CN111500548A - 一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法 - Google Patents

一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，具体制备步骤包括：将收获得到的细胞液进行离心分离；所述离心分离采用UniFuge一次性桶状碗体离心机。另外，还包括细胞复苏，细胞传代，病毒培养，收获细胞，离心洗涤工序。本发明可以解决现有技术中的水痘‑带状疱疹病毒疫苗的生产工艺中存在细胞收集及洗涤无菌操作风险高、洗涤去除牛血清白蛋白效果差的的问题。

Description

一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法。
背景技术
水痘减毒活疫苗是将水痘病毒OKA株在MRC-5二倍体细胞培养繁殖而获得的病毒冻干制品。适用于对12月龄以上的健康儿童、青少年及成人、高危人群及其密切接触者进行水痘预防的主动免疫。带状疱疹减毒活疫苗与水痘减毒活疫苗基本类似，其浓度约是水痘疫苗的10倍。
食品药品监督管理局大力鼓励和引导生产企业通过一次性生产技术提高和保证疫苗的质量。目前水痘—带状疱疹病毒疫苗现有工艺均为通过细胞工厂、CorningHYPERStack培养室培养人二倍体细胞，接种水痘病毒，CPE达到50％以上时，通过消化收集细胞，通过低速杯式离心机进行离心、洗涤细胞，重悬细胞沉淀后对细胞悬液进行冻融或超声，通过破碎细胞释放病毒，收集上清，加入适宜保护剂冻干而成。
水痘病毒对培养条件要求很高，在病毒培养阶段通常需要添加终浓度在2％牛血清，牛血清白蛋白是一种强致敏原，是导致水痘—带状疱疹病毒疫苗不良反应的主要因素，如何降低疫苗牛血清白蛋白残留量是生产中迫切需要控制和解决的问题，本发明提供一种利用UniFuge一次性使用的桶状碗体离心机收集、洗涤细胞，有效解决了水痘-带状疱疹病毒疫苗细胞收集效率低、牛血清白蛋白残留不容易去除的技术问题，提高了水痘—带状疱疹病毒疫苗安全性。
因此开发一种高效率、无菌收集细胞、去除牛血清白蛋白的方法，制备更低杂质、更高安全性水痘—带状疱疹病毒疫苗非常重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，以解决现有技术中的水痘-带状疱疹病毒疫苗的生产工艺中存在细胞收集及洗涤无菌操作风险高、洗涤去除牛血清白蛋白效果差的的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，具体制备步骤包括：将收获得到的细胞液进行离心分离；
所述离心分离采用UniFuge一次性桶状碗体离心机。
进一步的，所述离心分离包括：将所述收获得到的细胞液加入容器中，连接UniFuge一次性桶状碗体离心机，于离心力1500～3000g，每分钟按1.5～3L/min泵入细胞悬液条件下，进行离心分离，离心结束后使用0.01mol/L速度，重复洗涤2～3个离心机腔体体积。
进一步的，所述具体制备步骤包括：细胞复苏；细胞传代；病毒接种；收获得到细胞液；离心分离。
进一步的，所述细胞复苏包括：将MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199-801培养液，将细胞管解冻，融化后的细胞悬液无菌吸入到10mL离心管中，补加生长液，1000rpm离心5分钟；弃上清液，加入细胞生长液重悬细胞，转移到T25细胞瓶中，补加培养液，恒温培养3～4天后，得复苏细胞液。
进一步的，所述MRC-5细胞为来源于ATCC的工作细胞库MRC-5细胞。
进一步的，所述细胞传代包括：先将盛放有复苏细胞液的瓶内液体吸弃，加入磷酸盐缓冲溶液液洗涤细胞表面，再加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化1～3分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入细胞培养液，吹打细胞面，使细胞分散，按1:4～1:8传代比例进行传代，补加入至0.2～0.3mL/cm2的5-10％新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，恒温培养。
进一步的，所述病毒接种包括：待所述传代培养过程中，细胞单层融合度为80～90％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.001～0.01，维持液为的2～5％新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，维持液量为0.2～0.3mL/cm2，恒温培养。
进一步的，所述收获得到细胞液包括：待病毒接种后，恒温培养过程中，细胞的CPE达到50％时收获细胞，加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞表面，然后按0.1mL/cm2加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化1～3分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，摇晃至细胞全部脱落。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
上述技术方案基于用UniFuge一次性使用的桶状碗体离心机，UniFuge一次性桶状碗体离心机，进料及排液过程无剪切力有效可以避免细胞破碎，适合细胞收集或去除，较大的空间使得收集细胞生产过程无需停顿，适合工业化规模生产；全密闭管路可实现无菌操作最大6L/min处理能力，相对于传统大容量离心机处理能力最大6L/50min提高30～50倍，有效提高了细胞收集效率；采用上述技术方案的方法后，生产设备及生产场地要求将降低一倍，生产效率提升约100％,生产成本约下降10％～15％。
