CN105315375A - 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向CLD18A2的T淋巴细胞及其制备方法和应用。本发明人首次从诸多肿瘤相关基因中成功地找到了一种适用于研制CAR？T细胞的靶基因CLD18A2，并成功制备了靶向CLD18A2的CAR？T细胞，从而为胰腺癌，胃癌等肿瘤提供一种全新的治疗手段。

Description

靶向CLD18A2的T淋巴细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于肿瘤细胞治疗领域，更具体地，本发明涉及靶向CLD18A2的T淋巴细胞及其制备方法和应用。
背景技术
T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意[GruppSA，etal.Adoptivecellulartherapy.CurrTopMicrobiolImmunol.,2011；344:149-72.]。近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(TCellReceptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimericantigenreceptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CART淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。CART淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略[SchmitzM，etal.Chimericantigenreceptor-engineeredTcellsforimmunotherapyofCancer.JBiomedBiotechnol，2010，doi:10.1155/2010/956304.]。
嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD27、CD137、CD134等的胞内信号区。
胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CART淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CART可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[ZhangT.etal.ChimericNKG2D-modifiedTcellsinhibitsystemicT-celllymphomagrowthinamannerinvolvingmultiplecytokinesandcytotoxicpathways，CanRes2007，67(22):11029-11036.]。
随后发展的第二代CART淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CART在体内的存活周期和抗肿瘤效果[DottiG.etal.CD28costimulationimprovesexpansionandpersistenceofchimericantigenreceptormodifiedTcellsinlymphomapatients.JClinInvest,2011,121(5):1822-1826.]。
近些年发展的第三代CART淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CART在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[CarpenitoC.，etal.ControloflargeestablishedtumorxenograftswithgeneticallyretargetedhumanTcellscontainingCD28andCD137domains.PNAS，2009，106(9):3360–3365.]。
尽管CART淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但其较高风险亦需要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CART淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳酸酐酶IX(CAIX)是第一个用于临床的CART淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CART淋巴细胞后出现2-4级肝毒性。分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评价[StoterG.etal.TreatmentofmetastaticrenalcellcarcinomawithautologousT-lymphocytesgeneticallyretargetedagainstcarbonicanhydraseIX:firstclinicalexperience.Jclinoncol，2006，24(13):e20-e22.；NgoMC.，etal.Exvivogenetransferforimprovedadoptiveimmunotherapyofcancer.HumanMolecularGenetics，2011，R1-R7]。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可能会被活化，导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的“细胞因子风暴”。这种信号外漏(singnalleakage)会导致脱靶细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在采用针对Her2的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中由于正常肺组织中低表达Her2而引发所谓的“细胞因子风暴”致病人猝死[MorganRA.，etal.ReportofaseriousadverseeventfollowingtheadministrationofTcellstransducedwithachimericantigenreceptorrecognizingErbb2.MolecularTherapy，2010，18(4):843-851.]。
