CN104178587A - 一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用 - Google Patents

一种利用dhplc检测猪流感病毒h5亚型的特异性引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物及其应用，所述的特异性引物为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，本发明采用PCR扩增结合非变性DHPLC分析模式，建立猪流感病毒快速筛选的一种新的方法，可以快速、自动化、高通量筛查猪流感病毒，大大提高了检测效率，缩短了检测时间，对预防和控制猪流感H5亚型的爆发具有重要的临床意义。

Description

一种利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物及其应用
技术领域
本发明涉及动物病毒检测技术领域，特别是一种利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物及其应用。
背景技术
猪流感，是由正黏病毒科A型流感病毒属的猪流感病毒(Swine influeza virus,SIV)引起的一种急性、热性、高度接触传染性的呼吸道传染病。在免疫选择压力下，猪流感病毒血清型众多，遗传变异频繁。根据血清学和病原学的研究报道表明，世界范围内存在H1N1、H1N2、H1N7、H3N1、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1、H9N2等9种亚型，我国已经报道H1N1、H1N2、H3N2、H5N1、H6N6和H9N2等亚型，其中H5亚型猪流感的毒力较强，且可能导致高致病力禽流感的流行，成为畜牧业关注的主要猪流感亚型。鉴于猪流感病毒的亚型较多，且导致猪呼吸道的病原较多，临床症状难以区分。因此，建立猪流感H5亚型的快速诊断技术，是确诊病原亚型的有效措施。对猪流感的诊断方法主要为病毒的分离鉴定，HI试验、ELISA方法等血清学方法，常规PCR和定量PCR方法等核酸诊断方法。其中，病毒的分离鉴定耗时长，准确率低，现在已经较少实用。ELISA等血清学方法随着猪流感血清亚型的增多、新旧毒株之间具有一定的交叉反应,其应用受到一定的限制。常规PCR和定量PCR方法，敏感特异，但达不到高通量集成化诊断的要求。因此，需要研究一种能对猪流感病毒进行高通量、快速排查，准确鉴别的集成化检测技术。
高效变性液相色谱技术(Denaturing high performance liquid chromatograph,DHPLC)是近年来发现起来的一种快速、非凝胶的核酸分析方法。其原理为带有磷酸基团的DNA样品在缓冲液带动形成流动相，通过三乙胺乙酸盐(TEAA)的“桥分子”作用吸附于固定相上的DNASep分离柱。DNA片段越长，与较多的TEAA结合使其在色谱柱中滞留时间越长。通过增加流动相中具有亲水性的乙腈浓度，逐渐造成DNA和TEAA的脱离，核酸片段就会按分子量大小洗脱而分离。一般来说，产物分子相差1％的片段既能够被分离。目前国内外已经应用DHPLC进行病原的分型鉴别、遗传疾病的突变分析、食品微生物检测等领域。
但如何利用高效变性液相色谱技术检测猪流感病毒H5亚型，至今未见报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物及其应用，能够有效解决准确、灵敏和高通量的鉴别猪流感病毒H5亚型的问题。
本发明解决的技术方案是，包括以下步骤：
(1)猪流感H5亚型引物的设计和合成
登录美国国立生物信息技术中心(NCBI)，检索已公布的猪流感病毒H5亚型基因序列，BLAST比对后，使用引物设计软件Primer 5.0设计一对引物，具体序列如下：上游引物SEQID NO.1为5’-AGTGAATTGGCATATGGTAACTG-3’；下游引物SEQ ID NO.2为5’-AACTGAGTGTCCATTTTGTCAAT-3’，引物由大连宝生物有限公司合成；
(2)病毒RNA的提取
参照Takra Minibest Viral RNA/DNA提取试剂盒说明书分别提取猪流感病毒H5N1亚型、H1N1亚型、H3N2亚型，猪瘟病毒，O型口蹄疫病毒，猪病毒性腹泻病毒，猪繁殖和呼吸综合征病毒的病毒RNA，取D260nm/D280nm比值范围在1.9～2.1的病毒RNA，-70℃保存备用；
(3)RT-PCR的反应体系和条件
以提取的病毒RNA模板，进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应体系如下，Taq酶(PrimeScriptEnzyme)2μl，反应缓冲液(buffer)25μl，浓度20pm/μl的上游引物1μl,浓度20pm/μl的下游引物1μl,病毒RNA模板5μl,超纯水16μl，反应条件为：42℃反转录30min，95℃ 3min,95℃ 30sec,退火温度52℃ 30sec,72℃ 1min,共30个循环；
(4)DHPLC方法的分析条件
DHPLC的分析条件：在非变性分析模式下,采用双链单片段DNA(double strande singalfragment)分析模式，DNASep柱温选择50℃，平衡分离柱至基线稳定后开始进样，上样量:PCR产物5μl，洗脱条件为：起始流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝69:125，7分钟时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝46:125，16.5分钟终止时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝43:125，流速为:0.9 ml/min；流动相浓度梯度变化由Navigator software分析软件控制设定，检测器为紫外检测器；
所述的缓冲溶液A为浓度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸盐(TEAA)；三乙胺乙酸盐(TEAA)购自Transgenomic公司；所述的缓冲溶液B由以体积百分比的乙腈25％和缓冲溶液A75％混合在一起组成，乙腈(色谱纯)购自Sigma公司；所述的Takra Minibest Viral RNA/DNA病毒DNA提取试剂盒购自宝生物公司。
本发明提出了利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物在制备检测猪流感H5亚型病毒试剂盒或试剂中的应用，其中，所述的DHPLC方法的分析条件同上。
