CN115300621A - 水痘-带状疱疹减毒活疫苗制备方法和系统 - Google Patents

水痘-带状疱疹减毒活疫苗制备方法和系统 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水痘‑带状疱疹减毒活疫苗的制备方法和系统。具体地，本发明提供了一种水痘‑带状疱疹减毒活疫苗的自动化连续流制备方法，以及所用的制备系统。本发明采用一次性连续流收获方式收获病毒感染细胞后分装入一次性冻存袋，采用液氮冷冻系统储存冷冻，融解系统融化，并使用连续流超声破碎获取疫苗原液，简化人工操作。并且，本发明的制备系统通过全程管路连接，全程使用不添加抗生素的培养基，设备自动化生产，大大降低了污染风险，显著提高了生产效率。

Description

水痘-带状疱疹减毒活疫苗制备方法和系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种水痘-带状疱疹减毒活疫苗的自动化连续流制备方法，以及所用的制备系统。
背景技术
水痘是一种高度传染性疾病，其发生具有明显的季节性和周期性。通过预防接种水痘疫苗是目前控制病毒传播的唯一方法。由日本大阪大学微生物疾病研究所(BIKEN)的学者建立的VZV Oka株，是目前国际上唯一获得WHO认可的疫苗株。临床研究证明，Oka株水痘疫苗接种反应轻微，能诱导机体产生良好的、持久的免疫应答和保护效果。
水痘-带状疱疹疫苗现有生产工艺中病毒提取步骤为机械破碎+超声波破碎的方式，因设备仅针对500ml的离心瓶，因此开口操作多，操作时间长，生产过程可能会对原液的病毒滴度有一定的影响。
因此本领域亟待开发操作过程简单省时、对水痘-带状疱疹减毒活疫苗质量可精准把控的制备方法和制备系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自动化连续流水痘-带状疱疹减毒活疫苗的制备方法和系统，所述方法和系统使用一次性碗式离心机和一次性冻存袋，减少了清洁与灭菌步骤，降低了微生物污染的几率；制备全程通过管路连接，全程使用不添加抗生素的培养基，实现了自动化连续流生产。
本发明的第一方面，提供了一种制备水痘-带状疱疹减毒活疫苗的方法，所述方法包括步骤：
(a)提供水痘病毒毒种感染的病变细胞；
(b)使用一次性碗式离心机，离心收集步骤(a)中的病变细胞，并将病变细胞存入一次性冻存袋；
(c)利用冷冻系统冷冻一次性冻存袋中的病变细胞，从而得到冷冻的病变细胞；其中，所述冷冻系统为液氮冷冻；
(d)利用融解系统融化一次性冻存袋中冷冻的病变细胞，从而获得融化收获液；
(e)将步骤(d)中融化收获液和等比例体积的超声缓冲液在超声容器中混匀，将超声容器与连续流超声波破碎仪的进液口连接，进行连续流超声，从而获得超声破碎收获液；
(f)将步骤(e)中的超声破碎收获液经滤器过滤后收集，从而获得水痘-带状疱疹减毒活疫苗原液；其中所述滤器与所述连续流超声破碎仪的出液口连接。
在另一优选例中，在步骤(a)中，还包括以下子步骤：
(a1)以细胞工厂为培养容器，培养宿主细胞；
(a2)对宿主细胞连续传代培养至30-40代(较佳地32代)，接种水痘病毒毒种；
(a3)培养接种水痘病毒毒种的宿主细胞，在接种水痘病毒毒种的宿主细胞的细胞病变达到35％-65％时，即获得水痘病毒毒种感染的病变细胞。
在另一优选例中，在培养宿主细胞和培养接种水痘病毒毒种的宿主细胞的过程中，使用ACFM对细胞进行培养基更换和清洗。
在另一优选例中，在接种水痘病毒毒种前，使用四十层显微镜对细胞工厂内的细胞逐层镜检，镜检合格的宿主细胞接种水痘病毒毒种。
在另一优选例中，所述宿主细胞为人二倍体MRC-5细胞。
在另一优选例中，所述水痘病毒毒种为水痘毒种Oka株。
在另一优选例中，在步骤(a)和步骤(b)之间，还包括步骤:使用PBS清洗病变细胞2-3次，加入EDTA，使用ACFM振摇，从而获得病变细胞悬液。
在另一优选例中，在步骤(b)中，使用蠕动泵通过连接细胞工厂和一次性碗式离心机的给料管将病变细胞悬液收集至一次性碗式离心机的填料碗体中，收集病变细胞悬液的进液流速为1500ml/min-2500ml/min。
