CN105062980A

CN105062980A - 改进的病毒纯化方法

Info

Publication number: CN105062980A
Application number: CN201510475203.0A
Authority: CN
Inventors: M.C.科菲
Original assignee: Oncolytics Biotech Inc
Current assignee: Oncolytics Biotech Inc
Priority date: 2004-10-22
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2015-11-18
Also published as: BRPI0516221A; HK1100959A1; SG156673A1; ES2562237T3; IL182562A0; ZA200704034B; JP2008516616A; CA2584142C; AU2005297372A1; US7901921B2; JP4898690B2; CA2584142A1; DK1814982T3; WO2006042414A1; EP1814982B1; AU2005297372B2; US20060088869A1; MX2007004696A; CN101098959A; EP1814982A4

Abstract

本发明涉及改进的病毒纯化方法。特别是涉及纯化呼肠孤病毒的方法。可以使用去污剂从细胞培养物提取感染性病毒，生产高滴度的病毒，然后可以通过简单的步骤，例如过滤和柱色谱，纯化病毒。还提供了根据本发明制备的病毒和包含所述病毒的组合物。

Description

改进的病毒纯化方法

本申请是申请日为2005年10月21日的中国专利申请200580044412.4“改进的病毒纯化方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及从细胞培养物提取病毒的方法。更具体地，该方法可以用于提取适合在临床上施用给哺乳动物(包括人)的形式的感染性病毒。

参考文献

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背景技术

由于病毒会造成非常多的疾病，病毒学已经成为被集中研究的领域。总是存在有效率地生产病毒的需求，以便分离和纯化病毒蛋白、制备疫苗、或提供用于实验室研究的感染性病毒。近年来，病毒治疗的新发展还需要有效率地生产感染性病毒。

呼肠孤病毒治疗是病毒治疗的一个实例。呼肠孤病毒是能结合许多种细胞的双链RNA病毒。但是，大多数细胞对呼肠孤病毒感染不敏感，呼肠孤病毒向它的细胞受体的结合不会在这些细胞中导致病毒复制或病毒颗粒生产。这可能是尚不清楚呼肠孤病毒与任何特定疾病有关的原因。

用ras癌基因转化的细胞会变得对呼肠孤病毒感染敏感，而它们的未转化的对应物则不然(Strongetal.，1998)。例如，当用激活的Ras或Sos(一种会激活Ras的蛋白)转化呼肠孤病毒-抗性的NIH3T3细胞时，会增强呼肠孤病毒感染。类似地，在用EGF受体基因或v-erbB癌基因(它们二者均会激活ras途径)转染后，对呼肠孤病毒感染有抗性的小鼠成纤维细胞变得敏感(Strongetal.，1993；Strongetal.，1996)。因而，呼肠孤病毒可以选择性地感染具有激活的Ras途径的细胞，并在其中复制。

ras癌基因是高比例的哺乳动物肿瘤的原因。激活ras基因自身的突变，发生在约30％所有人肿瘤中(Bos，1989)，主要是胰腺癌(90％)、散发的结肠直肠癌(50％)和肺癌(40％)，以及髓细胞白血病(30％)。在ras途径中，在ras上游或下游的因子的激活，也与肿瘤有关。例如，HER2/Neu/ErbB2或表皮生长因子(EGF)受体的过表达常见于乳腺癌(25-30％)，血小板衍生的生长因子(PDGF)受体或EGF受体的过表达在神经胶质瘤和成胶质细胞瘤中很普遍(40-50％)。已知EGF受体和PDGF受体二者在结合它们各自的配体后都会激活ras，v-erbB会编码缺少胞外域的组成性激活的受体。

由于非常多的人肿瘤的原因是原癌基因ras的基因改变或高Ras活性，呼肠孤病毒疗法是这样的情况的新的、有希望的疗法(Coffeyetal.，1998)。呼肠孤病毒疗法对Ras-相关的肿瘤细胞是高选择性的，使正常细胞不受感染。该疗法具有多种用途，且可以用于人和非人的动物。

为了生产适用于临床施用的呼肠孤病毒，需要快速且有效率的在培养细胞中生产呼肠孤病毒的方法。另外，从培养细胞纯化病毒的传统方法繁琐且费时，使得病毒生产的成本过高。因此，也需要改进的生产病毒的方法。

发明内容

本发明涉及改进的从细胞培养物提取和纯化病毒的方法，其可以用于小和大规模的病毒生产。该方法包含简单的提取步骤，其中将去污剂直接加入细胞培养物中。此后，可以通过例如过滤或离心，从提取混合物去除细胞碎片。通过色谱方法，可以进一步浓缩和/或富集得到的病毒悬浮液。根据本发明制备的病毒可以用于任何目的，包括纯化病毒蛋白，接种疫苗，感染宿主细胞和临床施用。

因此，本发明的一个方面提供了从细胞培养物生产病毒的方法，其包含下述步骤：

(a)提供已经被病毒感染的细胞培养物；

(b)将去污剂加入培养物，并温育一段时间，以产生细胞裂解物，从而从细胞提取病毒；

(c)去除细胞碎片；和

(d)收集病毒。

在步骤(c)中，可以使用任意的方法来去除细胞碎片(即澄清细胞裂解物)。该方法优选地是基于病毒和细胞裂解物中的其它组分之间的大小或密度差异的简单方法(例如，过滤或离心)。更优选地，使用过滤，尤其是分步过滤。适宜的分步过滤包含具有大孔径的预过滤器，然后是至少另一个具有比该预过滤器更小的孔径的过滤器。在一个优选的实施方案中，通过分步过滤去除细胞碎片，其包含：

(1)通过具有5μM或8μM孔径的预过滤器，进行过滤；和

(2)在步骤(1)后，通过具有3μM和0.8μM孔径的组合过滤器，进行过滤。

在另一个优选的实施方案中，上面的步骤(2)包含，在步骤(1)后，通过具有0.8μM孔径的过滤器，进行过滤。

任选地，用内切核酸酶或其它DNA剪切酶处理细胞裂解物，以裂解长的、粘性的细胞DNA。通过过滤去除细胞碎片后，可以任选地浓缩滤液，以减小病毒悬浮液的体积。可以使用任何适用于病毒浓缩的方法，优选超滤或渗滤，包括切向流过滤。示例性的方法包括板框系统和中空纤维系统。更优选地，使用中空纤维系统。在一个优选的实施方案中，具有中空纤维系统的渗滤包含，使用具有300kDa分子量截止值的中空纤维筒。

本方法可以用于生产任意的病毒，优选无包膜病毒，最优选呼肠孤病毒。呼肠孤病毒优选地是哺乳动物呼肠孤病毒，更优选人呼肠孤病毒，更优选血清型3呼肠孤病毒，最优选Dearing株呼肠孤病毒。呼肠孤病毒可以是重组的呼肠孤病毒。重组的呼肠孤病毒可以通过不同呼肠孤病毒血清型对细胞(例如哺乳动物细胞或禽细胞)的共感染产生。重组的呼肠孤病毒可以是天然存在的或非天然存在的。重组的呼肠孤病毒可以来自2种或多种呼肠孤病毒株，尤其是选自下述的2种或多种呼肠孤病毒株：Dearing株，Abney株，Jones株，和Lang株。重组的呼肠孤病毒也可以源自来自不同血清型的呼肠孤病毒的重新分配，所述血清型例如选自：血清型1呼肠孤病毒，血清型2呼肠孤病毒和血清型3呼肠孤病毒。重组的呼肠孤病毒可以包含天然产生的变体外壳蛋白编码序列或突变的外壳蛋白编码序列。

在本发明中使用的细胞培养物可以包含适用于生产目标病毒的任何细胞。就呼肠孤病毒而言，细胞优选地是人胚肾293(HEK293)细胞或由它衍生的细胞，尤其是已经适应生长在悬浮培养中的HEK293细胞。

该方法可以任选地包含离子交换色谱的步骤，其中通过在适宜的条件下结合离子交换树脂来富集病毒。然后，使用合适的洗脱溶液，从离子交换剂洗脱病毒。离子交换剂和结合/洗脱条件的选择，随待纯化的病毒而变化。就呼肠孤病毒而言，阴离子交换剂和约7.0-9.0的pH是最有效的。pH优选地是约7.5至约8.5，且最优选约8.0。优选地，在磷酸盐缓冲液中进行离子交换，例如50mM磷酸钠，pH7.2。结合/洗脱缓冲液优选地没有镁盐。