设计CART时，所针对的抗原基因是一种关键性的选择，鉴于体内基因表达的复杂性以及各种不可控因素，选择到一个合适的用于CART的基因是非常困难的。并且，很多肿瘤特异性的抗原，很难找到针对其的且适合于构建CART细胞的特异性分子，在建立CART后，往往无法获得有活性的胞外结合区，这也是发展CART技术的难点。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向CLD18A2的T淋巴细胞及其制备方法和应用。
在本发明的第一方面，提供表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体(CAR)，所述的嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别CLD18A2(claudin18.2)的蛋白。
在一个优选例中，所述的特异性识别CLD18A2的蛋白是抗体或配体；较佳地，所述的抗体是单链抗体或结构域抗体。
在另一优选例中，所述的跨膜区是包含CD8或CD28的跨膜区和铰链区的序列。
在另一优选例中，所述的胞内信号区选自：CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，CD137，CD134的胞内信号区序列，或其组合。
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区：
特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD8和CD3ζ；
特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD8、CD137和CD3ζ；
特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD28分子的跨膜区(CD28a)、CD28分子的胞内信号区(CD28b)和CD3ζ；或
特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有SEQIDNO:19～22任一所述的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，提供编码所述的嵌合抗原受体的核酸。
在一个优选例中，所述的核酸具有SEQIDNO:15～18任一所述的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含所述的核酸。
在一个优选例中，所述的表达载体来源于慢病毒质粒pWPT(或pWPT-eGFP)。
在本发明的另一方面，提供一种病毒，所述的病毒(如慢病毒)包含所述载体。
在本发明的另一方面，提供所述的嵌合抗原受体、或所述的核酸、或所述的表达载体、或所述的病毒的用途，用于制备靶向CLD18A2的基因修饰的T淋巴细胞。
在本发明的另一方面，提供一种基因修饰的T淋巴细胞，其转导有所述的核酸，或所述的表达载体或所述的病毒。
在本发明的另一方面，提供一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQIDNO:19-22任一所述的氨基酸序列。
在本发明的另一方面，提供所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物，所述的肿瘤是CLD18A2阳性(高表达)的肿瘤。
在另一优选例中，所述的CLD18A2阳性的肿瘤包括：胰腺癌，胃癌。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、作为示例的本发明的包含编码CAR序列的慢病毒载体pWPT-eGFP-F2A-CAR的结构示意图。
图2、嵌合抗原受体各部分的连接顺序的示意图。
图3、实施例1抗CLD18A2的单链抗体纯化电泳图。
图4、CLD18A1、CLD18A2的稳定表达细胞系WesternBlot检测的结果。
图5、流式细胞仪检测CLD18A2单链抗体和CLD18A1、CLD18A2结合特异性检测结果。
图6、拼接好的嵌合抗原受体的电泳鉴定。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示了一种基于CLD18A2基因的CART淋巴细胞及其制备方法。
CLD18A2基因
本发明人前期考察了许多种肿瘤特异性基因，发现这类基因中相当大一部分也表达于部分组织的正常细胞中，无法应用于嵌合抗原受体T细胞技术；有的肿瘤特异性基因具有较好的肿瘤特异性表达特性，但是，基于其设计的CART细胞没有肿瘤细胞杀伤活性或者活性很低，这可能是由于相应基因表达的蛋白抗原性低或者表达位置不合理或表达量不够高等原因导致，也可能是由于重组构建后获得的T淋巴细胞受到了影响而肿瘤杀伤能力减弱或丧失导致。
经过反复考察和筛选，本发明人找到了CLD18A2基因作为设计CART细胞的靶基因。