在另一优选例中，在步骤(b)中，一次性碗式离心机的离心力为1500G-3000G。
在另一优选例中，在步骤(b)中，所述一次性冻存袋的装量范围为2500ml-5000ml。
在另一优选例中，所述一次性冻存袋的材质为低密度聚乙烯。
在另一优选例中，在步骤(c)中，所述冷冻系统的冷冻温度为0℃到-100℃，预冷时间为0分钟(即不预冷)或10-60分钟，冷冻时间为20分钟-2小时，较佳地1小时，冷冻保持的温度为-80℃到-100℃。
在另一优选例中，所述冷冻系统被设置为预冷60分钟，使冷冻温度由0℃下降至-40℃，然后持续冷冻20分钟，期间使冷冻温度由-40℃下降至-100℃，然后-80℃冷冻保持。
在另一优选例中，所述冷冻系统被设置为不预冷，持续冷冻1小时，期间使冷冻温度由0℃下降至-80℃～-100℃，然后-80℃～-100℃冷冻保持。
在另一优选例中，所述冷冻系统被设置为不预冷，持续冷冻1小时，期间使冷冻温度由-60℃下降至-80℃～-100℃，然后-80℃～-100℃冷冻保持。
在另一优选例中，在步骤(d)中，所述融解系统的融化温度为40℃-60℃，融化时间为40分钟-2小时，较佳地1小时。
在另一优选例中，所述融解系统的融化温度为40℃，融化时间为1小时。
在另一优选例中，所述融解系统的融化温度为45℃，融化时间为1小时。
在另一优选例中，所述融解系统的融化温度为50℃，融化时间为1小时。
在另一优选例中，所述融解系统的融化温度为55℃，融化时间为1小时。
在另一优选例中，所述融解系统的融化温度为60℃，融化时间为1小时。
在另一优选例中，在步骤(e)中，所述连续流超声波破碎仪的参数设置为：频率20Khz，振幅40％，流速1.5L/min。
在另一优选例中，在步骤(f)中，所述滤器为材质为醋酸纤维素的囊式滤器，滤芯规格为10um。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(g)将步骤(f)中获得的水痘-带状疱疹疫苗原液与冻干保护剂混合，经冻干处理后获得水痘-带状疱疹减毒活疫苗冻干制剂。
在另一优选例中，所述冻干处理的冻结温度为-45±2℃，干燥时间为7±1小时。
在另一优选例中，所述方法全程无菌操作，且全程使用不添加抗生素的培养基。
在另一优选例中，所述方法各步骤中使用的各器材通过无菌管路连接，从而实现自动化连续流制备。
本发明的第二方面，提供了一种制备水痘-带状疱疹减毒活疫苗的系统，所述系统包括以下模块：
(M1)细胞培养和病毒接种模块，所述模块被配置为培养宿主细胞并接种水痘病毒毒种，从而提供水痘病毒毒种感染的病变细胞；
(M2)细胞收集模块，所述细胞收集模块被配置为使用一次性碗式离心机，离心收集水痘病毒毒种感染的病变细胞，并将病变细胞存入一次性冻存袋；
(M3)冷冻模块，所述冷冻模块被配置为冷冻一次性冻存袋中的病变细胞，从而得到冷冻的病变细胞；
(M4)融解模块，所述融解模块被配置为融化一次性冻存袋中冷冻的病变细胞，从而获得融化收获液；
(M5)连续流超声模块，所述连续流超声模块被配置为使用连续流超声破碎仪超声破碎超声容器中的融化收获液，从而获得超声破碎收获液；
(M6)过滤模块，所述过滤模块被配置为使用滤器将获得的超声破碎收获液过滤，从而获得水痘-带状疱疹减毒活疫苗原液。
在另一优选例中，所述(M1)细胞培养和病毒接种模块被配置为：以细胞工厂为培养容器，培养宿主细胞，并对传代培养至30-40代(较佳地32代)的宿主细胞接种水痘病毒毒种，将接种水痘病毒毒种的宿主细胞培养至病变达到35％-65％；
在另一优选例中，所述(M2)细胞收集模块被配置为：使用蠕动泵通过连接(M1)中的细胞工厂和一次性碗式离心机的给料管将病变细胞悬液收集至一次性碗式离心机的填料碗体中，离心后，将获得的水痘病毒毒种感染的病变细胞存入一次性冻存袋。
在另一优选例中，使用一次性碗式离心机收集病变细胞悬液的进液流速为1500ml/min-2500ml/min。
在另一优选例中，所述一次性碗式离心机的离心力为1500G-3000G。
在另一优选例中，所述一次性冻存袋的装量范围为2500ml-5000ml。
在另一优选例中，所述(M3)冷冻模块的冷冻温度为0℃到-100℃，预冷时间为0分钟(即不预冷)或10-60分钟，冷冻时间为20分钟-2小时，较佳地1小时，冷冻保持的温度为-80℃到-100℃。
