CN104857013A - 一种抑制新城疫病毒的药物 - Google Patents

Abstract

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种抑制新城疫病毒的药物。抑制新城疫病毒的药物为低分子量的β-壳聚糖。β-壳聚糖能够显著提高IL-2、TLR-7、IFN-β、TNF-α等免疫因子的表达，从而激发免疫系统的抗病毒反应，提高家禽免疫力，从而有效抑制新城疫病毒的发病及扩散。对于β-壳聚糖抗鸡新城疫病毒的效果研究也为其他病毒类疾病的预防和治疗提供了有效依据和可能的药物研发方向。

Description

一种抑制新城疫病毒的药物

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种抑制新城疫病毒的药物。

背景技术

壳聚糖是仅次于纤维素且唯一带正电荷的天然多糖化合物，由于其特殊的化学结构及电荷分布，而被赋予了极好的生物活性、化学活性。壳聚糖根据构型不同可分为α-壳聚糖、β-壳聚糖和γ-壳聚糖。目前，自然界储存量最高的α-壳聚糖已有很多研究，不同分子量的α-壳聚糖已有一些产品上市，如创口贴、农肥、农药和保健品等。由于空间结构上的差异，同样分子量的β-壳聚糖较α-壳聚糖表现出更好的溶解性、更高的反应活性和对反应试剂更高的亲和性，具有更好的生物活性、生物安全性和化学可修饰性。此外β-壳聚糖还具有优异的抗氧化、抗菌及抗病毒的活性。但由于β-壳聚糖量少，且在一定的条件下很容易转变构型为α-壳聚糖，对β-壳聚糖的研究与产品开发目前还很少。

新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性、急性败血性传染病。具有分布范围广、易感禽类多、经济损失大、影响国际贸易等特点。目前新城疫的防治主要以预防为主，虽然有多种疫苗和免疫方法，但是该病的发病率却仍是居高不下。其主要原因有母源抗体的干扰、病毒引起的免疫抑制等。由于新城疫防治困难，给我国已造成了巨大的经济损失，引起了人们的极大关注。同时作为免疫损伤性疾病，对于新城疫的研究是系统性研究免疫损伤性疾病的重要基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制新城疫病毒的药物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种抑制新城疫病毒的药物，抑制新城疫病毒的药物为低分子量的β-壳聚糖。

所述抑制新城疫病毒的药物为10-3KDa的β-壳聚糖。

所述抑制新城疫病毒的药物为6-3KDa的β-壳聚糖。

所述抑制新城疫病毒的药物为经生理盐水溶解的低分子量的β-壳聚糖溶液。

所述抑制新城疫病毒的药物是浓度为1-10g/L经生理盐水溶解的低分子量的β-壳聚糖溶液。

上述药物与新城疫病毒混合直接作用于家禽作为直接抑制病毒组；上述药物直接作用于家禽作为预防作用组；上述药物直接作用于携带病毒的家禽作为治疗作用组；直接抑制病毒组相比于预防作用组和治疗作用组，最大程度的降低了新城疫病毒的血凝效价，其次为预防作用组。

直接抑制病毒组的β-壳聚糖最佳分子量段为3-6KDa，浓度为2-8g/L时即可将鸡胚尿囊液中血凝效价由11降低到0；预防作用组的β-壳聚糖最佳分子量段为4-6KDa，浓度为1g/L时效果更好；治疗作用组的β-壳聚糖最佳分子量段为4-6KDa，作用较弱。

一种抑制新城疫病毒的药物的应用，所述药物作为制备新城疫病毒的抑制药物。

所述药物作为制备家禽免疫因子调节剂。

本发明的优点

1.本发明采用不同分子量、不同浓度的低分子量β-壳聚糖作为实验原料，系统化的研究了分子量对β-壳聚糖抗新城疫病毒效果的影响。为制备具有防治新城疫病毒的β-壳聚糖药物的分子量提供了理论参考。

2.本发明采用不同浓度，不同的给药方式对β-壳聚糖抑制新城疫病毒的效果进行优化，并确定了最低的抑制浓度，发现同时注射新城疫Lasota病毒和β-壳聚糖的直接抑制作用组具有好的抑制病毒效果，且在一定范围内随着浓度的升高，抑制病毒效果得到加强。

