CN104857012A - 一种抑制新城疫病毒制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种抑制新城疫病毒制剂及其应用。抑制新城疫病毒的药物为低分子量的α-壳聚糖。低分子量α-壳聚糖能够显著提高IL-2、TNF-α等免疫因子的表达，从而激发免疫系统的抗病毒反应，提高家禽免疫力，从而有效抑制新城疫病毒的发病及扩散。这为低分子量α-壳聚糖成为防治抗新城疫病毒药物的研究打下了很好的基础。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种抑制新城疫病毒制剂及其应用。
背景技术
壳聚糖是仅次于纤维素且唯一带正电荷的天然多糖化合物，由于其特殊的化学结构及电荷分布，而被赋予了极好的生物活性、化学活性。壳聚糖根据构型不同可分为α-壳聚糖、β-壳聚糖和γ-壳聚糖。其中α-壳聚糖的自然存储量最高，甲壳动物的外壳、昆虫的外壳等均富含α-壳聚糖，目前应用最广。低分子量的α-壳聚糖由于其溶解性等优势，活性更好，得到了更广泛的应用，如农药、农肥和保健品等，还有部分研究应用于提高机体免疫力的饲料添加剂。
新城疫是由新城疫病毒(NDV)引起禽类的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型症状的高度接触性、急性败血性传染病。具有分布范围广、易感禽类多、经济损失大、影响国际贸易等特点。目前新城疫的防治主要以预防为主，虽然有多种疫苗和免疫方法，但是该病的发病率却仍是居高不下。其主要原因有母源抗体的干扰、病毒引起的免疫抑制等。由于新城疫防治困难，给我国已造成了巨大的经济损失，引起了人们的极大关注。同时作为免疫损伤性疾病，对于新城疫的研究是系统性研究免疫损伤性疾病的重要基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制新城疫病毒制剂及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种抑制新城疫病毒的制剂，抑制新城疫病毒的制剂为低分子量的α-壳聚糖。
所述抑制新城疫病毒的制剂为10-1KDa的α-壳聚糖。
所述抑制新城疫病毒的制剂为10-3KDa的α-壳聚糖。
所述抑制新城疫病毒的制剂为经生理盐水溶解的低分子量的α-壳聚糖溶液。
所述抑制新城疫病毒的制剂是浓度为1-10g/L经生理盐水溶解的低分子量的α-壳聚糖溶液。
上述制剂与新城疫病毒混合作为直接抑制病毒组；上述制剂作为预防作用组；直接抑制病毒组相比于预防作用组，具有更好的免疫效果。
直接抑制病毒组中最佳α-壳聚糖分子量段为10-4KDa；预防作用组的最佳α-壳聚糖分子量段为8KDa-3KDa。
一种抑制新城疫病毒的制剂的应用，所述制剂作为制备新城疫病毒的抑制药物。
一种抑制新城疫病毒的制剂的应用，所述制剂作为制备家禽免疫因子调节剂。
本发明的优点：
1.本发明采用不同分子量、不同浓度的低分子量α-壳聚糖作为实验原料，系统化的研究了分子量对α-壳聚糖抗新城疫病毒效果的影响。根据随着α-壳聚糖分子量的降低，其抗病毒效果呈现波动趋势的结果，确定了最佳的分子量在5KDa左右抗病毒综合效果最好。
2.本发明采用不同浓度，不同的给药方式对α-壳聚糖抑制新城疫病毒的效果进行优化，发现同时注射新城疫Lasota病毒和α-壳聚糖的抑制作用组具有好的抑制病毒效果，且在低浓度就表现出了较好的抗病毒活性，确定了α-壳聚糖的最佳使用方式。
3.本发明采用低分子量的α-壳聚糖可显著降低新城疫病毒血凝效价，同时促进IL-2、TNF-α等免疫因子RNA表达显著增加，极大提高免疫系统性能。
4.本发明所述α-壳聚糖是一种天然存在的带正电荷的天然多糖，目前发现其本身具有提高免疫力、良好的生物亲和性和良好的生物安全性等特点，作为药物使用，能有效降低毒副作用及相关生物污染。
5.本实验获得的不同分子量的α-壳聚糖是通过微波辅助方法制得，简单可行，原料制备方便且不引入化学有毒物质，具有很好的广泛应用前景。
附图说明
