587A (zh) 2014-09-12 2014-09-12 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104178587A true CN104178587A (zh) 2014-12-03

Family

ID=51959927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410462170.1A Pending CN104178587A (zh) 2014-09-12 2014-09-12 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104178587A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105368984A (zh) * 2015-12-10 2016-03-02 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种东方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法
CN105385788A (zh) * 2015-12-10 2016-03-09 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴运谱等: "表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性", 《畜牧兽医学报》 *
尹可等: "H5亚型猪流感病毒HA1重组蛋白的制备及间接ELISA检测方法的建立", 《中国兽医科学》 *
杨焕良等: "猪流感病毒RT-PCR快速检测方法的建立", 《动物医学进展》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105368984A (zh) * 2015-12-10 2016-03-02 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种东方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法
CN105385788A (zh) * 2015-12-10 2016-03-09 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 一种西方马脑脊髓炎病毒pcr-dhplc检测引物及其检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103757139B (zh) 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
CN103614489B (zh) 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN101736094A (zh) 变异型猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及应用
CN103276109A (zh) 禽流感h7n9病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN107287350A (zh) 一种检测猪圆环病毒3型的引物、试剂盒及方法
CN104498629A (zh) H3n2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN103243181B (zh) 甲型h7n9流感病毒检测试剂盒及检测方法
CN105603120B (zh) 用于检测蓝舌病毒、牛病毒性腹泻病毒和口蹄疫病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法
CN104178587A (zh) 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用
CN108950081A (zh) 一种h7亚型禽流感病毒的实时荧光定量rt-pcr检测方法
CN102230023B (zh) 双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及应用
CN106435036B (zh) 一种用于检测d型流感病毒的荧光pcr引物和探针及检测方法
CN108531659A (zh) 一种快速检测牛流行热病毒的rt-pcr引物及试剂盒
CN105296676A (zh) 一种戊型肝炎病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法
CN105586438B (zh) 用于检测赤羽病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法
CN105567868B (zh) 用于检测赤羽病毒、牛病毒性腹泻病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法
CN110669872A (zh) H9和h10亚型禽流感病毒三重rt-pcr检测引物组、试剂盒及方法
CN105296675A (zh) 一种乙型流感病毒核酸检测试剂盒及其制备方法
CN102453770A (zh) 一种用于检测猪细小病毒的方法
CN103602756A (zh) 一种新城疫病毒的检测方法
CN103805717A (zh) 一种用于检测I型和IV型马疱疹病毒的双重Eva Green实时荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
CN103276108A (zh) 禽流感病毒h7型rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN106086234A (zh) H9亚型aiv、h6亚型aiv和aiv的三重rt‑pcr试剂盒及其应用
CN104450955B (zh) 欧亚类禽型h1n1猪流感病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN102851395B (zh) 一种检测传染性喉气管炎病毒的液相芯片方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20141203