Claudin18(CLD18)分子(Genbankaccessionnumber:splicevariant1(CLD18A1):NP.sub.-057453，NM.sub.-016369，andsplicevariant2(CLD18A2):NM.sub.-001002026，NP.sub.-001002026)是一个分子量大约为27.9/27.72的跨膜蛋白。Claudins是位于上皮与内皮的紧密连接的膜蛋白。
经研究，表明CLD18A1选择性地表达于正常肺和胃上皮，而CLD18A2的表达仅限于胃上皮已分化的短命细胞，不表达于胃干细胞；并且，现有研究表明，CLD18A2在很多肿瘤细胞中表达。鉴于CLD18A2的上述特性，本发明人推测认为，CLD18A2可能是这些肿瘤的重要治疗靶点；并且，经过后续大量工作验证，落实了这一推测。
嵌合抗原受体及其编码核酸
本发明提供了一种表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别CLD18A2(claudin18.2)的蛋白。将该嵌合抗原受体表达于T淋巴细胞的表面，可使得T淋巴细胞对高表达CLD18A2的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。
作为本发明的优选方式，所述胞外结合区包含特异性识别CLD18A2单链抗体scFv(CLD18A2)。上述嵌合抗原受体蛋白的胞外结合区通过CD8铰链区与CD8或者CD28的跨膜区相连接，跨膜区后紧接胞内信号区。
本发明也包括编码所述嵌合抗原受体的核酸。本发明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
特异性识别人CLD18A2单克隆抗体可以选用现有技术中公开的抗体。多种识别CLD18A2的C末端表位的单克隆抗体可以以合适的方式运用于本发明，只要它们在经过重组构建后，最后可以获得具有杀伤活性的CART淋巴细胞。作为本发明的优选方式，应用单链抗体，较佳地，所述的单链抗体是163和175抗体；163和175两种抗体，可以特异性识别CLD18A2但不识别CLD18A1。更佳地，它们与Fc连接(ScFv-163和scFv-175)。
本发明中使用的术语“单链抗体(scFv)片段”指的是通过如下定义的抗体片段，其是包含通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。本发明使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，ColdSpringHarborLaboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。上述单链抗体还可以包括其衍生物。本发明中“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与CLD18A2抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；Malmborg，免疫学方法杂志183(1995)，7-13)。还包括，例如WO89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，WO91/10741，WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法所产生的抗体的衍生物。
本发明的术语“特异性识别”的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。
嵌合抗原受体的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。CD8或CD28是T淋巴细胞表面的天然标记物。人CD8蛋白是个异二聚体，由αβ或者γδ两条链组成。在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自CD8α或者CD28的跨膜区。此外，CD8α铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将嵌合抗原受体CAR的靶点识别结构域scFv和胞内信号区连接起来。
胞内信号区可以选自CD3ζ，FcεRIγ，CD28，CD137，CD134蛋白的胞内信号区，及其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转导区。CD3δZ是截短的不具有ITAM基序的CD3ζ序列，在本发明实践中一般作为阴性对照的构建。FcεRIγ主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外如前所述，CD28，CD137，CD134是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CART淋巴细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
本发明的核酸所编码的抗CLD18A2嵌合抗原受体蛋白可以选自按如下方式顺序连接：
scFv(CLD18A2)-CD8-CD3ζ，
scFv(CLD18A2)-CD8-CD137-CD3ζ，
scFv(CLD18A2)-CD28a-CD28b-CD3ζ，
scFv(CLD18A2)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ，
及其组合，其中相关嵌合抗原受体蛋白中CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表CD28分子的胞内信号区。上述各种抗CLD18A2嵌合抗原受体统称为scFv(CLD18A2)-CAR。
在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸具有如SEQIDNO:15～18所述的序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的核酸是编码具有如SEQIDNO:19-22之一的嵌合抗原受体蛋白的核酸。