在另一优选例中，所述(M3)冷冻模块被设置为预冷60分钟，使冷冻温度由0℃下降至-40℃，然后持续冷冻20分钟，期间使冷冻温度由-40℃下降至-100℃，然后-80℃冷冻保持。
在另一优选例中，所述(M3)冷冻模块被设置为不预冷，持续冷冻1小时，期间使冷冻温度由0℃下降至-80℃～-100℃，然后-80℃～-100℃冷冻保持。
在另一优选例中，所述(M3)冷冻模块被设置为不预冷，持续冷冻1小时，期间使冷冻温度由-60℃下降至-80℃～-100℃，然后-80℃～-100℃冷冻保持。
在另一优选例中，所述(M4)融解模块的融化温度为40℃-60℃，融化时间为40分钟-2小时，较佳地1小时。
在另一优选例中，在所述(M5)连续流超声模块中，所述连续流超声波破碎仪的参数设置为：频率20Khz，振幅40％，流速1.5L/min。
在另一优选例中，在所述(M6)过滤模块中，所述滤器为材质为醋酸纤维素的囊式滤器，滤芯规格为10um。
在另一优选例中，所述系统还进一步包括(M7)冻干模块，所述冻干模块被配置为将获得的水痘-带状疱疹疫苗原液与冻干保护剂混合后进行冻干处理，从而获得水痘-带状疱疹疫苗冻干制剂。
在另一优选例中，在所述(M7)冻干模块中，冻干处理的冻结温度为-45±2℃，干燥时间为7±1小时。
在另一优选例中，所述系统的(M1)-(M6)各模块之间通过管路连接。
在另一优选例中，所述系统的(M1)-(M7)各模块之间通过管路连接。
在另一优选例中，所述系统为无菌操作系统。
在另一优选例中，所述系统为自动化系统。
在另一优选例中，所述系统还包括：(M8)控制模块，用于控制模块(M1)细胞培养和病毒接种模块、(M2)细胞收集模块、(M3)冷冻模块、(M4)融解模块、(M5)连续流超声模块和(M6)过滤模块，以及(M7)冻干模块的自动化运作。
在另一优选例中，所述(M8)控制模块控制所述系统中的模块按照(M1)→(M2)→(M3)→(M4)→(M5)→(M6)→(M7)的顺序依次运行。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了使用干冰酒精混合物冷冻一次性冻存袋的测试数据。
图2显示了使用本发明的冷冻系统冷冻一次性冻存袋的测试数据。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地研发了一种自动化连续流水痘-带状疱疹减毒活疫苗的制备方法和系统。本发明的方法使用一次性碗式离心机收获病变细胞，将收获的病变细胞存入一次性冻存袋，并采用液氮冷冻代替传统的干冰酒精混合物冷冻，使用程序融解系统融化，然后进行连续流超声，从而获得疫苗原液。本发明的系统通过全程管路连接，使用一次性碗式离心机和一次性冻存袋，且设备自动化生产，显著提高了生产效率，有利于生产扩大化，而且减少了清洁与灭菌的步骤，降低了微生物污染的几率。在此基础上，完成了本发明。
术语
一次性碗式离心机
本发明所用的一次性碗式离心机由一次性碗状中空离心腔体构成。物料通过进入管进入离心腔体，从腔体底部进入并逐渐被导向至碗内壁，在这个过程中液体逐渐加速。液体中的细胞培养物跟随液体高速旋转并受到离心力的作用下贴附在碗内壁并堆积。培养物料在离心腔内沿着径向运动，沿途被继续离心。最后，已去除上清液的细胞培养物在完成离心后流出，并进入下一个单元操作。
一次性冻存袋
如本文所用，术语“一次性冻存袋”是指一种带管道的由多层共挤技术一次性挤出生产的冻存袋，满足耐受低温、安全性、稳定性和生物相容性等性能要求。适用于一次性的生物制品(可耐受冻存-196℃/复苏70℃)。
冷冻系统和融解系统
如本文所用，术语“冷冻系统”是指利用液氮的气化潜热和显热，快速冷却、冻结产品的装置。
如本文所用，融解系统由加热单元、摆动融解箱、控制管理平台三部分组成。在加热单元中采用加热片作为核心加热部件，采用PLC及HMI作为核心控制系统。融解系统采用了独立的温控回路，能获得尽可能一致的升温效果。同时，也节约能源。
连续流超声破碎仪