本发明采用PCR扩增结合非变性DHPLC分析模式，建立猪流感病毒快速筛选的一种新的方法，可以快速、自动化、高通量筛查猪流感病毒，大大提高了检测效率，缩短了检测时间，对预防和控制猪流感H5亚型的爆发具有重要的临床意义。
附图说明
图1为猪流感H5亚型DHPLC检测方法的特异性结果。其中，1:SIV H5N1亚型，2:SIVH5亚型质粒，3:SIV H1N1亚型，4:SIV H3N2亚型，5:猪瘟病毒，6:O型口蹄疫病毒，7:猪病毒性腹泻病毒，8:猪繁殖和呼吸综合征病毒。
图2为猪流感H5亚型DHPLC检测方法的敏感性结果。其中，1:106 copies，2:105copies,3:104 copies,4:103 copies,5:102 copies,6:10 copies,7:1 copy,8:阴性对照。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明，这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。
实施例1(检测猪流感H5亚型的DHPLC方法特异性)的步骤如下：
(1)SIV H5亚型的序列分析与猪流感H5亚型引物的设计和合成
在NCBI上查找猪流感病毒H5亚型的HA基因序列(即SIV H5亚型的靶基因序列)，HA基因序列如下：
Agtgaattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaataggggcgataaactctagtatgccattccacaacatccaccctctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatcaaacagattagtccttgcgactgggctcagaaatagccctcaaggagagagaagaagaaaaaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggtagatggttggtatgggtaccaccatagcaacgagcaggggagtgggtacgctgcagacaaagaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattgacaaaatgaacactcagtt
BLAST分析比较基因序列，使用引物设计软件Primer 5.0设计一对引物，具体序列如下：上游引物SEQ ID NO.1为5’-AGTGAATTGGCATATGGTAACTG-3’；下游引物SEQ ID NO.2为5’-AACTGAGTGTCCATTTTGTCAAT-3’。
(2)病毒RNA的提取
含猪流感H5亚型毒株的尿囊液和SIV猪鼻拭子的样品，8000r/min离心10分钟后，取上清，参照Takra Minibest Viral RNA/DNA提取试剂盒说明书提取含猪流感H5亚型毒株的尿囊液和SIV猪鼻拭子的样品RNA，即从含猪流感H5亚型毒株的尿囊液的样品中提取的是SIVH5N1亚型的RNA，从SIV猪鼻拭子的样品中提取的分别是SIV H1N1亚型、SIV H3N2亚型、猪瘟病毒、O型口蹄疫病毒、猪病毒性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒的RNA，对提取出的样品RNA用微量核酸蛋白分析仪测定D260nm和D280nm，计算RNA浓度，取D260nm/D280nm比值范围在1.9～2.1的病毒RNA，-70℃保存备用。
(3)RT-PCR的反应体系和条件
以提取的病毒RNA模板，进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应体系如下，Taq酶(PrimeScriptEnzyme)2μl，反应缓冲液(buffer)25μl，浓度20pm/μl的上游引物1μl,浓度20pm/μl的下游引物1μl,病毒RNA模板5μl,超纯水16μl，反应条件为：42℃反转录30min，95℃ 3min,95℃ 30sec,退火温度52℃ 30sec,72℃ 1min,共30个循环。
(4)DHPLC方法的分析条件
DHPLC的分析条件：DNAseq柱，4.6mm×5.4mm，粒度3μm，采用双链单片段DNA(double strande singal fragment)分析模式，使用紫外检测器，DNASep柱温选择50℃，平衡分离柱至基线稳定后开始进样，上样量:PCR产物5μl，洗脱条件为：起始流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝69:125，7分钟时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝46:125，16.5分钟终止时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B＝43:125，流速为:0.9ml/min；流动相浓度梯度变化由Navigator software分析软件控制设定。
(5)检测结果
猪流感病毒H5N1亚型出现特征性DHPLC吸收图谱，为阳性结果，而猪流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型、猪瘟病毒，O型口蹄疫病毒、猪病毒性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒为阴性结果(如图1)。
实施例2(检测猪流感H5亚型的DHPLC方法的灵敏性分析)步骤如下：
(1)SIV-H5亚型重组质粒的构建
提取猪流感H5亚型标准毒株的核酸，参照实施例1的方法进行PCR扩增，回收目的PCR产物，TA克隆于pMD18-T质粒，挑选阳性重组体，使用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ进行单、双酶切鉴定，并进行序列测定。
(2)灵敏性试验
用微量核酸蛋白分析仪测定猪流感病毒H5亚型重组质粒浓度，稀释为106,105,104,103,102,10和1个copies数核酸，参照实施例1的方法进行PCR扩增和DHPLC检测，研究方法的敏感性，结果表明DHPLC法可以检测最低10个copies核酸。
本发明经临床试验和应用，取得了良好的效果，具体如下：使用本发明的DHPLC方法对临床的151份猪鼻拭子皮毛样品进行SIV H5亚型检测，同时使用商品化猪流感H5亚型核酸检测试剂盒平行检测。结果，其中32份阳性样品中DHPLC法和定量PCR试剂盒的检测结果均为阳性，剩余119份结果均为阴性，两者的符合率为100％。说明DHPLC可以适用于临床的大批量SIV H5亚型的诊断，且筛选速度快，缩短了检测时间，对预防和控制猪流感H5亚型的爆发具有重要的临床意义。