表达载体及细胞
本发明还提供了包含上述编码表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸的载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体pWPT-eGFP。该质粒属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G；及空载体pWPT-eGFP，其可以用于重组引入目的核酸序列，即编码CAR的核酸序列。空载体pWPT-eGFP(其本身为后续试验中的mock)中由延长因子-1α(elongationfactor-1α，EF-1α)启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP)的表达。而包含编码CAR的目的核酸序列的重组表达载体pWPT-eGFP-F2A-CAR是通过由来自口蹄疫病毒(food-and-mouthdiseasevirus，FMDV)的核糖体跳跃序列(ribosomalskippingsequence2A)(简称F2A)实现eGFP与CAR的共表达的。
本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其他可用于将外源基因转导入T淋巴细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
在本发明的一个实施方案中，所述病毒是包含上述pWPT-eGFP-F2A-CAR重组载体(即含有scFv(CLD18A2)-CAR)的慢病毒。
本发明还提供了基因修饰的T淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的Nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(SleepingBeautysystem)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[DaviesJK.，etal.CombiningCD19redirectionandalloanergizationtogeneratetumor-specifichumanTcellsforallogeneiccelltherapyofB-cellmalignancies.CancerRes，2010，70(10):OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的抗CLD18A2嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因T淋巴细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
在一个实施方案中，本发明的基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由SEQIDNO:15-18之一的核酸编码表达。在另一个实施方案中，本发明的转基因T淋巴细胞表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQIDNO:19-22之一。
鉴于目前尚没有关于靶向CLD18A2的CART的报道，本发明人首次从诸多肿瘤相关基因中成功地找到了一种适用于CART细胞的靶基因CLD18A2，并成功制备了靶向CLD18A2的CART细胞，从而为胰腺癌，胃癌等肿瘤提供一种全新的治疗手段。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、抗CLD18A2的单链抗体的表达
本发明人经过反复地研究分析，鉴定出几个识别CLD18A2的scfv抗体，简称为125、163和175。
通过基于PCR搭桥的基因合成技术，合成125(SEQIDNO:1(核苷酸)，2(氨基酸))、163(SEQIDNO:3(核苷酸)，4(氨基酸))、175(SEQIDNO:5(核苷酸)，6(氨基酸))单链抗体序列，通过Nhe1/BamH1(购自NEB)双酶切，以T4DNA连接酶(购自NEB)于同样以Nhe1/BamH1双酶切载体质粒pCMV-V5-Fc(该载体在多克隆位点下游融合表达人抗体Fc片段，以下简称V5-Fc，购自上海锐劲生物)连接并转化于宿主菌TOP10中，挑取克隆通过PCR鉴定阳性克隆并通过测序确认，分别获得V5-scFv-125-Fc、V5-scFv-163-Fc、V5-scFv-175-Fc真核表达质粒。
将上述表达质粒分别转染生长良好的HEK-293F细胞，37℃，5％CO2，125rpm摇床连续培养7天，4000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清，并用0.45μm滤膜过滤，将处理好的样品以proteinA(购自GE)亲和柱进行亲和纯化，最终获得纯化的单链抗体-Fc融合蛋白scFv-125-Fc(简称scFv-125)、scFv-163-Fc(简称scFv-163)、scFv-175-Fc(简称scFv-175)，鉴定结果如图3。
实施例2、CLD18A1或CLD18A2的稳定表达细胞系的构建
1.CLD18A1和CLD18A2的表达载体的构建及慢病毒的制备
通过基于PCR搭桥的基因合成技术全系列合成CLD18A1完整编码序列(GenBank：NM_016369)和CLD18A1完整编码序列(GenBank：NM_001002026)，在编码的c端插入Flag标签(DYKDDDK)，并在合成基因片段的两端分别带上MluI/SalI(购自NEB)酶切位点，通过MluI/SalI双酶切，以T4DNA连接同样经MluI/SalI双酶切的载体质粒pWPT(购自addgene公司)，转化于宿主菌TOP10中，挑取克隆PCR鉴定并测序确认获得正确的慢病毒载体质粒PWPT-CLD18A1、PWPT-CLD18A2。将上述质粒分别与包装辅助质粒(pGag-pol、pREV、pVsv-g(均购自addgene公司)按一定比例共转染至293T细胞，分别于转染48h及72h后收集CLD18A1、CLD18A2病毒液，分装，-80℃保存。