在本发明中，经融解系统融化获得的融化收获液在超声容器中混匀后得到的样品，经过超声波所产生的空化、热和机械三种均质分散效应，得到超声破碎收获液。这一过程通过无菌管道连接超声波破碎仪的进液口和出液口，可实现连续流操作；同时样品始终处于4～6℃低温水浴的冷却，使之处理后的样品颗粒均匀且不易聚集成团。
本发明的方法
在本发明的一个方面，提供了一种制备水痘-带状疱疹减毒活疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供水痘病毒毒种感染的病变细胞；具体地，所述病变细胞经以下步骤获得：
(a1)以细胞工厂为培养容器，培养宿主细胞；
(a2)对宿主细胞连续传代培养至30-40代(较佳地32代)，接种水痘病毒毒种；
(a3)培养接种水痘病毒毒种的宿主细胞，在接种水痘病毒毒种的宿主细胞的细胞病变达到35％-65％时，即获得水痘病毒毒种感染的病变细胞；
(b)使用一次性碗式离心机，离心收集步骤(a)中的病变细胞，并将病变细胞存入一次性冻存袋；具体地，使用蠕动泵通过连接细胞工厂和一次性碗式离心机的给料管将病变细胞悬液收集至一次性碗式离心机的填料碗体中，收集病变细胞悬液的进液流速为1500ml/min-2500ml/min，一次性碗式离心机的离心力为1500G-3000G；
(c)利用冷冻系统冷冻一次性冻存袋中的病变细胞，从而得到冷冻的病变细胞；其中，所述冷冻系统为液氮冷冻；具体地，所述冷冻系统的冷冻温度为0℃到-100℃，预冷时间为0分钟(即不预冷)或10-60分钟，冷冻时间为20分钟-2小时，较佳地1小时，冷冻保持的温度为-80℃到-100℃；
(d)利用融解系统融化一次性冻存袋中冷冻的病变细胞，从而获得融化收获液；具体地，所述融解系统的融化温度为40℃-60℃，融化时间为40分钟-2小时，较佳地1小时；
(e)将步骤(d)中融化收获液和等比例体积的超声缓冲液在超声容器中混匀，将超声容器与连续流超声波破碎仪的进液口连接，进行连续流超声，从而获得超声破碎收获液，所述连续流超声波破碎仪的参数设置为频率20Khz，振幅40％，流速1.5L/min；
(f)将步骤(e)中的超声破碎收获液经滤器过滤后收集，从而获得水痘-带状疱疹疫苗原液；其中所述滤器与所述连续流超声破碎仪的出液口连接，滤器为材质为醋酸纤维素的囊式滤器，滤芯规格为10um；
(g)将步骤(f)中获得的水痘-带状疱疹疫苗原液与冻干保护剂混合，经冻干处理后获得水痘-带状疱疹减毒活疫苗冻干制剂，所述冻干处理的冻结温度为-45±2℃，干燥时间为7±1小时；
并且，所述方法全程无菌操作，且全程不添加抗生素，所述方法各步骤中使用的各器材通过无菌管路连接，从而实现自动化连续流制备。
在本发明的方法中，冷冻系统(液氮冷冻)与一次性冻存袋结合使用，传热面可直接附着在冷冻液上。一层薄薄的低密度聚乙烯层是蛋白质溶液和冷表面之间的唯一分隔。与冻融设备的换热板紧密接触，最大限度地提高热交换。与被干冰酒精混合物冷冻的旋冻瓶相比，换热系数更好。相对于瓶子或低温容器而言，它的冷冻距离相对较小。这确保了快速的冻结锋速度。此外，冻结过程更容易控制，因为板的温度可以测量。为它比其他任何方法都能达到更高的冻结锋速度。融解系统有独立的温控回路，这使得无论是冷冻少量的物料还是满载条件都能获得尽可能一致的升温效果。同时，也节约能源。
本发明的制备水痘-带状疱疹减毒活疫苗的系统
在本发明的另一个方面，提供了一种制备水痘-带状疱疹减毒活疫苗的系统，所述系统包括以下模块：
(M1)细胞培养和病毒接种模块，所述模块被配置为培养宿主细胞并接种水痘病毒毒种，从而提供水痘病毒毒种感染的病变细胞；
(M2)细胞收集模块，所述细胞收集模块被配置为使用一次性碗式离心机，离心收集水痘病毒毒种感染的病变细胞，并将病变细胞存入一次性冻存袋；
(M3)冷冻模块，所述冷冻模块被配置为冷冻一次性冻存袋中的病变细胞，从而得到冷冻的病变细胞；
(M4)融解模块，所述融解模块被配置为融化一次性冻存袋中冷冻的病变细胞，从而获得融化收获液；
(M5)连续流超声模块，所述连续流超声模块被配置为使用连续流超声破碎仪超声破碎超声容器中的融化收获液，从而获得超声破碎收获液；
(M6)过滤模块，所述过滤模块被配置为使用滤器将获得的超声破碎收获液过滤，从而获得水痘-带状疱疹减毒活疫苗原液；