3.本发明采用分子量为3KDa-6KDa的β-壳聚糖可将新城疫病毒血凝效价降至0，同时促进IL-2、IFN-β、TNF-α等免疫因子RNA表达量显著增加，极大提高免疫系统性能。

4.本发明所述β-壳聚糖是一种天然存在的带正电荷的天然多糖，目前发现其本身具有提高免疫力、良好的生物亲和和良好的生物安全性等特点，作为药物使用，能有效降低毒副作用及相关生物污染。

5.本发明所采用的不同分子量的β-壳聚糖是通过微波辅助方法制得，简单可行，原料制备方便且不引入化学有毒物质，具有很好的广泛应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的低分子量的β-壳聚糖高效液相色谱图，A分子量为5743Da，B分子量为3375Da。

图2为本发明实施例提供的低分子量的β-壳聚糖红外谱图,A分子量为5743Da，B分子量为3375Da。

具体实施例

下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。

实施例1

EID₅₀的测定：取SPF鸡胚30枚，分成6组，分别注射10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9鸡新城疫Lasota病毒原液，37℃孵育72h后收取尿囊液，测定EID₅₀＝10^-8.45/0.2ml,取150EID₅₀为病毒注射量。

药物安全限度测定：将分子量为10491、8588、7099、5933、5743、4371、3624、3375Da的β-壳聚糖分别用生理盐水配置成20g/l、10g/l、5g/l和1g/l四个梯度的溶液分别注射于SPF鸡胚尿囊腔中，观察96小时内，完全成活，继续培养至出壳，鸡胚外观健康完整，无残疾。

直接抑制作用组：将分子量为10491、8588、7099、5933、5743、4371、3624、3375Da的β-壳聚糖分别用生理盐水配置成1g/L、10g/L两种不同浓度的溶液，将不同分子量的β-壳聚糖经生理盐水配置的不同浓度的溶液抽滤除菌后，备用。将lasota鸡新城疫病毒用生理盐水稀释为10^-6后(原始病毒效价为2¹¹，96h内导致死亡)，将病毒稀释液与上述各物质的不同浓度的溶解液以1:1(v/v)的比例混匀，编号为1-16组，备用。

取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后注射1-16组溶液0.2mL/只。同时将空白组注射生理盐水，阳性对照1、2分别为1g/L、10g/L利巴韦林与病毒1:1(v/v)混合液。阳性对照3、4为1g/L、10g/L黄芪多糖与病毒1:1(v/v)混合液，阴性对照为10^-6鸡新城疫病毒与生理盐水1:1(v/v)混合液。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果如下表1。

表1

阴性对照：10空白对照：0阳性对照品纯度为90％以上

不同分子量的β-壳聚糖的制备：取β-壳聚糖原料溶解于过量的浓度为2wt％乙酸中，溶解后将其置于30％过氧化氢中采用微波处理，分别降解10min,60min,80min,180min,240min继而依次获得所需分子量为10491、8588、7099、5933、5743、4371、3624、3375Da的低分子量β-壳聚糖。其中，β-壳聚糖溶解液与过氧化氢之间的体积比为50:1.5；微波处理条件为：600w，70℃，500r/min。

实施例2

预防作用组：将分子量为10491、8588、7099、5933、5743、4371、3624、3375Da的β-壳聚糖分别用生理盐水配置成1g/L、10g/L两种不同浓度的溶液，将不同分子量的β-壳聚糖经生理盐水配置的不同浓度的溶液抽滤除菌后，编号1-16组备用。

取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后注射1-16组溶液0.2mL/只。同时将空白组注射生理盐水，阳性对照为1g/L、10g/L利巴韦林和黄芪多糖，阴性对照为生理盐水。1d后对实验组1-16组、阳性对照组及阴性对照组接种病毒0.2ml/只，浓度为10^-6。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果如下表2。

表2

阴性对照：10.2 空白对照：0 阳性对照品纯度为90％以上

实施例3

治疗作用组：将分子量为10491、8588、7099、5933、5743、4371、3624、3375Da的β-壳聚糖分别用生理盐水配置成1g/L、10g/L两种不同浓度的溶液，将不同分子量的β-壳聚糖经生理盐水配置的不同浓度的溶液抽滤除菌后，编号1-16组备用。