2.CLD18A1，CLD18A2外源表达稳定系的建立及及Westernblot检测
将上述收集的CLD18A1或CLD18A2病毒液分别加至铺于6cm平板内的293T细胞中，72h后收集细胞，使用细胞裂解液进行裂解。另外，使用CLD18A2病毒液分别感染人的胃癌BGC-823(购自中国科学院上海细胞库，TCHu11)和NCI-N87(购自ATCC，CRL-5822)细胞系，细胞长满后收集细胞使用细胞裂解液进行裂解。将裂解收集的细胞蛋白取40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后对凝胶进行免疫印迹，并用小鼠抗Flag抗体(购自SigmaAldrich)染色。PBS洗涤后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体(购自SantaCluz)孵育后使用ECL试剂显色，最后进行显影。
Westernblot结果显示，在转染了CLD18A1或CLD18A2的293T细胞(即293T-CLD18A1，293T-CLD18A2)以及转染CLD18A2的BGC-823和NCI-N87细胞(即BGC-823-CLD18A2，NCI-N87-CLD18A2)中可检测到分子量大小约28KD的条带，而在未转染的空细胞中未检测到相应条带(图4)，说明外源表达CLD18A1，CLD18A2的细胞系构建成功。
3.流式分析各个细胞系与抗CLD18A2抗体的结合情况实验步骤
通过荧光激活细胞分选仪(FACS)(BD公司，FACSCalibur)分析单链抗体scFv-125，scFv-163和scFv-175各自与下列各细胞系的结合能力。
具体方法如下：
1).取对数生长期的293T，293T-CLD18A1，293T-CLD18A2，BGC-823，BGC-823-CLD18A2，NCI-N87，NCI-N87-CLD18A2肿瘤细胞接种到6cm平皿中，接种细胞密度约为90％，37℃孵箱过夜培养。
2).使用10mM的EDTA消化细胞，200g×5min离心收集细胞。以1×106～1×107/mL的浓度重悬于1％含小牛血清的磷酸盐缓冲液(NBSPBS)中，按100ul/管的量加入流式专用管中。
3).200g×5min离心，弃上清。
4).分别加入待测抗体scFv-125，scFv-163和scFv-175，同时以无关抗体作为阴性对照，抗体终浓度为20μg/ml，每管加入100ul。冰浴，45分钟。
5).每管加入2ml1％NBSPBS，以200g×5min离心，共二遍。
6).弃上清，加入1:50稀释的FITC荧光标记的羊抗人抗体(来自上海康成生物工程有限公司)，每管加入100ul。冰浴，45分钟。
7).每管加入2ml1％NBSPBS，以200g×5min离心，共二遍。
8).弃上清，重悬于300ul1％NBSPBS中，流式细胞仪检测。
9).应用流式细胞仪数据分析软件WinMDI2.9分析数据。
流式细胞分析结果表明，单链抗体scFv-125不仅能与CLD18A1，也能与CLD18A2稳定表达的293T细胞结合(图5)，表明该单链抗体缺乏对于CLD18A2的结合特异性。幸运地，单链抗体ScFv-163和scFv-175可以特异识别CLD8A2稳定表达的293T，而不与稳定表达CLD18A1的293T细胞结合，表明这两个单链抗体可以特异识别CLD18A2。此外，这两个单链抗体也可以特异识别稳定转染CLD18A2的BGC-823或NCI-N87细胞系，但不与未转染CLD18A2的BGC-823或NCI-N87细胞结合。
实施例3、表达本发明核酸编码的嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建及病毒包装
表1解释了本发明示例的嵌合抗原受体各部分的连接顺序，该连接还可参见图2中所示。
表1
嵌合抗原受体 胞外结合区-跨膜区-胞内信号区1-胞内信号区2etc
CLD18A2-δZ scFv(CLD18A2)-CD8-CD3δzeta(阴性对照)
CLD18A2-163-Z scFv(CLD18A2-163)-CD8-CD3zeta
CLD18A2-175-Z scFv(CLD18A2-175)-CD8-CD3zeta
CLD18A2-163-28BBZ scFv(CLD18A2-163)-CD28a-CD28b-CD137(即：4-1BB)-CD3zeta
CLD18A2-175-28BBZ scFv(CLD18A2-163)-CD28a-CD28b-CD137-CD3zeta
1、核酸片段的扩增
(1)scFv(CLD18A2-163，CLD18A2-175)序列的扩增
以V5-scFv-163-Fc质粒为模板，采用的引物对正向引物(SEQIDNO:7)包含部分2A的序列和反向引物(SEQIDNO:8)包含部分CD8hinge序列，PCR扩增获得scFv(CLD18A2-163)；同样的，以V5-scFv-175-Fc质粒为模板，采用的引物对正向引物包含部分2A的序列和反向引物(SEQIDNO:9)和反向引物包含部分CD8hinge序列(SEQIDNO:10)PCR扩增获得scFv(CLD18A2-175)。
(2)嵌合抗原受体其他部分的核酸序列
抗CLD18A2嵌合抗原受体蛋白的除scFv(CLD18A2-163，CLD18A2-175)外其他部分的核酸序列分别以专利申请号为201310164725.X中公开的序列SEQIDNO:18，21为模板通过PCR方式获得。