(M7)冻干模块，所述冻干模块被配置为将获得的水痘-带状疱疹疫苗原液与冻干保护剂混合后进行冻干处理，从而获得水痘-带状疱疹疫苗冻干制剂；
此外，所述系统还包括：(M8)控制模块，用于控制模块(M1)细胞培养和病毒接种模块、(M2)细胞收集模块、(M3)冷冻模块、(M4)融解模块、(M5)连续流超声模块和(M6)过滤模块，以及(M7)冻干模块的自动化运作，并按照(M1)→(M2)→(M3)→(M4)→(M5)→(M6)→(M7)的顺序依次运行。
本发明所述系统的(M1)-(M7)各模块之间通过管路连接，是一种自动化的无菌操作系统。
本发明的主要优点：
(1)细胞培养容器采用细胞工厂，对细胞工厂和操作设备进行管道化连接；使用ACFM代替人工辅助对细胞进行补液，清洗细胞表面，降低了动物源污染风险，异性蛋白致敏风险，提高了收获率。
(2)采用一次性连续流收获方式收获感染细胞，收获的疫苗原液分装入一次性冻存袋，采用液氮冷冻系统程序储存，替代传统台式离心机和控温难度相对较大的干冰酒精混合物冷冻。
(3)水痘病毒为温度敏感株，人工手动温水融化旋冻瓶存在水温、时长等不确定因素，可造成病毒滴度损失，旋冻瓶浸泡在温水中有污染风险；本发明采用融解系统融化替代温水手动融化，进一步简化人工操作，使冻融过程更加精准可控。
(4)使用连续流超声波破碎仪代替原机械破碎+超声波破碎的方式进行细胞破碎病毒释放；连续化收获方式降低大量离心杯开瓶的污染风险，节约厂房面积，减少人工操作，降低经济成本。
(5)由于水痘减毒活疫苗实现了全程管路化生产，因此在生产过程中已达到无抗生素添加工艺，产品更安全。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
通用方法
材料
1.1.1病毒株及细胞系
人二倍体MRC-5细胞，由美国菌种保藏中心提供；水痘毒种Oka株，由日本阪大微生物病研究会提供。
1.1.2仪器设备
定量分液器；ACFM(自动化细胞工厂操作设备automatical cell factorymachine)；连续流离心机；连续流超声波破碎仪；冷冻系统；融化系统；四十层显微镜(四国计量工业株式会社)。
方法
1.2.1水痘减毒活疫苗的制备
1.2.1.1疫苗原液的制备
将24代MRC-5细胞复苏后，加入含10％胎牛血清的MEM培养基中，以细胞工厂为培养容器，37±1℃静置培养3～5天。四十层显微镜逐层镜检，镜检合格后细胞株按1︰2的比例扩培。混匀后的细胞悬液经蠕动泵泵入连接管道的细胞工厂，使用ACFM进行料液平衡，当细胞连续传至32代时接种水痘Oka株工作毒种。接种毒种的细胞于37±1℃静置培养2～3天，当细胞病变达35％～65％时弃液，每层加入250ml的PBS使用ACFM对细胞表面进行清洗。清洗两遍后弃去PBS，每层加入80ml的EDTA使用ACFM振摇，连续流离心机收获感染细胞，加入疫苗保护剂，经连续流超声处理、离心、澄清后，将收获于同批的细胞的上清液合并制成原液。
1.2.1.2疫苗成品的制备
将检定合格的疫苗原液冻干保护剂配制成半成品，半成品经分装、冻干后制成品。
1.2.2疫苗的检定
根据《水痘减毒活疫苗注册标准》对疫苗进行检定，比较含各方案的疫苗的病毒滴度、稳定性、水分等关键质量指标。
对比例1
本发明的冷冻系统与现有技术中干冰酒精混合物冷冻的对比
分别测试了本发明的冷冻系统与现有技术中干冰酒精混合物冷冻用于冷冻一次性冻存袋的冷冻效果。
使用干冰酒精混合物冷冻一次性冻存袋的测试数据如图1所示；
使用本发明的冷冻系统冷冻一次性冻存袋的测试数据如图2所示。
对比图1和图2，可以看出使用本发明的冷冻系统可以下潜到更低的温度。
实施例2
1)细胞复苏与传代
将24代MRC-5细胞37℃水浴后加入含10％胎牛血清的MEM培养基中，以细胞工厂为培养容器，37±1℃静置培养3～5天。四十层显微镜逐层镜检。镜检合格后细胞株按1︰2的比例扩培，混匀后的细胞悬液经蠕动泵泵入连接管道的细胞工厂，使用ACFM进行料液平衡。37±1℃培养箱静置培养。
2)病毒接种与收获