图1为分子量为4513的α-壳聚糖的高效液相色谱图。
图2为分子量为4513的α-壳聚糖红外谱图。
图3为本发明实施例提供的低浓度直接抑制试验效果图。
图4为本发明实施例提供的高浓度直接抑制试验效果图。
图5为本发明实施例提供的高浓度预防实验效果图。
具体实施例
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
EID50的测定：取SPF鸡胚30枚，分成6组，分别注射10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9鸡新城疫Lasota病毒原液，37℃孵育72h后收取尿囊液，测定EID50＝10-8.45/0.2ml,取150EID50为病毒注射量。
药物安全限度测定：将分子量为9926、8373、4513、2761、2622、2391、1968、1729Da的α-壳聚糖分别用生理盐水配置成15g/l、10g/l和5g/l三个梯度的溶液分别注射于SPF鸡胚尿囊腔中，观察96小时内，完全成活，继续培养至出壳，鸡胚外观健康完整，无残疾。
低浓度直接抑制试验：将分子量为9926、8373、4513、2761、2622、2391、1968、1729Da的α-壳聚糖分别用生理盐水配置成1g/L的溶液，将不同分子量的α-壳聚糖经生理盐水配置的溶液抽滤除菌后，备用。将lasota鸡新城疫病毒经生理盐水稀释为10-6后(原始病毒效价为211，96h内导致鸡胚死亡)，将病毒稀释液与上述各物质的不同浓度的溶解液以1:1(v/v)的比例混匀，按照α-壳聚糖分子量由大到小顺序依次编号为1-8组，备用。
取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后注射1-8组溶液0.2mL/只。同时将空白组注射生理盐水，阳性对照为1g/L利巴韦林与病毒1:1(v/v)混合液，阴性对照为10-6鸡新城疫病毒与生理盐水1:1(v/v)混合液。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果如下图3。
经Spss分析，分子量分别为9926、8373、4513、1968、1729Da的直接抑制组与阴性对照组具有显著性差异。
所述分子量为9926、8373、4513、2761、2622、2391、1968、1729Da的α-壳聚糖的制备为：将壳聚糖溶解于过量的浓度为2wt％乙酸中，溶解后将其置于30％过氧化氢中采用微波处理，分别降解5min、10min、15min、25min、30min、40min、60min、80min，继而依次获得所需分子量为9926、8373、4513、2761、2622、2391、1968、1729Da的壳聚糖。其中，壳聚糖溶解液与过氧化氢之间的体积比为50:1.5；微波处理条件为：600w，70℃，500r/min搅拌。
实施例2
高浓度直接抑制试验：将分子量为9926、8373、4513、2761、2622、2391、1968、1729Da的α-壳聚糖分别用生理盐水配置成10g/L的溶液，再分别加乙酸促进溶解，使溶解液中乙酸的终浓度达到1wt％。进一步溶解后将不同分子量的α-壳聚糖经生理盐水配置的溶液抽滤除菌后，备用。将lasota鸡新城疫病毒稀释为10-6后(原始病毒效价为211，96h内导致死亡)，而后将病毒稀释液与上述各物质的不同浓度的溶解液以1:1(v/v)的比例混匀，按照α-壳聚糖分子量由大到小顺序编号为1-8组，备用。
取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后注射1-8组溶液0.2mL/只。同时将空白组注射生理盐水，阳性对照为10g/L利巴韦林与病毒1:1(v/v)混合液，阴性对照为10-6鸡新城疫病毒与生理盐水1:1(v/v)混合液。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果如下图4。
实施例3