取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后接种10^-6鸡新城疫Lasota病毒0.2ml/只，实验组和对照组共21组，空白组注射等量生理盐水。1d后对于注射病毒的16组鸡胚注射1-16组实验溶液0.2mL/只和4组阳性对照组溶液及阴性对照组的生理盐水。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果如下表3。

表3

阴性对照：10.8 空白对照：0 阳性对照品纯度为90％以上

实施例4

最佳浓度的确定：将直接抑制病毒效果较好的分子量为5743、3624Da的β-壳聚糖分别用生理盐水配置成0.25g/L、0.5g/L、1g/L、2g/L、5g/L、7g/L、8g/L、10g/L一系列浓度的溶液，将不同分子量的β-壳聚糖经生理盐水配置的不同浓度的溶液抽滤除菌后，备用。将lasota鸡新城疫原毒稀释为10^-6后(原始病毒效价为2¹¹，96h内导致死亡)，将病毒稀释液与上述各物质的不同浓度的溶解液以1:1(v/v)的比例混匀，编号为1-16组，备用。

取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后注射1-14组溶液0.2mL/只。同时将空白组注射生理盐水，阳性对照分别为5g/L利巴韦林与病毒1:1(v/v)混合液和5g/L黄芪多糖与病毒1:1(v/v)混合液，阴性对照为10^-6鸡新城疫病毒与生理盐水1:1(v/v)混合液。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果见下表4和表5。

表4

表5

实施例5

取10g/L经生理盐水溶解的分子量为5743Daβ-壳聚糖溶液处理过的鸡胚尿囊液和阴性对照组鸡胚尿囊液各400μL于不同1.5mL离心管中，各加600μL裂解液颠倒混匀后加400μL氯仿，编号，颠倒混匀(10次左右)后放置-20℃沉淀10min。12000r/min离心10min，分管取上清液600μL，加异丙醇800μL，颠倒混匀，-20℃，沉淀30min。12000r/min离心10min。倾倒离心管上清，将管口向下置于吸水纸上，停留5-10s，沿离心管壁加入冷乙醇(75％)1000μL，冲洗1-2次。低速离心，将枪头置于核酸相反的位置吸出残余液体。

反转录：采用反转录试剂盒(试剂盒购买自北京全式金生物技术有限公司)，按说明书要求取上下游引物各1μL，RNase-free Water 6μL分别加入到各管中，65℃孵育5min后冰浴2min，然后再加入其它反应组分。分别为10μL2×TS Reaction Mix，1μLTransScript RT/RI EnzymeMix，1μLgDNA Remover，轻轻混匀，42℃孵育30min。85℃加热5min失活TransScript RT与gDNA Remover

荧光定量PCR：采用PCR试剂盒(试剂盒购买自北京全式金生物技术有限公司)，按说明书要求取8μLtemplate，上下游引物各1μL，10μL2×TransStart Top Green qPCR SuperMix设置步骤为①94℃30sec，循环数为1。②94℃5sec、50-60℃15sec、72℃10sec，循环数为50。

以β-actin为内参，采用2-ΔΔ^CT法计算ND、IL-2、IFN-β、TNF-α荧光定量PCR结果的差异：

Claims (7)

1.一种抑制新城疫病毒的药物，其特征在于：抑制新城疫病毒的药物为低分子量的β-壳聚糖。

2.按权利要求1所述的抑制新城疫病毒的药物，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的药物为10-3KDa的β-壳聚糖。

3.按权利要求2所述的抑制新城疫病毒的药物，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的药物为6-3KDa的β-壳聚糖。

4.按权利要求1、2或3所述的抑制新城疫病毒的药物，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的药物为经生理盐水溶解的低分子量的β-壳聚糖溶液。

5.按权利要求4所述的抑制新城疫病毒的药物，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的药物是浓度为1-10g/L经生理盐水溶解的低分子量的β-壳聚糖溶液。

6.一种权利要求1所述的抑制新城疫病毒的药物的应用，其特征在于：所述药物作为制备新城疫病毒的抑制药物。

7.一种权利要求1所述的抑制新城疫病毒的药物的应用，其特征在于：所述药物作为制备家禽免疫因子调节剂。