当细胞连续传至32代时接种水痘Oka株工作毒种。接种毒种的细胞于37±1℃静置培养2～3天，当细胞病变达35％～65％时弃液，每层加入250ml的PBS，使用ACFM代替人工对细胞表面进行清洗。清洗两遍后弃去PBS，每层加入80ml的EDTA使用ACFM振摇。给料管通过蠕动泵给离心机填料碗体中填入感染的MRC-5人二倍体细胞，进液速度1500ml/min，离心力2500G。细胞及细胞碎片在碗中分离给料和碗体旋转停止，取出细胞及细胞碎片以重悬的方式回收在一次性离心模组壁上的残余细胞，并进行细胞液的定容。
3)存入冷冻系统
收获液分装入一次性冻存袋，装量范围2500ml。储存于冷冻系统。冷冻模式设置为-40℃预冷60分钟，-100℃冷冻20分钟，-80℃冷冻保持。
4)融解系统融化
无菌实验通过后，使用程序融解系统融化，时间1小时，温度40℃。
5)连续流超声破细胞
将4)融化的收获液和等比例体积的PGS在溶液瓶或储液袋中混匀；将储液袋与连续流超声波破碎仪进行连接，连续流超声波破碎仪的参数设置为：频率20Khz，振幅40％，流速1.5L/min；在连续流超声波破碎仪的出液口连接材质为醋酸纤维素的囊式滤器，滤芯规格为10um，滤器另一端连接溶液瓶或储液袋；打开连续流超声波破碎仪，开始进料直至上清液收集完毕。
6)将5)中所述的水痘疫苗原液加入冻干保护剂混合，从而获得水痘疫苗制剂；
7)将6)中的水痘疫苗制剂经冻干工艺后获得水痘疫苗的冻干制剂，其中所述冻干工艺中，冻结温度为-45±2℃，和/或干燥时间为7±1小时。
实施例3
1)细胞复苏与传代
将24代MRC-5细胞37℃水浴后加入含10％胎牛血清的MEM培养基中，以细胞工厂为培养容器，37±1℃静置培养3～5天，四十层显微镜逐层镜检。镜检合格后细胞株按1︰2的比例扩培，混匀后的细胞悬液经蠕动泵泵入连接管道的细胞工厂，使用ACFM进行料液平衡。37±1℃培养箱静置培养。
2)病毒接种与收获
当细胞连续传至32代时接种水痘Oka株工作毒种。接种毒种的细胞于37±1℃静置培养2～3天，当细胞病变达35％～65％时弃液，每层加入250ml的PBS，使用ACFM代替人工对细胞表面进行清洗。清洗两遍后弃去PBS，每层加入80ml的EDTA使用ACFM振摇。给料管通过蠕动泵给离心机填料碗体中填入感染的MRC-5人二倍体细胞进液速度1500ml/min，离心力2000G。细胞及细胞碎片在碗中分离给料和碗体旋转停止，取出细胞及细胞碎片以重悬的方式回收在一次性离心模组壁上的残余细胞,并进行细胞液的定容。
3)存入冷冻系统
收获液分装入一次性冻存袋，装量范围3000ml。储存于冷冻系统，冷冻模式设置为不预冷1小时内0℃持续降温至-80℃，-80℃冷冻保持。
4)融解系统融化
无菌实验通过后，使用程序融解系统融化，时间1小时，温度50℃。
5)连续流超声破细胞
将4)融化的收获液和等比例体积的PGS在溶液瓶或储液袋中混匀；将储液袋与连续流超声波破碎仪进行连接，连续流超声波破碎仪的参数设置为：频率20Khz，振幅40％，流速1.5L/min；在连续流超声波破碎仪的出液口连接材质为醋酸纤维素的囊式滤器，滤芯规格为10um，滤器另一端连接溶液瓶或储液袋；打开连续流超声波破碎仪，开始进料直至上清液收集完毕。
6)将5)中所述的水痘疫苗原液加入冻干保护剂混合，从而获得水痘疫苗制剂；
7)将6)中的水痘疫苗制剂经冻干工艺后获得水痘疫苗的冻干制剂，其中所述冻干工艺中，冻结温度为-45±2℃，和/或干燥时间为7±1小时。
实施例4
1)细胞复苏与传代
将24代MRC-5细胞37℃水浴后加入含10％胎牛血清的MEM培养基中，以细胞工厂为培养容器，37±1℃静置培养3～5天，四十层显微镜逐层镜检。镜检合格后细胞株按1︰2的比例扩培，混匀后的细胞悬液经蠕动泵泵入连接管道的细胞工厂，使用ACFM进行料液平衡。37±1℃培养箱静置培养。
2)病毒接种与收获
当细胞连续传至32代时接种水痘Oka株工作毒种。接种毒种的细胞于37±1℃静置培养2～3天，当细胞病变达35％～65％时弃液，每层加入250ml的PBS，使用ACFM代替人工对细胞表面进行清洗。清洗两遍后弃去PBS，每层加入80ml的EDTA使用ACFM振摇。给料管通过蠕动泵给离心机填料碗体中填入感染的MRC-5人二倍体细胞进液速度2000ml/min，离心力3000G。细胞及细胞碎片在碗中分离给料和碗体旋转停止，取出细胞及细胞碎片以重悬的方式回收在一次性离心模组壁上的残余细胞,并进行细胞液的定容。