使用大小排阻色谱，也可以纯化病毒。大小排阻色谱优选地是在磷酸盐缓冲液中进行，例如50mM磷酸钠，pH7.2。另外，大小排阻色谱可以在没有镁盐的情况下进行。更具体地，可以使用离子交换和大小排阻色谱的组合。在一个实施方案中，使用阴离子交换剂、然后使用大小排阻色谱，纯化呼肠孤病毒。

本发明的另一个方面提供了一种组合物，其包含根据本文所述的任一种方法纯化的病毒。该组合物优选地适用于临床施用，尤其是临床上施用给人。更优选地，该组合物包含可药用的赋形剂和/或载体。

本发明的另一个方面提供了一种生产感染性呼肠孤病毒的方法，其包含：

(a)提供已经被呼肠孤病毒感染的HEK293细胞的培养物；

(b)通过将X-100(辛基酚聚氧乙烯(9-10)醚)加入培养物，并在约25℃至约37℃温育，从细胞提取病毒；

(c)用BENZONASETM内切核酸酶处理来自步骤(b)的混合物；

(d)通过过滤去除细胞碎片；

(e)通过超滤或渗滤浓缩滤液；

(f)通过离子交换和大小排阻色谱的组合，纯化呼肠孤病毒；和

(g)收集呼肠孤病毒。

还提供了一种包含根据本方法收集的呼肠孤病毒的组合物，尤其是另外包含可药用的赋形剂和/或载体的组合物。

在下面的附图和描述中，阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。从说明书、附图和权利要求书中，可以明白本发明的其它特征、目的和优点。

附图说明

图1显示了在150cm/h分离呼肠孤病毒超滤/渗滤(UF/DF)材料。在HR5_200Sepharose4FastFlow柱上，将该材料缓冲液交换进50mM磷酸盐pH7.2，5％甘油。加入0.30CV样品。收集从0.37CV至0.62CV洗脱的空体积，x-轴的单位是柱体积(CV)；y-轴是在280纳米的毫吸收单位(milli-absorptionunit)。

图2显示了以50cm/h在AktaExplorer100上分离大小排阻色谱(SEC)预纯化的材料。缓冲液A：50mM醋酸钠pH5.6，5％甘油。缓冲液B：A+1M氯化钠，x-轴的单位是ml；y-轴是在280纳米的毫吸收单位。A280CM线指示着来自1mlHiTrapCMSepharose柱的洗脱特征，A280SP线来自1mlHiTrapSPSepharose柱。

图3显示了SEC预纯化的呼肠孤病毒在不同HiTrap阴离子交换柱上的分离。流速；50cm/h。缓冲液A：25mMTrisClpH7.2，5％甘油。缓冲液B：A+1M氯化钠。进行10CV梯度来洗脱材料，x-轴的单位是ml；y-轴是在280纳米的毫吸收单位。在A280nm测得的洗脱谱如下：A280DEAE＝DEAESepharoseFastFlow；A280QXL＝QSepharoseXL，ANXHighSub＝ANXhighsub；QHP＝QSepharoseHP。

图4显示了以50cm/h，在HR5_100QSepharoseHP柱上测定5-10％临界点时的动态结合容量。观察到在临界点之前加入了超过12CV。缓冲液A：50mM磷酸钠pH7.2，5％甘油。缓冲液B：50mM磷酸钠pH7.0，5％甘油，2M氯化钠。使用10CV线性梯度至1M氯化钠，然后是5CV步骤至2M氯化钠。通过RT-PCR和蛋白印迹，测定病毒级分(病毒活性)。Y-轴：在A280nm的mAU，x-轴：按ml计的体积。

图5显示了容易放大的将呼肠孤病毒捕获到QSepharoseHR上的分步方法的开发。在与AektaExplorer100相连的HR5_100QSepharoseHP柱上，纯化5柱体积的用稀盐酸调节至pH7.2的UF/DF呼肠孤病毒。缓冲液A：50mM磷酸钠pH7.2，5％甘油。缓冲液B：50mM磷酸钠pH7.0，5％甘油，2M氯化钠。分步梯度：12.0％B使用5CV(洗涤)，25％B使用5CV(洗脱)，50％B使用5CV(再生)，CIP使用2CV(1M氢氧化钠，随后5CV100％B)。Y-轴：mAU，x-轴：按ml计的体积。用reo+指示含有病毒的级分。

图6显示了将呼肠孤病毒捕获到QSepharoseHP上的8倍放大。在HR10_100QSepharoseHP柱上，纯化10柱体积用稀盐酸调节至pH7.2的UF/DF呼肠孤病毒。缓冲液A：50mM磷酸钠pH7.2，5％甘油。缓冲液B：50mM磷酸钠pH7.0，5％甘油，1M氯化钠。分步梯度：12.0％B使用5CV(洗涤)，25％B使用5CV(洗脱)，50％B使用5CV(再生)，CIP使用2CV(1M氢氧化钠，随后5CV100％B)。Y-轴：mAU，x-轴：按ml计的体积。病毒洗脱在约5ml体积的级分B3/2中。

图7显示了在HR10_200Sepharose4FastFlow20ml柱上纯化病毒级分的第二步的8倍放大。使用了0.25CV(级分B3/2如图6所示)。线性流速：150cm/h。缓冲液：PBS，5％甘油。

图8A显示了银染色的4-12％SDSPAGE凝胶：泳道1：QSepharoseHP纯化后的病毒级分，泳道2：CsCl纯化的标准品，泳道3：稀释2倍的SEC纯化的最终材料。

图8B显示了纯化方法的4-12％SDSPAGE考马斯染色的凝胶。泳道1，原料，泳道2QSepharose材料，泳道3稀释2倍的CsCl材料，泳道4未稀释的CsCl材料，泳道5SEC纯化的材料。

图8C是通过TCID50测得的呼肠孤病毒回收的表。

具体实施方式

在更详细地描述本发明之前，如下定义在本申请中使用的术语，除非另有说明。

定义

如本文所使用的，″粘附细胞″指细胞培养物中粘附到培养容器上的细胞。粘附细胞的实例包括单层细胞，它们是会在培养容器的表面形成单细胞层的细胞。″悬浮细胞″或″悬浮的细胞″指细胞培养物中不会粘附到培养容器上的细胞。悬浮细胞可以生长在“旋转培养”中，后者是在培养过程中连续搅拌培养基的培养。

如本文所使用的，″环境温度″指约10℃至约30℃的温度。环境温度优选地是约15℃至约30℃，更优选约20℃至约25℃，最优选约25℃。

如本文所使用的，“细胞结合的”病毒是指附着或陷入产生病毒的细胞的一部分中的病毒。因而，在裂解宿主细胞之前，病毒是细胞结合的。当细胞裂解开始时，病毒可以仍然附着或陷入破碎的细胞的一部分，并保持细胞结合。但是，当病毒被游离地释放进培养基中时，它不再是细胞结合的。“游离于细胞的病毒”是未结合细胞的病毒。

如本文所使用的，″细胞培养物″或″细胞的培养物″指在它们的培养条件下发现的培养的细胞的群体。更具体地，细胞培养物包括细胞和培养基。已经沉淀的细胞不应视作细胞培养物，除非将它们又置于培养条件下的培养基中。

如本文所使用的，″细胞裂解″指破碎细胞的细胞膜，随后释放出细胞的全部或部分内容物。

如本文所使用的，物质的″临床施用″指，使活生物体的任意部分接触该物质，以便提高或维持该生物的健康状况。

如本文所使用的，″收集″病毒指分离由已经事先用病毒感染的细胞培养物生产的病毒的行为。典型地，通过分离细胞碎片和病毒，并收获包含病毒的部分，收集病毒。任选地，可以进一步分离病毒和可溶物，例如，通过离心。

如本文所使用的，″培养条件″指在细胞培养中使用的条件，包括但不限于温度，培养容器的类型，湿度，CO₂或在培养容器中使用的任何其它气体的浓度，培养基的类型，培养的细胞的初始密度，和在用病毒感染细胞的情况下，初始感染复数。