Claims (3)

1.一种利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物在检测猪流感H5亚型病毒中的应用，其中，所述的DHPLC的分析条件为：DNAseq柱，4.6mm×5.4mm，粒度3μm，采用双链单片段DNA分析模式，使用紫外检测器，DNASep柱温选择50℃，平衡分离柱至基线稳定后开始进样，上样量:PCR产物5μl，洗脱条件为：起始流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=69:125，7分钟时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=46:125，16.5分钟终止时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=43:125，流速为:0.9 ml/min；流动相浓度梯度变化由Navigator software分析软件控制设定；所述的缓冲溶液A为浓度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸盐的缓冲溶液；所述的缓冲溶液B由以体积百分比的乙腈25%和缓冲溶液A75%混合在一起组成。
3.权利要求1所述的利用DHPLC检测猪流感病毒H5亚型的特异性引物在制备检测猪流感H5亚型病毒试剂盒或试剂中的应用，其中，所述的DHPLC的分析条件为：DNAseq柱，4.6mm×5.4mm，粒度3μm，采用双链单片段DNA分析模式，使用紫外检测器，DNASep柱温选择50℃，平衡分离柱至基线稳定后开始进样，上样量:PCR产物5μl，洗脱条件为：起始流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=69:125，7分钟时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=46:125，16.5分钟终止时流动相的体积比为缓冲溶液A：缓冲溶液B=43:125，流速为:0.9 ml/min；流动相浓度梯度变化由Navigator software分析软件控制设定；所述的缓冲溶液A为浓度0.1 Mol/L的三乙胺乙酸盐的缓冲溶液；所述的缓冲溶液B由以体积百分比的乙腈25%和缓冲溶液A75%混合在一起组成。
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