3)存入冷冻系统
收获液分装入一次性冻存袋，装量范围4000ml。储存于冷冻系统，冷冻模式设置为不预冷1小时0℃持续降温至-100℃，-100℃冷冻保持。
4)融解系统融化
无菌实验通过后，使用程序融解系统融化，时间1小时，温度55℃。
5)连续流超声破细胞
将4)融化的收获液和等比例体积的PGS在溶液瓶或储液袋中混匀；将储液袋与连续流超声波破碎仪进行连接，连续流超声波破碎仪的参数设置为：频率20Khz，振幅40％，流速1.5L/min；在连续流超声波破碎仪的出液口连接材质为醋酸纤维素的囊式滤器，滤芯规格为10um，滤器另一端连接溶液瓶或储液袋；打开连续流超声波破碎仪，开始进料直至上清液收集完毕。
6)将5)中所述的水痘疫苗原液加入冻干保护剂混合，从而获得水痘疫苗制剂；
7)将6)中的水痘疫苗制剂经冻干工艺后获得水痘疫苗的冻干制剂，其中所述冻干工艺中，冻结温度为-45±2℃，和/或干燥时间为7±1小时。
实施例5
1)细胞复苏与传代
将24代MRC-5细胞37℃水浴后加入含10％胎牛血清的MEM培养基中，以细胞工厂为培养容器，37±1℃静置培养3～5天，四十层显微镜逐层镜检。镜检合格后细胞株按1︰2的比例扩培，混匀后的细胞悬液经蠕动泵泵入连接管道的细胞工厂，使用ACFM进行料液平衡。37±1℃培养箱静置培养。
2)病毒接种与收获
当细胞连续传至32代时接种水痘Oka株工作毒种。接种毒种的细胞于37±1℃静置培养2～3天，当细胞病变达35％～65％时弃液，每层加入250ml的PBS，使用ACFM代替人工对细胞表面进行清洗。清洗两遍后弃去PBS，每层加入80ml的EDTA使用ACFM振摇。给料管通过蠕动泵给离心机填料碗体中填入感染的MRC-5人二倍体细胞进液速度2500ml/min，离心力3000G。细胞及细胞碎片在碗中分离给料和碗体旋转停止，取出细胞及细胞碎片以重悬的方式回收在一次性离心模组壁上的残余细胞,并进行细胞液的定容。
3)存入冷冻系统
收获液分装入一次性冻存袋，装量范围5000ml。储存于冷冻系统，冷冻模式设置为不预冷1小时-60℃降温至-80℃，-80℃冷冻保持。
4)融解系统融化
无菌实验通过后，使用程序融解系统融化，时间1小时，温度60℃。
5)连续流超声破细胞
将4)融化的收获液和等比例体积的PGS在溶液瓶或储液袋中混匀；将储液袋与连续流超声波破碎仪进行连接，连续流超声波破碎仪的参数设置为：频率20Khz，振幅40％，流速1.5L/min；在连续流超声波破碎仪的出液口连接材质为醋酸纤维素的囊式滤器，滤芯规格为10um，滤器另一端连接溶液瓶或储液袋；打开连续流超声波破碎仪，开始进料直至上清液收集完毕。
6)将5)中所述的水痘疫苗原液加入冻干保护剂混合，从而获得水痘疫苗制剂；
7)将6)中的水痘疫苗制剂经冻干工艺后获得水痘疫苗的冻干制剂，其中所述冻干工艺中，冻结温度为-45±2℃，和/或干燥时间为7±1小时。
实施例6
按照实施例2-5生产的水痘-带状疱疹减毒活疫苗的各项检定结果如下表1-3：
表1 4种水痘减毒活疫苗原液的相关质量指标检定结果
Figure BDA0003784181380000161
表2 4种水痘减毒活疫苗原液的病毒稳定性试验结果
Figure BDA0003784181380000162
表3 4种水痘减毒活疫苗成品的相关质量指标检定结果
Figure BDA0003784181380000163
此外，还使用现有技术制备了水痘减毒活疫苗，制备步骤与实施例2的区别在于：在步骤1)中，使用普通细胞培养瓶为培养容器；在步骤2)中，使用传统台式离心机离心；在步骤3)中，将细胞收获液装入冷冻旋转瓶，并采用干冰酒精混合物进行冷冻；在步骤4)中，使用人工手动温水融化旋冻瓶；在步骤5)中，使用常规超声破碎仪超声，而非连续流超声。制备过程中使用添加抗生素的培养基。
制备的水痘减毒活疫苗成品的相关质量指标，如下表4所示：
表4现有技术水痘减毒活疫苗成品的相关质量指标检定结果
Figure BDA0003784181380000171