如本文所使用的，″细胞病变效应″是对感染的宿主细胞的损害。细胞病变效应可以由细胞的外观变得膨胀和颗粒状以及细胞块破碎来指示。在活细胞计数中，表现出细胞病变效应的细胞也可以吸收染料。

如本文所使用的，″去污剂″是具有亲水基团和疏水基团的物质。去污剂优选地是合成的化合物，更优选可生物降解的合成化合物。在本发明中使用的去污剂会增强细胞膜的破碎，以促进破碎的细胞的内容物的释放。

如本文所使用的，当细胞膜破裂且至少一部分细胞内容物从细胞中释放出来时，细胞是“破碎的”。通过例如冻融，超声处理或去污剂处理，可以破碎细胞。

如本文所使用的，″提取″病毒指将细胞结合的病毒转化成游离于细胞的病毒的行为。

如本文所使用的，″HEK293细胞″指命名为293的人胚肾细胞系(ATCC号CRL-1573)或它的衍生物。例如，293/SF细胞(ATCC号CRL-1573.1)是已经适应在无血清的培养基中生长的HEK293细胞。本发明还预见到适应在其他培养条件下生长的HEK293细胞，或用外源DNA转化的任意种类的HEK293细胞或衍生物，条件是，该转化不会损害细胞的支持如本发明所述的有效呼肠孤病毒生产的能力。

如本文所使用的，在将去污剂加入细胞培养物中之后的″温育″指允许细胞培养物与去污剂混合一段时间的行为。

如本文所使用的，″感染复数″或″MOI″指，当使病毒接触细胞时，病毒数与细胞数的比例。

如本文所使用的，″无包膜病毒″是不具有包膜的病毒。例如，无包膜病毒可以是属于下述科的任何病毒：腺病毒科(例如腺病毒)，小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒)，呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒)，乳头多瘤空泡病毒科(例如乳头瘤病毒)，细小病毒科(例如基尔汉大鼠病毒)或虹彩病毒科(例如大蚊虹彩病毒)。

如本文所使用的，″呼肠孤病毒″指归类于呼肠孤病毒属的任何病毒，无论是天然存在的、修饰的，还是重组的。呼肠孤病毒是具有双链的分段的RNA基因组的病毒。病毒体的直径为60-80nm，且具有2个同心的衣壳，其中的每一个都是二十面体。基因组由10-12个离散的片段状的双链RNA组成，总基因组大小为16-27kbp。各个RNA片段的大小不相同。已经从许多物种中回收了3种不同的、但是相关的呼肠孤病毒类型。所有3种类型具有共同的补体结合抗原。

人呼肠孤病毒由3种血清型组成：1型(Lang或T1L株)，2型(Jones，T2J株)和3型(Dearing株或Abney，T3D株)。在中和以及血细胞凝集素抑制测定的基础上，可以容易地鉴别3种血清型(见，例如，Fields，B.N.etal.，1996)。

呼肠孤病毒可以是天然存在的或修饰的。当可以从天然来源分离且未经实验室中的人工故意修饰时，呼肠孤病毒是″天然存在的″。例如，呼肠孤病毒可以来自″场源″，也就是说，来自已经被呼肠孤病毒感染的人。

呼肠孤病毒可以是重组的呼肠孤病毒，它源自2种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组片段的重组/重新分配。呼肠孤病毒基因组片段的重组/重配可以在至少两种遗传上不同的呼肠孤病毒感染宿主生物后天然地发生。重组的病毒体也可以在细胞培养物中产生，例如，通过用遗传上不同的呼肠孤病毒共感染许可的宿主细胞(Nibertetal.1995)。

因此，本发明预见到源自2种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组片段的重新分配的重组呼肠孤病毒，所述呼肠孤病毒包括但不限于，人呼肠孤病毒，例如1型(例如，Lang株)，2型(例如，Jones株)，和3型(例如，Dearing株或Abney株)，非人哺乳动物呼肠孤病毒，或禽呼肠孤病毒。本发明还预见到源自2种或多种遗传上不同的呼肠孤病毒的基因组片段的重新分配的重组呼肠孤病毒，其中至少一种亲代病毒是遗传工程化的，其包含一个或多个化学合成的基因组片段，后者已经用化学的或物理的诱变剂处理，或其自身是重组事件的结果。本发明还预见到已经经历在有化学诱变剂或物理诱变剂存在下的重组的重组呼肠孤病毒，所述化学诱变剂包括但不限于硫酸二甲酯和溴化乙锭，所述物理诱变剂包括但不限于紫外线和其它形式的辐射。

本发明还预见到在一个或多个基因组片段中包含缺失或重复的重组呼肠孤病毒，其包含作为与宿主细胞基因组重组的结果的附加遗传信息，或包含合成基因。

通过将突变的外壳蛋白(例如σl)掺入病毒体的外衣壳，可以修饰呼肠孤病毒。通过替换、插入或缺失，可以使蛋白突变。替换包括，插入不同的氨基酸来替代天然的氨基酸。插入包括，将额外的氨基酸残基插入蛋白的一个或多个位置。缺失包括，缺失蛋白中的一个或多个氨基酸残基。通过本领域已知的方法，可以产生这样的突变。例如，编码一种外壳蛋白的基因的寡核苷酸定点诱变，可以导致希望的突变外壳蛋白的产生。突变蛋白在呼肠孤病毒感染的体外哺乳动物细胞(例如COSl细胞)中的表达，会导致突变蛋白向呼肠孤病毒病毒体颗粒中的掺入(Turner和Duncan，1992；Duncanetal.，1991；Mahetal.，1990)。

如本文所使用的，″细胞的生存力″或″保持存活的细胞的百分比″是群体中没有表现出细胞病变效应的细胞的百分比。

如本文所使用的，″病毒感染″指病毒进入细胞、和随后的病毒在细胞中的复制。

方法

以前，我们已经开发了使呼肠孤病毒在HEK293细胞中生长的方法(美国专利申请公开号20020037576)。呼肠孤病毒会在HEK293细胞中复制，在病毒感染后的短时间内，在细胞中产生高滴度的病毒，从而提供简单且有效率的生产呼肠孤病毒的方法。另外，HEK293细胞已经适应悬浮生长，其可以大量培养，我们还开发了大规模生产方法。为了从悬浮培养物分离呼肠孤病毒，我们最初按照传统方法来提取和纯化病毒颗粒。简而言之，通过冻融来破碎细胞，并用(1，1，2-三氯-1，1，2-三氟-乙烷)提取3次。然后，用CsCl梯度和超速离心纯化病毒颗粒。但是，该方法对于大规模病毒生产而言过于繁琐和费时。

因此，我们开发了简化的提取呼肠孤病毒的方法。发现通过将HEK293细胞培养物与去污剂一起温育短时间，会将高水平的感染性呼肠孤病毒释放进提取物。然后通过基于大小或密度差异的简单的分离方法，例如过滤、渗滤或大小排阻，可以分离病毒和细胞碎片，且得到的病毒可以用于呼肠孤病毒治疗。根据本发明生产的呼肠孤病毒适用于施用给人，且该方法符合在有去污剂存在下破碎细胞的FDA推荐。

我们在预实验中测试了4种去污剂，非离子型去污剂辛基酚聚氧乙烯(9-10)醚(X-100)，辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(NONIDETTMP40或NP-40)和聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯(20)，以及离子型去污剂去氧胆酸钠。所有4种去污剂都能裂解细胞，并释放出超过背景水平的感染性病毒颗粒，其中X-100是最有效的。预见到其它去污剂，尤其是在经常用于破碎细胞的那些，也可以用于本发明中。这些其它的去污剂的实例包括，其它的去污剂，其它的去污剂(例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯80)，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸锂，和十二烷基三甲基氯化铵。

结果还表明，去污剂提取可以比冻融更有效，后者是标准的病毒提取方法。另外，已经报道，为了从Vero细胞(其中呼肠孤病毒是高度细胞结合的)提取禽呼肠孤病毒，蒸馏的去离子水比冻融、(1，1，2-三氯-1，1，2-三氟-乙烷)提取或胰蛋白酶处理更有效(Drastinietal.，1992)。本发明提供了更快速且方便和有效的方法，因为不再需要蒸馏水方法所需要的沉淀细胞和重新悬浮。