其中eGFP-F2A序列以专利申请号201310164725.X中所载的SEQIDNO:18质粒为模板，以引物对(SEQIDNO:11，12)进行PCR扩增获得。
CD8-CD3ζ(Z)和CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(28BBZ)的获得：分别以scFv(GPC3)-CD8-CD3ζ(专利申请201310164725.X中SEQIDNO:18)和scFv(GPC3)-CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(专利申请201310164725.X中SEQIDNO:21)为模板，采用引物对(SEQIDNO:13，14)通过PCR扩增，分别获得CD8-CD3ζ(Z)和CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(28BBZ)片段。
201310164725.X中SEQIDNO:18对应本发明中SEQIDNO:23序列。
201310164725.X中SEQIDNO:21对应本发明中SEQIDNO:24序列。
2、核酸片段的拼接
分别将如前述获得的eGFP-F2A核酸片段，与等摩尔的scFv(CLD18A2-163)或scFv(CLD18A2-175)核酸片段以及等摩尔的CD8-CD3ζ(Z)或CD28a-CD28b-CD137-CD3ζ(BBZ)核酸片段，按图2所示进行三片段拼接并PCR，拼接条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及正向引物(SEQIDNO:11)和反向引物(SEQIDNO:14)后PCR扩增30个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行30个循环，然后总延伸68℃，10min。扩增获得的片段分别为(表2)：
eGFP-scFv(CLD18A2)-163-Z(SEQIDNO:15，19)，
eGFP-scFv(CLD18A2)-163-BBZ(SEQIDNO:16，20)，
eGFP-scFv(CLD18A2)-175-Z(SEQIDNO:17，21)，
eGFP-scFv(CLD18A2)-175-BBZ(SEQIDNO:18，22)。
结果鉴定如图6。
表2、本发明中的序列
3、慢病毒质粒载体的构建
作为示例的构建本发明的慢病毒质粒载体使用的载体系统属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2(购自addgene)；编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G(购自addgene)及基于空载体pWPT-eGFP(购自addgene)的编码目的基因CAR的重组表达载体。
在空载体pWPT-eGFP中，延长因子-1α(elongationfactor-1α，EF-1α)的启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，eGFP)的表达，而在编码目的基因CAR的重组表达载体中通过来自口蹄疫病毒的核糖体跳跃序列(foodandmouthdiseasevirus，FMDV，ribosomalskippingsequence，F2A)实现eGFP与目的基因CAR的共表达。F2A是来自口蹄疫病毒的2A(或称为“自剪切多肽2A”)的一段核心序列，具备2A的“自剪切”功能，可以实现上游和下游基因共表达。2A由于其剪切效率高、上下游基因表达平衡性高及自身序列短小的优点为构建基因治疗多顺反子载体提供了一种有效的可行策略。尤其在基于嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的免疫治疗中多应用该序列实现目的基因与GFP或者eGFP的共表达，通过检测GFP或者eGFP即可间接检测CAR的表达。
本实施例构建了由F2A相连的eGFP与特异性CAR共表达的慢病毒表达载体，统称为pWPT-eGFP-F2A-CAR(图1)。上述步骤2中获得的目的基因eGFP-F2A-CAR(参见实施例3中的1(2)，F2A后面的元件简称为CAR)通过MluI和SalI限制性内切酶双酶切，连入同样双酶切的pWPT载体中，从而构建表达各嵌合抗原受体的慢病毒载体。构建成功的载体经MluI和SalI酶切鉴定及序列测定正确后，可以准备用于慢病毒包装。如前所述，eGFP-F2A-CAR转录为一条mRNA，但最终翻译为eGFP和抗CLD18A2嵌合抗原受体两条肽链，其中在CD8α信号肽的引导下抗CLD18A2嵌合抗原受体将定位在细胞膜上。
得到的含有各目的CAR的载体如下：
pWPT-eGFP-F2A-scFv(CLD18A2)-163-Z；
pWPT-eGFP-F2A-scFv(CLD18A2)-163-BBZ；
pWPT-eGFP-F2A-scFv(CLD18A2)-175-Z；
pWPT-eGFP-F2A-scFv(CLD18A2)-175-BBZ。
4、质粒转染293T包装慢病毒
以6×106的密度接种培养至第6～10代的HEK-293T细胞(ATCC：CRL-11268)于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染。培养基为含10％胎牛血清(购自PAA公司)的DMEM(购自PAA公司)，次日，在转染前约2小时更换培养液为无血清DMEM。
转染的步骤如下：
4.1将20μg空质粒pWPT-eGFP(mock对照)或20μg的各目的基因质粒pWPT-eGFP-F2A-CAR，分别与15μg包装质粒PAX2：和6μg包膜质粒pMD2.G，溶入500μLMillQ水中，混匀，
4.2逐滴加入62μL2.5MCaCl2(购自Sigma公司)，以1200rpm/minvortex混匀，