综合以上结果，可以看出本发明的制备方法通过全程管路连接，设备自动化生产，大大降低了污染风险，全程使用不添加抗生素的培养基，因此抗生素检出量接近0。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种制备水痘-带状疱疹减毒活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)提供水痘病毒毒种感染的病变细胞；
(b)使用一次性碗式离心机，离心收集步骤(a)中的病变细胞，并将病变细胞存入一次性冻存袋；
(c)利用冷冻系统冷冻一次性冻存袋中的病变细胞，从而得到冷冻的病变细胞；其中，所述冷冻系统为液氮冷冻；
(d)利用融解系统融化一次性冻存袋中冷冻的病变细胞，从而获得融化收获液；
(e)将步骤(d)中融化收获液和等比例体积的超声缓冲液在超声容器中混匀，将超声容器与连续流超声波破碎仪的进液口连接，进行连续流超声，从而获得超声破碎收获液；和
(f)将步骤(e)中的超声破碎收获液经滤器过滤后收集，从而获得水痘-带状疱疹减毒活疫苗原液；其中所述滤器与所述连续流超声破碎仪的出液口连接。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，还包括以下子步骤：
(a1)以细胞工厂为培养容器，培养宿主细胞；
(a2)对宿主细胞连续传代培养至30-40代(较佳地32代)，接种水痘病毒毒种；
(a3)培养接种水痘病毒毒种的宿主细胞，在接种水痘病毒毒种的宿主细胞的细胞病变达到35％-65％时，即获得水痘病毒毒种感染的病变细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，使用蠕动泵通过连接细胞工厂和一次性碗式离心机的给料管将病变细胞悬液收集至一次性碗式离心机的填料碗体中，收集病变细胞悬液的进液流速为1500ml/min-2500ml/min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述冷冻系统的冷冻温度为0℃到-100℃，预冷时间为0分钟(即不预冷)或10-60分钟，冷冻时间为20分钟-2小时，较佳地1小时；冷冻保持的温度为-80℃到-100℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，所述融解系统的融化温度为40℃-60℃，融化时间为40分钟-2小时，较佳地1小时。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(g)将步骤(f)中获得的水痘-带状疱疹疫苗原液与冻干保护剂混合，经冻干处理后获得水痘-带状疱疹减毒活疫苗冻干制剂。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法全程无菌操作，且全程使用不添加抗生素的培养基。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法各步骤中使用的各器材通过无菌管路连接，从而实现自动化连续流制备。
9.一种制备水痘-带状疱疹减毒活疫苗的系统，其特征在于，所述系统包括以下模块：
(M1)细胞培养和病毒接种模块，所述模块被配置为培养宿主细胞并接种水痘病毒毒种，从而提供水痘病毒毒种感染的病变细胞；
(M2)细胞收集模块，所述细胞收集模块被配置为使用一次性碗式离心机，离心收集水痘病毒毒种感染的病变细胞，并将病变细胞存入一次性冻存袋；
(M3)冷冻模块，所述冷冻模块被配置为冷冻一次性冻存袋中的病变细胞，从而得到冷冻的病变细胞；
(M4)融解模块，所述融解模块被配置为融化一次性冻存袋中冷冻的病变细胞，从而获得融化收获液；
(M5)连续流超声模块，所述连续流超声模块被配置为使用连续流超声破碎仪超声破碎超声容器中的融化收获液，从而获得超声破碎收获液；
(M6)过滤模块，所述过滤模块被配置为使用滤器将获得的超声破碎收获液过滤，从而获得水痘-带状疱疹疫苗原液。
10.如权利要求9所述的系统，其特征在于，所述系统还进一步包括(M7)冻干模块，所述冻干模块被配置为将获得的水痘-带状疱疹疫苗原液与冻干保护剂混合后进行冻干处理，从而获得水痘-带状疱疹疫苗冻干制剂。
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