预见到在本发明中可以使用高浓度的盐(例如盐酸胍)来替代去污剂。但是，优选地使用去污剂，而不是高浓度的盐。

本发明因而提供了快速且简单的从细胞培养物提取病毒的方法。去污剂可以直接加入悬浮培养物，或加入粘附细胞的培养基中。在任一种情况下，不需要首先去除培养基。另外，不需要其它的破碎细胞或提取病毒的方法，例如冻融或超声处理。

本发明的一个重要特征是，提取过程可以在环境温度或环境温度以上进行。传统地，病毒提取和纯化是在低温进行，典型地在0-4℃，以保持蛋白的结构和功能。出于相同的原因，在提取溶液中通常也包含蛋白酶抑制剂。因此，令人惊讶的是，本方法可以在更高的温度进行，且不需要任何蛋白酶抑制剂。实际上，高达37℃的温度会产生与25℃的温度大约相同量的感染性病毒。结果，可以如下进行病毒提取：将去污剂直接加入细胞培养物，并继续搅拌培养物，以便释放病毒，无需改变温度。或者，由于根据本发明的病毒提取不需要维持恒定温度，操作可以在环境温度进行，尽管环境温度可能随地方不同而变化，或在同一个地方随时间不同而变化。

提取后，可以纯化病毒，这基于例如，病毒和提取物中的其它组分之间的大小或密度差异。更具体地，可以采用过滤或离心从病毒去除细胞碎片。为了优化过滤条件，我们测试了在有几种不同的提取去污剂存在下多种过滤器的效果(实施例1)。证实分步过滤方法是最有效的。因而，首先使用具有相对较大孔径(例如，5μM或8μM)的预过滤器来从提取混合物中去除大碎片，随后使用具有小孔径的过滤器，例如含有3μM过滤器和0.8μM过滤器的组合过滤器单元。在没有预过滤器的情况下，提取混合物会迅速堵塞过滤器，从而浪费材料和时间。在另一个实施方案中，在5μM或8μM预过滤器步骤之后，可以使用具有0.8μM单一孔径的过滤器。

如实施例1所证实的，基于过滤后收集的体积，优选地使用1％X-100进行病毒提取。另外，醋酸纤维素膜过滤器比玻璃纤维膜过滤器好，因为醋酸纤维素膜过滤器允许滤过更大体积的提取混合物，使它更适合大规模生产。

根据病毒生产的目的，可能希望浓缩含有病毒的滤液。在实施例2和4中证实了使用超滤/渗滤的浓缩步骤。在实施例2中，测试了2种超滤/渗滤系统，PallFiltron的板框盒和A/GTechnology的中空纤维筒。结果表明，在它们的操作速度或体积损失的程度方面，两种系统是相当的，但是中空纤维筒更容易操作。在实施例4中，结果表明，具有300kDa分子截止值的中空纤维筒会为后续纯化提供良好的材料。

基于它的表面电荷，可以进一步纯化病毒。因为不同的病毒具有不同的表面蛋白，这决定了它们在任意特定pH时的表面电荷，对于每种病毒，必须确定合适的纯化条件。实施例3解释了确定呼肠孤病毒的最佳离子交换条件。因而，在不同的pH，使用含有不同树脂的离子交换柱来纯化已经如上所述提取、过滤和浓缩的呼肠孤病毒制品。结果表明，含有ANXSEPHAROSETM的弱阴离子柱在pH7.0-8.5时是最有效的。pH优选地是约7.5或8.0，最优选约8.0。

也可以基于大小差异来纯化病毒，例如，使用大小排阻色谱。就呼肠孤病毒而言，离子交换和大小排阻色谱的组合是特别有效的。优选地，在大小排阻色谱之前使用阴离子交换柱。还优选地，在结合/洗脱缓冲液中避免镁盐。使用磷酸盐缓冲液而不是基于Tris的缓冲液，会提高结合和选择性。在合适时，也可以使用其它的色谱方法，例如基于亲合力或疏水相互作用的那些。因此，可以使用柱色谱作为CsCl密度梯度超速离心的有效替代方案，以达到良好的产率、纯度和规模。

本方法可以用于使用HEK293细胞以外的细胞的呼肠孤病毒生产，所述细胞包括但不限于，小鼠L929，Vero和中国仓鼠卵巢细胞。预见到本方法也可以用于其它病毒，尤其是其它无包膜病毒。本领域的普通技术人员基于本文公开的内容，可以确定用于纯化其它病毒的合适条件。使用本方法可以制备的病毒包括，但不限于，下述科的病毒：肌病毒科，siphoviridae，podpviridae，teciviridae，corticoviridae，原生病毒科，lipothrixviridae，fuselloviridae，痘病毒科，虹彩病毒科，藻DNA病毒科，杆状病毒科，疱疹病毒科，腺病毒科，乳头多瘤空泡病毒科，多DNA病毒科，丝形病毒科，微病毒科，联体病毒科，环病毒科，细小病毒科，肝DNA病毒科，逆转录病毒科，cyctoviridae，呼肠孤病毒科，birnaviridae，副粘病毒科，弹状病毒科，纤丝病毒科，正粘病毒科，本扬病毒科，沙粒病毒科，光滑病毒科，picomaviridae，欧防风黄点病毒科，豇豆花叶病毒科，potyviridae，caliciviridae，星状病毒科，罗达病毒科，tetraviridae，蕃茄丛矮病毒科，冠状病毒科，glaviviridae，披膜病毒科，和杆状RNA病毒科。

组合物

还提供了包含根据本发明的方法制备的病毒的组合物。这些组合物可以用于分离和表征病毒蛋白、生产疫苗，或在组合物含有感染性病毒时，用作病毒原种或用于临床施用。

对于临床施用目的，组合物通常与赋形剂相混合，用赋形剂稀释，或包封在载体中，所述载体可以是胶囊、药袋、纸或其它容器的形式(WO99/08692A1)，作为药物组合物。当可药用的赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料，其起活性成分的赋形物、载体或介质的作用。因而，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、锭剂、药袋、扁胶囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、含有例如高达10重量％活性化合物的软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液和无菌包装的粉剂。

合适的赋形剂的一些实例包括乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯树胶，磷酸钙，藻酸盐，西黄芪树胶，明胶，硅酸钙，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素，无菌水，无菌盐水，糖浆，和甲基纤维素。另外，制剂可以包括：润滑剂，例如滑石粉，硬脂酸镁，和液状石蜡；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和调味剂。使用本领域已知的方法，可以将本发明的组合物配制成在施用给患者后快速、持续或延迟释放活性成分。

施用呼肠孤病毒的途径，以及制剂、载体或介质，取决于靶细胞的位置和类型。可以使用许多种施用途径。例如，对于易接近的实体瘤，可以通过直接注射进瘤中，施用呼肠孤病毒。对于造血肿瘤，例如，可以静脉内或血管内施用呼肠孤病毒。对于体内不易接近的肿瘤，例如转移灶，可以通过使它可以被全身地运输到哺乳动物体内并从而到达肿瘤的方式(例如，静脉内或肌肉内)，施用呼肠孤病毒。或者，可以将呼肠孤病毒直接施用到单一实体瘤，然后它在体内被全身地携带到转移灶。也可以如下施用呼肠孤病毒：皮下，腹膜内，鞘内(例如，对于脑瘤)，局部(例如，对于黑素瘤)，口服(例如，对于口腔瘤或食管瘤)，直肠(例如，对于结肠直肠瘤)，阴道(例如，对于子宫颈瘤或阴道瘤)，经鼻或通过吸入喷雾(例如，对于肺瘤)。优选地，通过注射施用呼肠孤病毒。

本发明的药物组合物可以掺入其中的用于口服或注射施用的液体形式包括，水溶液，适当地调味的糖浆剂，水或油悬浮液，和调味的含有食用油的乳状液，所述食用油例如玉米油、棉子油、芝麻油、椰子油或花生油，以及酏剂和类似的药物介质。