4.3最后逐滴加入500μL2×HeBS(280mMNaCl，10mMKCl，1.5mMNa2HPO4·2H2O，12mM葡萄糖，50mMHepes(购自Sigma公司)，pH7.05，0.22μM过滤除菌)，1200rpm/minvortex混匀10s，
4.4立即逐滴加入培养皿中，轻轻摇匀，37℃，5％CO2，培养4～6h后，更换为含10％胎牛血清的DMEM。
在转染次日观察转染效率(即呈绿色荧光的细胞比例)，～80％的阳性转染效率即为转染实验成功。在转染48h或72h后，使用0.45μm滤器(购自Millipore公司)过滤收集病毒，然后采用BeckmanOptimaL-100XP超速离心机28000rpm，4℃离心2小时，弃离心上清，离心所得沉淀用1/10～1/50原液体积的Quantum007培养液(购自PAA公司)进行重悬，以100μL/管分装冻存于-80℃，以待病毒滴定或感染T淋巴细胞。
5、测定包装有mock或者eGFP-F2A-CAR的慢病毒滴度
第一天，以1×105/mL接种293T细胞于96孔培养板，100μL/孔，37℃，5％CO2培养，培养液为含10％胎牛血清的DMEM。第二天，弃50μL/孔培养上清，补加50μL/孔新鲜上述培养液，并含终浓度为6μg/mL的polybrene，37℃，5％CO2孵育30min。加10μL/孔的病毒原液或1μL/孔的病毒浓缩液，5倍稀释，4个梯度，两个复孔，37℃，5％CO2培养。感染48h后，流式细胞仪检测eGFP，以阳性率为5～20％的细胞数为宜，计算滴度(U/mL)＝阳性率×稀释倍数×100×104。磷酸钙转染法包装的上述包含mock即空载体对照和各eGFP-F2A-CAR的病毒的滴度均为约0.5～2×106U/mL的水平，经浓缩后所测的病毒滴度约为2×107U/mL。
实施例4、重组慢病毒感染CTL细胞
由健康人外周血通过密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞(上海市血液中心提供)，外周血单个核细胞通过CTL细胞磁珠(购自StemCellTechnologies)负性分选方法获得CTL，分选后的CTL细胞进行流式细胞检测CTL细胞的纯度，以CTL细胞的阳性率≥95％为宜进行下一步操作。以约1×106/mL密度加入Quantum007淋巴细胞培养基液(购自PAA公司)培养并以细胞：磁珠比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen公司)和终浓度100U/mL的重组人IL-2(购自上海华新生物高技术有限公司)刺激培养24h。然后以MOI≈5用上述重组慢病毒感染CTL细胞。感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度100U/mL的重组人IL-2。
感染的CTL细胞在培养第8天时通过流式细胞检测各不同嵌合抗原受体表达，由于eGFP与CAR共表达，检测eGFP的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞。以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照，表达不同嵌合抗原受体的病毒感染CTL细胞其阳性率如表3所示。该阳性率结果表明，通过慢病毒感染的方法能够获得一定阳性率的CAR+CTL细胞。
表3
转染有下列CAR的CTL细胞 CTL细胞eGFP阳性率
Mock(空载体对照) 56％
融合表达163单链抗体的CLD18A2-Z 51％
融合表达163单链抗体的CLD18A2-28BBZ 54％
融合表达175单链抗体的CLD18A2-Z 52％
融合表达175单链抗体的CLD18A2-28BBZ 55％
CTL细胞在分别感染包装有不同嵌合抗原受体的病毒后，以细胞密度为5×105/ml隔天传代培养、计数、并对传代的细胞培养液补加IL-2(终浓度为100U/ml)，培养第11天约有20～40倍的扩增，表明表达不同嵌合抗原受体的CTL细胞在体外能够进行一定数量的扩增，为后续体外毒性试验及体内试验提供了保证。
实施例5、表达嵌合抗原受体细胞的体外毒性效果实验
体外毒性实验使用的材料如下：
如表4所示的293T和胃癌细胞系作为靶细胞，效应细胞为如实施例4所验证的体外培养12天的FACS检测嵌合抗原受体表达的阳性细胞记为嵌合抗原受体阳性(CAR+)的CTL，效靶比视情况分别为3:1，1:1和1:3，靶细胞数量为10000/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值。检测时间为第18h。
其中各实验组和各对照组如下：
各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的CTL，
对照组1：靶细胞最大释放LDH，
对照组2：靶细胞自发释放LDH，
对照组3：效应细胞自发释放LDH。
检测方法：采用CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(Formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
细胞毒性计算公式为：
具体如表4和表5所示，本发明的表达嵌合抗原受体(融合表达了单链抗体163或者175)CLD18A2-ZCAR+的CTL和CLD18A2-28BBZCAR+的CTL对高表达CLD18A2的293T细胞有明显的杀伤作用，而对高表达CLD18A1的293T细胞没有杀伤，表明它们可以选择性地杀伤CLD18A2的细胞。此外，本发明的表达嵌合抗原受体CLD18A2-ZCAR+的CTL和CLD18A2-28BBZCAR+的CTL也可以对高表达CLD18A2的两种胃癌细胞系BGC-823及NCI-N87具有显著的杀伤(见表4和表5)，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强，而对不表达CLD18A2的BGC-823及NCI-N87却没有特异性细胞毒性作用。