高浓度预防实验：将分子量为9926、8373、4513、2761、2622、2391、1968、1729Da的α-壳聚糖分别用生理盐水配置成10g/L的溶液，再分别加乙酸促进溶解，使溶解液中乙酸的终浓度达到1wt％。进一步溶解后将不同分子量的α-壳聚糖经生理盐水配置的溶液抽滤除菌后，编号1-8组备用。
取9-11日龄SPF鸡胚，用照蛋器观察鸡胚存活情况并画出气室，确定打孔位置。采用碘伏对鸡胚气室外壳进行消毒后，再用75％酒精消毒，打孔器打孔后注射1-8组溶液0.2mL/只。同时将空白组注射生理盐水，阳性对照为10g/L利巴韦林，阴性对照为生理盐水。3h后对实验组1-8组、阳性对照组及阴性对照组接种病毒0.2ml/只，浓度为10-6。蜡封，避免感染，放置于37℃孵育箱孵育72h。每隔8小时观察鸡胚存活情况，将24h内死亡鸡胚剔除，并将死亡鸡胚的尿囊液及时抽取进行血凝试验。72h后将所有活胚置于-20℃，冷冻1.5h致死抽取尿囊液进行血凝试验。结果如下图5。
实施例4
取10g/L经生理盐水溶解的分子量为4513Da的α-壳聚糖溶液作用后的鸡胚尿囊液400μL于1.5mL离心管中，加600μL裂解液颠倒混匀后加400μL氯仿，编号，颠倒混匀(10次左右)后放置-20℃沉淀10min。12000r/min离心10min，分管取上清液600μL，加异丙醇800μL，颠倒混匀，-20℃，沉淀30min。12000r/min离心10min。倾倒离心管上清，将管口向下置于吸水纸上，停留5-10s，沿离心管壁加入冷乙醇(75％)1000μL，冲洗1-2次。低速离心，将枪头置于核酸相反的位置吸出残余液体。
反转录：采用反转录试剂盒(试剂盒购买自北京全式金生物技术有限公司)，按说明书要求取上下游引物各1μL，RNase-free Water 6μL分别加入到各管中，65℃孵育5min后冰浴2min，然后再加入其它反应组分。分别为10μL2×TS Reaction Mix，1μLTransScript RT/RI EnzymeMix，1μLgDNA Remover，轻轻混匀，42℃孵育30min。85℃加热5min失活TransScript RT与gDNA Remover
荧光定量PCR：采用PCR试剂盒(试剂盒购买自北京全式金生物技术有限公司)，按说明书要求取8μLtemplate，上下游引物各1μL，10μL2×TransStart Top Green qPCR SuperMix设置步骤为①94℃30sec，循环数为1。②94℃5sec、50-60℃15sec、72℃10sec，循环数为50。
以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法计算IL-2、TNF-α荧光定量PCR结果的差异：
Claims (7)
1.一种抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：抑制新城疫病毒的制剂为低分子量的α-壳聚糖。
2.按权利要求1所述的抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的制剂为10-1KDa的α-壳聚糖。
3.按权利要求2所述的抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的制剂为10-3KDa的α-壳聚糖。
4.按权利要求1、2或3所述的抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的制剂为经生理盐水溶解的低分子量的α-壳聚糖溶液。
5.按权利要求4所述的抑制新城疫病毒的制剂，其特征在于：所述抑制新城疫病毒的制剂是浓度为1-10g/L经生理盐水溶解的低分子量的α-壳聚糖溶液。
6.一种权利要求1所述的抑制新城疫病毒的制剂的应用，其特征在于：所述制剂作为制备新城疫病毒的抑制药物。
7.一种权利要求1所述的抑制新城疫病毒的制剂的应用，其特征在于：所述制剂作为制备家禽免疫因子调节剂。
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