为了制备固体组合物，例如片剂，将基本的活性成分/呼肠孤病毒与药物赋形剂相混合，制成含有本发明的化合物的均匀混合物的固体预配组合物。当提及这些预配组合物是均匀的时，指活性成分均匀地分散在组合物中，使得该组合物可以容易地细分成同样有效的单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊。

可以将本发明的片剂或丸剂包衣或混合，制成能提供长效优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内部剂量和外部剂量组分，后者是前者外面的包壳的形式。两种组分可以用肠层隔开，所述肠层用于防止在胃中崩解，并允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。许多种材料可以用作这样的肠层或肠衣，这样的材料包括许多聚合酸，和聚合酸与紫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素等材料的混合物。

用于吸入或吹入的组合物包括，在可药用的水性或有机溶剂中的溶液和悬浮液，或其混合物，和粉剂。液体或固体组合物可以含有如本文所述的合适的可药用赋形剂。优选地，可以通过口服的或经鼻的呼吸途径施用组合物，实现局部的或全身的作用。使用惰性气体，可以雾化在优选地可药用的溶剂中的组合物。可以从喷雾装置直接吸入雾化的溶液，或可以将喷雾装置连接到面罩或间歇正压呼吸机上。从以适当方式输送制剂的装置，可以施用溶液、悬浮液或粉剂组合物，优选地口服或经鼻施用。

在本发明的方法中采用的另一种优选的制剂使用透皮送递装置(″贴剂″)。这样的透皮贴剂可以用于连续地或不连续地输注控制量的本发明的呼肠孤病毒。用于递送药剂的透皮贴剂的结构和使用，是本领域熟知的。见，例如，这里引作参考的美国专利号5,023,252。可以将这样的贴剂构建成用于连续地、脉冲地或根据需要递送药剂。

在Remington′sPharmaceuticalSciences中，可以找到用于本发明的其它合适的制剂。

下面的实施例用于解释本发明，不应当以任何方式视作限制本发明的范围。

实施例

在下面的实施例中，下述缩写具有下述含义。没有定义的缩写具有普遍接受的含义。

CIP＝原位清洗

CV＝柱体积

CI＝置信区间

℃＝摄氏度

DF＝渗滤

DTT＝二硫苏糖醇

FBS＝胎牛血清

g/L＝克/升

hr＝小时

β-ME＝β-巯基乙醇

μg＝微克

μl＝微升

μM＝微摩尔

mAU＝毫吸收单位

mg＝毫克

ml＝毫升

mM＝毫摩尔

M＝摩尔

MOI或m.o.i.＝感染复数

NP-40＝NONIDET^TMP-40(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)

PBS＝磷酸盐缓冲盐水

PFU＝噬斑形成单位

rpm＝转数/分钟

SEC＝大小排阻色谱

SDS＝十二烷基硫酸钠

TCID₅₀＝组织培养物感染剂量50

UF＝超滤

一般材料和方法(除非另有说明)

细胞和病毒

人胚肾293(HEK293)和小鼠成纤维细胞L-929细胞由生产商BioRelianceCorporation(Rockville，Md.)提供。HEK293细胞生长在含有10％热灭活的马血清和90％下述混合物的培养基中：含有2mML-谷氨酰胺的Eagle氏基本必需培养基和调节至含有1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸钠的厄尔氏平衡盐溶液。在含有10％FBS和90％下述混合物的培养基中，繁殖小鼠L-929细胞：含有2mML-谷氨酰胺的Eagle氏基本必需培养基和调节至含有1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸钠的厄尔氏平衡盐溶液。

在36℃±2℃，在6％±2％CO₂和80％±5％相对湿度下，在旋转速度为35-40rpm的旋转烧瓶中的添加了4mML-谷氨酰胺的293无血清培养基(LifeTechnologies，Rokville，Md.)中，培养293/SF细胞。

首先在根据Smith(Smithetal.，1969)纯化的L-929细胞悬浮培养物中繁殖在这些研究中使用的呼肠孤病毒血清型3的Dearing株，例外是，在提取缓冲液中省略β-巯基乙醇(β-ME)。纯化的呼肠孤病毒的颗粒/PFU比通常是100/1。通过L-929细胞上的噬斑滴定，确定病毒滴度，并表达为Log₁₀TCID₅₀/ml。然后，在293/SF细胞中大规模生产病毒。

悬浮细胞的感染

使293/SF细胞生长至10⁶/ml，并用呼肠孤病毒感染。使培养物生长，直到培养基的颜色从红色变成橙色，或直到通过活细胞计数测得细胞的生存力降至希望的水平。对于没有表现出细胞病变效应(其由细胞的外观变得膨胀和颗粒状以及细胞块破碎来指示)的细胞，可以在显微镜下进行活细胞计数。也可以通过本领域常用的活细胞染色，进行活细胞计数。

当达到希望的细胞生存力水平时，离心沉淀细胞，并重新悬浮于10mMTris，pH7.4，250mMNaCl和0.1％-100。然后，通过冻融裂解细胞，并在冰上保持20-40分钟，定期搅拌来混合和裂解细胞。在搅拌下，用等体积的预冷(1，1，2-三氯-1，1，2-三氟-乙烷)提取悬浮液10分钟，随后在4℃、在2500rpm离心10分钟，分离不同相。去除水相(上面)，并如上所述重新提取2次，通过在4℃、在25,000rpm超速离心1小时，沉淀病毒。

提取和纯化病毒的传统方法

将沉淀重新悬浮于PBS中，通过氯化铯分步梯度纯化病毒。梯度含有在10mMTris(pH7.4)中制备的2层CsCl溶液(分别是1.20g/ml和1.4g/ml)。将病毒悬浮液装载到梯度的上面，并在4℃、在26,000rpm，在SW28.1转子中离心2小时。收获病毒带(两条带中下面的带，因为上面的带含有空衣壳)，并在无菌PBS中透析。

内切核酸酶处理

用去污剂裂解细胞后，将50mMMgCl₂溶液加入粗裂解物至终浓度为1mMMgCl₂。然后加入内切核酸酶(250,000单位/ml，EMIndustries目录号1016979M)至约10单位/ml。在36℃，在保温箱中搅拌裂解物1小时。

实施例1

澄清：去除细胞碎片

本实施例的目的是开发合适的澄清方法，其与使用去污剂裂解细胞的方法相容，且适合将来的放大和生产。在本实施例中，通过3μm/0.8μm膜盒式过滤器，或通过预过滤器(5μm或8μm)和3μm/0.8μm膜盒式过滤器的组合，过滤裂解物。在本研究中使用的所有过滤器具有0.015平方英尺的表面积。基于通过0.015平方英尺膜过滤的体积，为大规模过滤确定膜的能力。另外，为3μm/0.8μm膜盒式过滤器对比两种不同的膜材料(醋酸纤维素和玻璃纤维膜)的过滤效率。

测试了3种去污剂。将携带呼肠孤病毒的细胞等量地分入3个无菌1L瓶中，所述瓶上标记了3种不同的待测裂解剂：1％X-100，0.3％X-100和0.1％Na-DOC。将体积为92mL和28mL的10％X-100加入瓶1和2中，使得这些瓶中的工作浓度分别是1％和0.3％X-100。将体积为9.2mL的10％Na-DOC加入第三个瓶中，至0.1％的工作浓度。将所有3个瓶子置于搅拌板上，在室温、在160±20rpm搅拌30分钟。对于每种裂解条件，取裂解后的样品进行滴度分析。

将约20mL50mMMgCl₂加入每个瓶中的粗裂解物，至约1mMMgCl₂的工作浓度。随后将40μL内切核酸酶(250,000单位/mL)加至约10单位/mL的工作浓度。在36℃，在设定为5的保温箱中，搅拌粗裂解物1小时。这些步骤用于去除宿主细胞DNA，和降低裂解物的粘性，从而使进一步加工更容易。