上述技术方案采用的离心机系统自带的重悬沉淀功能适合水痘疫苗中细胞的洗涤，且其可重复功能非常适合需要多次洗涤水痘—带状疱疹病毒疫苗，逐步去除和降低牛血清白蛋白残余量。从而提高水痘病毒疫苗生产的效率与质量标准；进料及排液过程无剪切力有效避免细胞破碎引起病毒损失问题；且自动清洗细胞表面粘附的牛血清白蛋白，将有效降低水痘病毒病毒制剂中牛血清白蛋白残留量技术问题；上述技术方案的方法培养条件下，水痘—带状疱疹病毒疫苗原液牛血清白蛋白残余量将下降至5ng/mL以下。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库的MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含10％新生牛血清的M199-801培养液，将细胞管解冻，融化后的细胞悬液无菌吸入到10mL离心管中，补加生长液，1000rpm离心5分钟；弃上清液，加入细胞生长液重悬细胞，转移到T25细胞瓶中，补加培养液，恒温培养3天后，得复苏细胞液。
细胞传代：先将盛放有复苏细胞液的瓶内液体吸弃，加入磷酸盐缓冲溶液液洗涤细胞表面，再加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化1分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入细胞培养液，吹打细胞面，使细胞分散，按1:4传代比例进行传代，补加入至0.2mL/cm2的5％新生牛血清pH7.2 M199-801培养液，恒温培养。
病毒接种：待所述传代培养过程中，细胞单层融合度为80％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.001，维持液为的2％新生牛血清pH7.2 M199-801培养液，维持液量为0.2mL/cm2，恒温培养。
收获得到细胞液：待病毒接种后，恒温培养过程中，细胞的CPE达到50％时收获细胞，加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞表面，然后按0.1mL/cm2加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化1分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，摇晃至细胞全部脱落。
离心分离：将所述收获得到的细胞液加入容器中，连接UniFuge一次性桶状碗体离心机，于离心力1500g，每分钟按1.5L/min泵入细胞悬液条件下，进行离心分离，离心结束后使用0.01mol/L速度，重复洗涤2个离心机腔体体积；再用0.01mL/cm2培养面积加入冻干保护剂重悬细胞，收集细胞悬液至冷冻瓶中。
实施例2
细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库的MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含15％新生牛血清的M199-801培养液，将细胞管解冻，融化后的细胞悬液无菌吸入到10mL离心管中，补加生长液，1000rpm离心5分钟；弃上清液，加入细胞生长液重悬细胞，转移到T25细胞瓶中，补加培养液，恒温培养3天后，得复苏细胞液。
细胞传代：先将盛放有复苏细胞液的瓶内液体吸弃，加入磷酸盐缓冲溶液液洗涤细胞表面，再加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化2分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入细胞培养液，吹打细胞面，使细胞分散，按1:5传代比例进行传代，补加入至0.25mL/cm2的8％新生牛血清pH7.3 M199-801培养液，恒温培养。
病毒接种：待所述传代培养过程中，细胞单层融合度为85％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.009，维持液为的3％新生牛血清pH7.3 M199-801培养液，维持液量为0.25mL/cm2，恒温培养。
收获得到细胞液：待病毒接种后，恒温培养过程中，细胞的CPE达到50％时收获细胞，加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞表面，然后按0.1mL/cm2加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化2分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，摇晃至细胞全部脱落。
离心分离：将所述收获得到的细胞液加入容器中，连接UniFuge一次性桶状碗体离心机，于离心力2000g，每分钟按2L/min泵入细胞悬液条件下，进行离心分离，离心结束后使用0.01mol/L速度，重复洗涤2个离心机腔体体积；再用0.01mL/cm2培养面积加入冻干保护剂重悬细胞，收集细胞悬液至冷冻瓶中。
实施例3
细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库的MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含20％新生牛血清的M199-801培养液，将细胞管解冻，融化后的细胞悬液无菌吸入到10mL离心管中，补加生长液，1000rpm离心5分钟；弃上清液，加入细胞生长液重悬细胞，转移到T25细胞瓶中，补加培养液，恒温培养4天后，得复苏细胞液。
细胞传代：先将盛放有复苏细胞液的瓶内液体吸弃，加入磷酸盐缓冲溶液液洗涤细胞表面，再加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化3分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入细胞培养液，吹打细胞面，使细胞分散，按1:8传代比例进行传代，补加入至0.3mL/cm2的10％新生牛血清pH7.4 M199-801培养液，恒温培养。