效靶比依赖性的数据进一步显示表达本发明的抗CLD18A2嵌合抗原受体的CTL对高表达CLD18A2的胃癌细胞的特异性细胞毒性作用。
相比较而言，被含有mock质粒(不携带CLD18A2-CAR的空质粒载体pWPT-eGFP)的病毒转染的作为空白对照的CTL显示对上述三种高表达CLD18A2的细胞系的细胞毒性作用均非常低。其对高表达CLD18A2的细胞系的细胞毒性与表达本发明的抗CLD18A2嵌合抗原受体的CTL的细胞毒性数据呈现出非常显著的差异。
以上结果表明，选择针对CLD18A2的单链抗体所构建的嵌合抗原受体，能够选择性地杀伤高表达CLD18A2的靶细胞。此外，从细胞毒性数据来看，CLD18A2-28BBZ的CART比CLD18A2-Z的CART对表达CLD18A2的细胞毒性更强。
表4、融合表达单链抗体163的CART细胞的细胞毒性
表5、融合表达单链抗体175的CART细胞的细胞毒性
讨论
目前CART细胞已经成为一种潜在的治疗手段。但是很多肿瘤，比方说胃癌尚没有有关CART细胞治疗的报道。已有研究表明，CLD18A2可能是胃组织的特异标志物，因此，也可能成为胃癌等肿瘤的治疗靶点。但是，目前关于CLD18A2作为治疗靶点的候选药物只有单克隆抗体，它是否能成功用于相应肿瘤治疗尚不得而知。因此，有必要寻找新的治疗手段。考虑到CLD18A2的组织特异性，本发明设想如果能够用CART细胞进行靶向治疗，有望可以得到一种新的抗癌制剂。但是，我们知道CLD18A2抗原是一个紧密连接蛋白，是否能够被CART细胞接触并引发对相应靶细胞的杀伤尚不得而知。此外，由于蛋白质空间构象是牵一发而动全身，很多单抗演化成单链抗体往往丧失了抗原结合活性或特异性。幸运地，本发明人发现有两个单链抗体(163和175)保留单克隆抗体的抗原结合特异性。的进一步研究表明，由这两个单链抗体所构成的CART细胞保留了对CLD18A2阳性细胞的选择性杀伤作用。本发明的结果表明，CLD18A2确实可以成为CART细胞治疗的靶点；针对CLD18A2的CART细胞是一种肿瘤治疗候选新手段。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (15)

1.表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包含顺序连接的：胞外结合区，跨膜区和胞内信号区，其中所述胞外结合区包含特异性识别CLD18A2的蛋白。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的特异性识别CLD18A2的蛋白是抗体或配体；较佳地，所述的抗体是单链抗体或结构域抗体。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的跨膜区是包含CD8或CD28的跨膜区和铰链区的序列。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的胞内信号区选自：CD3ζ，FcεRIγ，CD27，CD28，CD137，CD134的胞内信号区序列，或其组合。
5.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括如下的顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区：
特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD8和CD3ζ；
特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD8、CD137和CD3ζ；
特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区和CD3ζ；或
特异性识别CLD18A2的单链抗体、CD28分子的跨膜区、CD28分子的胞内信号区、CD137和CD3ζ。
6.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有SEQIDNO:19～22任一所述的氨基酸序列。
7.编码权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体的核酸。
8.如权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述的核酸具有SEQIDNO:15～18任一所述的核苷酸序列。
9.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求7-8任一所述的核酸。
10.如权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体来源于慢病毒质粒pWPT。
11.一种病毒，其特征在于，所述的病毒包含权利要求9或10所述载体。
12.权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体、或权利要求7或8所述的核酸、或权利要求9或10所述的表达载体、或权利要求11所述的病毒的用途，用于制备靶向CLD18A2的基因修饰的T淋巴细胞。
13.一种基因修饰的T淋巴细胞，其特征在于，其转导有权利要求7或8所述的核酸，或权利要求9或10所述的表达载体或权利要求11所述的病毒。
14.一种基因修饰的T淋巴细胞，其特征在于，其表面表达一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列选自SEQIDNO:19-22任一所述的氨基酸序列。
15.权利要求13或14所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤的药物，所述的肿瘤是CLD18A2阳性的肿瘤。
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