校正Watson-Marlow泵(505U)，使流速与泵速相关联。根据销售商主的建议，在澄清研究中使用5rpm的泵速(40mL/min流速)。

使来自每种处理条件的裂解物穿过下述的过滤器之一：

1)3μm/0.8μm膜盒式过滤器；

2)串连的5μm孔径预过滤器→3μm/0.8μm膜盒式过滤器；和

3)串连的8μm膜孔径预过滤器→3μm/0.8μm膜盒式过滤器。

3μm/0.8μm膜盒式过滤器具有双层异质膜结构，这允许高污物装载能力和高处理量。第一个过滤器的孔径(3μm)大于第二个过滤器(0.8μm)。预过滤器包含多层渐细的褶状无纺聚丙烯厚度过滤器材料。在本研究中使用的所有过滤器具有0.015平方英尺的表面积。为3μm/0.8μm膜盒式过滤器测试两种膜材料，即醋酸纤维素和玻璃纤维。

基于滴度值和穿过过滤器的体积，确定裂解剂和过滤器条件的最佳组合。监视跨膜的压降，以确定发生膜污损的时间。膜污损的指标是25psi的压降，超过该值时，过滤器会损坏。当单独使用3μm/0.8μm膜盒式过滤器时，在膜污损之前，不超过35mL会穿过这些膜盒式过滤器。孔径3/0.8μm的膜在5分钟内污损，表明必必须使用预过滤器来消除细胞碎片对膜的堵塞。在3/0.8μm膜盒过滤器之前使用5μm预过滤器，可以显著增加得到的滤液的量，而在经8μm预过滤器后经3μm/0.8μm膜盒过滤器过滤，会在穿过过滤器的体积方面产生最高的膜容量(每0.015平方英尺过滤器表面积，收集平均200mL)。与其它两种裂解条件相比，1％X-100会产生最好的结果。

结果还表明，基于滤过这些膜的体积，醋酸纤维素膜材料工作得比玻璃纤维膜更好。当与大批收获(在裂解和过滤之前的细胞培养物)的感染性相比较时，在任何过滤阶段都没有观察到感染性的显著降低。基于本研究的结果，20L大批收获的过滤需要1.5平方英尺膜表面积。

实施例2

浓缩

为了选择合适的系统来浓缩和渗滤澄清的裂解物，对比了来自PallFiltron(www.pall.com)的板框盒和来自A/GTechnology(www.agtech.com)的中空纤维筒。在两种系统中，使用相同的聚醚砜膜材料。选择的标准是容易使用、达到的浓缩程度和产物的病毒滴度。

在本研究中使用的板框盒是Pall的MINIM系统，它是一种实验室台式单元，和含有2个悬挂的筛选通道300kD超滤膜(各0.2平方英尺)的LVCentramate。在浓缩澄清的裂解物之前，用2L反渗透(RO)水(美国药典级)冲洗该装置，以清洗储存凝胶。用2L温热的0.1NNaOH，将盒灭菌。然后排空系统，用2L反渗透水冲洗，并用病毒的生长培养基调节。排空整个系统，测得系统和管道的滞留体积是6mL。

在本研究中测试的中空纤维筒是A/GTechnology的QUIXSTAND^TM台式系统，4M号柱超滤筒(650cm²表面积)。关于板框盒，首先用2L反渗透(RO)水(美国药典级)冲洗该装置，以清洗储存凝胶。用2L温热的0.1NNaOH，将盒灭菌。然后排空系统，用2L反渗透水冲洗，并通过用病毒的生长培养基冲洗，进行调节。在实验过程中，使用600mL/min的恒定进料流速。

对于2种系统，使澄清的裂解物再循环，直到将材料浓缩至约250mL(10倍浓缩)，取样进行滴度分析(I-浓缩后)。在1L(5渗滤体积)渗滤缓冲液(20mMTris+0.2MNaCl+1mMMgCl2，pH8.0±0.1)中，渗滤浓缩物(渗余物)，取另一个样品进行滴度分析(渗滤后)。将剩余物进一步浓缩至约120mL。在最终浓缩后，从系统排出产物，并收集在一个无菌容器中(最终浓缩后)。然后，用40mL渗滤缓冲液冲洗系统，以确保最大产物回收。

在使用中空纤维和板框系统的浓缩过程中监测的过程参数如表1所示。

表1

TMP＝[(进料压力+剩余物压力)/2-渗透压力]

在中空纤维方法中，跨膜压力(TMP)保持在低于8psi，而在板框方法中，TMP升高至30psi。在中空纤维系统中使用更大的膜表面积，可能产生更轻的盒污损。

使用板框盒，在4小时内达到约20倍浓缩，而使用中空纤维筒，在3小时内达到14倍浓缩，在另外30分钟中，我们能得到20倍浓缩。当对比任一个系统的裂解后值时，存在产物的45-50％损失。中空纤维筒的建立比板框盒更容易。因此，基于操作的容易，中空纤维筒对于超滤和渗滤步骤是更合适的系统。

实施例3

离子交换

病毒具有不同的表面电荷，因为它们具有不同的表面分子。因此，可以使用离子交换色谱纯化病毒，且条件随病毒的性质而变化。因此，我们测试了用于呼肠孤病毒纯化的各种pH的离子交换色谱条件。如上所述，生产、提取和过滤呼肠孤病毒，并进行在不同pH的离子交换色谱。确定每个步骤后的滴度，如下面的表2所示。

表2

因此，pH7.0-9.0会产生比其它pH更高的呼肠孤病毒产率。在该步骤中使用的pH优选地是7.5-8.5，尤其是pH8.0。尽管阳离子和阴离子交换剂都起作用，阴离子交换剂通常是更有效的。

实施例4

可放大的纯化方法

呼肠孤病毒是一种肠道病毒，其特异性地感染具有激活的ras-途径的细胞。由于ras-途径的激活是许多种癌症类型的共同点，已经在细胞系、动物模型中以及临床上证实，呼肠孤病毒血清型3会造成许多种肿瘤的消退。为了满足II/III期临床试验对大规模生产感染性病毒的需要，开发了基于过滤和色谱的方法。我们在这里报道了完全可放大的从细胞培养物纯化活性病毒的方法的开发。该三步方法由超滤步骤、阴离子交换纯化和在制剂缓冲液中的组分离组成。该方法可以放大到20升生物反应器规模，并转移到GMP设施中生产。该方法的总回收率大于50％，最终纯度与通过2个连续的氯化铯离心步骤生产的材料相当。

材料和方法

色谱：所有纯化实验都在AktaExplorer100系统上进行，并通过级分收集器Frac950收集级分。常规地监测在280，260和215nm的紫外线以及电导率和pH。所有色谱介质和仪器均购自GEHealthcare，Biosciences。

SDSPAGE：所有SDSPAGE材料都购自Invitrogen。使用4-12％SDSPAGE凝胶，并根据生产商的说明书使用。在电泳之前，将所有样品在65℃变性10分钟。

使用全长彩虹标记作为尺寸标准(GEHealthcare，Biosciences)。

SDSPAGE的染色：银染料购自GEHealthcareBiosciences。胶体考马斯染料购自Invitrogen。对于每种染料，遵循生产商的说明书。将银染料的显色步骤保持8分钟，以将凝胶过染色，确保可以清楚地看到剩余的污染物。

蛋白印迹：一式两份地在SDSPAGE凝胶上电泳，将凝胶之一转移到ECL硝酸纤维素上。除了转移缓冲液(Invitrogen)以外，所有试剂和印迹装置购自GEHealthcareBiosciences。在45V，在20％甲醇中，将凝胶印迹40分钟。根据染色标记的转移，检查转移的完全性。在脱脂奶(当地食品店)中封闭膜过夜，并与在脱脂奶0.2％Tween中1∶20000稀释的山羊多克隆抗体一起温育。用过量的PBS-Tween0.2％冲洗印迹3x5分钟，然后在1∶100000，与单克隆抗-山羊-HRP抗体(Sigma)一起温育。如上所述冲洗印迹，然后根据生产商的说明书，用ECL检测试剂显色。然后，将印迹暴露于KodakBioMaxLight胶片30秒、1分钟、5分钟等，并根据生产商的说明书，使用GBX显色剂和固定剂(Kodak)手工显色胶片。

RNA分离：使用RNAWizard(Ambion)，从0.5ml每种级分的样品中提取RNA，制备用于RT-PCR的样品。遵循生产商的说明书，将RNA沉淀重新悬浮于DEPC处理的水中，至0.1ml终体积。使用1ml每种样品以及1∶10稀释液进行RT-PCR扩增。