病毒接种：待所述传代培养过程中，细胞单层融合度为90％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数(MOI)为0.01，维持液为的5％新生牛血清pH7.4 M199-801培养液，维持液量为0.3mL/cm2，恒温培养。
收获得到细胞液：待病毒接种后，恒温培养过程中，细胞的CPE达到50％时收获细胞，加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞表面，然后按0.1mL/cm2加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化3分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，摇晃至细胞全部脱落。
离心分离：将所述收获得到的细胞液加入容器中，连接UniFuge一次性桶状碗体离心机，于离心力3000g，每分钟按3L/min泵入细胞悬液条件下，进行离心分离，离心结束后使用0.01mol/L速度，重复洗涤3个离心机腔体体积；再用0.01mL/cm2培养面积加入冻干保护剂重悬细胞，收集细胞悬液至冷冻瓶中。
实施例4
本实施例相比于实施例1而言，区别在于：采用青岛爱普科生产的Neofuge 15R离心机取代UniFuge一次性桶状碗体离心机，其余条件保持不变。
对实施例1-4的制备方法进行测试，具体测试方法和测试结果如下所述：
测试方法：测试个实施例在离心分离工序前水痘-带状疱疹病毒疫苗原液牛血清白蛋白的含量，再测试经过离心分离后水痘-带状疱疹病毒疫苗原液牛血清白蛋白的含量，测试结果如表1所示：
表1：水痘-带状疱疹病毒疫苗原液牛血清白蛋白残留量
离心分离前 离心分离后
实施例1 72.63ng/mL 3.68ng/mL
实施例2 76.88ng/mL 2.98ng/mL
实施例3 71.56ng/mL 2.45ng/mL
实施例4 78.99ng/mL 53.61ng/mL
由表1测试结果可知，经过本发明特定的制备工序和制备设备的结合，可以有效降低水痘-带状疱疹疫苗中牛血清白蛋白残留量，提高疫苗安全性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (8)

1.一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，其特征在于，具体制备步骤包括：将收获得到的细胞液进行离心分离；
所述离心分离采用UniFuge一次性桶状碗体离心机。
2.根据权利要求1所述的一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，其特征在于，所述离心分离包括：将所述收获得到的细胞液加入容器中，连接UniFuge一次性桶状碗体离心机，于离心力1500～3000g，每分钟按1.5～3L/min泵入细胞悬液条件下，进行离心分离，离心结束后使用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液，重复洗涤2～3个离心机腔体体积。
3.根据权利要求1所述的一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，其特征在于，所述具体制备步骤包括：细胞复苏；细胞传代；病毒接种；收获得到细胞液；离心分离。
4.根据权利要求3所述的一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，其特征在于，所述细胞复苏包括：将MRC-5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199-801培养液，将细胞管解冻，融化后的细胞悬液无菌吸入到10mL离心管中，补加生长液，1000rpm离心5分钟；弃上清液，加入细胞生长液重悬细胞，转移到T25细胞瓶中，补加培养液，恒温培养3～4天后，得复苏细胞液。
5.根据权利要求4所述的一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，其特征在于，所述MRC-5细胞为来源于ATCC的工作细胞库MRC-5细胞。
6.根据权利要求3所述的一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，其特征在于，所述细胞传代包括：先将盛放有复苏细胞液的瓶内液体吸弃，加入磷酸盐缓冲溶液液洗涤细胞表面，再加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化1～3分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入细胞培养液，吹打细胞面，使细胞分散，按1:4～1:8传代比例进行传代，补加入至0.2～0.3mL/cm2的5～10％新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，恒温培养。
7.根据权利要求3所述的一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，其特征在于，所述病毒接种包括：待所述传代培养过程中，细胞单层融合度为80～90％时，取水痘工作种子批进行感染，感染复数为0.001～0.01，维持液为的2～5％新生牛血清pH7.2～7.4M199-801培养液，维持液量为0.2～0.3mL/cm2，恒温培养。
8.根据权利要求3所述的一种水痘—带状疱疹病毒疫苗制备方法，其特征在于，所述收获得到细胞液包括：待病毒接种后，恒温培养过程中，细胞的CPE达到50％时收获细胞，加入磷酸盐缓冲液洗涤细胞表面，然后按0.1mL/cm2加入EDTA-Trypsin消化液，直至覆盖细胞，细胞瓶平放消化1～3分钟，待细胞面肉眼观察出现间隙时，摇晃至细胞全部脱落。
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