PCR样品的琼脂糖凝胶电泳：通过加入20ml6x装载染料，其含有1∶10000稀释的VistraGreen(GEHealthcare，Biosciences)和50％甘油，在4％EZ凝胶(Invitrogen)上分析PCR反应物。每孔加入20ml，并将50bp序列梯(GEHealthcare，Biosciences)用作尺寸标准。

PCR带的检测：在Typhoon9600扫描仪上扫描所有凝胶，溴化乙锭设置在650PMT设置，正常的灵敏度设置在50微米分辨率。

Sepharose，AKTAexplorer，Unicorn，HR，ImageQuant，VistraGreen和Typhoon是GEHealthcare的商标。GEHealthcare是GeneralElectric的商标。

E-凝胶和Novex凝胶是InvitrogenCorp.的注册商标。聚合酶链反应(PCR)在归RocheMolecularSystems和F.Hoffman-LaRocheLtd.所有的专利的范围内。

方法开发：原料的描述

呼肠孤病毒是一种无被膜的双链RNA病毒，其具有二十面体对称和众所周知的蛋白组分。它具有约85nm的直径和约12600万道尔顿的分子量。决定病毒向色谱基质的结合行为的外衣壳由主要外衣壳蛋白λl(其分子量为76.3kDa)的600个拷贝、和主要外衣壳蛋白σ3的600个拷贝(其中外衣壳基本单位通常由μlσ3的异六聚体组成)组成。另外，在病毒表面上也发现了作为同型三聚体的次要外衣壳蛋白σl的36个拷贝。σl会介导病毒向细胞表面的结合。三种外衣壳蛋白σ3，σl和μl分别具有5.2，5.2，和6.6的等电点。内衣壳由λl(二聚体)的120个拷贝、λ2(五聚体)的60个拷贝和μl的24个拷贝组成。核心由λ3的12个拷贝、RNA聚合酶和主要核心蛋白σ2的120个拷贝组成。所有λ蛋白具有约120kDa的分子量，μ为约80kDa，且σ为约47-48kDa。

如下制备在方法开发中使用的所有材料。给20升生物反应器接种HEK293衍生的细胞系，后者在含有4mM谷氨酰胺和酚红的无血清培养基中。使细胞生长2-3天，以1x10⁶细胞/ml的细胞数进行感染，MOI为0.5。继续进行病毒生产另外2-3天。通过在37℃加入10％TritonX-100至1％终浓度，在120rpm裂解细胞30分钟。将粗裂解物的样品浓度调节至1mM氯化镁，并在37℃和120rpm，用10u/ml的benzonase消化1小时。然后，经8微米过滤器、随后经0.8微米过滤器，过滤材料。进一步浓缩材料，并在分子量截止值为300kDa、总面积为4800cm²的GEHealthcare中空纤维筒上交换缓冲液。在5体积的20mMTris缓冲液pH7.8，25mM氯化钠中，交换材料。渗滤后，加入甘油至10％的终浓度。

决定呼肠孤病毒纯化的可接受工作范围的参数

下面的文献指出了用于纯化呼肠孤病毒3型Dearing的稳定性窗口(Floydetal.，1977；Floydetal.，1978p.1079-1083和1084-1094；Floydetal.，1979；Draynaetal.，1982)。基于文献，假设包含pH5.0-8.0和0-2M氯化钠盐浓度的色谱条件是良好的起始范围。聚集和能潜在地诱导聚集的条件也是要考虑的因素。基于来自文献的数据(id.)，假设pH窗口范围pH5.0-8.0、和从0.025-2M氯化钠的盐浓度是可接受的。也将甘油加入所有缓冲液中预防聚集。未测试由于聚集导致的病毒的损失，甘油的省略是否对病毒稳定性和感染性具有有害作用。

已经在文献中描述了病毒体的等电点(pI)(Floydetal.，1978p.1084-1079，Tayloretal.，1981)。使用色谱聚焦和全颗粒微量电泳，已经证实了3.8-3.9的表观pI。呼肠孤病毒3型Dearing的两种最丰富的主要外壳蛋白σ3和μ1具有低得多的酸性pI(见上面)。这也与病毒向不同离子交换剂的吸附行为非常一致(Zerdaetal.，1981)。不一致的最可能的解释是下述事实，即色谱聚焦在许多方面是测量带电荷的结构域(而不是在溶液中的总电荷)的二维技术，而微量电泳可以通过调节缓冲液条件产生一些偏差，这也可能影响实验结果。避免在缓冲液配方中使用镁盐，因为已经报道，在有镁存在下，在冷冻后病毒的感染性下降(Estesetal.，1979)。

初步介质筛分

初步评价了离子交换(IEX)，疏水相互作用色谱(HIC)，肝素亲和色谱和固定化金属鳌合色谱(IMAC)。σ3(两种主要外衣壳蛋白之一)确实含有锌指基序，因此将IMAC视作该病毒的有效捕获技术。

为了确定病毒体是否会结合不同类型的色谱介质，还在Sepharose4FastFlow上分组分离病毒，以去除一些主要的污染物，并将病毒交换到更适合结合的缓冲液条件。在20cm床高和150cm/h的线性流速，初步评价了Sepharose6和4FastFlow。加入5-30％柱体积的样品体积。由于Sepharose6FastFlow对于球形分子的大小排阻界限是在2-5百万道尔顿的范围内，且Sepharose4FastFlow具有约2000万道尔顿的排阻界限，后者会提供更好的分辨，因此允许使用高达25％的柱体积。超过该值，不再能分辨峰。通过加入盐和/或乙二醇都不能抑制该现象。在图1中显示了在HR5_20Sepharose4FastFlow柱上尺寸分离原料的典型色谱图。

在pH5.0-6.0的范围内，测试了阳离子交换介质。使用了弱(羧甲基)和强(磺丙基)阳离子交换基团(图2)。

对于大小排阻预纯化的病毒，在pH5.6，在SP和CMSepharoseFastFlow上观察到病毒的良好结合。但是，UF/DF材料根本不结合，甚至在pH5.0也不结合。2.5％乙二醇的加入，有助于破碎已经形成的聚集体，并允许病毒的结合，但是会降低病毒感染性。

还使用SEC预纯化的材料，测试了负载钙、锌和镁的鳌合金属琼脂糖的病毒结合。但是，在25和50cm/h样品应用时，没有病毒会保留在柱上。还使用预纯化的病毒，在不同的盐浓度评价了HeparinSepharose6FastFlow，但是仍然没有观察到结合。如(Spinneretal.，2001)所述通过RTPCR分析级分，并通过蛋白印迹和SDSPAGE进行分析。

尽管所有HIC柱似乎都会在一定程度上保留病毒，选择性较差，且由于沉淀造成的损失较高，甚至当使用氯化钠作为离液盐时也是如此。

还筛选了不同的阴离子交换剂的选择性和结合。评价了DEAE，ANXhighsub，QSepharoseFastFlow，XL和HighPerformance(HP)的病毒结合。当测试SEC预纯化的材料时，选择性似乎不同(图3)。

阴离子交换似乎是第一个纯化步骤的最有力的、可放大的选择。因此，为reolysin的纯化进一步评价了不同的阴离子交换剂。

阴离子交换捕获步骤的优化

不同的阴离子交换剂显然会提供不同的选择性。QSepharoseXL是最明显不同的，它会产生分裂的病毒峰。由于病毒在超过pH8.0时不稳定，且在结合过程中的阴离子交换剂的微环境可能会升高最多1pH单位，在pH7.2加入样品，所有后续的步骤保持在pH7.0。用稀盐酸将样品调节至pH7.2。

由于在Tris-Cl缓冲液中的选择性似乎较差，还评价了磷酸盐缓冲液。使用磷酸盐缓冲液，会提高结合和选择性(未显示数据)。还对比了5种不同的阴离子交换剂的结合能力。对于所有90微米珠子(ANXhighsub，DEAE，QFastFlow，和XL)，观察到早期漏过，其中材料在1-2个柱体积后确实漏过。在5cm床高和50cm/h线性流速或6分钟停留时间观察到漏过之前，QSepharoseHighPerformance允许加入超过12柱体积的病毒(图4)。

因此选择QSepharoseHighPerformance用于第一步的其它方法开发。使用线性梯度至1M氯化钠从QSepharoseHP洗脱病毒表明，在0.5M洗脱病毒，在梯度早期洗脱一些残余污染物，在梯度晚期洗脱一些其它污染物。

评价了洗涤、洗脱和再生的不同步骤浓度。当用0.24M氯化钠洗涤柱(在约0.26-0.27M氯化钠之前，不会洗脱病毒)、用0.5M氯化钠洗脱和用2M氯化钠再生时，发现了最佳的条件(图5)。

该分步方法允许浓缩病毒8-10倍，且滴度以及蛋白印迹和RT-PCR表明60-70％的回收。还开发了清洁方案，且下述再生组合允许完全恢复柱能力和洗脱曲线：以上流方向，在50cm/h、使用2柱体积2M氯化钠，随后在25cm/h、使用2柱体积1M氢氧化钠，随后以上流方向，在50cm/h、使用另外2柱体积2M氯化钠(未显示数据)。由于在最终配方中达到的病毒滴度足够高，选择在150cm/h和20cm床高时Sepharose4FastFlow上的组分离用于第二个纯化和缓冲液交换步骤。在这些条件下，可以使用最高达35％总柱体积，并将病毒交换进最终的制剂缓冲液中。

放大

阴离子交换纯化的8倍放大

为了证实可放大性，将该方法8倍放大至HR10_100QSepharoseHighPerformance柱。在放大过程中，保持所有参数恒定，例如停留时间，使用的体积，步骤浓度和使用的样品的mg/树脂的ml。在该10倍放大中，污染物的洗脱曲线以及病毒峰几乎相同(图6)。

为试验工厂和随后的GMP生产，将该方法进一步放大50倍。使用开发的方法，纯化5升4xUF/DF预纯化的病毒，得到可比较的回收率和纯度。

为了达到与氯化铯梯度纯化的材料相同的最终纯度水平，还将组分离放大10倍。在图7中显示了第二步的10倍放大的洗脱曲线。

如银染色的SDSPAGE所证实的，最终产物的纯度与梯度纯化的材料相似(图8A)。如考马斯染色的SDSPAGE所证实的，该两步方法也会产生比梯度纯化的材料更高浓度的材料(图8B)。蛋白印迹分析证实了病毒带的一致性，并允许定量总过程的病毒回收率。总回收率大于50％。这也得到了滴度测定的证实(图8C)。

实施例4的总结

开发了用于纯化无包膜病毒的纯化方法，并放大了超过50倍。不同色谱分离原理的筛选表明，在呼肠孤病毒的情况下，阴离子交换和大小排阻是纯化完全生物活性的(感染性的)病毒体的最佳选择。仔细地筛选和优化了分别作为第一步和第二步的阴离子交换和大小排阻色谱的条件，以实现有力的、可放大的方法。对第一步的吸附和脱附步骤流速以及第二步的样品注射和无梯度洗脱给与特别注意。评价了不同阴离子交换剂的结合容量，表面结合仅发生在6％琼脂糖介质上的大于2MDa颗粒和在4％琼脂糖介质上的大于20Mda颗粒，使用更小的珠子会与珠子直径的减小成比例地增加结合容量(因数分别为3和9)。当洗脱病毒时，使用磷酸盐缓冲液(而不是基于Tris的缓冲液)会产生更好的选择性，且在生物活性的恢复方面视乎更优越。另外，在渗滤和洗脱缓冲液中避免使用镁盐。

8倍放大证实，在放大后洗脱曲线是可再现的，且该分步方法允许以约60-70％产率回收感染性病毒。要达到通过2个连续密度梯度离心步骤纯化的病毒的最终纯度，第二步是必需的，且允许同时将病毒缓冲液交换进最终的制剂缓冲液中。由于QSepharoseHighPerformance介质的高容量，最终的滴度足够高，可以省略其它的超滤步骤。当使用34微米珠子时，在放大到BPGlOO柱后，没有观察到由于潜在的反压力问题造成的负面影响。在整个样品应用和操作中，床上的压力降保持在1.5bar以下。

但是，由于酚红在不同批次原料中的不同量，且当使用低滴度病毒原料时，在放大后观察到容量的不一致性。在这些条件下，在洗涤步骤中会损失一些病毒材料，且损失会高达50％。但是，更好地控制原料的质量，可以将纯化方法的性能恢复至可与原始小规模方法相比的值。

总之，本发明提供了用于大规模生产呼肠孤病毒的纯化方法，其质量可与传统小规模方法相比。

本领域的技术人员会明白所述方法和本发明的系统的各种改进和变体，而不脱离本发明的范围和精神。尽管已经参考特定优选实施方案描述了本发明，应当理解，不应当将要求保护的本发明不适当地限制为这样的特定实施方案。实际上，本领域的技术人员显而易见的用于实现本发明的模式的各种改进，都在下面的权利要求书的范围内。

Claims

1.从细胞培养物生产病毒的方法，其包含下述步骤：

(a)提供已经被病毒感染的细胞培养物；

(c)去除细胞碎片；和

(d)收集病毒。

2.权利要求1的方法，其中通过过滤去除细胞碎片。

3.权利要求1的方法，其中通过分步过滤去除细胞碎片，其包含：

(1)通过具有5μM或8μM孔径的预过滤器，进行过滤；和

4.权利要求1的方法，其中通过分步过滤去除细胞碎片，其包含：

(1)通过具有5μM或8μM孔径的预过滤器，进行过滤；和

(2)在步骤(1)后，通过具有0.8μM孔径的过滤器，进行过滤。

5.权利要求1的方法，还包含用DNA剪切酶处理细胞裂解物。

6.权利要求2的方法，还包含浓缩滤液。

7.权利要求6的方法，其中通过渗滤浓缩滤液。

8.权利要求7的方法，其中使用具有300kDa分子量截止值的中空纤维筒进行渗滤。

9.权利要求1的方法，其中所述病毒是无包膜病毒。

10.权利要求1的方法，其中所述病毒是呼肠孤病毒。

11.权利要求10的方法，其中所述呼肠孤病毒是哺乳动物呼肠孤病毒。

12.权利要求11的方法，其中所述哺乳动物呼肠孤病毒是人呼肠孤病毒。

13.权利要求12的方法，其中所述人呼肠孤病毒是血清型3病毒。

14.权利要求13的方法，其中所述血清型3呼肠孤病毒是Dearing株。

15.权利要求10的方法，其中所述呼肠孤病毒是重组的呼肠孤病毒。

16.权利要求1的方法，其中所述细胞是人胚肾293(HEK293)细胞。

17.权利要求16的方法，其中所述HEK293细胞悬浮生长。

18.权利要求1的方法，还包含通过阴离子交换色谱纯化病毒。

19.权利要求1的方法，还包含通过离子交换和大小排阻色谱的组合纯化病毒。

20.权利要求19的方法，其中使用阴离子交换剂进行所述离子交换。

21.权利要求19的方法，其中在大小排阻色谱之前进行所述离子交换。

22.权利要求19的方法，其中在没有镁的情况下，进行所述离子交换和大小排阻色谱。

23.权利要求19的方法，其中在离子交换和大小排阻色谱中使用磷酸盐缓冲液。

24.权利要求23的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包含50mM磷酸钠，pH7.2。

25.一种组合物，其包含根据权利要求1收集的病毒。

26.权利要求25的组合物，其适合临床施用。

27.权利要求26的组合物，还包含可药用的赋形剂和/或载体。

28.生产感染性呼肠孤病毒的方法，其包含：

(a)提供已经被呼肠孤病毒感染的HEK293细胞的培养物；

(b)通过将辛基酚聚氧乙烯(9-10)醚至10加入培养物，并在约25℃至约37℃温育，从细胞提取病毒；

(c)用DNA剪切酶处理来自步骤(b)的混合物；

(d)通过过滤去除细胞碎片；

(e)通过超滤或渗滤浓缩滤液；

(g)收集呼肠孤病毒。

29.权利要求28的方法，其中所述步骤(f)包含阴离子交换色谱和随后的大小排阻色谱。

30.一种组合物，其包含根据权利要求28的方法制备的呼肠孤病毒。

31.权利要求30的组合物，还包含可药用的赋形剂和/或载体。